RU2636042C1

RU2636042C1 - Mouse hybridoma amacr, clone g8 - producer of monoclonal antibody having specificity to alpha-methylacyl-coenzyme racemase (amacr) of human

Info

Publication number: RU2636042C1
Application number: RU2016131198A
Authority: RU
Inventors: Дарья Викторовна Самойлова; Алексей Николаевич Грачев; Ольга Владимировна Ковалева; Мария Сергеевна Шитова
Original assignee: ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "ПраймБиоМед"
Priority date: 2016-07-28
Filing date: 2016-07-28
Publication date: 2017-11-17

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: invention relates to mouse hybridoma AMACR with the registration number of VKPM N-166, which is a producer of a monoclonal antibody detecting the human cytoplasmic alpha-methylacyl coenzyme A racemase AMACR in adenocarcinoma cells of the prostate and in cells of other organs containing this antigen.

EFFECT: invention allows to obtain efficiently antibodies specifically detecting alpha-methylacyl coenzyme A racemase of human immunocytochemistry, immunohistochemistry, immunoblotting, and immunofluorescence.

4 dwg, 3 ex

Description

Изобретение относится к биотехнологии, биологии и медицине и предназначено для выявления цитоплазматического белка человека альфа-метилацил-коэнзим А рацемазы AMACR, также известного как P504S, в неопластических клетках аденокарциномы простаты, ткани нормальной печени, клеточных линиях аденокарциномы простаты иммуноцитохимическим, иммуногистохимическим и иммунофлуоресцентным методами, а также методом иммуноблоттинга для научно-исследовательских и клинико-лабораторных целей.The invention relates to biotechnology, biology and medicine, and is intended to detect the human cytoplasmic protein alpha-methylacyl-coenzyme A of racemase AMACR, also known as P504S, in neoplastic cells of prostate adenocarcinoma, normal liver tissue, prostate adenocarcinoma cell lines, immunocytochemical, immuno-histochemical and immuno-histochemical methods as well as the method of immunoblotting for research and clinical and laboratory purposes.

На сегодняшний день антитела являются мощным инструментом для изучения фундаментальных вопросов, направленных на выяснение функций белков человека в норме и при патологиях.Today, antibodies are a powerful tool for studying fundamental issues aimed at elucidating the functions of human proteins in normal and pathological conditions.

Как известно, иммуноцитохимические методы анализа, с использованием антител к известным белкам-маркерам биоптата опухоли позволяют классифицировать тип новообразований и оценить степень злокачественности (М.А. Пальцев, Н.М. Аничков. Патологическая анатомия. - М.: Медицина, 2001). Иммуногистохимическая окраска моноклональными антителами высокоспецифичных клеточных белков в сочетании с иммунопероксидазным методом позволяет не только оценивать опухоли низкой степени дифференцировки, опухоли неизвестного происхождения, более точно различать опухоли различного тканевого происхождения (Клиническая онкология: учебное пособие / под ред. П.Г. Брюсова, П.Н. Зубаревой. - СПб.: СпецЛит, 2012. - 455 с.: ил.), но и позволяет выбрать соответствующие методы лечения. Антитела к белкам, служащим специфическими онкомаркерами клеток, повсеместно применяются для клинической оценки прогноза опухолевой прогрессии (Lea P., Ling М. "New molecular assays for cancer diagnosis and targeted therapy". Curr. Opin. Mol. Ther. 2008, 10: 251-259).As is known, immunocytochemical methods of analysis using antibodies to well-known protein markers of tumor biopsy make it possible to classify the type of neoplasms and evaluate the degree of malignancy (M. A. Paltsev, N. M. Anichkov. Pathological anatomy. - M .: Medicine, 2001). The immunohistochemical staining of highly specific cellular proteins with monoclonal antibodies in combination with the immunoperoxidase method allows not only to evaluate tumors of a low degree of differentiation, tumors of unknown origin, to more accurately distinguish tumors of different tissue origin (Clinical Oncology: study guide / edited by P.G. Bryusov, P. N. Zubareva. - St. Petersburg: SpetsLit, 2012. - 455 p.: Ill.), But also allows you to choose the appropriate treatment methods. Antibodies to proteins that serve as specific tumor markers of cells are widely used for the clinical assessment of the prognosis of tumor progression (Lea P., Ling M. "New molecular assays for cancer diagnosis and targeted therapy". Curr. Opin. Mol. Ther. 2008, 10: 251 -259).

AMACR (альфа-метилацил-КоА-рацемаза) рассматривается как онкомаркер с 2000 г., когда было выявлено повышение экспрессии данного гена в клетках аденокарциномы простаты при помощи ДНК-микроматриц по сравнению с нормальными эпителиальными клетками простаты и доброкачественной гиперплазией простаты (Xu J., Stolk J.A., Zhang X., Silva S.J., Houghton R.L., Matsumura M., Vedvick T.S., Leslie K.В., Badaro R., Reed S.G. Identification of differentially expressed genes in human prostate cancer using subtraction and microarray. Cancer Res., 60: 1677-1682, 2000; Luo J., Duggan D.J., Chen Y., Sauvageot J., Ewing С.M., Bittner M.L., Trent J.M., Isaacs W.B. Human prostate cancer and benign prostatic hyperplasia: molecular dissection by gene expression profiling. Cancer Res., 61:4683-4688, 2001).AMACR (alpha-methylacyl-CoA racemase) has been considered an oncomarker since 2000, when an increase in the expression of this gene in prostate adenocarcinoma cells using DNA microarrays was detected compared to normal prostate epithelial cells and benign prostatic hyperplasia (Xu J., Stolk JA, Zhang X., Silva SJ, Houghton RL, Matsumura M., Vedvick TS, Leslie K.V., Badaro R., Reed SG Identification of differentially expressed genes in human prostate cancer using subtraction and microarray. Cancer Res., 60: 1677-1682, 2000; Luo J., Duggan DJ, Chen Y., Sauvageot J., Ewing C. M., Bittner ML, Trent JM, Isaacs WB Human prostate cancer and benign prostatic hyperplasia: molecular dissection by gene expression profi ling. Cancer Res., 61: 4683-4688, 2001).

