JP6518110B2 - Primer and method for detecting Klebsiella pneumoniae (Klebsiellapneumoniae) - Google Patents
Primer and method for detecting Klebsiella pneumoniae (Klebsiellapneumoniae) Download PDFInfo
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Description
本発明は、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）を検出するためのプライマー、及びKlebsiella pneumoniaeの検出法に関する。 The present invention relates to a primer for detecting Klebsiella pneumoniae (Klebsiella pneumoniae) and a method for detecting Klebsiella pneumoniae.
病原微生物が生体内に侵入することにより引き起こされる感染症は、生体の恒常性を損なうことが知られている。感染症に対する有効な対策として、抗生物質の投与が知られているが、近年、不適切な抗生物質の投与により多剤耐性菌が出現するなどの問題が生じている。この問題を防ぐために、早期に適切な抗生物質投与を行うことが求められており、そのためには、迅速かつ正確な微生物の同定が必要である。近年開発が進んでいる遺伝子検査法は、比較的短時間（数時間）で病原菌を検出できるだけでなく菌種の詳細な同定も可能であるが、訓練が必要な高度な手技と高価な専用装置を必要とし、広く普及していない。 It is known that an infection caused by the invasion of a pathogenic microorganism into a living body impairs homeostasis of the living body. Administration of antibiotics is known as an effective countermeasure against infectious diseases, but in recent years, problems such as appearance of multidrug-resistant bacteria have occurred due to administration of inappropriate antibiotics. In order to prevent this problem, it is required to perform appropriate antibiotic administration at an early stage, which requires a rapid and accurate identification of microorganisms. Although genetic testing methods that have been developed in recent years can not only detect pathogens in a relatively short time (several hours), but also enable detailed identification of bacterial species, advanced techniques that require training and expensive dedicated devices Need and are not widespread.
一方、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）は、ヒトにおいて感染症を生ずるのみならず、乳房炎の原因菌ともなることから、その早期検出による感染拡大防止が求められている。Klebsiella pneumoniaeの検出に関する文献として特許文献1〜2が知られているが、特許文献1〜2に記載されたKlebsiella pneumoniaeの検出法は、検出に必要な時間や特異性の面で十分とは言えないものであった。 On the other hand, Klebsiella pneumoniae (Klebsiella pneumoniae) not only causes infections in humans, but also becomes a causative agent of mastitis, and therefore, it is required to prevent the spread of infection by its early detection. Patent documents 1 and 2 are known as documents regarding detection of Klebsiella pneumoniae, but the detection method of Klebsiella pneumoniae described in patent documents 1 and 2 is sufficient in terms of time and specificity required for detection. It was nothing.
本発明は、Klebsiella pneumoniaeを簡便かつ迅速に検出するためのプライマーセットを提供することを目的とする。また、本発明は、Klebsiella pneumoniaeの簡便かつ迅速な検出方法を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a primer set for detecting Klebsiella pneumoniae conveniently and rapidly. Another object of the present invention is to provide a simple and rapid method for detecting Klebsiella pneumoniae.
上記課題を解決するために鋭意検討した結果、本発明者はKlebsiella pneumoniaeに特異的な塩基配列から設計したプライマーを用いることで、Klebsiella pneumoniaeを特異的に検出し得ることを見出し、本願発明を完成するに至った。 As a result of earnest studies to solve the above problems, the present inventors have found that Klebsiella pneumoniae can be specifically detected by using a primer designed from a base sequence specific to Klebsiella pneumoniae, and the present invention has been completed. It came to
したがって、本発明は以下の態様（１）〜（１６）を包含する。
（１）等温核酸増幅法によってクレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）を検出するためのプライマーセットであって、
該セットが、標的配列である、配列番号1によって表される塩基配列、又は配列番号1によって表される塩基配列において1若しくは数個の塩基の欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入を含む塩基配列において、3’末端側から5’末端側に向かってF3c配列、F2c配列、F1c配列、R1配列、R2配列、及びR3配列を規定し、それぞれの相補的配列をF3配列、F2配列、F1配列、R1c配列、R2c配列、及びR3c配列としたときに、下記の（a）及び（b）のプライマーを含み、かつ、下記の（c）〜（e）のプライマーのいずれか一つ以上を含む、プライマーセット：
（a）プライマーの3’末端側にF2配列を含み、5’末端側にF1c配列を含むプライマー；
（b）プライマーの3’末端側にR2配列を含み、5’末端側にR1c配列、又は相互にハイブリダイズする2つの核酸配列を同一鎖上に有する折り返し配列、を含むプライマー；
（c）前記標的配列におけるF2c配列の3'末端の塩基から、F1c配列の3'末端の3'末端側に隣接する塩基までの配列の部分配列である配列A又は配列Aに相補的な配列Bを含むプライマー及び／又は前記標的配列におけるR2配列の5'末端の塩基から、R1配列の5'末端の5'末端側に隣接する塩基までの配列の部分配列である配列C又は配列Cに相補的な配列Dを含むプライマー；
（d）F3配列を含むプライマー；
（e）R3配列を含むプライマー。
（２）等温核酸増幅法が、LAMP法又はSmartAmp法である、（１）に記載のプライマーセット。
（３）（a）のプライマーにおいて、F2配列が、配列番号2、10、若しくは11によって表される塩基配列、又は配列番号2、10、若しくは11によって表される塩基配列において1若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列である、（１）又は（２）に記載のプライマーセット。
（４）（a）のプライマーにおいて、F1c配列が、配列番号12若しくは13によって表される塩基配列、又は配列番号12若しくは13によって表される塩基配列において1若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列である、（３）に記載のプライマーセット。
（５）（b）のプライマーにおいて、R2配列が、配列番号3によって表される塩基配列、又は配列番号3によって表される塩基配列において１若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列である、（１）〜（４）のいずれかに記載のプライマーセット。
（６）（b）のプライマーにおいて、折り返し配列が、配列番号8若しくは9によって表される塩基配列、又は配列番号8若しくは9によって表される塩基配列において１若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列である、（１）〜（５）のいずれかに記載のプライマーセット。
（７）（c）のプライマーが、配列番号4若しくは7によって表される塩基配列、又は配列番号4若しくは7によって表される塩基配列において１若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列を含む、（１）〜（６）のいずれかに記載のプライマーセット。
（８）（d）のプライマーにおいて、F3配列が配列番号5によって表される塩基配列、又は配列番号5によって表される塩基配列において１若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列である、（１）〜（７）のいずれかに記載のプライマーセット。
（９）（e）のプライマーにおいて、R3配列が配列番号6によって表される塩基配列、又は配列番号6によって表される塩基配列において１若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列である、（１）〜（８）のいずれかに記載のプライマーセット。
（１０）（１）に記載の（a）〜（e）のプライマーにおいて、F1c配列、F2配列、R1c配列又は折り返し配列、R2配列、配列A、B、C、又はD、F3配列、及びR3配列の組合せが、以下の表の組合せ1〜17のいずれかである、（１）又は（２）に記載のプライマーセット。
Therefore, the present invention includes the following aspects (1) to (16).
(1) A primer set for detecting Klebsiella pneumoniae by isothermal nucleic acid amplification method, comprising:
The set includes a deletion, substitution, addition, and / or insertion of one or several bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 which is a target sequence In the base sequence, F3c sequence, F2c sequence, F1c sequence, R1 sequence, R2 sequence and R3 sequence are defined from the 3 'end to the 5' end side, and their complementary sequences are F3 sequence, F2 sequence, When the F1 sequence, the R1c sequence, the R2c sequence, and the R3c sequence are included, one or more of the following primers (a) and (b) are included, and any one or more of the following primers (c) to (e) Primer set including:
(A) a primer comprising an F2 sequence at the 3 'end of the primer and an F1c sequence at the 5'end;
(B) a primer comprising an R2 sequence at the 3 'end of the primer and an R1c sequence at the 5' end, or a folded sequence having two nucleic acid sequences hybridizing mutually on the same strand;
(C) A sequence complementary to the sequence A or the sequence A, which is a partial sequence of the sequence from the base at the 3 'end of the F2c sequence in the target sequence to the base adjacent to the 3' end of the 3 'end of the F1c sequence A sequence C or a sequence C which is a partial sequence of a sequence from the base at the 5 'end of the R2 sequence in the primer containing the B and / or the target sequence to the 5' end of the 5 'end of the R1 sequence A primer comprising the complementary sequence D;
(D) a primer comprising the F3 sequence;
(E) Primer containing R3 sequence.
(2) The primer set according to (1), wherein the isothermal nucleic acid amplification method is LAMP method or SmartAmp method.
(3) In the primer of (a), the F2 sequence has one or two of the base sequences represented by SEQ ID NO: 2, 10 or 11 or the base sequences represented by SEQ ID NO: 2, 10 or 11 The primer set according to (1) or (2), wherein the base is a sequence deleted, substituted, added and / or inserted.
(4) In the primer of (a), the F1c sequence has a deletion or substitution of one or two bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 12 or 13, or in the base sequence represented by SEQ ID NO: 12 or 13 The primer set according to (3), which is a sequence added, and / or inserted.
(5) In the primer of (b), deletion or substitution, addition, or deletion of one or two bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 in the R2 sequence The primer set in any one of (1)-(4) which is the inserted sequence.
(6) In the primer of (b), one or two bases are deleted or substituted in the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 or 9, or the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 or 9 in the folding sequence The primer set according to any one of (1) to (5), which is a sequence added, and / or inserted.
(7) The primer of (c) has a deletion, substitution, addition, or deletion of one or two bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 7, or in the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 7 The primer set in any one of (1)-(6) containing the sequence which / or was inserted.
(8) In the primer of (d), one or two bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 or the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 have deletion, substitution, addition, and / or Or the primer set in any one of (1)-(7) which is the inserted sequence.
(9) In the primer of (e), one or two bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 or the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 have deletion, substitution, addition, and / or Or the primer set in any one of (1)-(8) which is the inserted sequence.
(10) In the primers (a) to (e) described in (1), F1c sequence, F2 sequence, R1c sequence or folding sequence, R2 sequence, sequence A, B, C or D, F3 sequence, and R3 The primer set according to (1) or (2), wherein the combination of sequences is any of the combinations 1 to 17 in the following table.
（１１）（１）〜（１０）のいずれかに記載のプライマーセットを含む、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）を検出するためのキット。
（１２）（１）〜（１０）のいずれかに記載のプライマーセットを用いて等温核酸増幅法によりサンプル由来の核酸を増幅する工程、及び増幅産物の量又は存在を測定する工程を含む、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）の検出方法。
（１３）等温核酸増幅法がLAMP法又はSmartAmp法である、（１２）に記載の方法。
（１４）配列番号1によって表される塩基配列、又は配列番号1によって表される塩基配列において1若しくは数個の塩基の欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入を含む塩基配列、又はその部分配列からなる核酸の量又は存在を測定する工程を含む、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）を特異的に検出する方法。
（１５）前記核酸を増幅する工程を含む、（１４）に記載の方法。
（１６）増幅を等温核酸増幅法により行う、（１４）又は（１５）に記載の方法。
(11) A kit for detecting Klebsiella pneumoniae, comprising the primer set according to any of (1) to (10).
