RU2622009C1 - Способ формирования биорезорбируемой полимерной клеточной матрицы для регенерации ткани - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области фармацевтики и представляет собой способ формирования биорезорбируемой полимерной клеточной матрицы для регенерации ткани, заключающийся в том, что изготавливают литографией комплект двумерных матриц в виде пленки полимера с поверхностными массивами микро- и нанообъектов, которые для каждой двумерной матрицы выполняют с индивидуальной архитектурой, системностью и взаимосвязанностью расположения в архитектуре микро- и нанообъектов, с возможностью задания структуры костной ткани, подлежащей формированию, с учетом ее биологических функций, с возможностью обеспечения механической поддержки, управления процессами дифференцировки и пролиферации клеток, затем двумерные матрицы собирают в каркас-носитель для клеточных культур и биологических агентов, ориентируя их друг относительно друга с возможностью задания структуры костной ткани и фиксируя в стопку, отличающийся тем, что сборку осуществляют в жидкой среде, отверждаемой при фотоэкспонировании в биорезорбируемый полимер, двумерные матрицы последовательно устанавливают друг относительно друга с зазором, в котором в процессе последовательной установки посредством проекционной трехмерной печати с использованием цифрового проектора получают слои биорезорбируемого полимера, содержащие массивы микрообъектов с индивидуальной архитектурой, системностью и взаимосвязанностью расположения их в архитектуре возможностью задания внешней формы и внутренней трехмерной структуры матрицы, согласно трехмерной компьютерной модели кости, с возможностью обеспечения механической поддержки, управления процессами дифференцировки и пролиферации клеток в ортогональном направлении относительно поверхности двумерных матриц. Изобретение обеспечивает повышение точности имитации структуры, формируемой (восстанавливаемой) ткани, достижение точности имитации в трех измерениях (объемной точности); задание трехмерной формы матрицы копирующей форму кости, основываясь на трехмерной компьютерной модели кости, задающей как внешнюю форму, так и внутреннюю трехмерную микроструктуру. 10 з.п. ф-лы, 3 ил., 3 пр.

Description

Техническое решение относится к медицине, в частности к травматологии, ортопедии, регенеративной медицине, стоматологии, челюстно-лицевой хирургии, и может быть использовано в процессах регенерации и создания новых тканей и органов при проведении терапевтической реконструкции поврежденных органов.

Известен способ формирования биорезорбируемой полимерной клеточной матрицы для регенерации ткани (Michael А.К. Liebschner (ed.), Computer-Aided Tissue Engineering, Methods in Molecular Biology, vol. 868, Springer Science+Business Media, LLC 2012, chapter 17 «Projection Printing of 3-Dimensional Tissue Scaffolds», Yi Lu and Scaochen Chen, p.p. 289-302), заключающийся в формировании матрицы посредством проекционной трехмерной печати (3D-печать) с использованием цифровых проекторов (DLP-принтер) послойно. На платформу наносят слой исходного жидкого отверждаемого при фотоэкспонировании материала, затем DLP-принтером проецируют изображение целого слоя до отверждения материала слоя, после чего наносят следующий слой и снова проецируют изображение слоя до отверждения материала слоя. Проецирование до отверждения материала каждого слоя осуществляют согласно цифровой трехмерной модели, которую в виде программы закладывают в компьютер, реализуя при этом возможность управления процессом формирования послойно. Операцию со слоями повторяют необходимое для изготовления трехмерной матрицы количество раз.

К причинам, препятствующим достижению технического результата, относится следующее.

Послойная 3D-печать легко справляется с макро- и микро- размерами. Однако она не пригодна для формирования нанообъектов. 3D-печатью невозможно создавать наноструктурированные поверхности с массивами нанообъектов, которые необходимы для адгезии клеток и запуска управления процессами дифференцировки и пролиферации клеток, а также обеспечения механической поддержки.

За ближайший аналог к заявляемому техническому решению принят способ формирования биорезорбируемой полимерной клеточной матрицы для регенерации ткани, раскрытый в описании запатентованного устройства - биорезорбируемой полимерной клеточной матрице (см. описание к патенту РФ №2563621 на изобретение, МПК: A61F 2/02 (2006.01)).

Способ включает следующее.

В процессе формирования матрицы сначала изготавливают комплект N двумерных матриц. Каждую из двумерных матриц комплекта получают с помощью литографии в виде пленки полимера с поверхностными массивами микро- и/или нанообъектов. В отношении каждой из двумерных матриц комплекта выполняют массивы микро- и/или нанообъектов с индивидуальной архитектурой, системностью и взаимосвязанностью расположения в архитектуре микро- и/или нанообъектов, с возможностью задания структуры костной ткани комплектом двумерных матриц, подлежащей формированию, с учетом ее биологических функций, с возможностью обеспечения механической поддержки, управления процессами дифференцировки и пролиферации клеток. После изготовления комплекта двумерных матриц собирают каркас-носитель для клеточных культур и биологических агентов, ориентируя друг относительно друга N двумерных матриц с возможностью задания структуры костной ткани. При сборке указанные двумерные матрицы фиксируют в стопку. Каждой из двумерных матриц задают двумерную структуру формируемой ткани - структуру в плоскости, сборкой матриц в стопку ориентированным образом друг относительно друга обеспечивают задание трехмерной структуры - структуры в объеме. Причем сборку двумерных матриц производят после заселения каждой матрицы клеточной культурой и биологическими агентами. При сборке N ориентированных друг относительно друга двумерных матриц их устанавливают с примыканием друг к другу или с зазором.

В качестве материала для изготовления каждой из двумерных матриц используют полимер молочной кислоты или полимер молочной кислоты с сополимерами, в частности, используют поли-L-лактид: «PURASORB PL 18», «PURASORB PL 38» и «PURASORB PL 65».

Каркас-носитель из N ориентированных друг относительно друга двумерных матриц получают с фиксацией матриц посредством геля на основе гиалуроновой кислоты с содержанием последней от 1 до 2% включительно или посредством фибринового клея.

Перед формированием комплекта N двумерных матриц изготавливают набор штампов для штамповой (импринт) литографии, которую используют для получения каждой из двумерных матриц комплекта. Для получения микро- и/или нанорельефа с массивами микро- и/или нанообъектов в каждой из матриц комплекта используют единый штамп, который в едином процессе формирует отпечаток (импринт) всей структуры двумерной матрицы при задании структуры костной ткани.