Повышенная экспрессия AMACR в аденокарциноме простаты была подтверждена и иммуногистохимическими методами (Jiang Z., Fanger G.R., Woda В.A. et al. Expression of alpha-methylacyl-CoA racemase (P504s) in various malignant neoplasms and normal tissues: a study of 761cases. Hum. Pathol. 2003; 34(8); 792-6). Большинство опухолевых клеток аденокарциномы простаты и метастазов простаты во многих случаях имели интенсивное положительное окрашивание AMACR. Положительно, но менее интенсивно AMACR выявлялся в клетках интраэпителиальной гиперплазии простаты высокой степени (HGPIN). В нормальных эпителиальных клетках простаты и доброкачественной гиперплазии простаты окрашивание AMACR было отрицательно или слабоположительно (Jun Luo, Shan Zha, Wesley R. Gage, Thomas A. Dunn, Jessica L. Hicks, Christina J. Bennett, Charles M. Ewing, Elizabeth A. Platz et. al. alpha-Methylacyl-CoA Racemase: A New Molecular Marker for Prostate Cancer. CANCER RESEARCH 62, 2220-2226, April 15, 2002).Increased AMACR expression in prostate adenocarcinoma was also confirmed by immunohistochemical methods (Jiang Z., Fanger GR, Woda B.A. et al. Expression of alpha-methylacyl-CoA racemase (P504s) in various malignant neoplasms and normal tissues: a study of 761cases Hum. Pathol. 2003; 34 (8); 792-6). Most tumor cells of prostate adenocarcinoma and prostate metastases in many cases had intense positive AMACR staining. Positively, but less intensely, AMACR was detected in high grade prostate intraepithelial hyperplasia (HGPIN) cells. In normal prostate epithelial cells and benign prostatic hyperplasia, AMACR staining was negative or weakly positive (Jun Luo, Shan Zha, Wesley R. Gage, Thomas A. Dunn, Jessica L. Hicks, Christina J. Bennett, Charles M. Ewing, Elizabeth A. Platz et al. Alpha-Methylacyl-CoA Racemase: A New Molecular Marker for Prostate Cancer. CANCER RESEARCH 62, 2220-2226, April 15, 2002).

Функционально рацемаза относится к ферментам, катализирующим переход ветвящихся жирных кислот из R в S-стереоизомеры, что, в свою очередь, усиливает связанные со свободными радикалами процессы, вызывающие повреждение ДНК клетки. Скорее всего это объясняет повышенный риск развития рака предстательной железы, особенно при высоком уровне поступления разветвленных жирных кислот с пищей (например, с молочными продуктами или говядиной) (Evans A.J. Alpha-methylacyl СоА racemase (P504S): overview and potential uses in diagnostic pathology as applied to prostate needle biopsies // J. Clin. Pathol. 2003. Vol. 56. P. 892-897). Выявление AMACR в физиологических жидкостях организма имеет существенные ограничения из-за его невысокой специфичности, так как данный маркер экспрессируется злокачественными новообразованиями и при других локализациях (например, молочной железы), а также некоторыми нормальными тканями (печень, почки) (Witkiewicz AK. Alpha-methylacyl-CoA racemase protein expression is associated with the degree of differentiation in breast cancer using quantitative image analysis. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2005; 14:1418-1423.; Jiang Z., Fanger G.R., Woda B.A. et al. Expression of alpha-methylacyl-CoA racemase (P504s) in various malignant neoplasms and normal tissues: a study of 761cases. Hum. Pathol. 2003; 34(8); 792-6). В то же время AMACR, как маркер, высокоэффективен при иммуногистохимическом исследовании и позволяет дифференцировать опухолевые клетки от других патологических процессов, а также более точно определить стадию заболевания, в том числе и по биопсийному материалу. (Nassar A., Amin М.В., Sexton D.G., Cohen С.Utility of alpha-methylacyl coen-zyme A racemase (p504s antibody) as a diagnostic immunohistochemical marker for cancer // Appl Immunohistochem Mol Morphol. 2005. Vol. 13. №3. P. 252-255., Rubin M.A., Bismar T.A., Andren O., Mucci L., Kim R., Shen R., Ghosh D., Wei J.T., Chinnaiyan A.M., Adami H.O., Kantoff P.W., Johansson J.E. Decreased alpha-methylacyl CoA racemase expression in localized prostate cancer is associated with an increased rate of biochemical recurrence and cancer-specific death // Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2005. Vol. 14. №6. P. 1424-1432.). Этот маркер считается позитивным в 80-100% случаев малых очагов рака. Также белок AMACR оказался высокочувствительным и высокоспецифичным маркером не только клеток аденокарциномы, но и предшествующих ей изменений - простатической интраэпителиальной неоплазии (PIN) высокой степени. У человека AMACR локализован в двух клеточных компартментах: в пероксисомах (активность выше) и в митохондриях. (Ferdinandusse S., Denis S., Ijlst L., Dacremont G., Waterham H.R., Wanders R.J. Subcellular localization and physiological role of α-methylacyl-CoA racemase. J. Lipid Res., 41: 1890-1896, 2000). Поэтому этот маркер можно использовать в комбинации с другими иммуногистохимическими маркерами. Например, использование совместно с маркерами базальных клеток эпителия простаты (34βЕ12, р6З) позволит улучшить морфологическую диагностику рака простаты, особенно по материалам игольных биопсий, являющихся в настоящее время основным средством выявления этой патологии (Boran С, et al. Reliability of the 34betaE12, keratin 5/6, p63, bcl-2, and AMACR in the diagnosis of prostate carcinoma. Urologic oncology. 2011; 29(6):614-23). В частности, такой комбинированный подход дает возможность идентифицировать онкологическую сущность таких неопределенных изменений, как атипическая мелкоацинарная пролиферация, и дифференцировать резидуальные клетки аденокарциномы от атипизма клеток доброкачественных желез, обусловленного облучением предстательной железы для лечения рака. Антитела к белку AMACR также широко используются и для решения многих фундаментальных проблем, связанных с выяснением механизмов возникновения и прогрессии рака простаты (Evans AJ. Alpha-methylacyl СоА racemase (P504S): overview and potential uses in diagnostic pathology as applied to prostate needle biopsies. J Clin Pathol. 2003; 56:892-897).Functionally, racemase refers to enzymes that catalyze the transition of branching fatty acids from R to S stereoisomers, which, in turn, enhances the processes associated with free radicals that cause damage to cell DNA. Most likely, this explains the increased risk of developing prostate cancer, especially with a high intake of branched fatty acids from food (for example, dairy products or beef) (Evans AJ Alpha-methylacyl CoA racemase (P504S): overview and potential uses in diagnostic pathology as applied to prostate needle biopsies // J. Clin. Pathol. 2003. Vol. 56. P. 892-897). The detection of AMACR in physiological body fluids has significant limitations due to its low specificity, since this marker is expressed by malignant neoplasms at other locations (for example, the mammary gland), as well as some normal tissues (liver, kidneys) (Witkiewicz AK. Alpha- methylacyl-CoA racemase protein expression is associated with the degree of differentiation in breast cancer using quantitative image analysis. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2005; 14: 1418-1423 .; Jiang Z., Fanger GR, Woda BA et al. Expression of alpha -methylacyl-CoA racemase (P504s) in various malignant neoplasms and normal tissues: a study of 761cases. Hum. Pathol. 2003; 34 (8); 792-6). At the same time, AMACR, as a marker, is highly effective in immunohistochemical studies and allows us to differentiate tumor cells from other pathological processes, as well as more accurately determine the stage of the disease, including biopsy material. (Nassar A., Amin M.V., Sexton DG, Cohen C. Utility of alpha-methylacyl coenzyme A racemase (p504s antibody) as a diagnostic immunohistochemical marker for cancer // Appl Immunohistochem Mol Morphol. 2005. Vol. 13 No. 3. P. 252-255., Rubin MA, Bismar TA, Andren O., Mucci L., Kim R., Shen R., Ghosh D., Wei JT, Chinnaiyan AM, Adami HO, Kantoff PW, Johansson JE Decreased alpha-methylacyl CoA racemase expression in localized prostate cancer is associated with an increased rate of biochemical recurrence and cancer-specific death // Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2005. Vol. 14. No. 6. P. 1424-1432.). This marker is considered positive in 80-100% of cases of small foci of cancer. Also, AMACR protein turned out to be a highly sensitive and highly specific marker not only of adenocarcinoma cells, but also of the changes preceding it - high-grade prostatic intraepithelial neoplasia (PIN). In humans, AMACR is localized in two cell compartments: in peroxisomes (higher activity) and in mitochondria. (Ferdinandusse S., Denis S., Ijlst L., Dacremont G., Waterham H.R., Wanders R.J. Subcellular localization and physiological role of α-methylacyl-CoA racemase. J. Lipid Res., 41: 1890-1896, 2000). Therefore, this marker can be used in combination with other immunohistochemical markers. For example, the use together with markers of basal cells of the prostate epithelium (34βE12, p6Z) will improve the morphological diagnosis of prostate cancer, especially based on needle biopsies, which are currently the main means of detecting this pathology (Boran C, et al. Reliability of the 34betaE12, keratin 5/6, p63, bcl-2, and AMACR in the diagnosis of prostate carcinoma. Urologic oncology. 2011; 29 (6): 614-23). In particular, such a combined approach makes it possible to identify the oncological nature of such undefined changes as atypical small acinar proliferation and to differentiate residual adenocarcinoma cells from atypism of benign gland cells due to irradiation of the prostate gland for cancer treatment. Antibodies to the AMACR protein are also widely used to solve many fundamental problems related to elucidating the mechanisms of occurrence and progression of prostate cancer (Evans AJ. Alpha-methylacyl CoA racemase (P504S): overview and potential uses in diagnostic pathology as applied to prostate needle biopsies. J Clin Pathol. 2003; 56: 892-897).

