RU2627178C2 - Method for bacillus thuringiensis strains genetic certification by means of multiplex express analysis of reference dna sequences - Google Patents
Method for bacillus thuringiensis strains genetic certification by means of multiplex express analysis of reference dna sequences Download PDFInfo
- Publication number
- RU2627178C2 RU2627178C2 RU2015156796A RU2015156796A RU2627178C2 RU 2627178 C2 RU2627178 C2 RU 2627178C2 RU 2015156796 A RU2015156796 A RU 2015156796A RU 2015156796 A RU2015156796 A RU 2015156796A RU 2627178 C2 RU2627178 C2 RU 2627178C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- seq
- sequences
- bacillus thuringiensis
- primers
- strains
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИFIELD OF TECHNOLOGY
Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии и биотехнологии и обеспечивает способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК, применяемый для генетической паспортизации коммерческих штаммов Bacillus thuringiensis.The present invention relates to the field of molecular biology and biotechnology, and provides a method for conducting multiplex rapid analysis of DNA reference sequences used for genetic certification of commercial Bacillus thuringiensis strains.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND
Bacillus thuringiensis представляет собой грамположительную спорообразующую почвенную бактерию, которая во время споруляции синтезирует большие количества кристаллического белкового эндотоксина, который может оказывать инсектицидное действие на некоторые виды насекомых.Bacillus thuringiensis is a gram-positive spore-forming soil bacterium that, during sporulation, synthesizes large amounts of crystalline protein endotoxin, which can have an insecticidal effect on some species of insects.
Указанный белок в течение длительного времени использовали в качестве микробного пестицида, в связи с чем бактерия Bacillus thuringiensis являлась объектом многих исследований. В результате таких исследований были выделены новые штаммы, обладающие не только инсектицидной, но и противовирусной активностью. Так, например, в патенте RU2405035 описан новый штамм Bacillus thuringiensis (Bt), обладающий противовирусной активностью, в частности, относительно высокопатогенного вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (A/H5N1) и антикандидозной активностью, в частности, относительно Candida albicans 620.The specified protein for a long time used as a microbial pesticide, and therefore the bacterium Bacillus thuringiensis has been the subject of many studies. As a result of such studies, new strains with not only insecticidal, but also antiviral activity were isolated. For example, in patent RU2405035 a new strain of Bacillus thuringiensis (Bt) is described having antiviral activity, in particular, against the highly pathogenic avian influenza virus A / chicken / Kurgan / 05/2005 (A / H5N1) and anti-candida activity, in particular, Candida albicans 620.
Согласно патенту RU2551236 Государственным научным центром вирусологии и биотехнологии «Вектор» был обнаружен и депонирован новый штамм Bacillus thuringiensis (Bt), обладающий противовирусной активностью, в частности, относительно высокопатогенного вируса гриппа человека A/H3N2 для получения препаратов, направленных на подавление указанного вируса.According to the patent RU2551236 by the State Scientific Center for Virology and Biotechnology "Vector", a new strain of Bacillus thuringiensis (Bt) was discovered and deposited with antiviral activity, in particular, with respect to the highly pathogenic human influenza virus A / H3N2 for the production of drugs aimed at suppressing this virus.
В патенте RU2178798 описан выделенный и очищенный белок, происходящий из Bacillus thuringiensis var. thuringiensis, имеющий молекулярную массу приблизительно 20 кДа, определенную с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ, и чувствительность к протеазам и кислым условиям, проявляющий цитотоксическое действие против опухолевых клеток.Patent RU2178798 describes an isolated and purified protein derived from Bacillus thuringiensis var. thuringiensis having a molecular weight of approximately 20 kDa, determined by SDS-PAGE electrophoresis, and sensitivity to proteases and acidic conditions, exhibiting a cytotoxic effect against tumor cells.
В заявке RU2003109416 предложен инсектицидный препарат на основе бактерий Bacillus thuringiensis, содержащий в качестве действующего начала растворенный дельта-эндотоксин, а в составе целевых добавок растворитель, прилипатель-стабилизатор, наполнитель.In the application RU2003109416, an insecticidal preparation based on the bacteria Bacillus thuringiensis is proposed, containing dissolved active delta-endotoxin as an active ingredient, and in the composition of target additives a solvent, an adhesive-stabilizer, a filler.
Инсектицидные белки, локализованные в указанных бактериях, разделяют по размерам на три класса: 133-145 кДа, 65-67 кДа и 27 кДа.Insecticidal proteins localized in these bacteria are divided by size into three classes: 133-145 kDa, 65-67 kDa and 27 kDa.