(12) Klebsiella comprising a step of amplifying a nucleic acid derived from a sample by isothermal nucleic acid amplification using the primer set according to any of (1) to (10), and a step of measuring the amount or presence of an amplification product -A detection method of pneumoniae (Klebsiella pneumoniae).
(13) The method according to (12), wherein the isothermal nucleic acid amplification method is LAMP method or SmartAmp method.
(14) A nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a nucleotide sequence including deletion, substitution, addition and / or insertion of one or several bases in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a portion thereof A method for specifically detecting Klebsiella pneumoniae, comprising the step of measuring the amount or presence of a nucleic acid consisting of a sequence.
(15) The method according to (14), which comprises the step of amplifying the nucleic acid.
(16) The method according to (14) or (15), wherein the amplification is performed by isothermal nucleic acid amplification.
本発明により、Klebsiella pneumoniaeの簡便かつ迅速な検出及び同定が可能となる。 The present invention enables simple and rapid detection and identification of Klebsiella pneumoniae.
＜標的配列＞
一態様において、本発明は、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae、以下、「K.pneumoniae」とも称する）を検出するためのプライマーセットに関する。本発明において、K.pneumoniaeを検出するための標的配列は、特に配列番号1によって表される、K.pneumoniaeのhemolysinをコードするDNA配列である。
<Target sequence>
In one aspect, the present invention relates to a primer set for detecting Klebsiella pneumoniae (hereinafter also referred to as "K. pneumoniae"). In the present invention, the target sequence for detecting K.pneumoniae is a DNA sequence encoding K.pneumoniae's hemolysin represented by SEQ ID NO: 1 in particular.
本発明の標的配列は、K.pneumoniaeに特異的である限り上記配列番号1によって表される配列に限定されず、配列番号1によって表される塩基配列において1若しくは数個の塩基の欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入を含む塩基配列を含む。本明細書において、「１若しくは数個」の範囲は、1から10個、好ましくは1から7個、さらに好ましくは1から5個、特に好ましくは1から3個、あるいは1個又は2個である。 The target sequence of the present invention is not limited to the sequence represented by SEQ ID NO: 1 as long as it is specific to K. pneumoniae, and deletion of one or several bases in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 It includes a nucleotide sequence including substitution, addition, and / or insertion. In the present specification, the range of “one or several” is 1 to 10, preferably 1 to 7, more preferably 1 to 5, particularly preferably 1 to 3, or 1 or 2 is there.
また、本発明の標的配列は、K.pneumoniaeに特異的である限り上記配列番号1によって表される配列に限定されず、配列番号1によって表される塩基配列と70%以上の同一性、好ましくは80%以上の同一性、より好ましくは90%以上の同一性、最も好ましくは95%以上の同一性、例えば97%以上、98%以上若しくは99%以上の同一性を有する塩基配列を含む。本明細書において、同一性の値は、複数の塩基酸配列間の同一性を演算するソフトウェア（例えば、FASTA、DANASYS、及びBLAST）を用いてデフォルトの設定で算出した値を示す。塩基配列の同一性の値は、一致度が最大となるように一対の塩基配列をアライメントした際に一致する塩基の数を算出し、当該一致する塩基の数の、比較した塩基配列の全塩基数に対する割合として算出される。ここで、ギャップがある場合、上記の全塩基数は、１つのギャップを１つの塩基として数えた塩基数である。同一性の決定方法の詳細については、例えばAltschul et al, Nuc. Acids. Res. 25, 3389-3402, 1977及びAltschul et al, J. Mol. Biol. 215, 403-410, 1990を参照されたい。 Furthermore, the target sequence of the present invention is not limited to the sequence represented by SEQ ID NO: 1 as long as it is specific to K. pneumoniae, and 70% or more identity to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 is preferable. Contains a base sequence having 80% or more identity, more preferably 90% or more identity, most preferably 95% or more identity, such as 97% or more, 98% or more or 99% or more identity. In the present specification, the value of identity refers to a value calculated with default settings using software (eg, FASTA, DANASYS, and BLAST) for calculating the identity between a plurality of basic acid sequences. The value of identity of base sequences is calculated by calculating the number of matching bases when aligning a pair of base sequences so as to maximize the degree of matching, and calculating the total number of bases of the compared base sequences of the number of matching bases. Calculated as a percentage of the number. Here, when there is a gap, the total number of bases described above is the number of bases counting one gap as one base. For details of how to determine identity see, for example, Altschul et al, Nuc. Acids. Res. 25, 3389-3402, 1977 and Altschul et al, J. Mol. Biol. 215, 403-410, 1990. .
同様に、本発明の標的配列は、K.pneumoniaeに特異的である限り上記配列番号1によって表される配列に限定されず、配列番号1によって表される塩基配列に相補的な配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであってよい。 Similarly, the target sequence of the present invention is not limited to the sequence represented by SEQ ID NO: 1 as long as it is specific to K. pneumoniae, but is stringent to a sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 It may be a polynucleotide that hybridizes under various conditions.
本明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味し、例えばGreen and Sambrook, Molecular Cloning, 4th Ed (2012), Cold Spring Harbor Laboratory Press を参照して適宜決定することができる。具体的には、サザンハイブリダイゼーションの際の温度や溶液に含まれる塩濃度、及びサザンハイブリダイゼーションの洗浄工程の際の温度や溶液に含まれる塩濃度によりストリンジェントな条件を設定することができる。より詳細には、ストリンジェントな条件としては、例えば、ハイブリダイゼーション工程では、ナトリウム濃度が25〜500mM、好ましくは25〜300mMであり、温度が40〜68℃、好ましくは40〜65℃である。より具体的には、ハイブリダイゼーションは、1〜7×SSC、0.02〜3% SDS、温度40℃〜60℃で行うことができる。また、ハイブリダイゼーションの後に洗浄工程を行っても良く、洗浄工程は、例えば0.1〜2×SSC、0.1〜0.3% SDS、温度50〜65℃で行うことができる。 In the present specification, "stringent conditions" mean conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed, for example, Green and Sambrook, Molecular Cloning, 4th Ed (2012), It can be determined appropriately by referring to the Cold Spring Harbor Laboratory Press. Specifically, stringent conditions can be set by the temperature at the time of Southern hybridization, the salt concentration contained in the solution, the temperature at the washing step of the Southern hybridization, and the salt concentration contained in the solution. More specifically, as stringent conditions, for example, in the hybridization step, the sodium concentration is 25 to 500 mM, preferably 25 to 300 mM, and the temperature is 40 to 68 ° C., preferably 40 to 65 ° C. More specifically, hybridization can be performed at 1-7 × SSC, 0.02 to 3% SDS, at a temperature of 40 ° C. to 60 ° C. In addition, a washing step may be performed after hybridization, and the washing step can be performed, for example, at 0.1 to 2 × SSC, 0.1 to 0.3% SDS, and at a temperature of 50 to 65 ° C.
また、本発明の標的配列は、K.pneumoniaeに特異的である限り上記配列番号1によって表される塩基配列、配列番号1において、1若しくは数個の塩基の欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入を含む塩基配列、配列番号1と70%以上の同一性、好ましくは80%以上の同一性、より好ましくは90%以上の同一性、最も好ましくは95%以上の同一性、例えば97%、98%若しくは99%の同一性を有する塩基配列、又は配列番号1に相補的な配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを構成する配列に限定されず、上記標的配列の部分配列であってよい。該部分配列は、例えば、配列番号1の配列の連続する少なくとも50塩基、60塩基、70塩基、80塩基、90塩基、又は100塩基を含む塩基配列、例えば配列番号1の1番目〜350番目の塩基配列、1番目〜300番目の塩基配列、1番目〜250番目の塩基配列、1番目〜200番目の塩基配列、好ましくは1番目〜150番目の塩基配列、特に好ましくは9番目〜127番目の塩基配列、又はこれらの配列において、1若しくは数個の塩基の欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入を含む塩基配列を含む、又はからなるものであってよい。 In addition, the target sequence of the present invention is a nucleotide sequence represented by the above SEQ ID NO: 1 as long as it is specific to K. pneumoniae, SEQ ID NO: 1 deletion, substitution, addition, and / or one or several bases. Or 70% or more identity, preferably 80% or more identity, more preferably 90% or more identity, most preferably 95% or more identity, eg 97% The present invention is not limited to a sequence having a 98% or 99% identity, or a sequence constituting a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to the sequence complementary to SEQ ID NO: 1, but a partial sequence of the above target sequence. May be there. The partial sequence is, for example, a base sequence including at least 50 contiguous bases, 60 bases, 70 bases, 80 bases, 90 bases or 100 bases of the sequence of SEQ ID NO: 1, for example, 1st to 350th of SEQ ID NO: 1 Base sequence, 1st to 300th base sequence, 1st to 250th base sequence, 1st to 200th base sequence, preferably 1st to 150th base sequence, particularly preferably 9th to 127th The nucleotide sequence, or in these sequences, may contain or consist of a nucleotide sequence including deletion, substitution, addition and / or insertion of one or several bases.
＜プライマー＞
一態様において、本発明は、上記標的配列から設計されたプライマー又はプライマーセットに関する。例えば、本発明は、上記標的配列の一部と同一又は相補的な塩基配列を含むか若しくはからなるプライマー、又は該プライマーを二種以上含むプライマーセットに関する。
<Primer>
In one aspect, the present invention relates to a primer or primer set designed from the above target sequence. For example, the present invention relates to a primer comprising or consisting of a base sequence identical or complementary to a part of the above target sequence, or a primer set comprising two or more of the primers.
本発明のプライマー及びプライマーセットは、等温核酸増幅法によって、上記標的配列を増幅し得るものであってよい。等温核酸増幅法とは、標的核酸配列を等温で増幅する方法である。本明細書において、等温核酸増幅法における「等温」とは、酵素及びプライマー等が機能し得る一定の温度、例えば40℃〜75℃、好ましくは50℃〜72℃、特に55℃〜70℃を意味する。代表的な等温核酸増幅法であるLAMP法及びSmartAmp法について、以下に説明する。 The primer and primer set of the present invention may be capable of amplifying the above target sequence by isothermal nucleic acid amplification. The isothermal nucleic acid amplification method is a method of amplifying a target nucleic acid sequence isothermally. In the present specification, "isothermal" in the isothermal nucleic acid amplification method refers to a certain temperature at which an enzyme, a primer and the like can function, such as 40 ° C to 75 ° C, preferably 50 ° C to 72 ° C, particularly 55 ° C to 70 ° C. means. The representative isothermal nucleic acid amplification methods LAMP method and SmartAmp method will be described below.
