RU2628098C2

RU2628098C2 - Method for assessment of cholera vibrio biofilms sensitivity to antibacterial drugs

Info

Publication number: RU2628098C2
Application number: RU2015155126A
Authority: RU
Inventors: Надежда Александровна Селянская; Людмила Михайловна Веркина; Светлана Викторовна Титова
Priority date: 2015-12-22
Filing date: 2015-12-22
Publication date: 2017-08-14
Also published as: RU2015155126A

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: method is proposed for assessment of cholera vibrio biofilms sensitivity to antibacterial drugs, including biofilm production on glass cylinders. Cylinders with the resulting biofilm are placed on agar in a Petri dish, antibacterial drug solutions at different concentrations are added in the middle of the cylinder. The results are taken into account after 18-20 h of incubation at 37°C by the presence or absence of cholera vibrios growth in the cylinders prints. Cholera vibrios biofilm sensitivity to antibacterial drugs is assessed by the activity index calculated by the formula:

where AI is the antibacterial drug activity index; MIC_s is the maximum MIC of this antibacterial drug for sensitive strains in accordance with MUK 4.2.2495-09; MIC_b is MIC value of this antibacterial drug with respect to the biofilm of the strain under study. Biofilm sensitivity of the strain under study is directly proportional to the AI index.

EFFECT: accuracy of evaluation of cholera vibrio strains biofilm sensitivity to an antibacterial drug.

2 dwg, 4 tbl, 2 ex

Description

Изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к формированию биопленок холерных вибрионов на твердом носителе для проведения тестирования антибактериальных препаратов на их эффективность в отношении биопленок.The invention relates to medical microbiology, in particular to the formation of biofilms of cholera vibrios on a solid carrier for testing antibacterial drugs for their effectiveness against biofilms.

Способность холерных вибрионов к образованию биопленки (1) затрудняет проведение мероприятий по профилактике и борьбе с холерой. Чувствительность бактерий, включенных в структуру биопленки, к антибактериальным препаратам может снижаться в 10-1000 раз по сравнению с планктонными формами (2, 3, 4), что создает трудности в терапии инфекционных заболеваний.The ability of cholera vibrios to form biofilms (1) makes it difficult to take measures for the prevention and control of cholera. The sensitivity of bacteria included in the biofilm structure to antibacterial drugs can decrease by 10-1000 times in comparison with planktonic forms (2, 3, 4), which creates difficulties in the treatment of infectious diseases.

В связи с этим оценка чувствительности к антибиотикам холерных вибрионов, находящихся в составе биопленок, является одной из важных проблем эффективности этиотропной терапии.In this regard, the assessment of antibiotic sensitivity of cholera vibrios that are part of biofilms is one of the important problems of the effectiveness of etiotropic therapy.

В настоящее время в практике клинических микробиологов активно используются стандартизированные методы изучения антибиотикорезистентности микроорганизмов, в том числе холерных вибрионов, включающие два основных способа: диско-диффузионный способ с применением дисков, содержащих определенное количество (5, 10, 15, 30, 150, 300 мкг-Ед) антибактериального препарата, и метод серийных разведений в жидкой либо твердой питательной среде (5), с помощью которого можно определить минимальную подавляющую концентрацию - МПК антибактериального препарата.Currently, in the practice of clinical microbiologists, standardized methods are actively used to study the antibiotic resistance of microorganisms, including cholera vibrios, which include two main methods: the disk diffusion method using disks containing a certain amount (5, 10, 15, 30, 150, 300 μg -U) an antibacterial drug, and the method of serial dilutions in a liquid or solid nutrient medium (5), with which you can determine the minimum inhibitory concentration - MIC of an antibacterial drug.

Вышеперечисленные методы разработаны для определения антибиотикорезистентности отдельно существующих планктонных клеток микроорганизмов. Способы определения чувствительности биопленок микроорганизмов к антибактериальным препаратам, в основу которых положены указанные методы, требуют на первом этапе получения биопленок на поверхности пробирки или флакона с последующим удалением жидкой фракции, двукратным промыванием дистиллированной водой и снятием при помощи урологического зонда с поверхности стекла адгезированной биопленочной культуры. Затем требуется центрифугирование, десятикратные разведения и высев на агар с последующим определением антибиотикочувствительности путем оценки жизнеспособности высвободившихся биопленочных бактерий (6).The above methods are designed to determine the antibiotic resistance of separately existing plankton cells of microorganisms. The methods for determining the sensitivity of biofilms of microorganisms to antibacterial drugs based on the indicated methods require at the first stage the production of biofilms on the surface of a test tube or vial, followed by removal of the liquid fraction, washing twice with distilled water and removing an adhesive biofilm from a glass surface using a urological probe. Then, centrifugation, tenfold dilutions, and agar plating are required, followed by determination of antibiotic sensitivity by assessing the viability of the released biofilm bacteria (6).