Для выявления белка AMACR у человека на сегодняшний день существует несколько доступных коммерческих как поликлональных, так и моноклональных антител. Известные мышиные гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к цитоплазматическому антигену эпителиальных клеток простаты человека AMACR, были получены при иммунизации мышей полноразмерным рекомбинантным белком AMACR человека (коммерчески доступные клоны 13Н4, 1D8, OTI2A11, 2Н9В5, 5F10, 2А10); различными рекомбинантными полипептидными участками белка AMACR человека (коммерчески доступные клоны 2A10F3).To detect the AMACR protein in humans, there are currently several commercial polyclonal and monoclonal antibodies available. Known murine hybridomas producing monoclonal antibodies to the cytoplasmic antigen of human prostate epithelial cells AMACR were obtained by immunizing mice with full-length recombinant human AMACR protein (commercially available clones 13H4, 1D8, OTI2A11, 2H9B5, 5F10, 2A10); various recombinant polypeptide regions of the human AMACR protein (commercially available clones 2A10F3).

К недостаткам описанных клонов относятся дороговизна моноклональных антител, продуцируемых данными гибридомами, ввиду их зарубежного происхождения, а также отсутствие для некоторых из них данных о тестировании в реакциях иммуногистохимии, иммунофлуоресценции, использующихся в ежедневной клинико-диагностической практике, а также иммуноблоттинге.The disadvantages of the described clones include the high cost of monoclonal antibodies produced by these hybridomas, due to their foreign origin, as well as the lack of data for some of them on testing in immunohistochemistry, immunofluorescence reactions used in daily clinical diagnostic practice, as well as immunoblotting.

Задачей изобретения является расширение ассортимента моноклональных антител, обладающих специфичностью к белку AMACR человека, использующихся для иммунодиагностики и прогностической оценки течения рака простаты у человека.The objective of the invention is to expand the range of monoclonal antibodies with specificity for the human AMACR protein, used for immunodiagnosis and prognostic assessment of the course of prostate cancer in humans.

Поставленная задача решается за счет мышиной гибридомы AMACR, клон G8 - продуцента моноклонального антитела, выявляющего альфа-метилацил-коэнзим А рацемазу AMACR методами иммуноцитохимии, иммуногистохимии, иммунофлуоресценции и иммуноблоттинга, полученной путем иммунизации мышей линии Balb/c синтетическим пептидом, и слиянием сенсибилизированных лимфоцитов иммунизированных мышей с клетками мышиной миеломы линии sp2/0 с помощью полиэтиленгликоля с молекулярной массой 4000.The problem is solved by the mouse hybridoma AMACR, clone G8 is a producer of a monoclonal antibody that detects alpha-methylacyl-coenzyme A racemase AMACR by immunocytochemistry, immunohistochemistry, immunofluorescence and immunoblotting obtained by immunization of mice with immunobacteriosis and Balb / mice with murine myeloma cells of the sp2 / 0 line using polyethylene glycol with a molecular weight of 4000.