К причинам, препятствующим достижению технического результата, относится следующее.

Во-первых, сборка двумерных матриц предусмотрена только после заселения каждой матрицы клеточной культурой и биологическими агентами, что осложняет их прецизионное расположение друг относительно друга.

Во-вторых, точная имитация структуры, формируемой ткани, достигается лишь в отношении двумерной матрицы, поскольку она задается высокоточным копированием структуры костной ткани лишь в двумерной плоскости. В отношении каждой из двумерных матриц комплекта выполняют массивы микро- и/или нанообъектов с индивидуальной архитектурой, системностью и взаимосвязанностью расположения в архитектуре микро- и/или нанообъектов, с возможностью задания структуры костной ткани комплектом двумерных матриц, подлежащей формированию, с учетом ее биологических функций, с возможностью обеспечения механической поддержки, управления процессами дифференцировки и пролиферации клеток. В ортогональном направлении относительно поверхности двумерных матриц точность имитации не регулируется. В зазоре между двумерными матрицами процесс формирования костной ткани носит спонтанный характер. Кроме того, отсутствует возможность задания трехмерной формы матрицы, копирующей форму кости

Техническим результатом предлагаемого решения является: - повышение точности имитации структуры, формируемой (восстанавливаемой) ткани, достижение точности имитации в трех измерениях (объемной точности). Задание трехмерной формы матрицы, копирующей форму кости, основываясь на трехмерной компьютерной модели кости, задающей как внешнюю форму, так и внутреннюю трехмерную микроструктуру.

Технический результат достигается в способе формирования биорезорбируемой полимерной клеточной матрицы для регенерации ткани, заключающемся в том, что изготавливают литографией комплект двумерных матриц в виде пленки полимера с поверхностными массивами микро- и нанообъектов, которые для каждой двумерной матрицы выполняют с индивидуальной архитектурой, системностью и взаимосвязанностью расположения в архитектуре микро- и нанообъектов, с возможностью задания структуры костной ткани, подлежащей формированию, с учетом ее биологических функций, с возможностью обеспечения механической поддержки, управления процессами дифференцировки и пролиферации клеток, затем двумерные матрицы собирают в каркас-носитель для клеточных культур и биологических агентов, ориентируя их друг относительно друга с возможностью задания структуры костной ткани и фиксируя в стопку, сборку осуществляют в жидкой среде, отверждаемой при фотоэкспонировании в биорезорбируемый полимер, двумерные матрицы последовательно устанавливают друг относительно друга с зазором, в котором в процессе последовательной установки посредством проекционной трехмерной печати с использованием цифрового проектора получают слои биорезорбируемого полимера, содержащие массивы микрообъектов с индивидуальной архитектурой, системностью и взаимосвязанностью расположения их в архитектуре, с возможностью задания внешней формы и внутренней трехмерной структуры матрицы, согласно трехмерной компьютерной модели кости, с возможностью обеспечения механической поддержки, управления процессами дифференцировки и пролиферации клеток в ортогональном направлении относительно поверхности двумерных матриц.

В способе в качестве материала пленки полимера для изготовления каждой из двумерных матриц используют биорезорбируемый материал - полилактид.

В способе при изготовлении каждую из двумерных матриц комплекта получают с помощью литографии в виде пленки полимера с поверхностными массивами микро- и нанообъектов, используя при этом штамповую литографию.

В способе перед изготовлением матриц штамповой литографией осуществляют изготовление структурно-формирующих штампов, представляющих собой комплект штампов, с помощью которого осуществляют задание в матрице структуры костной ткани, подлежащей формированию, учет ее биологических функций, возможность обеспечения механической поддержки, управления процессами дифференцировки и пролиферации клеток.

В способе структурно-формирующие штампы снабжены рельефом, позволяющим задавать или копировать структуру костной ткани, рельеф выполняют с возможностью отпечатка на пленке полимера массивов микро- и нанообъектов, характеризующихся индивидуальной архитектурой, системностью и взаимосвязанностью расположения в архитектуре микро- и нанообъектов, с возможностью задания структуры костной ткани, подлежащей формированию, учета ее биологических функций, с возможностью обеспечения механической поддержки, управления процессами дифференцировки и пролиферации клеток: массива продольных углублений, для формирования в матрице заготовок гаверсовых каналов, массива локальных углублений, расположенных вдоль продольных углублений, для формирования в матрице заготовок лакун в отротогональных друг другу направлениях, массива углублений, соединяющих продольные и локальные углубления, - для соединения заготовок лакун с заготовками для гаверсовых каналов, массива наноканалов, расположенных по всей поверхности пленки полимера под углом относительно продольных углублений, массива наноотверстий в локальных областях для создания в матрице наноструктурированных областей для улучшения адгезии клеток.

В способе процедуру штамповой литографии структурно-формирующими штампами проводят при температуре от 180°С до 195°С, включая указанные значения, и давлении от 30 до 50 атм, включая указанные значения, в течение времени от 5 до 10 минут, включая указанные значения.

В способе в качестве жидкой среды, отверждаемой при фотоэкспонировании в биорезорбируемый полимер полиэтилен гликоль/полилактид гидрогель, используют среду с составом: 54% вода, 33% (полилактид-полиэтилен гликоль-полилактид) олигомер, 11% диметил сульфоксид, 1,7% этил-триметилобензоил фенилфосфинат, 0,19% краситель феноловый красный, компоненты взяты в весовом соотношении.