Известен способ определения антибиотикочувствительности биопленок микрометодом серийных разведений в жидкой питательной среде в полистироловых планшетах, основанный на определении оптической плотности бактериальной культуры по количеству красителя, связавшегося с клетками микроорганизма (7, 8), либо визуально по наличию или отсутствию кольца образования биопленки на стенке лунки (9). Однако при работе с возбудителями особо опасных инфекций человека в соответствии с СП 1.3.3118-13 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)" использовать полистироловые пластины открытым способом не допускается.A known method for determining the antibiotic sensitivity of biofilms by the method of serial dilutions in a liquid nutrient medium in polystyrene tablets is based on determining the optical density of a bacterial culture by the amount of dye that binds to microorganism cells (7, 8), or visually by the presence or absence of a biofilm formation ring on the wall of a well ( 9). However, when working with pathogens of especially dangerous human infections in accordance with SP 1.3.3118-13 “Safety of work with microorganisms of I-II pathogenicity (danger) groups”, open polystyrene plates are not allowed.

Высокая трудоемкость указанных способов, необходимость наличия дополнительного оборудования, специального красителя, их многоэтапность сопряжены с затруднением соблюдения принципов биологической безопасности и не могут быть применены к возбудителю холеры, относящемуся ко II группе патогенности. Кроме того, удлинение времени исследования снижает эффективность выбора средств этиотропной терапии холеры у конкретного больного.The high complexity of these methods, the need for additional equipment, a special dye, their multi-stage are associated with difficulty in observing the principles of biological safety and cannot be applied to the cholera pathogen, belonging to the II pathogenicity group. In addition, lengthening the time of the study reduces the effectiveness of the choice of etiotropic therapy for cholera in a particular patient.

За прототип выбран способ оценки антибактериальных препаратов в отношении биопленок, образованных холерными вибрионами Эль Тор (10), заключающийся в том, что биопленки получают на пластиковых пластинках, помещенных в пенициллиновые флаконы, содержащие по 5 мл кипяченой водопроводной воды и суспензию холерных вибрионов в концентрации n×10⁴ м.кл. по отраслевому стандартности мутности Л.А. Тарасевича, затем флаконы с пластиковыми пластинками выдерживают при 37°C до 4 сут, после этого в них добавляют двукратные разведения антибактериальных препаратов и проводят инкубирование в течение 24 ч в термостате при 37°C с последующим высевом биопленки и 0,1 мл планктонной культуры на пластинки с агаром Мартена рН 7,7, затем проводят учет результатов через 24 ч по наличию или отсутствию роста холерных вибрионов.For the prototype, a method was chosen for evaluating antibacterial drugs with respect to biofilms formed by El Tor cholera vibrios (10), which means that biofilms are obtained on plastic plates placed in penicillin vials containing 5 ml of boiled tap water and a suspension of cholera vibrios in concentration n × 10 ⁴ m.cl. according to industry standard turbidity L.A. Tarasevich, then the bottles with plastic plates are kept at 37 ° C for 4 days, after which they add two-fold dilutions of antibacterial drugs and incubate for 24 hours in an incubator at 37 ° C, followed by seeding of the biofilm and 0.1 ml of plankton culture on plates with Marten agar pH 7.7, then record the results after 24 hours for the presence or absence of growth of cholera vibrios.

Недостатком прототипа является то, что для изучения чувствительности к большому числу антибактериальных препаратов в разных концентрациях необходимо большое число пластиковых пластинок, пенициллиновых флаконов, а также бактериальной суспензии. Кроме того, многоэтапность способа увеличивает трудоемкость и время исследования.The disadvantage of the prototype is that to study the sensitivity to a large number of antibacterial drugs in different concentrations, a large number of plastic plates, penicillin vials, as well as bacterial suspensions are needed. In addition, the multi-stage method increases the complexity and time of the study.