Продуцируемые гибридомой G8 моноклональные антитела к белку AMACR человека обладают селективной способностью связывать белок AMACR человека на иммуноблотах (Фиг. 4), на клеточном (Фиг. 2, Фиг. 3) и тканевом уровнях (на парафиновых срезах) (Фиг. 1), и расширяют существующий доступный ассортимент моноклональных антител к белку AMACR. Также следует отметить, что каждая вновь полученная гибридома уникальна. Моноклональные антитела, продуцируемые разными гибридомами, различаются по своей первичной структуре, по специфичности к различным антигенным детерминантам, аффинности и другим свойствам. Поэтому получение как можно большего количества моноклональных антител к белку AMACR человека важно с научной и практической точки зрения.Monoclonal antibodies produced by G8 hybridoma against human AMACR protein have the selective ability to bind human AMACR protein on immunoblots (Fig. 4), at the cellular (Fig. 2, Fig. 3) and tissue levels (on paraffin sections) (Fig. 1), and extend the existing available assortment of monoclonal antibodies to the AMACR protein. It should also be noted that each newly obtained hybridoma is unique. Monoclonal antibodies produced by different hybridomas differ in their primary structure, in specificity for various antigenic determinants, affinity, and other properties. Therefore, obtaining as many monoclonal antibodies to the human AMACR protein as possible is important from a scientific and practical point of view.

Технический результат изобретения заключается в получении линии гибридных культивируемых клеток мыши G8, продуцирующей доступные для отечественных клинико-диагностических лабораторий моноклональные антитела к цитоплазматическому антигену AMACR человека для иммуноцитохимии, иммуногистохимии, иммуноблотирования и иммунофлуоресценции, позволяющие использоваться для диагностики рака простаты.The technical result of the invention is to obtain a line of hybrid cultured mouse G8 cells producing monoclonal antibodies accessible to domestic clinical diagnostic laboratories to the human AMACR cytoplasmic antigen for immunocytochemistry, immunohistochemistry, immunoblotting and immunofluorescence, which can be used to diagnose prostate cancer.

Мышиную гибридому AMACR G8 получали следующим образом:The AMACR G8 mouse hybridoma was prepared as follows:

Пептид конъюгировали с рекомбинантным шаперонным белком hsp70 из M. tuberculosis, используя глютаровый альдегид. Конъюгат диализовали против фосфатно-солевого буфера рН7,2 (PBS). Далее проводили иммунизацию мышей линии Balb/c, самок с массой тела 16-18 граммов. Раствор конъюгата AMACR-hsp70 в PBS эмульгировали с равными объемами полного адъюванта Фройнда до получения устойчивой эмульсии и вводили в подушечки задних лап мышей из расчета 50 мкг конъюгата на мышь. Иммунизацию повторяли теми же дозами антигена, используя неполный адъювант Фройнда.The peptide was conjugated to the recombinant hsp70 chaperone protein from M. tuberculosis using glutaraldehyde. The conjugate was dialyzed against phosphate buffered saline pH 7.2 (PBS). Next, immunization was performed on Balb / c mice, females weighing 16-18 grams. A solution of AMACR-hsp70 conjugate in PBS was emulsified with equal volumes of complete Freund's adjuvant to obtain a stable emulsion and introduced into the pads of the hind legs of mice at the rate of 50 μg of conjugate per mouse. Immunization was repeated with the same doses of antigen using Freund's incomplete adjuvant.

Сыворотки мышей тестировали при помощи непрямого иммуноферментного анализа по следующей схеме: пептид сорбировали в PBS в концентрации 5 мкг/мл в течение 12 ч. Сыворотки титровали в PBS-AT (PBS-0,2% альбумин-0,05% Tween20), начиная с разведения 1:500 с шагом 2. В качестве контроля брали сыворотку неиммунной мыши.Mouse sera were tested by indirect enzyme-linked immunosorbent assay according to the following scheme: the peptide was sorbed in PBS at a concentration of 5 μg / ml for 12 hours. The sera were titrated in PBS-AT (PBS-0.2% albumin-0.05% Tween20), starting with a dilution of 1: 500 in step 2. As a control, serum of an non-immune mouse was taken.

Иммунные лимфоциты получали из подколенных лимфоузлов мышей. Гибридизовали с клетками мышиной миеломы линии sp2/0 по стандартной методике с использованием ПЭГ 4000. Клетки высевали в 96-луночные культуральные планшеты в полной ростовой среде с HAT. Для приготовления среды брали сухую среду DMEM (HyClone), разводили в деионизованной воде в концентрациях, рекомендованных производителем, фильтровали через бактериальный фильтр 0,22 мкм. Добавляли телячью сыворотку до концентрации 4%, глутамин, гентамицин, пируват натрия, HAT. На 4-5 день наблюдали рост гибридомных клонов. Супернатанты гибридом тестировали на 7-ой день после гибридизации по схеме, описанной для сывороток. Супернатанты разводили 1:1 в PBS-AT.Immune lymphocytes were obtained from popliteal lymph nodes of mice. Hybridized with sp2 / 0 mouse murine myeloma cells according to standard procedures using PEG 4000. Cells were seeded in 96-well culture plates in complete growth medium with HAT. To prepare the medium, dry DMEM medium (HyClone) was taken, diluted in deionized water at the concentrations recommended by the manufacturer, filtered through a 0.22 μm bacterial filter. Calf serum was added to a concentration of 4%, glutamine, gentamicin, sodium pyruvate, HAT. On day 4-5, hybridoma clone growth was observed. Hybridoma supernatants were tested on the 7th day after hybridization according to the scheme described for sera. Supernatants were diluted 1: 1 in PBS-AT.

Позитивные клоны были клонированы 2-4 раза методом предельных разведений до получения стабильных продуцентов антител. Были определены субклассы антител иммуноферментным анализом при помощи коммерческих наборов. Клетки наращивали в полной среде и внутрибрюшинно вводили мышам линии Balb/c, предварительно праймированных минеральным маслом. Рост асцитных опухолей наблюдали на 8-12 дни после ввода клеток. Асцитные жидкости тестировали по той же схеме, что и для сывороток.Positive clones were cloned 2-4 times by the method of limiting dilutions to obtain stable producers of antibodies. Subclasses of antibodies were determined by enzyme immunoassay using commercial kits. Cells were grown in complete medium and intraperitoneally injected into Balb / c mice previously primed with mineral oil. The growth of ascites tumors was observed on 8-12 days after the introduction of cells. Ascitic fluids were tested in the same way as for serums.