В способе двумерные матрицы последовательно устанавливают друг относительно друга с зазором, в котором в процессе последовательной установки посредством проекционной трехмерной печати с использованием цифрового проектора получают слои биорезорбируемого полимера, а именно, первую из собираемых двумерных матриц устанавливают на платформе, погруженной в ванну с жидкой средой, отверждаемой при фотоэкспонировании в биорезорбируемый полимер, двумерную матрицу подают в ванну и осуществляют требуемое позиционирование ее относительно платформы, обеспечивая зазор между двумерной матрицей и платформой, проводят фотоэкспонирование жидкой среды в зазоре, согласно программе, задающей структуру формируемой костной ткани, проводя экспонирование и отверждение в локальных областях жидкой среды согласно программе, и фиксируя двумерную матрицу к получаемому слою биорезорбируемого полимера, затем в ванну подают очередную двумерную матрицу и осуществляют требуемое позиционирование ее относительно платформы, обеспечивая зазор между очередной двумерной матрицей и зафиксированной к полученному слою биорезорбируемого полимера двумерной матрицей, проводят очередное фотоэкспонирование жидкой среды в зазоре, согласно программе, задающей структуру формируемой костной ткани, проводя экспонирование и отверждение в локальных областях жидкой среды согласно программе, и фиксируя двумерную матрицу к очередному получаемому слою биорезорбируемого полимера, в котором заложена на микроуровне структура костной ткани, указанные операции повторяют до сборки всего комплекта двумерных матриц, получая в результате чередующиеся слои из двумерных матриц и биорезорбируемого полимера с заданной в нем на микроуровне структурой костной ткани.

В способе получают слои биорезорбируемого полимера толщиной от 12 до 500 мкм, включая указанные значения.

В способе проводят фотоэкспонирование в течение от 10 до 90 сек, включая указанные значения.

В способе получают слои биорезорбируемого полимера, содержащие массивы микрообъектов с индивидуальной архитектурой, системностью и взаимосвязанностью расположения их в архитектуре, с возможностью задания структуры костной ткани, подлежащей формированию, а именно, для формирования в матрице заготовок гаверсовых каналов, для формирования в матрице заготовок лакун, для соединения заготовок лакун с заготовками для гаверсовых каналов.

Сущность технического решения поясняется нижеследующим описанием и прилагаемыми фигурами.

На Фиг. 1 схематически отражено проведение процесса формирования биорезорбируемой полимерной клеточной матрицы для регенерации ткани, где: 1 - платформа; 2 - жидкая среда; 3 - двумерная матрица; 4 - слой биорезорбируемого полимера; 5 - ванна; 6 - окно; 7 - проекционная линза; 8 - проектор; 9 - компьютер; 10 - ролик с исходной пленкой; 11 - ролики со структурно-формирующими штампами; 12 - лазер; 13 - исходная пленка; 14 - ролик для протяжки пленки.

На Фиг. 2 представлены фрагменты используемого структурно-формирующего штампа, а) оптическая фотография рельефа заготовок с открытыми гаверсовыми каналами шириной около 20 мкм, сообщающимися с лакунами по обеим их сторонам посредством ортогонально расположенных к ним канальцев, б) электронно-микроскопическое изображение наноструктурированной поверхности, сформированной между гаверсовыми каналами, лакунами и канальцами, где: 15 - заготовка гаверсова канала; 16 - заготовка лакуны; 17 - заготовка канальца (заготовка углубления, соединяющего продольные и локальные углубления, - для соединения заготовок лакун с заготовками для гаверсовых каналов).

На Фиг. 3 продемонстрирован простейший результат сборки двумерных матриц из полилактида толщиной 20 мкм с помощью проекционной трехмерной печати, а) оптическая фотография сборки комплекта из четырех двумерных матриц, зажатых по краям стенкой каркаса матрицы из биорезорбируемого полимера и подвешенных на столбиках в средней части пленки, б) электронно-микроскопическое изображение фрагмента торца каркаса-носителя, демонстрирующего встраивание двумерных матриц своими краями в стенку каркаса матрицы из биорезорбируемого полимера, где: 3 - двумерная матрица; 18 - столбик; 19 - стенка каркаса матрицы.

В предлагаемом техническом решении формирование биорезорбируемой полимерной клеточной матрицы для регенерации ткани осуществляется в два этапа (см. Фиг. 1). Содержание первого этапа включает выполнение комплекта двумерных матриц 3. Содержание второго этапа - сборка комплекта двумерных матриц 3 в трехмерный каркас-носитель, и формирование итоговой биорезорбируемой полимерной клеточной матрицы для заселения клеточных культур и биологических агентов.

Технический результат обеспечивается в результате реализации второго этапа - сборкой комплекта двумерных матриц 3, (получаемых предварительно, в частности, штамповой литографией посредством структурно-формирующего штампа (см. Фиг. 2)). В процессе сборки обеспечивают получение каркаса-носителя, копирующего форму и внутреннюю трехмерную структуру кости, и формирование итоговой биорезорбируемой полимерной клеточной матрицы, готовой для заселения клеточных культур и биологических агентов (см. Фиг. 3). Отличительные особенности сборки матрицы относительно приведенного ближайшего аналога заключаются в использовании для сборки цифрового проектора 8, проекционной трехмерной печати, соответствующих материалов - жидкой среды 2, отверждаемой при фотоэкспонировании (см. Фиг. 1). Причем использование трехмерной печати позволяет формировать трехмерную форму и структуру биорезорбируемой полимерной клеточной матрицы, основываясь на трехмерной компьютерной модели, таким образом, достигается максимальное соответствие как внешней форме, так и внутренней структуре кости (или другого формируемого объекта).

Процесс формирования биорезорбируемой полимерной клеточной матрицы осуществляют на линии, собранной на основе установки штамповой литографии и установки трехмерной проекционной печати CARIMA DP110. Функциональные элементы линии - платформа 1, проектор 8, лазер 12, ролик для протяжки пленки 14 - реализованы с возможностью управление их работой от компьютера 9.

Опишем сначала процесс второго этапа: сборку комплекта двумерных матриц 3 в трехмерный каркас-носитель, и формирование итоговой биорезорбируемой полимерной клеточной матрицы. Данный этап выполняется с использованием установки трехмерной проекционной печати (3D принтера) (см. Фиг. 1). Управляемую от компьютера 9 платформу 1 перемещают вертикально ко дну ванны 5, заполненной жидкой средой 2, отверждаемой при фотоэкспонировании, на точно заданное программой расстояние (от 12 до 50 мкм), соответствующее толщине формируемого слоя биорезорбируемого полимера 4. На платформе 1 посредством проекционной трехмерной печати с использованием цифрового проектора 8 формируют слой биорезорбируемого полимера 4, отверждаемый согласно проецируемому изображению. Фотоэкспонирование для задания структуры костной ткани данного слоя трехмерной матрицы осуществляют через окно 6, которым снабжена ванна 5, направляя свет от проектора 8 на проекционную линзу 7 и далее через окно 6 в жидкую среду 2, в зазор между платформой 1 и дном ванны. Фотоэкспонирование осуществляют засветкой изображения, задающего структуру формируемой костной ткани, таким образом, происходит отверждение слоя в локальных областях жидкой среды зазора согласно трехмерной компьютерной модели кости (или другого формируемого объекта).