Техническая задача предлагаемого изобретения состояла в разработке способа, позволяющего с высокой достоверностью просто и быстро оценивать чувствительность биопленок холерных вибрионов к антибактериальным препаратам для отбора наиболее эффективных средств этиотропной терапии холеры.The technical task of the invention was to develop a method that allows with high reliability to simply and quickly assess the sensitivity of biofilms of cholera vibrios to antibacterial drugs for the selection of the most effective means of etiotropic therapy of cholera.

Поставленная техническая задача достигается тем, что в способе оценки чувствительности биопленок холерных вибрионов к антибактериальным препаратам, включающем получение биопленки на твердом носителе, который помещают в суспензию холерных вибрионов в конечной концентрации n×10⁴ м.к./мл и выдерживают в термостате при 37°C не менее 4-х сут с последующим посевом на агар Мартена, отличие заключается в том, что биопленку получают на стеклянных цилиндрах длиной 10 мм и диаметром 8 мм, которые размещают во флаконе объемом 50 мл с водопроводной автоклавированной водой, в последний вносят суспензию холерных вибрионов, выдерживают 5 сут в термостате, после этого стеклянные цилиндры достают пинцетом из флакона и трехкратно промывают в физиологическом растворе, затем устанавливают цилиндры на агар в чашке Петри, не более 6 штук на одинаковом удалении друг от друга, после этого вносят в середину цилиндра 0,05 мл раствора антибактериального препарата в разных концентрациях, позволяя определять минимальную подавляющую рост биопленки концентрацию МПКб антибактериального препарата, учет результатов осуществляют через 18-20 часов инкубации при 37°C по наличию или отсутствию роста холерных вибрионов в отпечатках цилиндров, при этом оценивают чувствительность биопленки холерных вибрионов к антибактериальным препаратам по индексу активности, который определяют по формулеThe stated technical problem is achieved by the fact that in the method for assessing the sensitivity of biofilms of cholera vibrios to antibacterial drugs, which includes obtaining biofilms on a solid carrier, which is placed in a suspension of cholera vibrios in a final concentration of n × 10 ⁴ MK./ml and incubated in a thermostat at 37 ° C for at least 4 days, followed by seeding on Marten agar, the difference is that the biofilm is obtained on glass cylinders 10 mm long and 8 mm in diameter, which are placed in a 50 ml bottle with a water autoclave filled with water, a suspension of cholera vibrios is introduced into the latter, kept for 5 days in a thermostat, then the glass cylinders are taken out of the bottle with tweezers and washed three times in physiological saline, then the cylinders are mounted on agar in a Petri dish, no more than 6 pieces at the same distance from each other after that, 0.05 ml of the antibacterial drug solution is introduced into the middle of the cylinder in different concentrations, making it possible to determine the minimum inhibitory biofilm growth concentration of MPCb of the antibacterial drug, taking into account the cut tatov performed after 18-20 hours of incubation at 37 ° C by the presence or absence of growth of Vibrio cholerae in prints cylinders, the sensitivity is evaluated Vibrio cholerae biofilms to antimicrobial activity index, which is defined by the formula

,

где ИА - индекс активности антибактериального препарата в отношении исследуемого штамма;where IA is the activity index of the antibacterial drug in relation to the studied strain;

МПК_ч - максимальное значение МПК данного антибактериального препарата для чувствительных штаммов;IPC _h - the maximum value of the IPC of this antibacterial drug for sensitive strains;

МПК_б - значение МПК данного антибактериального препарата в отношении биопленки исследуемого штамма,IPC _b - the value of the IPC of this antibacterial drug in relation to the biofilm of the studied strain,

чем выше ИА, тем более чувствителен данный штамм к антибактериальному препарату.the higher the IA, the more sensitive this strain is to an antibacterial drug.

Предлагаемый способ реализуется следующим образом.The proposed method is implemented as follows.

На первом этапе создают биопленки, для этого в качестве твердого носителя используют стеклянные цилиндры длиной 10 мм и имеющие внешний диаметр 8 мм, внутренний - 6 мм. Цилиндры помещают во флакон (50 мл) с водопроводной автоклавированной водой (до 40 цилиндров в один флакон), куда вносят суспензию холерных вибрионов, последняя приготовленна из 18-часовой агаровой культуры по отраслевому стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича (ОСО-42-25-59-86 П), в конечной концентрации n×10⁴ м.кл/мл., и выдерживают в термостате в течение 5 суток.At the first stage, biofilms are created; for this, glass cylinders 10 mm long and having an outer diameter of 8 mm and an inner diameter of 6 mm are used as a solid support. Cylinders are placed in a bottle (50 ml) with tap autoclaved water (up to 40 cylinders in one bottle), where a suspension of cholera vibrios is added, the latter prepared from an 18-hour agar culture according to the industry standard turbidity GISK named after L.A. Tarasevich (OSO-42-25-59-86 P), in a final concentration of n × 10 ⁴ mcl / ml, and kept in a thermostat for 5 days.