Антитела из асцитов выделяли при помощи метода преципитации 50%-ым сульфатом аммония. Диализовали против PBS. Концентрации антител измеряли спектрофотометрическим методом при длине волны 280 нм. Выделенные антитела тестировали в ИФА по вышеописанной схеме. А затем отобранные по ИФА антитела тестировали методами иммуногистохимии на срезах аденокарциномы простаты и нормальной печени. В результате был отобран клон G8, секретирующий моноклональное антитело, выявляющее белок AMACR в неопластических клетках аденокарциномы простаты (Фиг. 1). Дополнительно проводили тестирование полученного клона G8 антитела к AMACR методами непрямой иммунофлуоресценции (Фиг. 2) и иммуноцитохимии на клетках человека РС3 (Фиг. 3), иммуноблоттинга на лизатах клеточной линии HEK293T, экспрессирующей рекомбинантный AMACR (Фиг. 4).Antibodies from ascites were isolated using a precipitation method with 50% ammonium sulfate. Dialyzed against PBS. Antibody concentrations were measured spectrophotometrically at a wavelength of 280 nm. Isolated antibodies were tested in ELISA according to the above scheme. And then, ELISA antibodies were tested by immunohistochemistry on sections of prostate adenocarcinoma and normal liver. As a result, a G8 clone secreting a monoclonal antibody was detected that detected the AMACR protein in the neoplastic cells of the prostate adenocarcinoma (Fig. 1). Additionally, the obtained clone G8 antibody against AMACR was tested by indirect immunofluorescence (Fig. 2) and immunocytochemistry on human PC3 cells (Fig. 3), immunoblotting on lysates of the HEK293T cell line expressing recombinant AMACR (Fig. 4).

Мышиная гибридома AMACR, клон G8 принята на депонирование по форме «Национальное патентное депонирование» 14 января 2016 года Всероссийской коллекцией промышленных микроорганизмов ФГУПГосНИИГенетика с коллекционным номером ВКПМ Н-166.The AMACR mouse hybridoma, clone G8 was accepted for deposit in the form of “National Patent Deposit” on January 14, 2016 by the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms FSUE GosNII Genetics with a collection number VKPM N-166.

Мышиная гибридома AMACR, клон G8 - продуцент моноклонального антитела AMACR - имеет следующие характеристики:The murine hybridoma AMACR, clone G8 - producer of the monoclonal antibody AMACR - has the following characteristics:

Морфологические признаки: Культура имеет вид суспензии, где клетки собраны в конгломераты и слабо прикрепляются к субстрату.Morphological characteristics: The culture has the form of a suspension, where the cells are collected in conglomerates and loosely attached to the substrate.

Условия рутинного культивирования клеток гибридомы AMACR, клон G8: Среда для культивирования - ДМЕМ («ПанЭко», Россия), 10% эмбриональной телячьей сыворотки FetalClone 1 («HyClone», США), 2 мМ L-глутамина, 80 мкл тилозина (50 мг/мл), 2,5 мл гентамицина (50 мг/мл), 100 мМ пируват натрия. Условия культивирования: 37°С, абсолютная влажность и 5% СО₂ в атмосфере. Частота пассирования - каждые 3-4 суток, кратность рассева 1:5-1:10.Routine cultivation conditions of AMACR hybridoma cells, clone G8: Culture medium - DMEM (PanEco, Russia), 10% fetal calf serum FetalClone 1 (HyClone, USA), 2 mM L-glutamine, 80 μl tylosin (50 mg / ml), 2.5 ml of gentamicin (50 mg / ml), 100 mm sodium pyruvate. Cultivation conditions: 37 ° C, absolute humidity and 5% CO ₂ in the atmosphere. The passivation frequency is every 3-4 days, the sieving ratio is 1: 5-1: 10.

Способ криоконсервирования клеток гибридомы AMACR, клон G8. Криозащитная среда: 70% сыворотки FetalClone 1 («HyClone», США), 20% DMEM («ПанЭко», Россия), 10% ДМСО («ПанЭко», Россия). Криопробирки с суспензией клеток помещают на сутки в холодильник на -80°С, затем переносят в жидкий азот для длительного хранения. Жизнеспособность клеток после размораживания 80%. После размораживания клетки культивируют при плотности 0.2-0.3⋅10⁶ кл/мл.Method for cryopreservation of AMACR hybridoma cells, clone G8. Cryoprotective medium: 70% FetalClone 1 serum (HyClone, USA), 20% DMEM (PanEco, Russia), 10% DMSO (PanEco, Russia). Cryovials with a suspension of cells are placed for a day in a refrigerator at -80 ° C, then transferred to liquid nitrogen for long-term storage. Cell viability after thawing is 80%. After thawing, the cells are cultured at a density of 0.2-0.3 × 10 ⁶ cells / ml.

Бактерии, грибы, дрожжи и микоплазма в культуре не обнаружены.Bacteria, fungi, yeast and mycoplasma were not found in the culture.

Изотип моноклонального антитела AMACR, клон G8: моноклональное антитело, секретируемое гибридомой G8, относится к иммуноглобулинам класса IgG2a.AMACR monoclonal antibody isotype, clone G8: the monoclonal antibody secreted by the G8 hybridoma is an IgG2a class immunoglobulin.

Специфичность моноклонального антитела AMACR, клон G8. Моноклональное антитело выявляет белок AMACR в неопластических тканях аденокарциномы простаты человека (Фиг. 1), в ряде клеточных линий разного тканевого происхождения, например, в линии РС3 (карцинома предстательной железы) (Фиг. 2, 3). Антитело G8 также узнает рекомбинантный AMACR в суммарных клеточных лизатах линии HEK293T-AMACR на иммуноблотах (Фиг. 4).The specificity of the monoclonal antibody AMACR, clone G8. The monoclonal antibody detects AMACR protein in neoplastic tissues of human prostate adenocarcinoma (Fig. 1), in a number of cell lines of different tissue origin, for example, in the PC3 line (prostate carcinoma) (Fig. 2, 3). Antibody G8 also recognizes recombinant AMACR in total cell lysates of the HEK293T-AMACR line on immunoblots (Fig. 4).