Между определенными компьютерной моделью слоями трехмерной матрицы вводят микро-, наноструктурированные двумерные матрицы 3. После формирования на платформе 1 определенного слоя трехмерной матрицы, платформу отводят от дна ванны и помещают на дно ванны двумерную матрицу 3, затем платформу 1 опускают ко дну ванны 5, на котором расположена присоединяемая двумерная матрица 3, устанавливая требуемый зазор. После этого в зазоре осуществляют выборочную фотополимеризацию слоя биорезорбируемого полимера 4, в котором заложена на микроуровне структура костной ткани. Производится фотоэкспозиция выбранных участков слоя, соответствующих конкретному сечению трехмерной компьютерной модели кости, благодаря этому воспроизводится внешняя форма и микроструктура кости. За счет отверждения биорезорбируемого полимера 4 производят присоединение двумерной матрицы 3 к уже сформированной части трехмерной матрицы. После чего платформу 1 поднимают относительно дна, подают на дно ванны следующую двумерную матрицу 3 и формируют фотополимеризацией следующий слой биорезорбируемого полимера 4, либо формируют фотополимеризацией следующий слой биорезорбируемого полимера 4 без двумерной матрицы 3. Расстояние между двумерными матрицами 3 может задаваться произвольно, согласно компьютерной программе, и определяется толщиной слоев биорезорбируемого полимера 4, а также количеством этих слоев между двумерными матрицами 3. Далее, таким же образом присоединяют остальные двумерные матрицы 3 из комплекта, повторяют процедуры экспонирования с получением слоев биорезорбируемого полимера 4 и с заданием в нем структуры костной ткани. Таким образом, получают чередующиеся слои двумерных матриц 3 и слои биорезорбируемого полимера 4 с заданной в нем на микроуровне структурой костной ткани. Процесс повторяют до сборки всего комплекта двумерных матриц 3. Указанной процедурой с периодическим фотоэкспонированием и присоединением очередной двумерной матрицы 3 комплекта на микроуровне задается структура формируемой костной ткани в зазоре между двумерными матрицами 3 в ортогональном направлении относительно поверхности двумерных матриц 3. Для включения в игру массивов нанообъектов, которые, как известно, обеспечивают высокую адгезию клеток при заселении матриц клеточной культурой, распределение клеток оптимальным образом для эффективного протекания процесса регенерации ткани, запуск и управление процессами дифференцировки и пролиферации, механическую поддержку и учет биологических функций формируемой ткани, расположение микрообъектов слоя биорезорбируемого полимера 4 стыкуют с расположением нанообъектов двумерных матриц 3. Развитая адгезивная поверхность, к которой легко прикрепляются клетки, строго локализована в архитектуре двумерной матрицы 3, а возможности проекционной трехмерной печати с использованием цифрового проектора 8 обеспечивают с высокой точностью указанную стыковку. В результате реализуется возможность в ортогональном направлении относительно поверхности двумерных матриц 3 задавать с высокой точностью структуру костной ткани, подлежащей формированию, обеспечивать учет ее биологических функций и механическую поддержку, запускать и управлять процессами дифференцировки и пролиферации клеток.

В основу реализации первого этапа - изготовление комплекта двумерных матриц 3 - положено использование литографического метода. При изготовлении двумерной матрицы 3 необходимо обеспечить максимальное задание (копирование) структуры формируемой (восстанавливаемой) ткани на микро- и наноуровне. В матрице должно быть учтено максимально полное удовлетворение требований - способности имитировать структуру и биологические функции, обеспечить механическую поддержку, дифференцировку и пролиферацию клеток для управления структурой и функцией формируемой ткани. Учет указанных требований обеспечивает более полное подражание - задание или копирование природных свойств материалов и процессов их формирования. Кроме того, при этом реализуется возможность осуществления направленного ангиогенеза, в частности для костной ткани, за счет включения в матрицу элементов, являющихся заготовками для формирования гаверсовой системы и сосудов, связывающих лакуны. Указанные требования осуществимы благодаря литографии, посредством которой формируют поверхностный микро- и нанорельеф с массивами микро- и нанообъектов двумерных полимерных матриц, являющихся основными конструктивными элементами каркаса-носителя клеточных культур и биологических агентов, из которых собирают биорезорбируемую полимерную клеточную матрицу.

При изготовлении каждой из двумерных матриц 3 используют штамповую (импринт) литографию (либо роликовую штамповую литографию с роликовыми структурно-формирующими штампами 11, см. Фиг. 1). Для получения микро- и нанорельефа с массивами микро- и нанообъектов используют единый штамп (см. Фиг. 2), которым в едином процессе формируют отпечаток (импринт) всей структуры двумерной матрицы -при задании структуры костной ткани. Кроме того, достоинством такой литографии является ее дешевизна, быстрота, возможность формирования микро- и нанорельефов на больших площадях и даже при непрерывном пропускании ленты с пленкой, на которой формируют рельеф, через вращающийся цилиндрический штамп (см. Фиг. 1, позиции: 10 - ролик с исходной пленкой, 11 - ролики со структурно-формирующими штампами, 13 - исходная пленка, 14 - ролик для протяжки пленки). Роликом для протяжки пленки 14, управляемым от компьютера 9, приводят в движение ролик с исходной пленкой 10, на который намотана исходная пленка 13, пленку за счет тянущих усилий разматывают, подают и пропускают через ролики со структурно-формирующими штампами 11, посредством которых осуществляют отпечатывание. После чего за счет тянущих усилий ролика для протяжки пленки 14 отпечатанная пленка поступает на участок раскроя, на котором завершают изготовление двумерной матрицы 3, выкраивая ее из отпечатанной пленки полилактида лазером 12, управляемым от компьютера, с учетом требуемых размеров.