Цилиндры с полученными на них биопленками пинцетом достают из флакона и после трехкратного промывания в физиологическом растворе ставят на агар не более 6 на одну чашку Петри на одинаковом удалении друг от друга и от края чашки (см. фото 1) и в середину цилиндра добавляют по 0,05 мл раствора антибактериального препарата в разных концентрациях (см. табл. 1) с указанием нумерации на дне чашки. В контрольный цилиндр антибиотик не добавляют. Через 18-20 ч учитывают результаты по наличию или отсутствию роста холерных вибрионов в отпечатках цилиндров (см. фото 2).Cylinders with tweezers biofilms obtained on them are removed from the bottle and, after washing three times in physiological saline, put on agar no more than 6 on one Petri dish at the same distance from each other and from the edge of the cup (see photo 1) and add 0 in the middle of the cylinder , 05 ml of a solution of an antibacterial drug in different concentrations (see table. 1) with the numbering on the bottom of the cup. An antibiotic is not added to the control cylinder. After 18-20 hours, the results on the presence or absence of growth of cholera vibrios in the cylinder prints are taken into account (see photo 2).

На фото 2 видно наличие роста в кольце-отпечатке поверхности цилиндра под номерами 26 и 27 и отсутствие роста холерных вибрионов штамма V. cholerae El Tor 18904 в отпечатках под номерами 28-30.Photo 2 shows the presence of growth in the ring imprint of the cylinder surface under numbers 26 and 27 and the absence of growth of cholera vibrios of strain V. cholerae El Tor 18904 in prints under numbers 28-30.

Таким образом, антибиотик диффундирует в агар из стеклянных полых цилиндров, установленных вертикально на поверхность засеянного агара, в результате чего холерные вибрионы, находящиеся в составе биопленки, которая образовалась на стороне цилиндра, обращенной к агару, дают или не дают рост, в зависимости от их чувствительности к данной концентрации антибактериального препарата. За минимальную подавляющую рост биопленки концентрацию (МПКб) принимается наименьшая концентрация антибактериального препарата, воздействие которой вызывает гибель холерных вибрионов и отсутствие их роста на агаре, что можно наблюдать визуально.Thus, the antibiotic diffuses into the agar from glass hollow cylinders mounted vertically on the surface of the seeded agar, as a result of which the cholera vibrios contained in the biofilm that formed on the cylinder side facing the agar give or do not give growth, depending on their sensitivity to a given concentration of an antibacterial drug. For the minimum inhibitory growth of biofilm concentration (MPCb), the lowest concentration of the antibacterial drug is taken, the effect of which causes the death of cholera vibrios and the absence of their growth on agar, which can be observed visually.

На следующем этапе производят расчет индексов активности антибактериальных препаратов, что позволяет дать количественную оценку чувствительности биопленки к любому антибактериальному препарату, сравнивать индексы активности к двум и более препаратам с целью выбора наиболее оптимального из них для конкретного больного, контролировать чувствительность биопленки к препарату в динамике и при необходимости проводить своевременную его замену на более эффективный.At the next stage, the activity indices of antibacterial drugs are calculated, which allows a quantitative assessment of the biofilm sensitivity to any antibacterial drug, to compare the activity indices to two or more drugs in order to choose the most optimal one for a particular patient, to control the biofilm sensitivity to the drug in dynamics and the need to carry out its timely replacement with a more effective one.

Расчет индекса активности антибактериального препарата в отношении исследуемого штамма производят по формулеThe calculation of the activity index of the antibacterial drug in relation to the studied strain is carried out according to the formula

,

где ИА - индекс активности антибактериального препарата в отношении исследуемого штамма,where IA is the activity index of the antibacterial drug in relation to the studied strain,

МПК_ч - максимальное значение МПК данного антибактериального препарата для чувствительных штаммов в соответствии с МУК 4.2.2495-09 (5) (представлено в таблице 2),IPC _h - the maximum value of the IPC of this antibacterial drug for sensitive strains in accordance with MUK 4.2.2495-09 (5) (presented in table 2),

МПК_б - значение МПК данного антибактериального препарата в отношении биопленки исследуемого штамма.IPC _b - the value of the IPC of this antibacterial drug in relation to the biofilm of the studied strain.