Различные подвиды бактерии Bacillus thuringiensis могут экспрессировать один или более классов размеров.Various subspecies of the bacterium Bacillus thuringiensis can express one or more size classes.
Белок 133-145 кДа является пиротоксином, который при расщеплении протеазами средней части желудочно-кишечного тракта дает аминоконцевой фрагмент приблизительно 67 кДа, который содержит токсиновую часть молекулы. Токсин 67 кДа имеет значительную структурную гомологию с токсинами из различных других подвидов Bacillus thuringiensis. Однако токсин 27 кДа не обнаруживает гомологии с любым токсином из других классов токсинов, но является высокогомологичным в пределах этого подвида. Так, например, при клонировании гена для токсина 27 кДа из подвидов israeliensis (Bacillus thuringiensis israeliensis), kyushunsis (Bacillus thuringiensis kursataki) и morrisoni (Bacillus thuringiensis morrisoni) было обнаружено, что токсин Bacillus thuringiensis israeliensis отличается одним основанием от токсина Bacillus thuringiensis morrisoni; тогда как он только на 39% идентичен токсину Bacillus thuringiensis kursataki (Waalaijk et al., 1985; Ward and Ellar, 1986; Ward et al., 1986; Galjart et al., 1987; Koni and Ellar, 1993). Было также показано, что токсины из различных подвидов являются цитолитическими в отношении клеток насекомых в культуре.Protein 133-145 kDa is a pyrotoxin that, when proteases cleaved the middle part of the gastrointestinal tract, gives an amino-terminal fragment of approximately 67 kDa, which contains the toxin part of the molecule. The 67 kDa toxin has significant structural homology with toxins from various other subspecies of Bacillus thuringiensis. However, the 27 kDa toxin does not show homology with any toxin from other classes of toxins, but is highly homologous within this subspecies. For example, when cloning a gene for a 27 kDa toxin from the subspecies israeliensis (Bacillus thuringiensis israeliensis), kyushunsis (Bacillus thuringiensis kursataki) and morrisoni (Bacillus thuringiensis morrisoni), it was found that the toxin Bacillusraelus thuringiensiensisiurisiensiisisisiurisiensiisisisiurisiensiisensiisensiisensiisensiisensiisiensiisiensisiurisiensisiurisiensisiurisiensisiurisiensisiurisiensisiurisiensisiurisiensiurisiensis whereas it is only 39% identical to the toxin Bacillus thuringiensis kursataki (Waalaijk et al., 1985; Ward and Ellar, 1986; Ward et al., 1986; Galjart et al., 1987; Koni and Ellar, 1993). It has also been shown that toxins from various subspecies are cytolytic in relation to insect cells in culture.
Ведомственная коллекция полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (ВКСМ) поддерживает 37 штаммов Bacillus thuringiensis, обладающих выраженной энтомоцидной активностью и используемых для производства препаратов фитозащитного действия (битоксибациллин, бактокулицид, бацикол). Эффективность производимых биопрепаратов зависит от качества микробного материала.The departmental collection of beneficial microorganisms for agricultural purposes (VKSM) supports 37 strains of Bacillus thuringiensis, which have pronounced entomocidal activity and are used for the production of phyto-protective drugs (bitoxibacillin, bactoculicide, bacicol). The effectiveness of the biological products produced depends on the quality of the microbial material.
Исследования показывают, что контроль за чистотой и аутентичностью коммерческих штаммов может осуществляться с помощью их молекулярно-генетической паспортизации.Studies show that the purity and authenticity of commercial strains can be monitored using their molecular genetic certification.
Идентификация штаммов различных бактерий широко применяется в области техники. Так, например, в патенте RU2486251 представлен способ идентификации и дифференциации прокариотического микроорганизма, содержащего hin-регион, предусматривающий выделение и/или концентрирование ДНК, присутствующей в образце, амплификацию межгенного региона, визуализацию и секвенирование амплифицированных продуктов, а также сравнение полученных продуктов амплификации и их нуклеотидных последовательностей с известными, причем в качестве межгенного региона в указанном способе используют нуклеотидную последовательность, расположенную между копиями генов тРНК-Глю, представляющую собой hin-регион, которую амплифицируют с помощью родоспецифичных праймеров и секвенируют, идентификацию и дифференциацию прокариотических микроорганизмов проводят при этом на основании количества, длины и нуклеотидной последовательности продуктов такой реакции, характеризующих hin-регион.Identification of strains of various bacteria is widely used in the field of technology. So, for example, in patent RU2486251, a method for identifying and differentiating a prokaryotic microorganism containing a hin region is provided, which involves isolation and / or concentration of DNA present in the sample, amplification of the intergenic region, visualization and sequencing of amplified products, as well as comparison of the obtained amplification products and their nucleotide sequences with known, and as the intergenic region in the specified method using the nucleotide sequence located between duplicate tRNA-Glu genes, which is a hin region, which is amplified using genus-specific primers and sequenced, identification and differentiation of prokaryotic microorganisms is carried out in this case on the basis of the number, length and nucleotide sequence of the products of such a reaction characterizing the hin region.