Штамповая литография обеспечивает структуру микро- и нанорельефа с массивами микро- и нанообъектов, посредством которых задают (копируют) с высокой точностью структуру ткани, подлежащей формированию (восстановлению), в двумерной матрице 3. Литографически обеспечивают возможность реализации с высокой точностью индивидуальной архитектуры каждой из двумерных матриц 3 с копированием микро- и нанорельефа с массивами микро- и нанообъектов ткани, локализации с высокой точностью в архитектуре микро- и нанорельефа с массивами микро- и нанообъектов. Каждая из двумерных матриц 3 задает двумерную структуру формируемой ткани - структуру в плоскости, сборка матриц в каркас-носитель ориентированным образом друг относительно друга обеспечивает задание трехмерной структуры - структуры в объеме.

Реализация указанным образом каждой из двумерных матриц 3 с использованием штамповой литографии позволяет успешно задавать (копировать) с высокой точностью как микро-, так и наноструктуру ткани, поэтому в матрице, формируемой предлагаемым способом, наиболее полным образом учтена роль наноструктурирования. Благодаря литографии к наноструктурированию применен системный подход. Реализация каждой двумерной матрицы 3 на базе использования литографии позволяет осуществлять наноструктурирование исходной пленки 13 полимера заданным образом, с соблюдением системности, локальности в архитектуре формируемой матрицы. Поэтому в формируемой матрице предлагаемым способом обеспечивается высокая адгезия клеток при заселении готовой матрицы клеточной культурой, распределение клеток оптимальным образом для эффективного протекания процесса регенерации ткани. Развитая адгезивная поверхность, к которой легко прикрепляются клетки, строго локализована в архитектуре матрицы.

Для изготовления двумерной матрицы 3 на базе штамповой литографии вначале литографическими методами изготавливают структурно-формирующие штампы, представляющие собой комплект штампов, с помощью которого осуществляют задание (копирование) в матрице, структуры костной ткани, подлежащей формированию, учет ее биологических функций, возможность обеспечения механической поддержки, управления процессами дифференцировки и пролиферации клеток.

Штампы изготавливают из кремния, причем используют также промежуточные штампы из силикона и других материалов, например, Al₂O₃. Штампы снабжены специфическим микро- нанорельефом (см. Фиг. 2), позволяющим задавать, копировать структуру костной ткани. Рисунок рельефа штампа для задания структуры костной ткани в матрице выполняют с возможностью отпечатка на исходной пленке 13 полимера массивов микро- и нанообъектов, характеризующихся индивидуальной архитектурой, системностью и взаимосвязанностью расположения в архитектуре микро- и нанообъектов, с возможностью задания структуры ткани, подлежащей формированию, учета ее биологических функций, с возможностью обеспечения механической поддержки, управления процессами дифференцировки и пролиферации клеток: массива продольных углублений, для формирования в матрице заготовок гаверсовых каналов 15, массива локальных углублений, расположенных вдоль продольных углублений, для формирования в матрице заготовок лакун 16 в отротогональных друг другу направлениях, массива углублений, соединяющих продольные и локальные углубления, - для соединения заготовок лакун с заготовками для гаверсовых каналов (канальцы 17), массива наноканалов, расположенных по всей поверхности пленки полимера под углом относительно продольных углублений, массива наноотверстий в локальных областях для создания в матрице наноструктурированных областей для улучшения адгезии клеток (см. Фиг. 2). Следует отметить, что рисунок микро- и наноструктур штампа (а значит и на двумерной матрицы) задается при его изготовлении, и должен максимально соответствовать структуре конкретного органа или ткани, в нашем случае - кости. На Фиг. 2 приведен простейший экспериментальный образец, на котором каналы расположены параллельно друг другу, при изготовлении копии реальной кости следует использовать более сложный рисунок каналов, например, для трубчатых костей радиальное расположение каналов.

Приведенные штампы обеспечивают высококачественное микро- и наноструктурирование исходной пленки 13 из полилактида.

В качестве материала для изготовления комплекта двумерных матриц 3 используют биорезорбируемый материал, например, полилактид (Poly(L-lactide): PURASORB PL 65.

Таким образом, получение двумерной матрицы 3 осуществляют отпечатыванием пленок полилактида изготовленными структурно-формирующими штампами и последующим выкраиванием участка, соответствующего конкретному слою из цельной пленки.

Пленку полилактида можно получить из его порошка. Порошок растворяют с концентрацией от 0,5% до 10%, включая указанные значения, в хлороформе. Для полного растворения порошка до формирования однородного раствора осуществляют выдерживание в течение нескольких суток. Приготовленный раствор полилактида наносят на подложку кремния, используя центрифугу. Толщину пленок задают скоростью вращения подложки и концентрацией раствора полилактида в хлороформе. После нанесения пленки центрифугированием на подложку, ее сушат в сушильном шкафу при температуре около 50 градусов в течение суток для удаления растворителя. Контроль толщины пленок осуществляют с помощью микрометра, оптического микроскопа и атомно-силового микроскопа. Для изготовления двумерных матриц формируют пленки толщиной от 100 нм до 20 мкм, включая указанные значения. Необходимо отметить, что при изготовлении пленок выбирают полилактид с большим временем биорезорбируемости (поверхностная обработка).

Однако, при изготовлении двумерных матриц 3 проще и целесообразнее воспользоваться коммерчески доступной исходной пленкой 13.

Готовую исходную пленку 13 подвергают процедуре штамповой литографии на установке (см. Фиг. 1, позиции: 10 - ролик с исходной пленкой; 11 - ролики со структурно-формирующими штампами) вышеописанными структурно-формирующими штампами (см. Фиг. 2). Процесс штамповки проводят при температуре от 180 до 195°С, включая указанные значения, и давлении от 30 до 50 атм в течение времени от 5 до 10 мин.

После получения двумерных матриц приступают ко второму этапу - осуществляют изготовление каркаса-носителя, собранного и готового для заселения клеточных культур и биологических агентов, то есть готовой для использования биорезорбируемой полимерной клеточной матрицы для регенерации ткани. Все двумерные матрицы комплекта изготавливают заблаговременно с помощью обычной штамповой литографии. Либо соответствующая двумерная матрица формируется с использованием роликовой штамповой литографии непосредственно в течение сборки предыдущей матрицы (см. Фиг. 1). Процесс структурирования полимерной пленки с получением двумерных матриц и встраивания их в трехмерную матрицу легко автоматизируется.