Пример 1Example 1

От больного выделена культура Vibrio cholerae El Tor 5879. Проведена оценка чувствительности к антибактериальным препаратам данного штамма V. cholerae в биопленочной форме для выбора средств этиотропной терапии вновь предлагаемым способом с вычислением индексов активности антибактериальных препаратов (ИА).The culture of Vibrio cholerae El Tor 5879 was isolated from the patient. The sensitivity to the antibacterial drugs of this V. cholerae strain was evaluated in biofilm form to select etiotropic therapy using the newly proposed method with the calculation of the activity indexes of antibacterial drugs (IA).

Готовили разведения антибактериальных препаратов (мг/л) (таблица 1).Prepared dilutions of antibacterial drugs (mg / l) (table 1).

Для получения биопленок в качестве твердого носителя использовали стеклянные цилиндры длиной 10 мм, имеющие внешний диаметр 8 мм и внутренний диаметр 6 мм (±0,1 мм), которые помещали во флакон с водопроводной автоклавированной водой 50 мл (до 40 цилиндров в один флакон), содержащей суспензию V. cholerae El Tor 5879, приготовленную из 18-часовой агаровой культуры по отраслевому стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича (ОСО-42-25-59-86 П), в конечной концентрации n×10¹-10⁴ м.кл/мл. Флакон с цилиндрами выдерживали при 37°C 5 сут. Затем, цилиндры с полученными на них биопленками пинцетом доставали из флакона, трижды промывания в физиологическом растворе и ставили на агар Мартена не более 6 на одну чашку Петри на одинаковом удалении друг от друга и от края чашки. В середину каждого цилиндра добавляли по 0,05 мл раствора антибактериального препарата в разных концентрациях (таблица 1) с указанием нумерации на дне чашки. В контрольный цилиндр антибиотик не добавляли. Через 18-20 ч инкубации при 37°C цилиндры снимали пинцетом, опускали их в дезраствор и учитывали результаты по наличию или отсутствию роста холерных вибрионов в отпечатках цилиндров, записывая при этом минимальные подавляющие концентрации антибактериальных препаратов для биопленок МПК_б при положительном контроле (таблица 3).To obtain biofilms, glass cylinders 10 mm long with an external diameter of 8 mm and an inner diameter of 6 mm (± 0.1 mm) were used as solid carriers, which were placed in a bottle with tap autoclaved water of 50 ml (up to 40 cylinders in one bottle) containing a suspension of V. cholerae El Tor 5879, prepared from an 18-hour agar culture according to the industry standard turbidity GISK them. L.A. Tarasevich (OSO-42-25-59-86 P), in a final concentration of n × 10 ¹ -10 ⁴ mcl / ml. The bottle with cylinders was kept at 37 ° C for 5 days. Then, the cylinders with the biofilms obtained on them were removed from the vial, washed three times in physiological saline and placed on Marten agar no more than 6 on one Petri dish at the same distance from each other and from the edge of the cup. In the middle of each cylinder was added 0.05 ml of a solution of an antibacterial drug in different concentrations (table 1) with the numbering on the bottom of the cup. No antibiotic was added to the control cylinder. After 18-20 hours of incubation at 37 ° C, the cylinders were removed with tweezers, lowered into a disinfectant solution and the results on the presence or absence of cholera vibrios in the cylinder prints were taken into account, recording the minimum inhibitory concentrations of antibacterial drugs for MPC _b biofilms with a positive control (table 3 )

Для сравнения оценивали чувствительность к антибактериальным препаратам планктонной культуры штамма V. cholerae El Tor 5879 методом двукратных серийных разведений в соответствии с МУК 4.2.2495-09 (5).For comparison, we evaluated the sensitivity to antibacterial drugs of the planktonic culture of strain V. cholerae El Tor 5879 by the method of double serial dilutions in accordance with MUK 4.2.2495-09 (5).