Согласно патенту RU2561469 описан способ определения геновариантов штаммов возбудителя чумы методом мультилокусного секвенирования, включающий выделение хромосомной ДНК исследуемого штамма, амплификацию ДНК мишеней в полимеразной цепной реакции с использованием сконструированных праймеров, секвенирование амплифицированных фрагментов, выявление в них замен единичных нуклеотидов, маркерных для отдельных геновариантов, и определение геновариантов.According to patent RU2561469, a method is described for determining the genovariants of plague pathogen strains by multilocus sequencing, including the extraction of chromosomal DNA of the studied strain, amplification of target DNA in the polymerase chain reaction using designed primers, sequencing of amplified fragments, identification of single nucleotide and marker substitutions for them, for single marker nucleotides determination of genovariants.
Однако указанный способ также не может быть использован для генетической паспортизации коммерческих штаммов Bacillus thuringiensis.However, this method also cannot be used for genetic certification of commercial strains of Bacillus thuringiensis.
Согласно патенту СА2086405 предложен способ применения праймеров для полимеразной цепной реакции (ПЦР) для определения штаммов бактерии Bacillus thuringiensis, а также набор и способ, основанные на применении указных праймеров.According to patent CA2086405, a method for the use of polymerase chain reaction (PCR) primers for determining strains of the bacterium Bacillus thuringiensis, as well as a kit and method based on the use of these primers, is proposed.
Недостатком указанного способа можно считать невозможность определения конкретного штамма Bacillus thuringiensis, т.е. невозможность использования метода для паспортизации штаммов.The disadvantage of this method can be considered the impossibility of determining a specific strain of Bacillus thuringiensis, i.e. the inability to use the method for the certification of strains.
В патенте DE19904795 предложен способ, позволяющий разделить виды Bacillus cereus и Bacillus thuringiensis от других видов бацилл на основе полиморфизма определенных последовательностей ДНК. Однако указанный способ также не позволяет определить конкретный штамм Bacillus, т.е. его невозможно использовать для паспортизации штаммов.DE19904795 proposes a method for separating the species of Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis from other species of bacilli based on the polymorphism of certain DNA sequences. However, this method also does not allow to determine a specific strain of Bacillus, i.e. it cannot be used for certification of strains.
Патент RU2415948 описывает способ подвидовой дифференциации штаммов Yersinia pestis методом мультилокусного сиквенс-типирования, включающий выделение хромосомной ДНК исследуемого штамма, проведение полимеразной цепной реакции с амплификацией фрагментов генов, анализ результатов, отличающийся тем, что при проведении ПЦР используют олигонуклеотидные праймеры на гены rhaS, araC, metB, aspA и thiH, имеющие следующие последовательности: 
в полученной нуклеотидной последовательности фрагментов генов rhaS, araC, metB, aspA и thiH по нуклеотидам, находящимся в позициях 482, 494, 671 гена rhaS, в позиции 773 гена araC, в 988 и 989 гена metB, в 1087-1089 гена aspA и 552 гена thiH, определяют генотип штамма, по аллелям генов rhaS, araC, metB, aspA и thiH устанавливают сиквенс-тип (ST) штамма Y.pestis с последующей дифференциацией штаммов путем сравнения установленного сиквенс-типа с сиквенс-типами основного и неосновных подвидов.in the obtained nucleotide sequence of fragments of rhaS, araC, metB, aspA, and thiH genes for nucleotides located at positions 482, 494, 671 of the rhaS gene, at position 773 of the araC gene, in 988 and 989 of the metB gene, in 1087-1089 of the aspA and 552 gene of the thiH gene, the strain genotype is determined, the sequence type (ST) of the Y. pestis strain is determined by the alleles of the rhaS, araC, metB, aspA, and thiH genes, followed by differentiation of the strains by comparing the established sequence type with the sequence types of the main and non-main subspecies.
Однако указанный способ не позволяет разделить штаммы в пределах одного биовара.However, this method does not allow to separate the strains within the same biovar.