Для осуществления сборки используют платформу 1, ванну 5, снабженную окном 6, напротив которого устанавливают проектор 8, от которого посредством оптики -проекционной линзы 7, подают через окно 6 в направлении платформы 1 видимый свет, которым производят экспонирование. Ванну 5 заполняют жидкой средой 2, отверждаемой при фотоэкспонировании в биорезорбируемый полимер. В области дна ванна 5 снабжена щелевыми отверстиями для подачи наноструктурированной пленки, содержащую полученную двумерную матрицу 3 из исходной пленки 13. Перед входом в ванну 5, исходная пленка 13 проходит через ролики со структурно-формирующими штампами 11, претерпевая одновременный нагрев и давление. Таким образом, отпечатывают на поверхности исходной пленки 13 рельеф двумерной матрицы 3. Кроме того, перед входом в ванну 5, на полосе пленки, подвергнутой отпечатыванию, с помощью лазера 12, формируют сквозные отверстия размером от 10 до 100 мкм, обеспечивающие связь между слоями биорезорбируемого полимера 4 для обмена питательными веществами и прорастания клеток, а также завершают упомянутое изготовление двумерной матрицы 3, выкраивая ее из отпечатанной пленки лазером 12 посредством формирования сквозных перфорационных отверстий, вырезающих матрицу из цельной полосы рулона пленки.

Управляемую от компьютера 9 платформу 1 перемещают вертикально к дну ванны 5 на точно заданное программой расстояние (от 12 до 50 мкм), соответствующее толщине формируемого слоя биорезорбируемого полимера 4. Роликом для протяжки пленки 14, управляемым от компьютера 9, в ванну 5 через щелевые отверстия вводят двумерную матрицу 3, точно позиционируя ее относительно платформы 1. Получение указанного слоя с фиксацией к нему введенной в объем ванны 5 двумерной матрицы 3 осуществляют полимеризацией, которую инициируют локальной засветкой слоя жидкой среды 2, заданной программой, с образованием локально расположенных микрообъектов в экспонируемом слое жидкой среды 2. Экспонирование осуществляют в течение времени от 10 до 50 сек, включая указанные значения, видимым или ультрафиолетовым светом (спектральный диапазон, соответствующий длинам волны 300-700 нм). Время засветки зависит от толщины слоя, для получения более толстого слоя используют большее время засветки. Затем платформу 1 смещают по вертикали на заданную толщину следующего формируемого слоя биорезорбируемого полимера 4, осуществляют ввод в ванну 5 следующей двумерной матрицы 3 из комплекта с ее точным позиционированием относительно платформы 1, подвергают экспонированию жидкую среду 2 в зазоре между введенной двумерной матрицей 3 и зафиксированной двумерной матрицей 3 к полученному в предыдущих действиях слою биорезорбируемого полимера 4. Получают слой биорезорбируемого полимера 4 с фиксацией к нему двумерной матрицы 3. Между определенными программой слоями биорезорбируемого полимера 4 управляемым от компьютера 9 роликовым лентопротяжным механизмом, состоящим из ролика для протяжки пленки 14 и ролика с исходной пленкой 10, вводят очередную двумерную матрицу 3 из полилактида, подлежащую сборке. Многократным повторением приведенных действий, последовательно слой за слоем, осуществляют сборку каркаса-носителя, то есть получают готовую матрицу (см. Фиг. 3), в частности, в которой в ортогональном направлении к поверхности двумерных матриц 3 в слое биорезорбируемого полимеры 4 сформированы столбики 18, а весь комплект из четырех двумерных матриц 3 зафиксирован стенкой каркаса 19 из биорезорбируемого полимера, полученного отверждением жидкой среды 2 при экспонировании светом.

В качестве жидкой среды, отверждаемой при фотоэкспонировании в биорезорбируемый полимер, используют различные составы. В частности:

1) используют среду с составом: 54% вода, 33% полиэтилен гликоль/полилактид олигомер, 11% диметил сульфоксид, 1,7% фотоинициатор (этил-триметилобензоил фенилфосфинат), 0,19% краситель феноловый красный. Компоненты взяты в весовом соотношении [Т.М. Seck, F.P.W. Melchels, J. Feijen, D.W. Grijpma, «Designed biodegradable hydrogel structures prepared by stereolithography using poly(ethylene glycol)/poly(D,L-lactide)-based resins», J Control Release, 2010, 148:34-41];

2) используют среду с составом: 75% полилактида олигомеры, 19% этиллактат, 6% фотоинициатор (этил-триметилобензоил фенилфосфинат), 0,025% ингибитор гидрохинон, 0,2% краситель оранжевый. Компоненты взяты в весовом соотношении [F.P.W. Melchels, J. Feijen, D.W. Grijpma, «A poly (D, L-lactide) resin for the preparation of tissue engineering scaffolds by stereolithography», Biomaterials, 30 (2009), 3801-3809];

3) используют среду с составом: 74% дивиниловый эфир адипиновой кислоты, 23% тривиниловый эфир жирных кислот, 3% фотоинициатор ((бис(2,4,6-триметилбензол)-фенилфосфин оксид). Компоненты взяты в весовом соотношении [С.Heller, М. Schwentenwein, F. Varga, Rt. Liska, J. Stampfl ((Biocompatible and biodegradable photopolymers for microstereolithography», Proceedings of LAMP2009 - the 5th International Congress on Laser Advanced Materials Processing].

В результате реализации второго этапа получают слои биорезорбируемого полимера 4, содержащие массивы микрообъектов с индивидуальной архитектурой, системностью и взаимосвязанностью расположения их в архитектуре, с возможностью задания структуры костной ткани, подлежащей формированию, а именно, для формирования в матрице заготовок гаверсовых каналов, для формирования в матрице заготовок лакун, для соединения заготовок лакун с заготовками для гаверсовых каналов.

В качестве сведений, подтверждающих возможность реализации способа с достижением указанного технического результата, приводим нижеследующие примеры реализации.

Пример 1.