Оптимальные титры антител AMACR, клон G8, определяемые в асцитической жидкости методом иммуногистохимии - 1:2000, методом непрямой иммунофлуоресценции - 1:200, методом иммуноблотов - 1:20000.Optimal antibody titers AMACR, clone G8, determined in ascitic fluid by immunohistochemistry - 1: 2000, indirect immunofluorescence - 1: 200, immunoblot method - 1: 20000.

Продуцируемое гибридомой G8 моноклональное антитело рекомендуется для специфического выявления антигена AMACR в цитоплазме неопластических клеток аденокарциномы простаты человека методами иммуногистохимии, иммуноцитохимии, иммунофлуоресценции, иммуноблоттинга.The monoclonal antibody produced by G8 hybridoma is recommended for specific detection of the AMACR antigen in the cytoplasm of neoplastic cells of human prostate adenocarcinoma by immunohistochemistry, immunocytochemistry, immunofluorescence, and immunoblotting.

Изобретение иллюстрируют следующие фотографии:The invention is illustrated by the following photographs:

Фиг. 1. Специфичность антитела AMACR, клон G8, продуцируемого гибридомой G8, к белку AMACR в неопластических клетках аденокарциномы простаты, выявляемая методом иммуногистохимии. Для детекции связавшихся с антигеном антител, были использованы вторичные антитела к иммуноглобулинам мыши, конъюгированные с полимерной пероксидазой хрена (ПраймБиоМед, Россия) и субстрат ДАБ, как описано в Примере 1. Специфическая гранулярная окраска цитоплазмы клеток на парафиновом срезе ткани, фиксированном формалином, свидетельствует о наличии опухолевых клеток, экспрессирующих AMACR.FIG. 1. The specificity of the AMACR antibody, clone G8 produced by the G8 hybridoma, to the AMACR protein in neoplastic cells of prostate adenocarcinoma, detected by immunohistochemistry. Secondary antibodies to mouse immunoglobulins conjugated to polymer horseradish peroxidase (PrimeBioMed, Russia) and a DAB substrate, as described in Example 1, were used to detect antibodies bound to the antigen of antibodies. Specific granular staining of the cell cytoplasm on a paraffin section of tissue fixed with formalin the presence of tumor cells expressing AMACR.

Фиг. 2. Специфичность антитела, продуцируемого гибридомой G8, к белку AMACR в клетках человека линии РС3, выявляемая методом иммунофлуоресценции. Стрелками обозначен окрашенный антителом G8 AMACR, располагающийся в пероксисомах и митохондриях эпителиальных клеток линии РС3. Для выявления связавшихся с антигеном антител использовались вторичные антитела к иммуноглобулинам мыши, конъюгированные с флуорохромом Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, США), как описано в Примере 2.FIG. 2. The specificity of the antibody produced by the G8 hybridoma to the AMACR protein in human cells of the PC3 line, detected by immunofluorescence. Arrows indicate antibody-stained G8 AMACR located in the peroxisomes and mitochondria of the epithelial cells of the PC3 line. Secondary antibodies to mouse immunoglobulins conjugated with Alexa Fluor 488 fluorochrome (Molecular Probes, USA) were used to detect antibodies bound to the antigen, as described in Example 2.

Фиг. 3. Специфичность антитела, продуцируемого гибридомой AMACR, клон G8, к белку AMACR в клетках человека линии РС3, выявляемая методом иммуноцитохимии. Темные точки представляют собой окрашенный антителом антиген AMACR, располагающийся в пероксисомах и митохондриях клеток линии РС3. Для выявления связавшихся с антигеном антител использовались вторичные антитела к иммуноглобулинам мыши, конъюгированные с полимерной пероксидазой хрена (ПраймБиоМед, Россия) и субстрат ДАБ как описано в Примере 2.FIG. 3. The specificity of the antibody produced by the AMACR hybridoma, clone G8, to the AMACR protein in human cells of the PC3 line, detected by immunocytochemistry. The dark dots represent the antibody-stained AMACR antigen located in the peroxisomes and mitochondria of the PC3 cell line. Secondary antibodies to mouse immunoglobulins conjugated to polymer horseradish peroxidase (PrimeBioMed, Russia) and a DAB substrate as described in Example 2 were used to detect antibodies bound to the antigen.

Фиг. 4. Специфичность антитела, продуцируемого гибридомой AMACR, клон G8, к белку AMACR на лизатах линии HEK293T, экспрессирующей рекомбинантный AMACR, выявляется на иммуноблотах. Связывание белка AMACR антителом G8 после переноса белков на мембрану. Клеточные лизаты приготовлены, а мембрана проявлена, как описано в Примере 3. Электрофоретическая подвижность белка соответствует расчетной.FIG. 4. The specificity of the antibody produced by the AMACR hybridoma, clone G8, to the AMACR protein on lysates of the HEK293T line expressing recombinant AMACR is detected on immunoblots. Binding of AMACR protein by G8 antibody after transfer of proteins to the membrane. Cell lysates are prepared, and the membrane is developed as described in Example 3. Electrophoretic mobility of the protein corresponds to the calculated.

Изобретение иллюстрируют следующие примеры:The invention is illustrated by the following examples:

Пример 1. Приготовление срезов для иммуногистохимического выявления белка AMACR.Example 1. Preparation of slices for immunohistochemical detection of AMACR protein.

Иммуногистохимическое исследование проводят на операционном материале, фиксированном 10%-ным нейтральным формалином, забуференным фосфатным буфером, в течение 24 часов. После гистологической проводки материал заливают в парафин и затем готовят срезы толщиной 2-4 мкм. Срезы монтируют на специальные высокоадгезивные стекла (SuperFrost Plus, ApexLab) и высушивают в течение 18 часов при температуре 37°С.An immunohistochemical study is carried out on an operative material fixed with 10% neutral formalin buffered with phosphate buffer for 24 hours. After histological posting, the material is poured into paraffin and then sections 2-4 μm thick are prepared. Sections are mounted on special highly adhesive glass (SuperFrost Plus, ApexLab) and dried for 18 hours at a temperature of 37 ° C.