LAMP法は、プライマーとして、好ましくは少なくとも4種類のオリゴヌクレオチドを用いる核酸増幅法であり、2本鎖DNA、4つのプライマー、鎖置換型DNA polymerase、基質等を同一容器に入れ、一定温度(65℃付近)で保温することにより、検出までを１ステップの工程で行う。LAMP法は、増幅効率が高く、DNAを15分〜１時間程度で約109〜1010倍に増幅することができ、増幅産物の有無によって、短時間で標的DNA配列の有無を判定することが可能である（例えば、国際特許公開WO 00/28082号公報）。 The LAMP method is a nucleic acid amplification method using preferably at least four kinds of oligonucleotides as primers, and a double-stranded DNA, four primers, a strand displacement type DNA polymerase, a substrate and the like are placed in the same container and kept at a constant temperature (65 By keeping the temperature at around (° C.), detection is performed in a one-step process. The LAMP method has high amplification efficiency and can amplify DNA about 10 9 to 10 10 times in about 15 minutes to 1 hour, and determines the presence or absence of a target DNA sequence in a short time by the presence or absence of an amplification product (E.g., International Patent Publication WO 00/28082).
LAMP法では、標的遺伝子に対して、3’末端側から5’末端側に向かってF3c配列、F2c配列、F1c配列、R1配列、R2配列、及びR3配列を規定し、この6領域に対して、プライマーを設計する。プライマーとして、FIP（forward inner primer）及びBIP(back inner primer)を含むインナープライマーを用い、好ましくはさらにF3プライマー及びB3プライマーを含むアウタープライマーを用いる。FIPは、標的遺伝子のF2c領域と相補的なF2領域を3’末端側に有し、5’末端側に標的遺伝子のF1c領域と同一の配列を含む。F3プライマーは、標的遺伝子のF3c領域と相補的なF3領域を含む。BIPは、標的遺伝子のR2領域を3’末端側に有し、5’末端側に標的遺伝子のR1領域と相補的なR1c領域を含む。B3プライマーは、標的遺伝子のR3配列を含む。LAMP法では、ループプライマーと呼ばれるプライマーを用いて、反応をさらに促進することもできる。ループプライマーは、LAMP法の反応中間体として生じる構造の両端に存在するループ構造の一部の配列に相補的な配列を含む。 In the LAMP method, an F3c sequence, an F2c sequence, an F1c sequence, an R1 sequence, an R2 sequence, and an R3 sequence are defined from the 3 'end toward the 5' end with respect to the target gene. , Design a primer. As a primer, an inner primer comprising FIP (forward inner primer) and BIP (back inner primer) is used, preferably an outer primer further comprising F3 primer and B3 primer. FIP has an F2 region complementary to the F2c region of a target gene at the 3 'end, and contains a sequence identical to the F1c region of the target gene at the 5' end. The F3 primer contains an F3 region complementary to the F3c region of the target gene. BIP has the R2 region of the target gene at the 3 'end, and the 5' end includes the R1 c region complementary to the R1 region of the target gene. The B3 primer contains the R3 sequence of the target gene. In the LAMP method, a primer called loop primer can also be used to further promote the reaction. The loop primer contains a sequence complementary to the sequence of part of the loop structure present at both ends of the structure generated as a reaction intermediate of the LAMP method.
SmartAmp法は、LAMP法と類似する方法であるが、フォールディングプライマーと呼ばれる、5’側が自己相補的な配列、すなわち、相互にハイブリダイズする2つの核酸配列を同一鎖上に有する折り返し配列であるプライマーを用いる点で、LAMP法と相違する。また、上記の通りLAMP法では両端にループ構造を有する中間体が形成されるのに対し、SmartAmp法では、一方がループ構造、もう一方が折りたたみ構造を有する中間体が形成される点でも相違する。さらに、各プライマーの名称も、LAMP法とSmartAmp法では異なる。LAMP法とSmartAmp法の相違点の概略を図1に示す。 The SmartAmp method is a method similar to the LAMP method, but is a primer called a folding primer, which is a self-complementary sequence on the 5 'side, ie, a folded sequence having two nucleic acid sequences hybridizing with each other on the same strand It differs from the LAMP method in that it uses Further, as described above, in the LAMP method, an intermediate having a loop structure at both ends is formed, while in the SmartAmp method, an intermediate having one loop structure and another having a folded structure is formed. . Furthermore, the names of each primer are also different in the LAMP method and the SmartAmp method. An outline of the difference between the LAMP method and the SmartAmp method is shown in FIG.
本発明のプライマーセットは、上記「標的配列」の項目で記載した標的配列において、3’末端側から5’末端側に向かってF3c配列、F2c配列、F1c配列、R1配列、R2配列、及びR3配列を規定し、それぞれの相補的配列をF3配列、F2配列、F1配列、R1c配列、R2c配列、及びR3c配列としたときに、少なくとも以下の(a)及び(b)のプライマーを含む：（a）プライマーの3’末端側がF2配列を含むか又はからなり、5’末端側がF1c配列を含むか又はからなるプライマー；及び（b）プライマーの3’末端側がR2配列を含むか若しくはからなり、5’末端側がR1c配列、又は相互にハイブリダイズする2つの核酸配列を同一鎖上に有する折り返し配列、を含むか若しくはからなるプライマー。ここで、(b)のプライマーが5’末端側にR1c配列を含む場合には、該プライマーセットはLAMP法に用いることができ、(b)のプライマーが5’末端側に折り返し配列を含む場合には、該プライマーセットはSmartAmp法に用いることができる。 The primer set of the present invention is an F3c sequence, an F2c sequence, an F1c sequence, an R1 sequence, an R2 sequence, and an R3 sequence from the 3 'end toward the 5' end in the target sequence described in the item "target sequence". When at least the following primers (a) and (b) are defined, where the sequences are defined and the respective complementary sequences are F3 sequence, F2 sequence, F1 sequence, R1c sequence, R2c sequence, and R3c sequence: a) a primer comprising or consisting of an F2 sequence at the 3 'end of the primer and consisting or consisting of an F1c sequence at the 5' end; and (b) comprises or consists of an R2 sequence at the 3 'end of the primer, A primer comprising or consisting of an R1c sequence at the 5 'end side, or a folded sequence having two nucleic acid sequences hybridizing to each other on the same strand. Here, when the primer of (b) contains an R1c sequence at the 5 'end, the primer set can be used for the LAMP method, and when the primer of (b) contains a folding sequence at the 5' end The primer set can be used in the SmartAmp method.
上記（a）及び（b）のプライマーにおいて、「5’末端側」とは、二つの配列の相対的な位置関係を表し、「5’末端側」の配列が他方の配列に対して、5’末端により近いことを意味する。「5’末端側に含む」とは、好ましくは「5’末端」に含むことを意味する。同様に、「3’末端側」とは、二つの配列の相対的な位置関係を表し、「3’末端側」の配列が他方の配列に対して、3’末端により近いことを意味する。「3’末端側に含む」とは、好ましくは「3’末端」に含むことを意味する。 In the primers of (a) and (b) above, “5 ′ end side” indicates the relative positional relationship between the two sequences, and the “5 ′ end side” sequence is 5 relative to the other sequence. 'Means closer to the end. "Including at the 5 'end" means preferably including at the "5' end". Similarly, “3′-end” indicates the relative positional relationship between the two sequences, meaning that the “3′-end” sequence is closer to the 3 ′ end with respect to the other sequence. "Including at the 3 'end" means preferably including at the "3' end".
限定するものではないが、F2c配列の3’末端〜R2配列の5’末端の塩基長は60〜500塩基であってよく、F2cとF3c配列間、及びR2とR3配列間の塩基長は、0〜20塩基であってよい。また、限定するものではないが、F2cとF1c配列間、及びR2とR1の配列間の塩基長は、0〜60塩基であってよい。 Although not limited, the base length of the 3 'end of the F2c sequence to the 5' end of the R2 sequence may be 60 to 500 bases, and the base length between the F2c and F3c sequences and between the R2 and R3 sequences is It may be 0-20 bases. In addition, although not limited thereto, the base length between F2c and F1c sequences and between R2 and R1 sequences may be 0 to 60 bases.
本発明のプライマーセットは、上記（a）及び（b）のプライマーに加えて、さらに以下の（c）〜（e）のいずれか一つ以上を含んでもよい：（c）標的配列におけるF2c配列の3'末端の塩基から、F1c配列の3'末端の3'末端側に隣接する塩基までの配列の部分配列である配列A又は配列Aに相補的な配列Bを含む（好ましくは3'末端に含む）か若しくはからなるプライマー及び／又は標的配列におけるR2配列の5'末端の塩基から、R1配列の5'末端の5'末端側に隣接する塩基までの配列の部分配列である配列C又は配列Cに相補的な配列Dを含む（好ましくは3'末端に含む）か若しくはからなるプライマー；（d）F3配列を含む（好ましくは3'末端に含む）か又はからなるプライマー；及び（e）R3配列を含む（好ましくは3'末端に含む）か又はからなるプライマー。好ましくは、本発明のプライマーセットは、上記（a）及び（b）のプライマーに加えて、さらに上記（c）のプライマーを少なくとも含む。 The primer set of the present invention may further contain any one or more of the following (c) to (e) in addition to the primers of (a) and (b) above: (c) F2c sequence in the target sequence A sequence B which is a partial sequence of a sequence from a base at the 3 ′ end of the to a base adjacent to the 3 ′ end of the 3 ′ end of the F1c sequence, and a sequence B complementary to the sequence A (preferably the 3 ′ end A partial sequence of a sequence from the base at the 5 'end of the R2 sequence in the primer and / or the target sequence and the base adjacent to the 5' end of the 5 'end of the R1 sequence A primer comprising or consisting of (preferably at the 3 'end) the sequence D complementary to the sequence C; (d) a primer comprising or preferably consisting of the F3 sequence (or at the 3' end); 2.) A primer comprising or consisting of (preferably at the 3 'end) the R3 sequence. Preferably, the primer set of the present invention further includes at least the primer of (c) above in addition to the primers of (a) and (b) above.
LAMP法において用いる場合には、本発明のプライマーセットは、上記（a）及び（b）のプライマーに加えて、好ましくは上記（d）及び（e）のプライマーを含む。LAMP法において用いる場合には、本発明のプライマーセットは、さらに好ましくは、上記（c）のプライマーをさらに含む。 When used in the LAMP method, the primer set of the present invention preferably includes the primers of (d) and (e) in addition to the primers of (a) and (b) above. When used in the LAMP method, the primer set of the present invention further preferably further comprises the primer of (c) above.