В настоящее время наиболее эффективной технологией доскональной генетической характеристики штаммов микроорганизмов считается полногеномное секвенирование. При этом, несмотря на несомненную востребованность полногеномного секвенирования для паспортизации коммерческих штаммов, ее широкое применение ограничивается значительной трудозатратностью и себестоимостью. Поэтому для удешевления анализа и сокращения сроков его выполнения необходима разработка экспресс-методов высокопроизводительного секвенирования, позволяющих определять конкретные подвиды бактерии Bacillus thuringiensis.At present, genome sequencing is considered the most effective technology for the thorough genetic characterization of microorganism strains. Moreover, despite the undoubted demand for full-genome sequencing for the certification of commercial strains, its widespread use is limited by significant labor costs and cost. Therefore, in order to reduce the cost of analysis and shorten its execution time, it is necessary to develop express methods of high throughput sequencing, which make it possible to determine specific subspecies of the bacterium Bacillus thuringiensis.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION
В ходе экспериментов было неожиданно обнаружено, что одним из решений поставленной задачи может быть анализ не всего генома, а наиболее таксономически и функционально значимых генетических локусов (так называемого референт-комплекса). Не желая быть связанными какой-либо определенной теорией, авторы настоящего изобретения полагают, что указанный результат достигается с помощью стадии мультиплексного пиросеквенирования с использованием праймеров, содержащих определенные последовательности (SEQ ID NO: 1-60), представленные в настоящем изобретении.During the experiments, it was unexpectedly discovered that one of the solutions to the problem posed could be an analysis of not the whole genome, but the most taxonomically and functionally significant genetic loci (the so-called referent complex). Not wanting to be bound by any particular theory, the authors of the present invention believe that this result is achieved using the multiplex pyrosequencing step using primers containing specific sequences (SEQ ID NO: 1-60) provided in the present invention.
Таким образом, в настоящем изобретении предложен способ генетической паспортизации штаммов Bacillus thuringiensis с помощью проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК, включающий:Thus, the present invention provides a method for the genetic certification of Bacillus thuringiensis strains using a multiplex rapid analysis of DNA reference sequences, including:
а) выделение бактериальной ДНК;a) isolation of bacterial DNA;
б) проведение мультилокусной ПЦР для получения референт-комплексов ДНК с использованием праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 1-60 и их комбинаций;b) conducting multilocus PCR to obtain DNA reference complexes using primers containing the sequences of SEQ ID NO: 1-60 and their combinations;
в) пиросеквенирование полученных референт-комплексов ДНК для получения уникальных генетических паспортов штаммов Bacillus thuringiensis, достаточных для разделения штаммов в пределах одного биовара.c) pyrosequencing of the obtained DNA reference complexes to obtain unique genetic passports of Bacillus thuringiensis strains sufficient to separate the strains within one biovar.
В частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов Bacillus thuringiensis включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 53.In the particular case of the implementation of the present invention, the method of conducting multiplex rapid analysis of the reference DNA sequences of strains of Bacillus thuringiensis involves the use of a specific combination of primers containing the sequences SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 53.
В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов Bacillus thuringiensis включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 55.In another particular embodiment of the present invention, a method for conducting rapid multiplex analysis of the reference DNA sequences of Bacillus thuringiensis strains involves the use of a specific combination of primers containing the sequences SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 55.
В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов Bacillus thuringiensis включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 57.In another particular embodiment of the present invention, a method for conducting multiplex rapid analysis of DNA reference sequences of Bacillus thuringiensis strains involves the use of a specific combination of primers containing the sequences SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 57.
В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов Bacillus thuringiensis включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 31.In another particular embodiment of the present invention, a method for conducting rapid multiplex analysis of DNA reference sequences of Bacillus thuringiensis strains involves the use of a specific combination of primers containing the sequences SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 31.
В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов Bacillus thuringiensis включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 35.In another particular embodiment of the present invention, a method for conducting multiplex rapid analysis of the reference DNA sequences of Bacillus thuringiensis strains involves the use of a specific combination of primers containing the sequences SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 35.
В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов Bacillus thuringiensis включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43.In another particular embodiment of the present invention, a method for conducting multiplex rapid analysis of the reference DNA sequences of the Bacillus thuringiensis strains involves the use of a specific combination of primers containing the sequences SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43.
В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов Bacillus thuringiensis включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 54.In another particular embodiment of the present invention, a method for conducting multiplex rapid analysis of reference DNA sequences of Bacillus thuringiensis strains involves the use of a specific combination of primers containing the sequences SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 54.