Результаты представлены в таблице 3,The results are presented in table 3,

МПК_п - значение МПК данного антибактериального препарата в отношении исследуемого штамма в планктонной форме,IPC _p - the value of the IPC of this antibacterial drug in relation to the studied strain in plankton form,

МПК_ч - максимальное значение МПК данного антибактериального препарата для чувствительных штаммов в соответствии с МУК 4.2.2495-09 (5).IPC _h - the maximum value of the IPC of this antibacterial drug for sensitive strains in accordance with MUK 4.2.2495-09 (5).

Как показывает таблица 3, планктонная культура штамма V. cholerae El Tor 5879 оказалась чувствительна ко всем антибактериальным препаратам, взятым в исследование.As Table 3 shows, the planktonic culture of strain V. cholerae El Tor 5879 was sensitive to all antibacterial drugs taken in the study.

Вывод: при сравнении антибиотикочувствительности планктонной и биопленочной культур указанного штамма установлено, что значения МПК антибактериальных препаратов в отношении его биопленок увеличились в 2-16 раз. Наибольшим индексом в отношении биопленок данного штамма обладают ципрофлоксацин, доксициклин, которые можно рекомендовать данному больному.Conclusion: when comparing the antibiotic sensitivity of planktonic and biofilm cultures of this strain, it was found that the IPC values of antibacterial drugs in relation to its biofilms increased by 2-16 times. Ciprofloxacin, doxycycline, which can be recommended for this patient, have the highest index for biofilms of this strain.

Пример 2Example 2

Проводили оценку чувствительности к антибактериальным препаратам биопленок, образованных клиническими изолятами Vibrio cholerae El Tor 18826, 19667, Vibrio cholerae O139 16077, 16063, V. cholerae non O1 / non O139 16150, 19190.The sensitivity to antibacterial preparations of biofilms formed by the clinical isolates of Vibrio cholerae El Tor 18826, 19667, Vibrio cholerae O139 16077, 16063, V. cholerae non O1 / non O139 16150, 19190 was evaluated.

Осуществляли оценку чувствительности по технологии, описанной в примере 1. Учитывают результаты по наличию или отсутствию роста холерных вибрионов в отпечатках цилиндров, регистрируя при этом минимальные подавляющие концентрации антибактериальных препаратов для биопленок (МПКб) при положительном контроле (см. таблицу 4).The sensitivity was assessed using the technology described in Example 1. The results on the presence or absence of cholera vibrio growth in cylinder prints were taken into account, while recording the minimum inhibitory concentrations of antibacterial drugs for biofilms (MPCb) under positive control (see table 4).

Как показало исследование, наибольшей активностью в отношении биопленок штамма V. cholerae El Tor 18826 обладают гентамицин и доксициклин. В отношении биопленок V. cholerae El Tor 19667 - гентамицин, стрептомицин, ципрофлоксацин. Наибольшую активность в отношении биопленок штамма V. cholerae O139 16063 продемонстрировали гентамицин, тетрациклин и ципрофлоксацин, а в отношении биопленок V. cholerae O139 16077 - гентамицин, доксициклин, тетрациклин, ципрофлоксацин, налидиксовая кислота. В отношении биопленок штамма V. cholerae non O1 / non O139 16150 наиболее активными оказались ципрофлоксацин и рифампицицн, а 19190 - ципрофлоксацин и доксициклин.The study showed that gentamicin and doxycycline have the highest activity against biofilms of strain V. cholerae El Tor 18826. In relation to biofilms of V. cholerae El Tor 19667 - gentamicin, streptomycin, ciprofloxacin. The highest activity against biofilms of strain V. cholerae O139 16063 was shown by gentamicin, tetracycline and ciprofloxacin, and against biofilms of V. cholerae O139 16077 - gentamicin, doxycycline, tetracycline, ciprofloxacin, nalidixic acid. In relation to the biofilms of the strain V. cholerae non O1 / non O139 16150, ciprofloxacin and rifampicin turned out to be the most active, and 19190 ciprofloxacin and doxycycline.