上記（a）〜（b）のプライマーの長さは、プライマーセットが標的配列を増幅可能であれば特に限定しない。上記F3c配列、F2c配列、F1c配列、R1配列、R2配列、及びR3配列の長さは、それぞれ例えば12〜32ヌクレオチド、好ましくは15〜30ヌクレオチドであり、上記折り返し配列の長さは、例えば4〜60ヌクレオチド、好ましくは6〜40ヌクレオチドである。また、（a）のプライマーは、F2配列とF1c配列の間に、反応に影響を与えない0〜50ヌクレオチドからなる任意のオリゴヌクレオチドを含んでいてよく、同様に（b）のプライマーは、R2配列とR1c配列又は折り返し配列の間に、反応に影響を与えない0〜50ヌクレオチドからなる任意のオリゴヌクレオチドを含んでいてよい。したがって、（a）及び（b）のプライマーの長さは、例えば30〜100ヌクレオチド、好ましくは30〜50ヌクレオチド、特に好ましくは30〜40ヌクレオチドである。同様に、（c）〜（e）のプライマーの長さは、プライマーセットが標的配列を増幅可能であれば特に限定しないが、例えば12〜32ヌクレオチド、好ましくは15〜30ヌクレオチドである。 The lengths of the primers of (a) to (b) above are not particularly limited as long as the primer set can amplify the target sequence. The lengths of the F3c sequence, the F2c sequence, the F1c sequence, the R1 sequence, the R2 sequence, and the R3 sequence are, for example, 12 to 32 nucleotides, preferably 15 to 30 nucleotides, and the length of the folded sequence is, for example, 4 60 to 60 nucleotides, preferably 6 to 40 nucleotides. Also, the primer of (a) may contain any oligonucleotide consisting of 0 to 50 nucleotides which does not affect the reaction between the F2 sequence and the F1c sequence, and similarly, the primer of (b) is R2 Between the sequence and the R1c sequence or the folding sequence, any oligonucleotide consisting of 0 to 50 nucleotides which does not affect the reaction may be included. Accordingly, the length of the primers (a) and (b) is, for example, 30 to 100 nucleotides, preferably 30 to 50 nucleotides, particularly preferably 30 to 40 nucleotides. Similarly, the length of the primers (c) to (e) is not particularly limited as long as the primer set can amplify the target sequence, and is, for example, 12 to 32 nucleotides, preferably 15 to 30 nucleotides.
上記（a）のプライマーにおいて、F2配列は、配列番号2、10、若しくは11によって表される塩基配列、又は配列番号2、10、若しくは11によって表される塩基配列において1若しくは数個（例えば2〜3個、好ましくは2個）の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列であってよく、特に配列番号2、10、若しくは11によって表される塩基配列において5'末端及び3'末端の一方又は両方から合計で1若しくは数個の塩基が欠失した配列や、5'末端に1若しくは数個の塩基が付加した配列であることができる。また、F2配列は、配列番号2、10、若しくは11によって表される塩基配列と70%以上の同一性、80%以上の同一性、90%以上の同一性、95%以上の同一性、又は97%以上の同一性を有する塩基配列であってよい。また、F2配列は、配列番号2、10、若しくは11に相補的な配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを構成する塩基配列であってよい。F2配列はまた、配列番号1で表される塩基配列の相補的な塩基配列に含まれる部分塩基配列であって、配列番号2、10、若しくは11によって表される塩基配列と、配列番号2、10、若しくは11によって表される塩基配列の5'末端及び3'末端の一方又は両方に付加した合計で好ましくは9以下、より好ましくは6以下、最も好ましくは1、2又は3の塩基とからなる前記部分塩基配列であってよい。ここで、（a）のプライマーにおいて、F1c配列は、配列番号12若しくは13によって表される塩基配列、又は配列番号12若しくは13によって表される塩基配列において1若しくは数個（例えば2〜3個、好ましくは2個）の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列であってよく、特に配列番号12若しくは13によって表される塩基配列において5'末端及び3'末端の一方又は両方から合計で1若しくは数個の塩基が欠失した配列や、5'末端に1若しくは数個の塩基が付加した配列であることができる。また、F1c配列は、配列番号12若しくは13によって表される塩基配列と70%以上の同一性、80%以上の同一性、90%以上の同一性、95%以上の同一性、又は97%以上の同一性を有する塩基配列であってよい。また、F1c配列は、配列番号12若しくは13に相補的な配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを構成する塩基配列であってよい。F1c配列はまた、配列番号1で表される塩基配列に含まれる部分塩基配列であって、配列番号12若しくは13によって表される塩基配列と、配列番号12若しくは13によって表される塩基配列の5'末端及び3'末端の一方又は両方に付加した合計で好ましくは9以下、より好ましくは6以下、最も好ましくは1、2又は3の塩基とからなる前記部分塩基配列であってよい。 In the primer of the above (a), one or several (for example, 2) of the F2 sequences in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, 10 or 11 or in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, 10 or 11 The sequence may have a deletion, substitution, addition, and / or insertion of 3 to 3, preferably 2) bases, and in particular, the 5 'end of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, 10 or 11 And a sequence in which one or several bases in total are deleted from one or both of the 3 'end and a sequence in which one or several bases are added to the 5' end. In addition, the F2 sequence has 70% or more identity, 80% or more identity, 90% or more identity, 95% or more identity, or the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, 10 or 11 It may be a nucleotide sequence having 97% or more identity. In addition, the F2 sequence may be a nucleotide sequence constituting a polynucleotide that hybridizes to a sequence complementary to SEQ ID NO: 2, 10, or 11 under stringent conditions. The F2 sequence is also a partial base sequence contained in a complementary base sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, and the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, 10 or 11; The total number of bases added is preferably 9 or less, more preferably 6 or less, and most preferably 1, 2 or 3 bases in total added to one or both of the 5 'end and the 3' end of the base sequence represented by 10 or 11. The partial base sequence may be Here, in the primer (a), the F1c sequence is one or several (for example, 2 to 3) in the base sequence represented by SEQ ID NO: 12 or 13, or in the base sequence represented by SEQ ID NO: 12 or 13 Preferably, 2) bases may be a deleted, substituted, added, and / or inserted sequence, in particular, one or the 5 'end and the 3' end in the base sequence represented by SEQ ID NO: 12 or 13 It may be a sequence in which one or several bases in total are deleted from both, or a sequence in which one or several bases are added to the 5 'end. In addition, the F1c sequence has 70% or more identity, 80% or more identity, 90% or more identity, 95% or more identity, or 97% or more with the base sequence represented by SEQ ID NO: 12 or 13 It may be a nucleotide sequence having the identity of In addition, the F1c sequence may be a nucleotide sequence constituting a polynucleotide that hybridizes with a sequence complementary to SEQ ID NO: 12 or 13 under stringent conditions. The F1c sequence is also a partial base sequence contained in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, and 5 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 12 or 13 and the base sequence represented by SEQ ID NO: 12 or 13 The partial base sequence may be a total of preferably 9 or less, more preferably 6 or less, and most preferably 1, 2 or 3 bases in total added to one or both of the 'end and the 3' end.
上記（b）のプライマーにおいて、R2配列は、配列番号3によって表される塩基配列、又は配列番号3によって表される塩基配列において1若しくは数個（例えば2〜3個、好ましくは2個）の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列であってよく、特に配列番号3によって表される塩基配列において5'末端及び3'末端の一方又は両方から合計で1若しくは数個の塩基が欠失した配列や、5'末端に1若しくは数個の塩基が付加した配列であることができる。また、R2配列は、配列番号3によって表される塩基配列と70%以上の同一性、80%以上の同一性、90%以上の同一性、95%以上の同一性、又は97%以上の同一性を有する塩基配列であってよい。また、R2配列は、配列番号3に相補的な配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを構成する塩基配列であってよい。R2配列はまた、配列番号1で表される塩基配列に含まれる部分塩基配列であって、配列番号3によって表される塩基配列と、配列番号3によって表される塩基配列の5'末端及び3'末端の一方又は両方に付加した合計で好ましくは9以下、より好ましくは6以下、最も好ましくは1、2又は3の塩基とからなる前記部分塩基配列であってよい。 In the primer of the above (b), the R2 sequence is one or several (for example, 2 to 3, preferably 2) of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 The sequence may have a base deleted, substituted, added, and / or inserted, and in particular, one or several in total from one or both of the 5 'end and 3' end in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 Or a sequence in which one or several bases are added to the 5 'end. In addition, the R2 sequence has 70% or more identity, 80% or more identity, 90% or more identity, 95% or more identity, or 97% or more identity to the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 It may be a nucleotide sequence having sex. In addition, the R2 sequence may be a nucleotide sequence that constitutes a polynucleotide that hybridizes to a sequence complementary to SEQ ID NO: 3 under stringent conditions. The R2 sequence is also a partial base sequence contained in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, and the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 and the 5 'end of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 and 3 The partial base sequence may consist of a total of preferably 9 or less, more preferably 6 or less, and most preferably 1, 2 or 3 bases in total added to one or both 'ends.
上記（b）のプライマーにおいて、折り返し配列は、相互にハイブリダイズする2つの核酸配列を同一鎖上に有する配列であれば、特に限定しない。折り返し配列中に存在する相互にハイブリダイズする2つの核酸配列は、他の配列を介さずに直接隣接していてもよいし、他の配列を介して接していてもよい。折り返し構造を形成する各核酸の長さは、限定するものではないが、例えば2〜30塩基、好ましくは2〜20塩基である。また、折り返し構造を形成する2つの核酸配列の間に存在し得る他の配列の長さは、限定するものではないが、例えば1〜40塩基、好ましくは1〜20塩基又は1〜10塩基である。 In the primer of (b) above, the folding sequence is not particularly limited as long as it has two nucleic acid sequences hybridizing to each other on the same strand. The two nucleic acid sequences hybridizing to each other present in the folded sequence may be directly adjacent to each other without intervening other sequences, or may be joined via other sequences. The length of each nucleic acid forming the folded structure is not limited, but is, for example, 2 to 30 bases, preferably 2 to 20 bases. Also, the length of other sequences that may be present between two nucleic acid sequences that form a folded structure is not limited, and is, for example, 1 to 40 bases, preferably 1 to 20 bases or 1 to 10 bases is there.
上記（b）のプライマーにおける折り返し配列は、配列番号8若しくは9によって表される塩基配列、又は配列番号8若しくは9によって表される塩基配列において1若しくは数個（例えば2〜3個、好ましくは2個）の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列であってよい。また、折り返し配列は、配列番号8若しくは9によって表される塩基配列と70%以上の同一性、80%以上の同一性、90%以上の同一性、95%以上の同一性、又は97%以上の同一性を有する塩基配列であってよい。また、折り返し配列は、配列番号8若しくは9に相補的な配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを構成する塩基配列であってよい。 The folding sequence in the primer of the above (b) is one or several (for example, 2 to 3, preferably 2) in the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 or 9 or in the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 or 9 Sequences may be deleted, substituted, added and / or inserted. In addition, the folded sequence has 70% or more identity, 80% or more identity, 90% or more identity, 95% or more identity, or 97% or more with the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 or 9 It may be a nucleotide sequence having the identity of In addition, the folded sequence may be a nucleotide sequence that constitutes a polynucleotide that hybridizes to a sequence complementary to SEQ ID NO: 8 or 9 under stringent conditions.