Парафин далее удаляют со срезов в трех сменах ксилола, по 10 мин в каждой смене. Проводят срезы через спирты с объемной долей изопропанола 100% (абс), 100% (абс), 70%, 50% по 5 мин в каждом и промывают в дистиллированной воде. Блокировка эндогенной пероксидазы проводится в 3% перекиси водорода 10 минут. Срезы инкубируют с антителами AMACR, клон G8, разведенными в PBST буфере (ПраймБиоМед, Россия) а затем с антителами к иммуноглобулинам мыши, конъюгированными с полимерной пероксидазой хрена (ПраймБиоМед, Россия). Окрашивание проявляется при добавлении субстрата ДАБ хромогена на 5-10 минут (ПраймБиоМед, Россия). Результат представлен на Фиг. 1.Paraffin is then removed from the sections in three xylene shifts, 10 min in each shift. Sections were carried out through alcohols with a volume fraction of isopropanol of 100% (abs), 100% (abs), 70%, 50% for 5 minutes each and washed in distilled water. Blocking endogenous peroxidase is carried out in 3% hydrogen peroxide for 10 minutes. Sections were incubated with AMACR antibodies, clone G8, diluted in PBST buffer (PrimeBioMed, Russia) and then with antibodies to mouse immunoglobulins conjugated to horseradish polymer peroxidase (PrimeBioMed, Russia). Staining appears when a substrate of DAB chromogen is added for 5-10 minutes (PrimeBioMed, Russia). The result is shown in FIG. one.

Пример 2. Способы фиксации клеток для выявления белка AMACR в реакции непрямой иммунофлуоресценции и иммуноцитохимии.Example 2. Methods of cell fixation for the detection of AMACR protein in the reaction of indirect immunofluorescence and immunocytochemistry.

Культуру РС3 выращивают на покровных стеклах до достижения 70% конфлуентности. Клетки фиксируют, помещая в 3,7% параформальдегид на 15 мин, с последующей промывкой в PBS (ПанЭко, Россия) на 10 мин. После фиксации клетки инкубируют с антителом AMACR, клон G8 1 ч при комнатной температуре, а затем с козьими антителами к иммуноглобулинам мыши, конъюгированными с флуорохромом Cy3 (ПраймБиоМед, Россия), или полимерной пероксидазой хрена (ПраймБиоМед, Россия) 30 или 15 мин, соответственно, при комнатной температуре. Для визуализации окрашивания добавляют субстрат ДАБ хромоген на 5-10 минут (ПраймБиоМед, Россия) Препараты заключают в среду для заключения на водной основе и изучают в микроскоп Olympus ВХ53 (Cheminst, Германия), сопряженный с 2 мп камерой Infinity 2 (Lumenera, США), используя объективы U PlanFL N ×40/ЧА 0.75 и U PlanFL N ×100/ЧА 1.30. Для иммунофлуоресценции используются фильтры, U-FUNA и U-FGNA (Olympus, Япония). Результаты представлены на Фиг. 2 и 3.The PC3 culture is grown on coverslips until 70% confluency is achieved. Cells are fixed by placing paraformaldehyde in 3.7% for 15 minutes, followed by washing in PBS (PanEco, Russia) for 10 minutes. After fixation, cells are incubated with an AMACR antibody, clone G8 for 1 h at room temperature, and then with goat antibodies to mouse immunoglobulins conjugated with Cy3 fluorochrome (PrimeBioMed, Russia) or with horseradish polymer peroxidase (PrimeBioMed, Russia) for 30 or 15 min, respectively at room temperature. To visualize the staining, a DAB chromogen substrate is added for 5-10 minutes (PrimeBioMed, Russia). The preparations are enclosed in a water-based solution medium and examined using an Olympus BX53 microscope (Cheminst, Germany) coupled to a 2 MP Infinity 2 camera (Lumenera, USA) using lenses U PlanFL N × 40 / HO 0.75 and U PlanFL N × 100 / HO 1.30. Filters, U-FUNA and U-FGNA (Olympus, Japan) are used for immunofluorescence. The results are presented in FIG. 2 and 3.

Пример 3. Способ получения суммарных клеточных лизатов и выявления рекомбинантного белка AMACR методом иммуноблоттинга.Example 3. The method of obtaining total cell lysates and detection of recombinant protein AMACR by immunoblotting.