Для формирования биорезорбируемой полимерной клеточной матрицы для регенерации ткани сначала изготавливают литографией комплект двумерных матриц в виде пленок полимера с поверхностными массивами микро- и нанообъектов, которые для каждой двумерной матрицы выполняют с индивидуальной архитектурой, системностью и взаимосвязанностью расположения в архитектуре микро- и нанообъектов, с возможностью задания структуры костной ткани, подлежащей формированию, с учетом ее биологических функций, с возможностью обеспечения механической поддержки, управления процессами дифференцировки и пролиферации клеток.

В качестве материала пленки полимера для изготовления каждой из двумерных матриц используют биорезорбируемый материал - полилактид, а именно, «PURASORB PL 18».

При изготовлении каждую из двумерных матриц комплекта получают с помощью литографии в виде пленки полимера с поверхностными массивами микро- и нанообъектов, используя при этом штамповую литографию. Перед изготовлением матриц штамповой литографией осуществляют изготовление структурно-формирующих штампов, представляющих собой комплект штампов, с помощью которого осуществляют задание (копирование) в матрице, структуры костной ткани, подлежащей формированию, учет ее биологических функций, возможность обеспечения механической поддержки, управления процессами дифференцировки и пролиферации клеток. В процессе изготовления структурно-формирующие штампы снабжают рисунком рельефа, позволяющим задавать или копировать структуру костной ткани, рельеф выполняют с возможностью отпечатка на пленке полимера массивов микро- и нанообъектов, характеризующихся индивидуальной архитектурой, системностью и взаимосвязанностью расположения в архитектуре микро- и нанообъектов, с возможностью задания структуры костной ткани, подлежащей формированию, учета ее биологических функций, с возможностью обеспечения механической поддержки, управления процессами дифференцировки и пролиферации клеток: массива продольных углублений, для формирования в матрице заготовок гаверсовых каналов, массива локальных углублений, расположенных вдоль продольных углублений, для формирования в матрице заготовок лакун в отротогональных друг другу направлениях, массива углублений, соединяющих продольные и локальные углубления, - для соединения заготовок лакун с заготовками для гаверсовых каналов, массива наноканалов, расположенных по всей поверхности пленки полимера под углом относительно продольных углублений, массива наноотверстий в локальных областях для создания в матрице наноструктурированных областей для улучшения адгезии клеток в пленке также формируют набор сквозных микроотверстий 10-100 мкм для обеспечения обмена между слоями.

Процедуру штамповой литографии структурно-формирующими штампами проводят при температуре 180°С и давлении 50 атм, в течение времени 5 минут.

Двумерные матрицы собирают в каркас-носитель для клеточных культур и биологических агентов, ориентируя их друг относительно друга с возможностью задания структуры костной ткани и фиксируя в стопку.

Сборку осуществляют в жидкой среде, отверждаемой при фотоэкспонировании в биорезорбируемый полимер. В качестве жидкой среды, отверждаемой при фотоэкспонировании в биорезорбируемый полимер, используют среду с составом: 54% вода, 33% полиэтилен гликоль/полилактид олигомер, 11% диметил сульфоксид, 1,7% фотоинициатор (этил-триметилобензоил фенилфосфинат), 0,19% краситель феноловый красный. Компоненты взяты в весовом соотношении.

Двумерные матрицы последовательно устанавливают друг относительно друга с зазором, в котором в процессе последовательной установки посредством проекционной трехмерной печати с использованием цифрового проектора получают слои биорезорбируемого полимера, содержащие массивы микрообъектов с индивидуальной архитектурой, системностью и взаимосвязанностью расположения их в архитектуре, с возможностью задания структуры костной ткани, подлежащей формированию.

Управляемую от компьютера платформу перемещают вертикально к дну ванны заполненной жидкой средой, отверждаемой при фотоэкспонировании, на точно заданное программой расстояние 50 мкм, соответствующее толщине формируемого слоя биорезорбируемого полимера. На платформе, посредством проекционной трехмерной печати с использованием цифрового проектора, формируют слой биорезорбируемого полимера отверждаемый согласно проецируемому изображению. Экспонирование осуществляют в течение 45 сек в локальных областях жидкой среды зазора, засветкой изображения, задающего структуру формируемой костной ткани, согласно трехмерной компьютерной модели кости.

Двумерную матрицу подают на дно ванны и осуществляют требуемое позиционирование платформы, обеспечивая зазор между двумерной матрицей и слоем полимера на платформе 50 мкм. Затем проводят фотоэкспонирование жидкой среды в зазоре, согласно программе, задающей структуру формируемой костной ткани, проводя экспонирование и отверждение в локальных областях жидкой среды согласно программе, Производится фотоэкспозиция выбранных участков слоя, соответствующих конкретному сечению трехмерной компьютерной модели кости, благодаря этому воспроизводится внешняя форма и микроструктура кости. Отверждение жидкой среды фиксирует двумерную матрицу к получаемому слою биорезорбируемого полимера. Фотоэкспонирование осуществляют в течение 35 секунд. После окончания экспонирования и получения слоя биорезорбируемого полимера толщиной 50 мкм в ванну подают очередную двумерную матрицу и осуществляют требуемое позиционирование ее относительно платформы, обеспечивая зазор 50 мкм между очередной двумерной матрицей на дне ванны и двумерной матрицей зафиксированной к полученному слою биорезорбируемого полимера. Проводят очередное фотоэкспонирование жидкой среды в зазоре, согласно программе, задающей структуру формируемой костной ткани, проводя экспонирование и отверждение в локальных областях жидкой среды согласно программе, и фиксируя двумерную матрицу к очередному получаемому слою биорезорбируемого полимера, в котором заложена на микроуровне структура костной ткани. Фотоэкспонирование осуществляют в течение 35 сек. После окончания экспонирования и получения слоя биорезорбируемого полимера толщиной 50 мкм в ванну подают очередную двумерную матрицу. В результате повторения операций собирают комплект из четырех двумерных матриц, получая в результате чередующиеся слои из двумерных матриц и биорезорбируемого полимера толщиной 50 мкм с заданной в нем на микроуровне структурой костной ткани. В процессе экспонирования получают слои биорезорбируемого полимера, содержащие массивы микрообъектов с индивидуальной архитектурой, системностью и взаимосвязанностью расположения их в архитектуре, с возможностью задания структуры костной ткани, подлежащей формированию, а именно, микрообъектов для формирования в матрице заготовок гаверсовых каналов, для формирования в матрице заготовок лакун, для соединения заготовок лакун с заготовками для гаверсовых каналов

При этом расположение микрообъектов слоя биорезорбируемого полимера стыкуют с расположением массивов нанообъектов двумерных матриц с возможностью задания структуры костной ткани, подлежащей формированию, с учетом ее биологических функций, с возможностью обеспечения механической поддержки, управления процессами дифференцировки и пролиферации клеток в ортогональном направлении относительно поверхности двумерных матриц.