上記（c）のプライマーは、例えば、標的配列におけるF2c配列とF1c配列の間の部分配列又は該部分配列に相補的な配列を含む（好ましくは3'末端に含む）か若しくはからなるプライマー及び／又は標的配列におけるR1配列とR2配列の間の部分配列若しくは該配列に相補的な配列を含む（好ましくは3'末端に含む）か若しくはからなるプライマーであってよい。 The primer of (c) above includes, for example, a partial sequence between the F2c sequence and the F1c sequence in the target sequence or a sequence complementary to the partial sequence (preferably at the 3 'end) or consisting of Alternatively, it may be a primer comprising or consisting of a partial sequence between the R1 sequence and the R2 sequence in the target sequence or a sequence complementary to the sequence (preferably included at the 3 'end).
上記（c）のプライマーは、配列番号4若しくは7によって表される塩基配列、又は配列番号4若しくは7によって表される塩基配列において1若しくは数個（例えば2〜3個、好ましくは2個）の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列を含む、又はからなるものであってよく、特に配列番号4若しくは7によって表される塩基配列において5'末端及び3'末端の一方又は両方から合計で1若しくは数個の塩基が欠失した配列や、5'末端に1若しくは数個の塩基が付加した配列であることができる。また、（c）のプライマーは、配列番号4若しくは7によって表される塩基配列と70%以上の同一性、80%以上の同一性、90%以上の同一性、95%以上の同一性、又は97%以上の同一性を有する塩基配列を含むか又はからなるものであってよい。また、（c）のプライマーは、配列番号4若しくは7に相補的な配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを構成する塩基配列を含むか又はからなるものであってよい。 The primer of the above (c) is one or several (for example, 2 to 3, preferably 2) of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 7 or the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 7 The base may contain or consist of a sequence deleted, substituted, added and / or inserted, and in particular, one of the 5 'end and the 3' end in the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 7 Alternatively, it may be a sequence in which one or several bases in total are deleted from both or a sequence in which one or several bases are added to the 5 'end. The primer (c) has 70% or more identity, 80% or more identity, 90% or more identity, 95% or more identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 7 It may contain or consist of a nucleotide sequence having 97% or more identity. In addition, the primer of (c) may contain or consist of a base sequence constituting a polynucleotide that hybridizes to a sequence complementary to SEQ ID NO: 4 or 7 under stringent conditions.
上記（d）のプライマーにおいて、F3配列は、配列番号5によって表される塩基配列、又は配列番号5によって表される塩基配列において1若しくは数個（例えば2〜3個、好ましくは2個）の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列であってよく、特に配列番号5によって表される塩基配列において5'末端及び3'末端の一方又は両方から合計で1若しくは数個の塩基が欠失した配列や、5'末端に1若しくは数個の塩基が付加した配列であることができる。また、F3配列は、配列番号5によって表される塩基配列と70%以上の同一性、80%以上の同一性、90%以上の同一性、95%以上の同一性、又は97%以上の同一性を有する塩基配列であってよい。また、F3配列は、配列番号5に相補的な配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを構成する塩基配列であってよい。F3配列はまた、配列番号1で表される塩基配列の相補的な塩基配列に含まれる部分塩基配列であって、配列番号5によって表される塩基配列と、配列番号5によって表される塩基配列の5'末端及び3'末端の一方又は両方に付加した合計で好ましくは9以下、より好ましくは6以下、最も好ましくは1、2又は3の塩基とからなる前記部分塩基配列であってよい。 In the primer of the above (d), the F3 sequence is one or several (for example, 2 to 3, preferably 2) of the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 or the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 The sequence may have a base deleted, substituted, added, and / or inserted, and in particular, one or several in total from one or both of the 5 'end and 3' end in the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 Or a sequence in which one or several bases are added to the 5 'end. In addition, the F3 sequence has 70% or more identity, 80% or more identity, 90% or more identity, 95% or more identity, or 97% or more identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 It may be a nucleotide sequence having sex. In addition, the F3 sequence may be a nucleotide sequence that constitutes a polynucleotide that hybridizes to a sequence complementary to SEQ ID NO: 5 under stringent conditions. The F3 sequence is also a partial base sequence included in the complementary base sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, and the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 and the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 The partial base sequence may be a total of preferably 9 or less, more preferably 6 or less, and most preferably 1, 2 or 3 bases in total added to one or both of the 5 'end and the 3' end of
上記（e）のプライマーにおいて、R3配列は、配列番号6によって表される塩基配列、又は配列番号6によって表される塩基配列において1若しくは数個（例えば2〜3個、好ましくは2個）の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列であってよく、特に配列番号6によって表される塩基配列において5'末端及び3'末端の一方又は両方から合計で1若しくは数個の塩基が欠失した配列や、5'末端に1若しくは数個の塩基が付加した配列であることができる。また、R3配列は、配列番号6によって表される塩基配列と70%以上の同一性、80%以上の同一性、90%以上の同一性、95%以上の同一性、又は97%以上の同一性を有する塩基配列であってよい。また、R3配列は、配列番号6に相補的な配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを構成する塩基配列であってよい。R3配列はまた、配列番号1で表される塩基配列に含まれる部分塩基配列であって、配列番号6によって表される塩基配列と、配列番号6によって表される塩基配列の5'末端及び3'末端の一方又は両方に付加した合計で好ましくは9以下、より好ましくは6以下、最も好ましくは1、2又は3の塩基とからなる前記部分塩基配列であってよい。 In the primer of the above (e), the R3 sequence is one or several (for example, 2 to 3, preferably 2) of the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 or the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 The sequence may be a deletion, substitution, addition, and / or insertion of a base, particularly one or several in total from one or both of the 5 'end and 3' end in the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 Or a sequence in which one or several bases are added to the 5 'end. In addition, R3 sequence is 70% or more identity, 80% or more identity, 90% or more identity, 95% or more identity, or 97% or more identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 It may be a nucleotide sequence having sex. In addition, the R3 sequence may be a base sequence that constitutes a polynucleotide that hybridizes to a sequence complementary to SEQ ID NO: 6 under stringent conditions. The R3 sequence is also a partial base sequence contained in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, and the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 and the 5 'end of the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 and 3 The partial base sequence may consist of a total of preferably 9 or less, more preferably 6 or less, and most preferably 1, 2 or 3 bases in total added to one or both 'ends.
また、一態様において、本発明は、上記（a）〜（e）のプライマーにおいて、F1c配列、F2配列、R1c配列又は折り返し配列、R2配列、配列A、B、C、又はD、F3配列、及びR3配列の組合せが、以下の表の組合せ1〜17のいずれかである、プライマーセットに関する。 In one embodiment, the present invention provides the primers of (a) to (e) above, wherein the F1c sequence, the F2 sequence, the R1c sequence or the return sequence, the R2 sequence, the sequence A, B, C, or D, the F3 sequence, The present invention relates to a primer set in which the combination of R1 and R3 sequences is any of the combinations 1 to 17 in the following table.
ここで、組合せ1〜17において、各プライマーは、表中に記載された配列を含むか又はからなる。 Here, in combinations 1 to 17, each primer comprises or consists of the sequences listed in the table.
本発明の他の一態様では、上記表に示す組合せ1〜17のいずれかのプライマーセットにおいて、配列番号X（Xは表中の各組合せにおける配列番号の1つ以上を指す）によって表される塩基配列が、
配列番号Xによって表される塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された塩基配列；
配列番号Xによって表される塩基配列と70%以上の同一性、80%以上の同一性、90%以上の同一性、95%以上の同一性、又は97%以上の同一性を有する塩基配列；
配列番号Xに相補的な配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを構成する塩基配列（特に配列番号Xによって表される塩基配列において5'末端及び3'末端の一方又は両方から合計で1若しくは数個の塩基が欠失した配列や、5'末端に1若しくは数個の塩基が付加した配列）；或いは
配列番号1で表される塩基配列に含まれる部分塩基配列又は配列番号1で表される塩基配列の相補的な塩基配列に含まれる部分塩基配列であって、配列番号X（ただし配列番号Xが配列番号8又は9である場合を除く）によって表される塩基配列と、配列番号Xによって表される塩基配列の5'末端及び3'末端の一方又は両方に付加した合計で好ましくは9以下、より好ましくは6以下、最も好ましくは1、2又は3の塩基とからなる前記部分塩基配列
に置き換えられてもよい。これらの塩基配列については、(a)〜(e)のプライマーに関して説明した通りである。
In another embodiment of the present invention, in the primer set of any of the combinations 1 to 17 shown in the above table, represented by SEQ ID NO: X (X indicates one or more of SEQ ID NOs in each combination in the table) The base sequence is
A nucleotide sequence in which one or several bases are deleted, substituted, added and / or inserted in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: X;
A nucleotide sequence having 70% or more identity, 80% or more identity, 90% or more identity, 95% or more identity, or 97% or more identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: X;
A base sequence constituting a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to a sequence complementary to SEQ ID NO: X (particularly, from one or both of the 5 'end and the 3' end in the base sequence represented by SEQ ID NO: X) A sequence in which one or several bases are deleted, or a sequence in which one or several bases are added to the 5 'end); or a partial base sequence contained in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or A partial base sequence contained in a complementary base sequence of the base sequence shown, which is represented by SEQ ID NO: X (except when SEQ ID NO: 8 is SEQ ID NO: 8 or 9), The total number of not more than 9, preferably not more than 6, and most preferably 1, 2 or 3 bases in total added to one or both of the 5 'end and the 3' end of the base sequence represented by No. X Put in partial base sequence It may be gills. These base sequences are as described for the primers (a) to (e).
本発明の方法において増幅される配列は、LAMP法の場合、例えば、F1c配列とR1配列及びF1c配列とR1配列の間の配列、又はF1配列とR1c配列及びF1配列とR1c配列の間の配列を含む配列である。ここで、F1c配列とR1配列の間、又はF1配列とR1c配列の間の塩基長は、例えば0〜60塩基又は5〜50塩基であってよい。また、本発明の方法において増幅される配列は、SmartAmp法の場合、例えば、F1c配列とR2配列及びF1c配列とR2配列の間の配列、又はF1配列とR2c配列及びF1配列とR2c配列の間の配列を含む配列である。ここで、F1c配列とR2配列の間、又はF1配列とR2c配列の間の塩基長は、例えば0〜60塩基又は5〜50塩基であってよい。 The sequences amplified in the method of the present invention are, for example, in the case of the LAMP method, sequences between the F1c sequence and the R1 sequence and sequences between the F1c sequence and the R1 sequence, or sequences between the F1 sequence and the R1c sequence and the F1 sequence and the R1c sequence. Is an array containing Here, the base length between the F1c sequence and the R1 sequence or between the F1 sequence and the R1c sequence may be, for example, 0 to 60 bases or 5 to 50 bases. Further, in the case of SmartAmp method, the sequences amplified in the method of the present invention are, for example, sequences between F1c sequence and R2 sequence and sequences between F1c sequence and R2 sequences, or between F1 sequences and R2c sequences and F1 sequences and R2c sequences. Is an array containing the sequence of Here, the base length between the F1c sequence and the R2 sequence, or between the F1 sequence and the R2c sequence may be, for example, 0 to 60 bases or 5 to 50 bases.