В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов Bacillus thuringiensis включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 56.In another particular embodiment of the present invention, a method for conducting rapid multiplex analysis of DNA reference sequences of Bacillus thuringiensis strains involves the use of a specific combination of primers containing the sequences SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 56.
В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов Bacillus thuringiensis включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 58.In another particular embodiment of the present invention, a method for conducting multiplex rapid analysis of DNA reference sequences of Bacillus thuringiensis strains involves the use of a specific combination of primers containing the sequences SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 58.
В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов Bacillus thuringiensis включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 32.In another particular embodiment of the present invention, a method for conducting rapid multiplex analysis of reference DNA sequences of Bacillus thuringiensis strains involves the use of a specific combination of primers containing the sequences SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 32.
В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов Bacillus thuringiensis включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 36.In another particular embodiment of the present invention, a method for conducting multiplex rapid analysis of DNA reference sequences of Bacillus thuringiensis strains involves the use of a specific combination of primers containing the sequences SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 36.
В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов Bacillus thuringiensis включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 44.In another particular embodiment of the present invention, a method for conducting multiplex rapid analysis of DNA reference sequences of Bacillus thuringiensis strains involves the use of a specific combination of primers containing the sequences SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 44.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Используемые в настоящей заявке термины и определения являются общеупотребительными и понятными для специалиста в данной области техники.The terms and definitions used in this application are commonly used and understood by a person skilled in the art.
В настоящем изобретении предложен способ генетической паспортизации штаммов Bacillus thuringiensis с помощью проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК с использованием праймеров, позволяющий каждому штамму Bacillus thuringiensis создать свой генетический паспорт с уникальным набором фрагментов ДНК.The present invention provides a method for genetic certification of Bacillus thuringiensis strains by means of multiplex rapid analysis of DNA reference sequences using primers, which allows each Bacillus thuringiensis strain to create its own genetic passport with a unique set of DNA fragments.
Таким образом, заявляемый способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов Bacillus thuringiensis включает:Thus, the claimed method of conducting multiplex rapid analysis of reference DNA sequences of strains of Bacillus thuringiensis includes:
а) выделение бактериальной ДНК,a) the isolation of bacterial DNA,
б) проведение мультилокусной ПЦР для получения референт-комплексов ДНК с использованием праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 1-60 и их комбинаций,b) conducting multilocus PCR to obtain DNA reference complexes using primers containing the sequences of SEQ ID NO: 1-60 and their combinations,
в) пиросеквенирование полученных референт-комплексов ДНК для получения уникальных генетических паспортов штаммов Bacillus thuringiensis, достаточных для разделения штаммов в пределах одного биовара.c) pyrosequencing of the obtained DNA reference complexes to obtain unique genetic passports of Bacillus thuringiensis strains sufficient to separate the strains within one biovar.
При необходимости в дальнейшем проверить, например, для цели защиты прав, проверки качества продукта и т.д., не используется ли в каком-либо препарате исходный штамм Bacillus thuringiensis, из этого препарата выделяют содержащийся в нем штамм и при помощи заявленного способа получают генетический паспорт выделенного штамма, после чего проводят аутентификацию исходного штамма в этом препарате путем сравнения генетических паспортов выделенного штамма и исходного штамма Bacillus thuringiensis. При этом заявленный способ позволяет идентифицировать штамм Bacillus thuringiensis очень точно - в пределах одного биовара.If necessary, further check, for example, for the purpose of protecting the rights, checking the quality of the product, etc., whether the original strain of Bacillus thuringiensis is used in any preparation, the strain contained in it is isolated from this preparation and using the claimed method a genetic passport of the isolated strain, after which the original strain is authenticated in this preparation by comparing the genetic passports of the isolated strain and the original Bacillus thuringiensis strain. Moreover, the claimed method allows to identify the strain of Bacillus thuringiensis very accurately - within the same biovar.
Описание предпочтительных вариантов реализации изобретенияDescription of preferred embodiments of the invention
В одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов Bacillus thuringiensis включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 53.In one particular embodiment of the present invention, a method for conducting rapid multiplex analysis of the reference DNA sequences of Bacillus thuringiensis strains involves the use of a specific combination of primers containing the sequences SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 25 , SEQ ID NO: 53.
В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов Bacillus thuringiensis включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 55.In another particular embodiment of the present invention, a method for conducting rapid multiplex analysis of the reference DNA sequences of Bacillus thuringiensis strains involves the use of a specific combination of primers containing the sequences SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 55.