Самый высокий индекс активности у доксициклина оказался в отношении штамма V. cholerae non O1 / non O13919190, тетрациклина - штаммов V. cholerae O13916063, 16077, V. cholerae non O1 / non O139 19190, левомицетина и ципрофлоксацина - V. cholerae non O1 / non O139 116150 и 19190, налидиксовой кислоты - V. cholerae O139 16077, стрептомицина - V. cholerae non O1 / non O13916160 и V. cholerae El Tor 19667, гентамицина - V. cholerae El Tor 19667, рифампицина - V. cholerae non O1 / non O13916150.The highest activity index for doxycycline was in relation to strain V. cholerae non O1 / non O13919190, tetracycline - strains V. cholerae O13916063, 16077, V. cholerae non O1 / non O139 19190, levomycetin and ciprofloxacin - V. cholerae non O1 / non O139 116150 and 19190, nalidixic acid - V. cholerae O139 16077, streptomycin - V. cholerae non O1 / non O13916160 and V. cholerae El Tor 19667, gentamicin - V. cholerae El Tor 19667, rifampicin - V. cholerae non O1 / non O13916150.

Использование предлагаемого изобретения за счет устранения многочисленных этапов исследования, изменения самого способа получения биопленок, а также оценки чувствительности биопленок большого числа штаммов V. cholerae к большому числу антибактериальных препаратов в различных концентрациях позволяет с высокой достоверностью просто и быстро оценивать по индексу активности наиболее эффективные антибиотики для лечения заболевания у конкретного больного.Using the present invention by eliminating the numerous stages of the study, changing the very method of producing biofilms, as well as evaluating the sensitivity of biofilms of a large number of V. cholerae strains to a large number of antibacterial drugs in various concentrations, it is possible to easily and quickly evaluate the most effective antibiotics for activity with high reliability treatment of the disease in a particular patient.

Источники информацииInformation sources

1. Татаренко О.А., Алексеева Л.П., Телесманич Н.Р., Шестиалтынова И.С., Чемисова О.С., Маркина О.В., Непомнящая Н.Б., Ускова Н.Н. Влияние некоторых факторов на формирование биопленки токсигенными и атоксигенными холерными вибрионами эль-тор // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2012. - №5. - С. 36-40.1. Tatarenko O.A., Alekseeva L.P., Telesmanich N.R., Shestialtynova I.S., Chemisova O.S., Markina O.V., Nepomnyashchaya N.B., Uskova N.N. The influence of some factors on the formation of biofilms with toxigenic and atoxigenic cholera vibrios el-tor // Epidemiology and Infectious Diseases. - 2012. - No. 5. - S. 36-40.

2. Чеботарь И.В., Маянский А.Н., Кончакова Е.Д. и др. Антибиотикорезистентность биопленочных бактерий. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2012; 14 (1): 51-58.2. Chebotar I.V., Mayansky A.N., Konchakova E.D. and others. Antibiotic resistance of biofilm bacteria. Clinical microbiology and antimicrobial chemotherapy. 2012; 14 (1): 51-58.

3. Ryder MA. Catheter-Related Infections: It’s All About Biofilm. // Topics in Advanced Practice Nursing Journal. - 2005; 5 (3);3. Ryder MA. Catheter-Related Infections: It’s All About Biofilm. // Topics in Advanced Practice Nursing Journal. - 2005; 5 (3);

4. Olson ME et al. Biofilm bacteria: formation and comparative susceptibility of antibiotics. Can J Vet Res 2002 April; 66 (2): 86-92.4. Olson ME et al. Biofilm bacteria: formation and comparative susceptibility of antibiotics. Can J Vet Res 2002 April; 66 (2): 86-92.

5. Определение чувствительности возбудителей опасных бактериальных инфекций (чума, сибирская язва, холера, туляремия, бруцеллез, сап, мелиоидоз) к антибактериальным препаратам. Метод, указ. МУК 4.2.2495-09. М.; 2009.5. Determination of the sensitivity of pathogens of dangerous bacterial infections (plague, anthrax, cholera, tularemia, brucellosis, glanders, melioidosis) to antibacterial drugs. Method, decree MUK 4.2.2495-09. M .; 2009.

6. Фролова Я.Н., Харсеева Г.Г., Миронов А.Ю. Чувствительность к антибиотикам биопленочных культур токсигенных штаммов Corynebacterium diphtheriae. // Клиническая лабораторная диагностика. - 2014. - Т. 59, №6. - С. 51-53.6. Frolova Ya. N., Kharseyeva G. G., Mironov A.Yu. Antibiotic sensitivity of biofilm cultures of toxigenic strains of Corynebacterium diphtheriae. // Clinical laboratory diagnostics. - 2014. - T. 59, No. 6. - S. 51-53.