＜キット＞
一態様において、本発明は、本発明のプライマー又はプライマーセットを含む、K.pneumoniaeを検出するためのキットに関する。本発明のキットは、上記プライマー又はプライマーセットに加えて、例えば、バッファー、酵素、及び／又は使用説明書等を含んでもよい。
<Kit>
In one aspect, the invention relates to a kit for detecting K. pneumoniae comprising a primer or primer set of the invention. The kit of the present invention may contain, for example, a buffer, an enzyme, and / or instructions for use in addition to the above-described primer or primer set.
＜方法＞
一態様において、本発明は、上記標的配列、例えば配列番号1によって表される塩基配列、又は配列番号1によって表される塩基配列において1若しくは数個の塩基の欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入を含む塩基配列、又はその部分配列からなる核酸の量又は存在を測定する工程を含む、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）を特異的に検出する方法に関する。特に、該方法は、該核酸を増幅する工程を含み、増幅は等温核酸増幅法により行われるのが好ましいが、PCR法等の公知の核酸増幅法により行ってもよい。ここで、該部分配列は、例えば、配列番号1の配列の連続する少なくとも50塩基、60塩基、70塩基、80塩基、90塩基、又は100塩基を含む塩基配列、例えば配列番号1の1番目〜350番目の塩基配列、1番目〜300番目の塩基配列、1番目〜250番目の塩基配列、1番目〜200番目の塩基配列、好ましくは1番目〜150番目の塩基配列、特に好ましくは9番目〜127番目の塩基配列、又はこれらの配列において、1若しくは数個の塩基の欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入を含む塩基配列を含む、又はからなるものであってよい。
<Method>
In one aspect, the present invention relates to the deletion, substitution, addition, and / or deletion of one or several bases in the above target sequence, for example, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 The present invention also relates to a method for specifically detecting Klebsiella pneumoniae, which comprises the step of measuring the amount or presence of a nucleic acid consisting of a nucleotide sequence comprising an insertion, or a partial sequence thereof. In particular, the method includes the step of amplifying the nucleic acid, and the amplification is preferably performed by isothermal nucleic acid amplification, but may be performed by a known nucleic acid amplification method such as PCR. Here, the partial sequence is, for example, a base sequence including at least 50 contiguous bases, 60 bases, 70 bases, 80 bases, 90 bases, or 100 bases of the sequence of SEQ ID NO: 1, for example, 1st to 350th base sequence, 1st to 300th base sequence, 1st to 250th base sequence, 1st to 200th base sequence, preferably 1st to 150th base sequence, particularly preferably 9th to The 127th base sequence, or a base sequence including deletion, substitution, addition and / or insertion of one or several bases in these sequences may be included or consist of.
核酸の増幅を等温核酸増幅法により行う場合には、上記プライマーセットのいずれかを用いればよいが、核酸の増幅をPCR法等の公知の核酸増幅法で行う場合には、例えば以下のプライマーセット：
配列番号2の配列を含む、又はからなるプライマー、及び配列番号3の配列を含む、又はからなるプライマー；
配列番号10の配列を含む、又はからなるプライマー、及び配列番号3の配列を含む、又はからなるプライマー；
配列番号11の配列を含む、又はからなるプライマー、及び配列番号3の配列を含む、又はからなるプライマー；を使用することができる。
When amplification of nucleic acid is performed by isothermal nucleic acid amplification method, any of the above primer sets may be used, but when amplification of nucleic acid is performed by known nucleic acid amplification methods such as PCR method, for example, the following primer sets :
A primer comprising or consisting of the sequence of SEQ ID NO: 2 and a primer comprising or consisting of the sequence of SEQ ID NO: 3;
A primer comprising or consisting of the sequence of SEQ ID NO: 10, and a primer comprising or consisting of the sequence of SEQ ID NO: 3;
A primer comprising or consisting of the sequence of SEQ ID NO: 11 and a primer comprising or consisting of the sequence of SEQ ID NO: 3 can be used.
本発明の方法において使用するプライマーは、上記プライマーセットに限定されず、標的配列に基づいて、公知の方法に従って作製してもよい。
本発明の方法は、設計したプライマー、DNAポリメラーゼ、増幅しようとする標的遺伝子を含むサンプル、及びバッファーを混合する工程、並びに該混合物をインキュベーションする工程を含む。この方法により、遺伝子増幅反応が進行し、増幅産物を得ることができる。
The primers used in the method of the present invention are not limited to the above primer set, and may be prepared according to known methods based on the target sequence.
The method of the invention comprises the steps of mixing the designed primers, the DNA polymerase, the sample containing the target gene to be amplified, and the buffer, and incubating the mixture. By this method, a gene amplification reaction can proceed to obtain an amplification product.
核酸増幅法に用いる酵素としては、例えば、Aac Polymerase、Bst DNAポリメラーゼ（ラージフラグメント)、Bca(exo-)DNAポリメラーゼ、大腸菌DNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Vent(Exo-)DNAポリメラーゼ（Vent DNAポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、DeepVent(Exo-)DNAポリメラーゼ（DeepVent DNAポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、KOD DNAポリメラーゼ等の鎖置換型DNAポリメラーゼ等が挙げられる。 Examples of enzymes used for nucleic acid amplification include Aac Polymerase, Bst DNA polymerase (large fragment), Bca (exo-) DNA polymerase, Klenow fragment of E. coli DNA polymerase I, Vent (Exo-) DNA polymerase (Vent DNA polymerase) And exoV activity), DeepVent (Exo-) DNA polymerase (deepVent DNA polymerase from which exonuclease activity is removed), and strand displacement DNA polymerases such as KOD DNA polymerase.
本発明における「サンプル」としては、例えば単離されたDNAを含む懸濁液、又は単離されていないDNAを含む懸濁液、例えば菌体を含む懸濁液が挙げられる。また、本発明におけるサンプルは、ヒト、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ等の哺乳動物の体液（例えば乳汁、唾液、血液、糞便等）又は組織（例えば、乳房近傍の皮膚組織等）等の生体由来サンプルであってよい。また、本発明におけるサンプルは、食品及び乳業の加工機器、装置、器具、及び用具等から採取してもよい。サンプルは、必要に応じて増幅の前に分離及び／又は濃縮等の前処理を行うことができる。 The "sample" in the present invention includes, for example, a suspension containing isolated DNA or a suspension containing non-isolated DNA, for example, a suspension containing cells. Further, the sample in the present invention is derived from a living body such as body fluid (eg, milk, saliva, blood, feces etc.) or tissue (eg, skin tissue near the breast etc.) of mammals such as humans, cattle, goats, sheep and pigs It may be a sample. Moreover, the sample in the present invention may be collected from food and dairy processing equipment, devices, instruments, tools and the like. The sample can be subjected to pretreatment such as separation and / or concentration prior to amplification, if necessary.
核酸増幅法に用いられ得るバッファーとして、例えばトリス塩酸バッファー、リン酸ナトリウムバッファー、リン酸カリウムバッファー等のバッファーが挙げられる。これらのバッファーには、必要に応じて、塩化マグネシウム等の塩やdNTPs等の基質を加えても良い。本発明の等温核酸増幅法に用い得るバッファーの具体例として、例えばDnaform社のReaction bufferが挙げられる。 Examples of the buffer that can be used for the nucleic acid amplification method include buffers such as Tris-HCl buffer, sodium phosphate buffer, potassium phosphate buffer and the like. If necessary, a salt such as magnesium chloride or a substrate such as dNTPs may be added to these buffers. Specific examples of the buffer that can be used for the isothermal nucleic acid amplification method of the present invention include, for example, Reaction buffer of Dnaform.
上記インキュベーション工程は、プライマーのアニーリング温度等を考慮して適宜定めることができる。例えば、等温増幅の場合には、使用する酵素の活性を維持できる温度により保つことで実施することができ、温度は、用いるプライマーの融解温度（Tm）又はそれ以下にすることが好ましい。等温増幅法におけるインキュベーション温度として、例えば40℃〜75℃、好ましくは50℃〜72℃、特に55℃〜70℃が挙げられ、インキュベート時間として、増幅産物の量又は存在を測定可能であれば特に限定しないが、例えば15分〜120分、好ましくは30〜90分が挙げられる。 The above-mentioned incubation step can be appropriately determined in consideration of the annealing temperature of the primer and the like. For example, in the case of isothermal amplification, this can be carried out by maintaining the temperature at which the activity of the enzyme used can be maintained, and the temperature is preferably set to the melting temperature (Tm) of the primer used or lower. The incubation temperature in the isothermal amplification method includes, for example, 40 ° C. to 75 ° C., preferably 50 ° C. to 72 ° C., particularly 55 ° C. to 70 ° C. Although it does not limit, for example, 15 minutes-120 minutes, Preferably 30-90 minutes are mentioned.
一態様において、本発明は、本発明のプライマーセットを用いて核酸増幅法、特に等温核酸増幅法によりサンプル由来の核酸を増幅する工程、及び増幅産物の量又は存在を測定する工程を含む、K.pneumoniaeの検出方法に関する。 In one aspect, the invention comprises the steps of amplifying nucleic acid from a sample by a nucleic acid amplification method, in particular an isothermal nucleic acid amplification method, using a primer set of the invention, and measuring the amount or presence of an amplification product. It relates to a method of detecting .pneumoniae.
本発明において、増幅産物の量又は存在を測定する工程は特に限定しない。本発明において、増幅産物の量を測定するとは、増幅産物の量を定量的に評価することを意味し、増幅産物の存在を測定するとは、増幅産物の有無を定性的に評価することを意味する。増幅産物の量又は存在の測定は、例えば増幅された遺伝子配列を特異的に認識する標識オリゴヌクレオチドを用いて行うことができ、さらに増幅反応終了後の反応液をそのまま電気泳動（例えば、アガロース電気泳動、及びポリアクリルアミドゲル電気泳動等）して増幅産物の有無の確認により行うことができる。また、反応液中にあらかじめ二本鎖核酸の分子内に特異的に取り込まれるインターカレーターであるエチジウムブロマイドやSYBR Green（Molecular Probes 社製）等を添加することによっても増幅を検出することが可能である（特開2001-242169）。また、伸長反応の際、副産物としてピロリン酸が生成され、反応液中のマグネシウムイオンと結合し、ピロリン酸マグネシウムの白濁・沈殿が生じるため、これを指標として肉眼又は吸光度計で検出することもできる。さらに、増幅された遺伝子配列を、該配列に特異的にハイブリダイズするヌクレオチドを固相化したDNAマイクロアレイやDNAチップを用いて検出することも可能である。また、特開2013-247968に記載の核酸目視検出法によって増幅した核酸を染色することによって検出することも可能である。 In the present invention, the step of measuring the amount or the presence of the amplification product is not particularly limited. In the present invention, measuring the amount of amplification product means quantitatively evaluating the amount of amplification product, and measuring the presence of amplification product means qualitatively evaluating the presence or absence of amplification product. Do. The measurement of the amount or the presence of the amplification product can be performed, for example, using a labeled oligonucleotide that specifically recognizes the amplified gene sequence, and the reaction solution after the amplification reaction is directly subjected to electrophoresis (for example, agarose electrophoresis) It can carry out by confirming the presence or absence of the amplification product by electrophoresis, and polyacrylamide gel electrophoresis etc.). Alternatively, amplification can be detected by adding ethidium bromide, SYBR Green (manufactured by Molecular Probes), or the like, which is an intercalator which is specifically incorporated into the double-stranded nucleic acid molecule in advance, into the reaction solution. (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-242169). In addition, during the extension reaction, pyrophosphate is produced as a by-product, and combines with magnesium ions in the reaction solution to cause cloudiness and precipitation of magnesium pyrophosphate, so it can be detected with the naked eye or an absorbance meter as an indicator . Furthermore, it is also possible to detect the amplified gene sequence using a DNA microarray or a DNA chip in which nucleotides that specifically hybridize to the sequence are immobilized. Moreover, it is also possible to detect by staining the nucleic acid amplified by the nucleic acid visual detection method described in JP-A-2013-247968.