В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов Bacillus thuringiensis включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 57.In another particular embodiment of the present invention, a method for conducting multiplex rapid analysis of DNA reference sequences of Bacillus thuringiensis strains involves the use of a specific combination of primers containing the sequences SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 57.
В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов Bacillus thuringiensis включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 31.In another particular embodiment of the present invention, a method for conducting rapid multiplex analysis of DNA reference sequences of Bacillus thuringiensis strains involves the use of a specific combination of primers containing the sequences SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 31.
В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов Bacillus thuringiensis включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 35.In another particular embodiment of the present invention, a method for conducting multiplex rapid analysis of the reference DNA sequences of Bacillus thuringiensis strains involves the use of a specific combination of primers containing the sequences SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 35.
В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов Bacillus thuringiensis включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43.In another particular embodiment of the present invention, a method for conducting multiplex rapid analysis of the reference DNA sequences of the Bacillus thuringiensis strains involves the use of a specific combination of primers containing the sequences SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43.
В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов Bacillus thuringiensis включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 54.In another particular embodiment of the present invention, a method for conducting multiplex rapid analysis of reference DNA sequences of Bacillus thuringiensis strains involves the use of a specific combination of primers containing the sequences SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 54.
В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов Bacillus thuringiensis включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 56.In another particular embodiment of the present invention, a method for conducting rapid multiplex analysis of DNA reference sequences of Bacillus thuringiensis strains involves the use of a specific combination of primers containing the sequences SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 56.
В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов Bacillus thuringiensis включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 58.In another particular embodiment of the present invention, a method for conducting multiplex rapid analysis of DNA reference sequences of Bacillus thuringiensis strains involves the use of a specific combination of primers containing the sequences SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 58.
В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов Bacillus thuringiensis включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 32.In another particular embodiment of the present invention, a method for conducting rapid multiplex analysis of reference DNA sequences of Bacillus thuringiensis strains involves the use of a specific combination of primers containing the sequences SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 32.
В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов Bacillus thuringiensis включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 36.In another particular embodiment of the present invention, a method for conducting multiplex rapid analysis of DNA reference sequences of Bacillus thuringiensis strains involves the use of a specific combination of primers containing the sequences SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 36.
В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов Bacillus thuringiensis включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 44.In another particular embodiment of the present invention, a method for conducting multiplex rapid analysis of DNA reference sequences of Bacillus thuringiensis strains involves the use of a specific combination of primers containing the sequences SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 44.
Следующие ниже примеры представлены исключительно для целей иллюстрации реализации данного изобретения и никоим образом не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения.The following examples are presented solely for the purpose of illustrating the implementation of the present invention and should in no way be construed as limiting the scope of the present invention.
ПРИМЕРЫEXAMPLES
1. Выделение бактериальной ДНК1. Isolation of bacterial DNA
Общую ДНК бактерий выделяли по следующей методике: 1,5±0,1 мл ночной культуры клеток центрифугировали при 14000 об/мин в течение 2 мин. Надосадочную жидкость удаляли, а клетки ресуспендировали в 500 буфера ТЕ (10 ммоль Трис-HCl, 5 ммоль ЭДТА, рН-8,0). К суспензии добавляли лизоцим (1 мг/мл) и инкубировали 5 мин при комнатной температуре. Затем добавляли SDS до концентрации 0,5% и протеиназу К до концентрации 0,05 мг/мл и инкубировали при 37°С в течение 1 ч. Окончательное разрушение клеток проводили методом встряхивания со стеклянными шариками в гомогенизаторе FastPrep24 при максимальной мощности в течение 1 мин.The total bacterial DNA was isolated according to the following procedure: 1.5 ± 0.1 ml of overnight cell culture was centrifuged at 14000 rpm for 2 minutes. The supernatant was removed and the cells were resuspended in 500 TE buffer (10 mmol Tris-HCl, 5 mmol EDTA, pH-8.0). Lysozyme (1 mg / ml) was added to the suspension and incubated for 5 min at room temperature. Then SDS was added to a concentration of 0.5% and proteinase K to a concentration of 0.05 mg / ml and incubated at 37 ° C for 1 h. The final cell destruction was carried out by shaking with glass beads in a FastPrep24 homogenizer at maximum power for 1 min .