7. Кам Ань Ха, Грамматикова Н.Э., Василенко И.А., Кедик С.А. Сравнительная оценка антибактериальной активности полигексаметиленгуанидина гидрохлорида и полигексаметиленгуанидина сукцината в опытах in vitro // Антибиотики и химиотерапия. - 2013. - 58 (1-2). - С. 3-7.7. Kam An Ha, Grammatikova N.E., Vasilenko I.A., Kedik S.A. Comparative evaluation of the antibacterial activity of polyhexamethylene guanidine hydrochloride and polyhexamethylene guanidine succinate in in vitro experiments // Antibiotics and chemotherapy. - 2013 .-- 58 (1-2). - S. 3-7.

8. Пат. РФ 2491348, МПК C12Q 1/04 G01N 33/569. Способ определения минимальной подавляющей концентрации антибактериального препарата / Харсеева Г.Г., Миронов А.Ю., Фролова Я.Н., Садовниченко Е.О.; - №2011140540; заявл. 06.10.2011 г.; опубл. 27.08.2013 г.8. Pat. RF 2491348, IPC C12Q 1/04 G01N 33/569. A method for determining the minimum inhibitory concentration of an antibacterial drug / Kharseeva G.G., Mironov A.Yu., Frolova Y.N., Sadovnichenko E.O .; - No. 20111140540; declared 10/06/2011; publ. 08/27/2013

9. Сидашенко О.И., Воронкова О.С., Сирокваша Е.А., Винников А.И. Влияние цефтриаксона и тетрациклина на формирование биопленки штаммами Staphylococcus epidermidis //

Ser.

Med. - 2014. - 5 (1). - С. 7-11.9. Sidashenko O.I., Voronkova O.S., Sirokvasha E.A., Vinnikov A.I. The effect of ceftriaxone and tetracycline on the formation of biofilms by strains of Staphylococcus epidermidis //

Ser.

Med. - 2014 .-- 5 (1). - S. 7-11.

10. Селянская H.A., Титова С.В., Кирилова О.Д., Веркина Л.М. // Влияние некоторых антимикробных препаратов на биопленки холерных вибрионов // Холера и патогенные для человека вибрионы // Материалы проблемной комиссии, г. Ростов-на-Дону, 2014 г., вып. 27, с. 136-138.10. Selyanskaya H.A., Titova S.V., Kirilova O.D., Verkina L.M. // Influence of some antimicrobial agents on biofilms of cholera vibrios // Cholera and human vibrios pathogenic for humans // Materials of the Problem Commission, Rostov-on-Don, 2014, vol. 27, p. 136-138.

ПримечанияNotes

ИА - индекс активности антибактериального препарата,IA - the activity index of the antibacterial drug,

МПК_Ч - максимальное значение МПК данного антибактериального препарата для чувствительных штаммов в соответствии с МУК 4.2.2495-09.IPC _H - the maximum value of the IPC of this antibacterial drug for sensitive strains in accordance with MUK 4.2.2495-09.

Claims

A method for assessing the sensitivity of cholera vibrios biofilms to antibacterial drugs, including the preparation of biofilms on a solid carrier, which is placed in a suspension of cholera vibrios at a final concentration of n × 10 ⁴ m.k. / ml and incubated at 37 ° C for at least 4 days followed by seeding on Marten agar, characterized in that the biofilm is obtained on glass cylinders with a length of 10 mm and a diameter of 8 mm, which are placed in a 50 ml vial with tap autoclaved water, a suspension of cholera vibri is introduced into the latter it is kept for 5 days in a thermostat, then the glass cylinders are taken out of the bottle with tweezers and washed three times in physiological saline, then the cylinders are placed on agar in a Petri dish, no more than 6 pieces are placed at the same distance from each other, then they are placed in the middle of the cylinder 0 , 05 ml of a solution of an antibacterial drug in different concentrations, allowing you to determine the minimum inhibitory biofilm growth concentration of BMP _b antibacterial drug, the results are taken into account after 18-20 hours of incubation at 37 ° C for the presence of sludge and the absence of growth of cholera vibrios in the prints of the cylinders, while the sensitivity of the biofilm of cholera vibrios to antibacterial drugs is evaluated by the activity index, which is determined by the formula

,

where IA is the activity index of the antibacterial drug in relation to the studied strain;

IPC _h - the maximum value of the IPC of this antibacterial drug for sensitive strains;

IPC _b - the value of the IPC of this antibacterial drug in relation to the biofilm of the studied strain,

the higher the IA, the more sensitive this strain is to an antibacterial drug.