本発明の方法によって、K.pneumoniaeを特異的に検出することが可能となり、K.pneumoniaeは乳房炎の原因ともなるため、本発明の方法により簡便かつ迅速に乳房炎の罹患又は罹患リスクの有無を判定することもできる。 The method of the present invention makes it possible to specifically detect K.pneumoniae, and K.pneumoniae also becomes a cause of mastitis. Can also be determined.
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be specifically described by way of the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
＜実施例1：プライマーの設計＞
高い特異性を有するプライマーを取得するため、本発明者らは、まずK. pneumoniaeのhemolysin遺伝子と、K. pneumoniaeの近縁種（14種）のhemolysin遺伝子の塩基配列を、Genetyx（株式会社ゼネティックス）を用いて比較した。比較を行った生物種と、そのhemolysinの配列のAccession numberを以下の表3に示す。
Example 1: Design of Primers
In order to obtain primers with high specificity, the present inventors first prepared the nucleotide sequences of the K. pneumoniae's hemolysin gene and the K. pneumoniae's related species (14 species) of the hemolysin gene as Genetyx (Genetics Co., Ltd. ) Were compared. The accession number of the species to which the comparison was made and the sequence of its hemolysin are shown in Table 3 below.
その結果、K. pneumoniaeのみに特異的な塩基配列として、配列番号1の配列を見出した。次に、この塩基配列から以下の表5に記載する各プライマーを、Genetyx（株式会社ゼネティックス）を用いて設計した。 As a result, the sequence of SEQ ID NO: 1 was found as a nucleotide sequence specific to K. pneumoniae only. Next, based on this nucleotide sequence, each primer described in Table 5 below was designed using Genetyx (Genetics, Inc.).
＜実施例2：精製DNAを検体とした等温核酸増幅反応＞
以下の方法に従って、設計した各プライマーにより、K. pneumoniae由来精製DNAを等温核酸増幅が可能か、リアルタイム蛍光測定法により評価した。
１）試料
K. pneumoniae(ATCC 13883)培養液から、QIAamp DNA Mini Kit（QIAGEN社）を用いて、添付の取り扱い説明書に従ってDNAを精製し、精製DNAを鋳型として等温核酸増幅反応を実施した。
Example 2 Isothermal Nucleic Acid Amplification Reaction Using Purified DNA as a Sample
According to the following method, K. pneumoniae-derived purified DNA was evaluated by real-time fluorescence measurement whether or not isothermal nucleic acid amplification was possible with each of the designed primers.
1) Sample
From the culture solution of K. pneumoniae (ATCC 13883), DNA was purified according to the attached instruction manual using QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN), and the isothermal nucleic acid amplification reaction was carried out using the purified DNA as a template.
２）反応溶液組成及び反応条件
以下の表4に示す反応溶液25 μL中に、各50 μMに調製したプライマーをTP（Turn back Primer）、FP（Folding Primer）、FIP（Foward Inner Primer）、BIP（Back Inner Primer）の場合は1.6 μL、BP（Boost Primer）、LP（Loop Primer）の場合は0.8 μL、OF（Outer Foward primer）、OR（Outer Reverse Primer）、F3プライマー、及びB3プライマーの場合は0.1 μL添加した。
2) Reaction solution composition and reaction conditions In 25 μL of the reaction solution shown in Table 4 below, the primers prepared to 50 μM each were TP (Turn back Primer), FP (Folding Primer), FIP (Foward Inner Primer), BIP 1.6 μL (Back Inner Primer), BP (Boost Primer), LP (Loop Primer) 0.8 μL, OF (Outer Forward primer), OR (Outer Reverse Primer), F3 primer, and B3 primer Was added in an amount of 0.1 μL.
増幅反応は、リアルタイム蛍光測定装置LightCyclerR 96システム（Roche）を用い、60℃、70分間にて実施し、SYBR Greenの蛍光を経時的にモニタリングすることにより解析した。 The amplification reaction was performed at 60 ° C. for 70 minutes using a real-time fluorescence measurement device LightCycler® 96 system (Roche) and analyzed by monitoring the fluorescence of SYBR Green over time.
３）プライマー
以下の表5に示すプライマーを用いた。本実施例で用いた各プライマーは、以下の表5に示す配列のみからなる。例えば、組合せ1において、TPは5'末端側のターンバック部及び3'末端側のアニール部からなり、ターンバック部は配列番号12からなり、アニール部は配列番号2からなる。同様に、組合せ1において、FPは5'末端側のフォールディング部及び3'末端側のアニール部からなり、フォールディング部は配列番号8からなり、アニール部は配列番号3からなる。同様に、組合せ1において、BPは配列番号4からなる。表5に示す他の組合せ2〜18についても同様である。
3) Primer The primers shown in Table 5 below were used. Each primer used in this example consists only of the sequences shown in Table 5 below. For example, in the combination 1, TP comprises a turnback portion at the 5 'end and an annealing portion at the 3' end, the turnback portion comprises SEQ ID NO: 12 and the annealing portion comprises SEQ ID NO: 2. Similarly, in the combination 1, FP comprises a 5 'end side folding portion and a 3' end side annealing portion, the folding portion comprises SEQ ID NO: 8 and the annealing portion comprises SEQ ID NO: 3. Similarly, in combination 1, BP consists of SEQ ID NO: 4. The same applies to the other combinations 2 to 18 shown in Table 5.
４）結果
表5に示したように、プライマー組合せ1〜17にて60℃において、60分以内で増幅反応が確認された。SmartAmp法による増幅反応においては、プライマーとしてTP及びFPのみを用いた場合には増幅が検出されなかったが（比較例1、組合せ18）、TP及びFPに加えてBP、OF、及びORのいずれか1種以上があれば、増幅反応が生じることを確認した（組合せ1〜17）。また、5種全てのプライマーを使用した場合、速い増幅反応が確認された（例えば、組合せ4〜8及び10等）。
4) Results As shown in Table 5, amplification reactions were confirmed within 60 minutes at 60 ° C. with primer combinations 1-17. In the amplification reaction by SmartAmp method, no amplification was detected when only TP and FP were used as primers (Comparative Example 1, Combination 18), but any of BP, OF, and OR in addition to TP and FP If one or more were present, it was confirmed that an amplification reaction occurred (combinations 1 to 17). Also, when all five primers were used, fast amplification reactions were observed (e.g. combinations 4-8 and 10 etc).
＜実施例３：検出感度の確認＞
以下の方法に従って、設計したプライマーの検出感度を評価した。
１）試料
実施例1と同様の方法により精製したK. pneumoniae (ATCC 13883)精製DNAを段階的に希釈し、鋳型として増幅反応を実施した。
すなわち、K. pneumoniaeのゲノムDNAが約6fg/copyであることを考慮して、実施例1の方法で得られた精製DNA溶液（60ng/μl）を段階的に（10倍ずつ）希釈し、各鋳型DNA濃度（100〜104copy/μL）となるように調製を行った。
Example 3 Confirmation of Detection Sensitivity
The detection sensitivity of the designed primers was evaluated according to the following method.
1) Sample The purified DNA of K. pneumoniae (ATCC 13883) purified by the same method as in Example 1 was serially diluted, and an amplification reaction was performed as a template.
That is, taking into consideration that the genomic DNA of K. pneumoniae is about 6 fg / copy, the purified DNA solution (60 ng / μl) obtained by the method of Example 1 is diluted stepwise (10-fold each), Preparation was performed so as to obtain each template DNA concentration (10 0 to 10 4 copies / μL).
２）反応溶液組成及び反応条件
表5に記載した、組合せ4のプライマーセット（TP(ターンバック部：配列番号12、アニール部：配列番号2)、FP(フォールディング部：配列番号8、アニール部：配列番号3)、BP(配列番号4)、OF(配列番号5)、OR(配列番号6)）を用いて増幅反応を実施した。反応溶液の組成及び増幅反応の条件は、実施例2に従った。
増幅反応は、ブロックインキュベータMiniT100H（Hangzhou Allsheng Instruments）を用い、60℃、60分間にて実施した。増幅の評価は、特開2013-247968に記載の核酸目視検出法に従って、反応後の溶液に1 μLの核酸検出試薬（0.1%ゲンチアナバイオレットB／2.0%亜硫酸ナトリウム／1.2%βシクロデキストリン／40%エタノール）を加え、溶液の色調変化から核酸増幅の有無を解析することにより行った。
2) Reaction solution composition and reaction conditions The primer set of combination 4 described in Table 5 (TP (turnback part: SEQ ID NO: 12, annealing part: SEQ ID NO: 2), FP (folding part: SEQ ID NO: 8), annealing part: The amplification reaction was performed using SEQ ID NO: 3), BP (SEQ ID NO: 4), OF (SEQ ID NO: 5), OR (SEQ ID NO: 6)). The composition of the reaction solution and the conditions for the amplification reaction were in accordance with Example 2.
The amplification reaction was carried out at 60 ° C. for 60 minutes using a block incubator MiniT100H (Hangzhou Allsheng Instruments). For evaluation of amplification, 1 μL of a nucleic acid detection reagent (0.1% gentian violet B / 2.0% sodium sulfite / 1.2% beta cyclodextrin / 40%) in the solution after reaction according to the nucleic acid visual detection method described in JP-A-2013-247968 Ethanol was added to analyze the presence or absence of nucleic acid amplification from the color tone change of the solution.