Далее проводили экстракцию смесью фенола, хлороформа и изоамилового спирта (24:24:1). ДНК осаждали двумя объемами этанола 5±1 мин при комнатной температуре. Раствор центрифугировали 2 мин при 14000 об/мин, удаляли супернатант, осадок промывали 70±2% этанолом, подсушивали и растворяли в 100 мкл дистиллированной воды.Then, extraction was carried out with a mixture of phenol, chloroform and isoamyl alcohol (24: 24: 1). DNA was precipitated with two volumes of ethanol for 5 ± 1 min at room temperature. The solution was centrifuged for 2 min at 14,000 rpm, the supernatant was removed, the precipitate was washed with 70 ± 2% ethanol, dried and dissolved in 100 μl of distilled water.
2. Проведение мультилокусной ПЦР для получения референт-комплексов ДНК2. Carrying out multilocus PCR to obtain DNA reference complexes
Для проведения мультилокусной ПЦР использовали следующие праймеры: 
Смеси праймеров готовили следующим образом.Mixtures of primers were prepared as follows.
Для приготовления смесей праймеров F отбирали по 3,5 мкл 10 0,5 рМ раствора каждого праймера F и перемешивали на вортексе. Аналогично готовили смеси праймеров R.To prepare primer F mixtures, 3.5 μl of a 10 0.5 rM solution of each primer F was selected and mixed on a vortex. Similarly prepared a mixture of primers R.
Комбинации праймеров, используемые для мультилокусного пиросеквенирования:Primer combinations used for multilocus pyrosequencing:
Для проведения мультилокусной ПЦР использовали следующие параметры.The following parameters were used for multilocus PCR.
Состав реакционной смеси: 
Режим проведения ПЦР: PCR mode:
Амплифицированную ДНК визуализировали с помощью электрофореза в 1 % агарозном геле с использованием маркера GeneRuler 100 bp DNA Ladder (Fermentas) для оценки наличия амплификатов нужного размера.Amplified DNA was visualized by electrophoresis on a 1% agarose gel using a GeneRuler 100 bp DNA Ladder marker (Fermentas) to assess the presence of amplitudes of the desired size.
3. Проведение пиросеквенирования образцов ДНК3. Pyrosequencing of DNA samples
Нуклеотидную последовательность референт-комплекса определяли на пиросеквенаторе Junior GS (Roche Applied Science, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Работу по сборке ридов и анализу референт-комплексов проводили с помощью программы CLC Genomics Workbench 7.5.1. (http://www.clcbio.com/products/latest-improvements/).The nucleotide sequence of the referent complex was determined on a Junior GS pyrosequencer (Roche Applied Science, USA) in accordance with the manufacturer's recommendations. The work on assembling reeds and analyzing referent complexes was carried out using the CLC Genomics Workbench 7.5.1 program. (http://www.clcbio.com/products/latest-improvements/).
Таким образом, заявляемый способ генетической паспортизации штаммов Bacillus thuringiensis с помощью проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК позволяет определять конкретные подвиды бактерии Bacillus thuringiensis в пределах одного биовара. При этом в отличие от способов, использующих полногеномное секвенирование, он является высокопроизводительным и характеризуется значительно меньшей трудозатратностью и себестоимостью, его применение приводит к сокращению сроков анализа и удешевлению его выполнения. Сравнение современных методов паспортизации штаммов, полученное опытным путем, приведено ниже в таблице.Thus, the inventive method for the genetic certification of strains of Bacillus thuringiensis using a multiplex rapid analysis of DNA reference sequences allows you to determine specific subspecies of the bacterium Bacillus thuringiensis within a single biovar. At the same time, unlike methods using full-genome sequencing, it is highly productive and is characterized by much lower labor input and cost, its use leads to a reduction in the analysis time and the cost of its implementation. A comparison of modern methods for certification of strains obtained experimentally is shown in the table below.
Любые патенты или публикации, упомянутые в этой заявке, являются показательными в отношении уровней квалификации специалистов в данной области, к которым имеет отношение данное изобретение. Эти патенты и публикации включены в настоящую заявку в качестве ссылки в полном объеме.Any patents or publications mentioned in this application are indicative of the skill levels of those skilled in the art to which this invention relates. These patents and publications are incorporated herein by reference in full.
Специалисту в данной области будет понятно, что представленные примеры вместе со способами, описанными в настоящей заявке, являются в настоящее время типичными предпочтительными вариантами, являются примерами и не предназначены для ограничения объема изобретения. Любые модификации, очевидные для специалиста в данной области техники, являются частью изобретательского замысла согласно настоящей заявке и должны быть также включены в объем настоящего изобретения.One skilled in the art will understand that the presented examples, together with the methods described in this application, are currently typical preferred options, are examples and are not intended to limit the scope of the invention. Any modifications obvious to a person skilled in the art are part of the inventive concept according to the present application and should also be included in the scope of the present invention.