Для получения клеточной линии HEK293T, экспрессирующей рекомбинантный AMACR, его кодирующая последовательность была заклонирована в вектор pcDNA3.1(-)MycHis с последующей транзиентной трансфекцией клеток HEK293T. Ген AMACR человека (нуклеотидная последовательность кДНК AMACR человека доступны в базе данных GeneBank по адресу http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ с порядковым номером NM 014324.5) амплифицируют на матрице кДНК, полученной из мРНК клеток линии РС3 с использованием ген-специфических праймеров (AMACR F2006 NotI TCGAGCGGCCGCGCCATGGCACTGCAG, AMACR R2006 KpnI GCTTGGTACCGAGACTAGCTTTTAC, встроенные сайты эндонуклеаз рестрикции NotI/KpnI). Амплифицированные фрагменты ДНК очищают и клонируют в вектор pcDNA3.1(-)MycHis по сайтам, созданным эндонуклеазами рестрикции KpnI и NotI. В результате получают плазмиду, несущую ген белка AMACR человека. Плазмиду тестируют на наличие нуклеотидных замен методом автоматического секвенирования ДНК. Компетентные клетки E.coli химически трансформируют полученной плазмидой pcDNA3.1(-)MycHis-AMACR, высевают на чашки с LB-агаром, содержащим 100 мкг/мл ампициллина, и инкубируют при 37°С в течение 16 ч. Далее в 50 мл среды LB переносят единичную колонию и наращивают при 37°С в течение 16 ч при постоянном перемешивании. Далее из ночной культуры выделяют плазмиду с помощью коммерческого набора реактивов (Promega) согласно протоколу производителя. Далее 2.5 мкг плазмиды используют для транзиентной трансфекции клеток с помощью реактива Lipofectamine 2000 (Thermofisher Scientific) согласно протоколу производителя. По истечении 48 часов 5×10⁵ клеток лизируют на льду в буфере, содержащем 50 тМ Трис-(гидроксиметил)-аминометана (рН 7.5), 150 mM NaCl, 10% глицерина, 0.5% Тритона Х-100 и коктейль протеазных ингибиторов (Roche, США). Суммарную концентрацию белков в лизатах определяют по методу Бредфорд с помощью Protein Assay Kit (Bio-Rad, США), следуя рекомендациям производителя.To obtain a HEK293T cell line expressing recombinant AMACR, its coding sequence was cloned into pcDNA3.1 (-) MycHis vector, followed by transient transfection of HEK293T cells. The human AMACR gene (the nucleotide sequence of human AMACR cDNA is available in the GeneBank database at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ with serial number NM 014324.5) is amplified on a cDNA matrix obtained from mRNA of PC3 cell line c using gene-specific primers (AMACR F2006 NotI TCGAGCGGCCGCGCCATGGCACTGCAG, AMACR R2006 KpnI GCTTGGTACCGAGACTAGCTTTTAC, built-in NotI / KpnI restriction endonuclease sites). The amplified DNA fragments are purified and cloned into the pcDNA3.1 (-) MycHis vector at sites created by KpnI and NotI restriction endonucleases. The result is a plasmid carrying the gene for human AMACR protein. The plasmid is tested for nucleotide substitutions by automatic DNA sequencing. Competent E. coli cells are chemically transformed with the resulting pcDNA3.1 (-) MycHis-AMACR plasmid, plated on LB agar plates containing 100 μg / ml ampicillin and incubated at 37 ° C. for 16 hours. Next, in 50 ml of medium LB is transferred to a single colony and expanded at 37 ° C. for 16 hours with constant stirring. Next, a plasmid is isolated from the overnight culture using a commercial reagent kit (Promega) according to the manufacturer's protocol. Next, 2.5 μg of the plasmid is used for transient transfection of cells using Lipofectamine 2000 reagent (Thermofisher Scientific) according to the manufacturer's protocol. After 48 hours, 5 × 10 ⁵ cells are lysed on ice in a buffer containing 50 tM Tris- (hydroxymethyl) -aminomethane (pH 7.5), 150 mM NaCl, 10% glycerol, 0.5% Triton X-100 and a cocktail of protease inhibitors (Roche , USA). The total concentration of proteins in the lysates is determined by the Bradford method using the Protein Assay Kit (Bio-Rad, USA), following the manufacturer's recommendations.

Перед электрофоретическим разделением к приготовленным лизатам добавляют 5×-ный буфер Лэммли, содержащий 250 мМ Трис-(гидроксиметил)-аминометана (рН 6.8), 50% глицерина, 10% додецилсульфата натрия (ДСН), 500 мМ бета-меркаптоэтанола, 0.5% бромфенолового синего. Образцы подвергают термической обработке при 95°С 5 мин. В каждую лунку 10% полиакриламидного геля с ДСН (ПААГ-ДСН) наносят лизаты, содержащие не менее 15 мкг суммарного белка. Электрофоретическое разделение белков в ПААГ-ДСН проводят 30 мин при 60 В и 60 мин при 160 В для дальнейшего разделения в электрофорезной камере. Далее гель инкубируют в буфере для проведения блоттинга, содержащем 50 мМ Трис-(гидроксиметил)-аминометана, 38 мМ глицина, 0.1% ДСН и 20% метанола. Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану (0.22 мкм, Millipore, США) проводят при постоянной силе тока 250 мА 60 мин. Мембрану инкубируют с антителами AMACR, клон G8 (разведение 1:20000 в 5% молоке), а затем с антителами к иммуноглобулинам мыши, конъюгированными с пероксидазой хрена (разведение 1:4000, Abeam, США). Сухое молоко (Bio-Rad, США) и антитела разводят в буфере TBST, содержащем 20 мМ Трис-(гидроксиметил)-аминометана (рН 7.6), 150 мМ NaCl, 0.05% Твина-20. Мембрану проявляют методом хемилюминесценции, используя набор ECL+Plus (Millipore, Великобритания) согласно инструкции производителя. Хемилюминесцентную реакцию регистрируют на приборе ChemiDoc MP (Bio-Rad, UK) с последующей обработкой с помощью программы ChemiDoc XRS+ imaging systems. Результаты представлены на Фиг. 4.Before electrophoretic separation, 5 × Laemmli buffer containing 250 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane (pH 6.8), 50% glycerol, 10% sodium dodecyl sulfate (SDS), 500 mM beta-mercaptoethanol, 0.5% bromophenol is added to the prepared lysates blue. Samples were heat treated at 95 ° C for 5 minutes. In each well of a 10% SDS gel of polyacrylamide (SDS page-SDS), lysates containing at least 15 μg of total protein are applied. Electrophoretic separation of proteins in SDS page-SDS is carried out for 30 min at 60 V and 60 min at 160 V for further separation in an electrophoresis chamber. Next, the gel is incubated in a blotting buffer containing 50 mM Tris- (hydroxymethyl) aminomethane, 38 mM glycine, 0.1% SDS and 20% methanol. Protein transfer to the nitrocellulose membrane (0.22 μm, Millipore, USA) is carried out at a constant current strength of 250 mA for 60 min. The membrane is incubated with AMACR antibodies, clone G8 (dilution 1: 20,000 in 5% milk), and then with antibodies to mouse immunoglobulins conjugated to horseradish peroxidase (dilution 1: 4000, Abeam, USA). Powdered milk (Bio-Rad, USA) and antibodies are diluted in TBST buffer containing 20 mM Tris- (hydroxymethyl) aminomethane (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20. The membrane is developed by chemiluminescence using an ECL + Plus kit (Millipore, UK) according to the manufacturer's instructions. The chemiluminescent reaction is recorded on a ChemiDoc MP instrument (Bio-Rad, UK), followed by treatment with the ChemiDoc XRS + imaging systems program. The results are presented in FIG. four.

Claims

AMACR murine hybridoma, clone G8, collection number VKPM H-166 - producer of a monoclonal antibody that detects alpha-methylacyl-coenzyme A racemase in neoplastic cells of prostate adenocarcinoma and in cells of other organs containing this antigen, by immunocytochemistry, immunohistochemistry, obtained by immunization of Balb / c mice with a synthetic peptide of the C-terminal portion of human AMACR protein and fusion of sensitized lymphocytes of immunized mice with murine myeloma cells l SRI sp2 / 0 with 50% polyethylene glycol solution having a molecular weight of 4,000.