３）結果
プライマー組合せ4にて等温下60分以内で、102 copy相当以上の鋳型DNAが含まれる反応液で増幅反応が生じたことを示す青色を呈した（図2、D）。また、増幅反応前の溶液（データ示さず）及び鋳型DNAを含まない反応溶液（図2、A）においては、色調変化は確認されなかった。以上より、設計したプライマーセットを用いれば、特別な解析装置や煩雑な菌体前処理を必要とせずに、102 copy相当のK. pneumoniaeに由来するDNAを検出することができることが明らかとなった。
3) Results The primer combination 4 exhibited a blue color indicating that the amplification reaction occurred in the reaction solution containing 10 2 copies or more of the template DNA within 60 minutes under the isothermal condition (FIG. 2, D). In addition, no color tone change was confirmed in the solution before the amplification reaction (data not shown) and the reaction solution containing no template DNA (FIG. 2, A). From the above, it becomes clear that DNA derived from K. pneumoniae equivalent to 10 2 copies can be detected without the need of a special analyzer or complicated cell pretreatment, using the designed primer set. The
＜実施例４：菌体懸濁液を検体とした等温核酸増幅反応＞
K. pneumoniae菌体懸濁液から直接核酸を増幅することが可能であるか、また、その増幅が菌種に特異的なものであるか検討した。
１）試料
ヒツジ血液寒天培地にて37℃、24時間培養したK. pneumoniae(ATCC 13883)、Klebsiella oxytoca、Escherichia coli、Enterobacter cloacae、Citrobacter spp.、及びSeratia marcescensのコロニーを10 μLの蒸留水に懸濁し、懸濁液1μLを鋳型として増幅反応を実施した。対照として、菌体懸濁液を含まない反応溶液も作成した。
<Example 4: Isothermal nucleic acid amplification reaction using bacterial cell suspension as a sample>
It was examined whether it was possible to amplify the nucleic acid directly from the K. pneumoniae cell suspension and whether the amplification was specific to the bacterial species.
1) Sample K. pneumoniae (ATCC 13883), Klebsiella oxytoca, Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Citrobacter spp., And seratia marcescens colonies cultured in sheep blood agar for 24 hours at 37 ° C were suspended in 10 μL of distilled water The amplification reaction was performed using 1 μL of the suspension as a template. As a control, a reaction solution containing no cell suspension was also prepared.
２）反応溶液組成及び反応条件
表5に記載した、組合せ4のプライマーセット（TP(ターンバック部：配列番号12、アニール部：配列番号2)、FP(フォールディング部：配列番号8、アニール部：配列番号3)、BP(配列番号4)、OF(配列番号5)、OR(配列番号6)）を用いて増幅反応を実施した。以下の表6に示す反応溶液25 μL中に、各50 μMに調製したプライマーをTP、FPは1.6 μL、BPは0.8 μL、OF、ORは0.1 μL添加した。
2) Reaction solution composition and reaction conditions The primer set of combination 4 described in Table 5 (TP (turnback part: SEQ ID NO: 12, annealing part: SEQ ID NO: 2), FP (folding part: SEQ ID NO: 8), annealing part: The amplification reaction was performed using SEQ ID NO: 3), BP (SEQ ID NO: 4), OF (SEQ ID NO: 5), OR (SEQ ID NO: 6)). In 25 μL of the reaction solution shown in Table 6 below, the primers prepared to 50 μM each were added with 1.6 μL of TP, FP, 0.8 μL of BP, and 0.1 μL of OF and OR.
増幅反応は、ブロックインキュベータMiniT100H（Hangzhou Allsheng Instruments）を用い、60℃、60分間にて実施した。増幅の評価は、特開2013-247968に記載の核酸目視検出法に従って、反応後の溶液に1 μLの核酸検出試薬（0.1%ゲンチアナバイオレットB／2.0%亜硫酸ナトリウム／1.2%βシクロデキストリン／40%エタノール）を加え、溶液の色調変化から核酸増幅の有無を解析することにより行った。 The amplification reaction was carried out at 60 ° C. for 60 minutes using a block incubator MiniT100H (Hangzhou Allsheng Instruments). For evaluation of amplification, 1 μL of a nucleic acid detection reagent (0.1% gentian violet B / 2.0% sodium sulfite / 1.2% beta cyclodextrin / 40%) in the solution after reaction according to the nucleic acid visual detection method described in JP-A-2013-247968 Ethanol was added to analyze the presence or absence of nucleic acid amplification from the color tone change of the solution.
３）結果
結果を以下の表7に示す。
上記プライマーセットにて増幅反応を行い、核酸検出試薬を添加したところ、K. pneumoniae菌体懸濁液を含むサンプルは、増幅反応が生じたことを示す青色を呈した（表7、A）。一方で、増幅反応前の溶液（データ示さず）及び菌体懸濁液を含まない反応溶液（表7、G）においては、色調変化は確認されなかった。以上より、本発明のプライマーセットを用いれば、特別な解析装置や煩雑な菌体前処理を必要とせずに、K. pneumoniaeを検出できることが明らかとなった。 The amplification reaction was carried out using the above primer set, and the nucleic acid detection reagent was added. The sample containing the K. pneumoniae cell suspension exhibited a blue color indicating that the amplification reaction had occurred (Table 7, A). On the other hand, no color tone change was confirmed in the solution before amplification reaction (data not shown) and the reaction solution not containing the cell suspension (Table 7, G). From the above, it became clear that K. pneumoniae can be detected using the primer set of the present invention without the need for a special analysis device or complicated cell pretreatment.
また、K. pneumoniae以外の菌体懸濁液を含むサンプルにおいても、色調変化は確認されなかった（表7、B〜F）。以上より、本発明のプライマーセットは、K. pneumoniaeの近縁種や、乳汁中に存在する可能性のある他の微生物と交差反応せずに、K. pneumoniaeを特異的に検出できることが明らかとなった。 Moreover, the color tone change was not confirmed also in the sample containing cell suspension other than K.pneumoniae (Table 7, BF). From the above, it is apparent that the primer set of the present invention can specifically detect K. pneumoniae without cross-reacting with K. pneumoniae related species or other microorganisms which may be present in milk. became.
本発明のプライマー及び方法により、K. pneumoniaeの簡便かつ迅速な検出及び同定が可能となる。 The primers and methods of the present invention allow simple and rapid detection and identification of K. pneumoniae.
Claims (6)
該セットが、標的配列である、配列番号1によって表される塩基配列、又は配列番号1によって表される塩基配列において1若しくは数個の塩基の欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入を含む塩基配列において、3’末端側から5’末端側に向かってF3c配列、F2c配列、F1c配列、R1配列、R2配列、及びR3配列を規定し、それぞれの相補的配列をF3配列、F2配列、F1配列、R1c配列、R2c配列、及びR3c配列としたときに、下記の（a）及び（b）のプライマーを含み、かつ、下記の（c）〜（e）のプライマーのいずれか一つ以上を含み：
（a）プライマーの3’末端側にF2配列を含み、5’末端側にF1c配列を含むプライマー；
（b）プライマーの3’末端側にR2配列を含み、5’末端側にR1c配列、又は相互にハイブリダイズする2つの核酸配列を同一鎖上に有する折り返し配列、を含むプライマー；
（c）前記標的配列におけるF2c配列の3'末端の塩基から、F1c配列の3'末端の3'末端側に隣接する塩基までの配列の部分配列である配列A又は配列Aに相補的な配列Bを含むプライマー及び／又は前記標的配列におけるR2配列の5'末端の塩基から、R1配列の5'末端の5'末端側に隣接する塩基までの配列の部分配列である配列C又は配列Cに相補的な配列Dを含むプライマー；
（d）F3配列を含むプライマー；
（e）R3配列を含むプライマー；かつ、
（a）のプライマーにおいて、F2配列が、配列番号2、10、若しくは11によって表される塩基配列、又は配列番号2、10、若しくは11によって表される塩基配列において1若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列であり、
（a）のプライマーにおいて、F1c配列が、配列番号12若しくは13によって表される塩基配列、又は配列番号12若しくは13によって表される塩基配列において1若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列であり、
（b）のプライマーにおいて、R2配列が、配列番号3によって表される塩基配列、又は配列番号3によって表される塩基配列において1若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列であり、
（b）のプライマーにおいて、折り返し配列が、配列番号8若しくは9によって表される塩基配列、又は配列番号8若しくは9によって表される塩基配列において1若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列であり、
（c）のプライマーが、配列番号4若しくは7によって表される塩基配列、又は配列番号4若しくは7によって表される塩基配列において1若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列を含み、
（d）のプライマーにおいて、F3配列が配列番号5によって表される塩基配列、又は配列番号5によって表される塩基配列において1若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列であり、
（e）のプライマーにおいて、R3配列が配列番号6によって表される塩基配列、又は配列番号6によって表される塩基配列において1若しくは2個の塩基が欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入された配列である、プライマーセット。 A primer set for detecting Klebsiella pneumoniae by isothermal nucleic acid amplification method, comprising:
The set includes a deletion, substitution, addition, and / or insertion of one or several bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 which is a target sequence In the base sequence, F3c sequence, F2c sequence, F1c sequence, R1 sequence, R2 sequence and R3 sequence are defined from the 3 'end to the 5' end side, and their complementary sequences are F3 sequence, F2 sequence, When the F1 sequence, the R1c sequence, the R2c sequence, and the R3c sequence are included, one or more of the following primers (a) and (b) are included, and any one or more of the following primers (c) to (e) the unrealized:
(A) a primer comprising an F2 sequence at the 3 'end of the primer and an F1c sequence at the 5'end;
(B) a primer comprising an R2 sequence at the 3 'end of the primer and an R1c sequence at the 5' end, or a folded sequence having two nucleic acid sequences hybridizing mutually on the same strand;
(C) A sequence complementary to the sequence A or the sequence A, which is a partial sequence of the sequence from the base at the 3 'end of the F2c sequence in the target sequence to the base adjacent to the 3' end of the 3 'end of the F1c sequence A sequence C or a sequence C which is a partial sequence of a sequence from the base at the 5 'end of the R2 sequence in the primer containing the B and / or the target sequence to the 5' end of the 5 'end of the R1 sequence A primer comprising the complementary sequence D;
(D) a primer comprising the F3 sequence;
(E) a primer comprising an R3 sequence ;
In the primer (a), one or two bases are missing in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, 10 or 11 or in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, 10 or 11 in the F2 sequence A deleted, substituted, added, and / or inserted sequence,
In the primer of (a), deletion or substitution, addition, or deletion of one or two bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 12 or 13 or the base sequence represented by SEQ ID NO: 12 or 13 in the F1c sequence And / or an inserted sequence,
In the primer of (b), deletion or substitution, addition, and / or insertion of one or two bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 in the R2 sequence Array, and
In the primer (b), the return sequence is the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 or 9, or one or two bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 or 9 are deleted, substituted, added, And / or an inserted sequence,
The primer of (c) has a deletion, substitution, addition, and / or insertion of one or two bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 7, or the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 7 Containing the sequence
In the primer of (d), one or two bases are deleted, substituted, added, and / or inserted in the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 or the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 in the F3 sequence Array, and
In the primer of (e), one or two bases are deleted, substituted, added, and / or inserted in the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 or the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 in the R3 sequence A primer set that is
以下の表の組合せ1〜17のいずれかのプライマーセットにおいて、表中の各組合せにおける1つ以上の塩基配列が、1若しくは2個の塩基の欠失、置換、付加、及び／若しくは挿入を含むプライマーセットである、請求項１に記載のプライマーセット。
In the primer set of any of the combinations 1 to 17 in the following table, one or more base sequences in each combination in the table include a deletion, substitution, addition, and / or insertion of one or two bases. The primer set according to claim 1, which is a primer set.
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