Claims (16)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015156796A RU2627178C2 (en) | 2015-12-29 | 2015-12-29 | Method for bacillus thuringiensis strains genetic certification by means of multiplex express analysis of reference dna sequences |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015156796A RU2627178C2 (en) | 2015-12-29 | 2015-12-29 | Method for bacillus thuringiensis strains genetic certification by means of multiplex express analysis of reference dna sequences |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2015156796A RU2015156796A (en) | 2017-07-04 |
| RU2627178C2 true RU2627178C2 (en) | 2017-08-03 |
Family
ID=59309415
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015156796A RU2627178C2 (en) | 2015-12-29 | 2015-12-29 | Method for bacillus thuringiensis strains genetic certification by means of multiplex express analysis of reference dna sequences |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2627178C2 (en) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6878519B1 (en) * | 2002-01-24 | 2005-04-12 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Air Force | DNA probes for specific genes of anthrax |
-
2015
- 2015-12-29 RU RU2015156796A patent/RU2627178C2/en active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6878519B1 (en) * | 2002-01-24 | 2005-04-12 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Air Force | DNA probes for specific genes of anthrax |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Сафронова В.И. и др. Полногеномное секвенирование и сравнительный анализ генов "домашнего хозяйства" и вирулентности у коммерческих штаммов Bacillus thuringiensis с энтомоцидным действием. Сельскохозяйственная биология, 2015, том 50, 3, стр.332-338. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2015156796A (en) | 2017-07-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11807848B2 (en) | High throughput discovery of new genes from complex mixtures of environmental microbes | |
| Fujikawa et al. | Sensitive and robust detection of citrus greening (huanglongbing) bacterium “Candidatus Liberibacter asiaticus” by DNA amplification with new 16S rDNA-specific primers | |
| JP2005504508A5 (en) | ||
| US20100311041A1 (en) | Pcr diagnostics of dermatophytes and other pathogenic fungi | |
| Fránová et al. | Genetic diversity of Czech ‘Candidatus Phytoplasma mali’strains based on multilocus gene analyses | |
| Zheng et al. | Characterization of five molecular markers for pathotype identification of the clubroot pathogen Plasmodiophora brassicae | |
| Olukayode et al. | Dynamic insertion of Pot3 in AvrPib prevailing in a field rice blast population in the Philippines led to the high virulence frequency against the resistance gene Pib in rice | |
| Zhou et al. | PCR methods for the rapid detection and identification of four pathogenic Legionella spp. and two Legionella pneumophila subspecies based on the gene amplification of gyrB | |
| Brylińska et al. | Evaluation of PCR markers for Phytophthora infestans mating type determination | |
| EP3428291A3 (en) | Ion torrent genomic sequencing | |
| JP5522820B2 (en) | Method for detecting pathogens of strawberry important diseases and primers for detection | |
| Poon et al. | Differential gene expression analysis of Secreted in Xylem (SIX) genes from Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4 in Musa acuminata cv. Berangan and potential application for early detection of infection | |
| Damchuay et al. | High nucleotide sequence variation of avirulent gene, AVR-Pita1, in Thai rice blast fungus population | |
| Mouton et al. | Identification of a polymorphic collagen-like protein in the crustacean bacteria Pasteuria ramosa | |
| Fernández et al. | Draft Genome Sequence of “Candidatus Phytoplasma pruni”(X-disease group, subgroup 16SrIII-B) strain ChTDIII from Argentina | |
| RU2627178C2 (en) | Method for bacillus thuringiensis strains genetic certification by means of multiplex express analysis of reference dna sequences | |
| JP2016500276A (en) | Isolation of probability-directed nucleotide sequences | |
| JP2016500276A5 (en) | ||
| Sierra-Arguello et al. | The use of FTA cards for transport and detection of gyr A mutation of Campylobacter jejuni from poultry | |
| Voronina et al. | Regularities of the ubiquitous polyhostal microorganisms selection by the example of three taxa | |
| Kumar et al. | Identification and Characterization of Staphylococcus aureus 16S rRNA gene isolated from different Food Specimens from South Indian Region | |
| Ohadi et al. | Evaluation of Genetic Content of the CRISPR Locus in Listeria monocytogenes Isolated From Clinical, Food, Seafood and Animal Samples in Iran | |
| US20100055703A1 (en) | Organism-Specific Hybridizable Nucleic Acid Molecule | |
| CN105132563B (en) | A kind of primer sets and detection method of the detection of aphid fungal component multiplex PCR | |
| RU2552611C2 (en) | Method of subspecies differentiation of plague agent strains using polymerase chain reaction method |