Пример 2.

Для формирования биорезорбируемой полимерной клеточной матрицы для регенерации ткани сначала изготавливают литографией комплект двумерных матриц в виде пленки полимера с поверхностными массивами микро- и нанообъектов, которые для каждой двумерной матрицы выполняют с индивидуальной архитектурой, системностью и взаимосвязанностью расположения в архитектуре микро- и нанообъектов, с возможностью задания структуры костной ткани, подлежащей формированию, с учетом ее биологических функций, с возможностью обеспечения механической поддержки, управления процессами дифференцировки и пролиферации клеток.

В качестве материала пленки полимера для изготовления каждой из двумерных матриц используют биорезорбируемый материал - полилактид, а именно, «PURASORB PL 65».

При изготовлении каждую из двумерных матриц комплекта получают с помощью литографии в виде пленки полимера с поверхностными массивами микро- и нанообъектов, используя при этом штамповую литографию. Перед изготовлением матриц штамповой литографией осуществляют изготовление структурно-формирующих штампов, представляющих собой комплект штампов, с помощью которого осуществляют задание (копирование) в матрице, структуры костной ткани, подлежащей формированию, учет ее биологических функций, возможность обеспечения механической поддержки, управления процессами дифференцировки и пролиферации клеток. В процессе изготовления структурно-формирующие штампы снабжают рельефом, позволяющим задавать или копировать структуру костной ткани, рисунок рельефа выполняют с возможностью отпечатка на пленке полимера массивов микро- и нанообъектов, характеризующихся индивидуальной архитектурой, системностью и взаимосвязанностью расположения в архитектуре микро- и нанообъектов, с возможностью задания структуры костной ткани, подлежащей формированию, учета ее биологических функций, с возможностью обеспечения механической поддержки, управления процессами дифференцировки и пролиферации клеток: массива продольных углублений, для формирования в матрице заготовок гаверсовых каналов, массива локальных углублений, расположенных вдоль продольных углублений, для формирования в матрице заготовок лакун в отротогональных друг другу направлениях, массива углублений, соединяющих продольные и локальные углубления, - для соединения заготовок лакун с заготовками для гаверсовых каналов, массива наноканалов, расположенных по всей поверхности пленки полимера под углом относительно продольных углублений, массива наноотверстий в локальных областях для создания в матрице наноструктурированных областей для улучшения адгезии клеток, в пленке также формируют набор сквозных микроотверстий 10-100 мкм для обеспечения обмена между слоями.

Процедуру штамповой литографии структурно-формирующими штампами проводят при температуре 195°С и давлении 40 атм, в течение времени 6 минут.

После изготовления двумерные матрицы собирают в каркас-носитель для клеточных культур и биологических агентов, ориентируя их друг относительно друга с возможностью задания структуры костной ткани и фиксируя в стопку.

Сборку осуществляют в жидкой среде, отверждаемой при фотоэкспонировании в биорезорбируемый полимер. В качестве жидкой среды, отверждаемой при фотоэкспонировании в биорезорбируемый полимер, используют среду с составом: 75% полилактида олигомеры, 19% этиллактат, 6% фотоинициатор (этил-триметилобензоил фенилфосфинат), 0,025% ингибитор гидрохинон, 0,2% краситель оранжевый. Компоненты взяты в весовом соотношении.

Двумерные матрицы последовательно устанавливают друг относительно друга с зазором, в котором в процессе последовательной установки посредством проекционной трехмерной печати с использованием цифрового проектора получают слои биорезорбируемого полимера, содержащие массивы микрообъектов с индивидуальной архитектурой, системностью и взаимосвязанностью расположения их в архитектуре, с возможностью задания структуры костной ткани, подлежащей формированию.

Управляемую от компьютера платформу перемещают вертикально к дну ванны заполненной жидкой средой, отверждаемой при фотоэкспонировании, на точно заданное программой расстояние 50 мкм, соответствующее толщине формируемого слоя биорезорбируемого полимера. На платформе, посредством проекционной трехмерной печати с использованием цифрового проектора, формируют слой биорезорбируемого полимера отверждаемый согласно проецируемому изображению. Экспонирование осуществляют в течение 35 сек в локальных областях жидкой среды зазора, засветкой изображения, задающего структуру формируемой костной ткани, согласно трехмерной компьютерной модели кости.

Двумерную матрицу подают в ванну и осуществляют требуемое позиционирование платформы, обеспечивая зазор между двумерной матрицей и платформой. Затем проводят фотоэкспонирование жидкой среды в зазоре, согласно программе, задающей структуру формируемой костной ткани, проводя экспонирование и отверждение в локальных областях жидкой среды согласно программе, и фиксируя двумерную матрицу к получаемому слою биорезорбируемого полимера. Фотоэкспонирование осуществляют в течение 20 сек. После окончания экспонирования и получения слоя биорезорбируемого полимера толщиной 25 мкм в ванну подают очередную двумерную матрицу и осуществляют требуемое позиционирование ее относительно платформы, обеспечивая зазор 50 мкм между очередной двумерной матрицей и зафиксированной к полученному слою биорезорбируемого полимера двумерной матрицей. Проводят очередное фотоэкспонирование жидкой среды в зазоре, согласно программе, задающей структуру формируемой костной ткани, проводя экспонирование и отверждение в локальных областях жидкой среды согласно программе, и фиксируя двумерную матрицу к очередному получаемому слою биорезорбируемого полимера, в котором заложена на микроуровне структура костной ткани. Фотоэкспонирование осуществляют в течение 40 сек. После окончания экспонирования и получения слоя биорезорбируемого полимера толщиной 50 мкм в ванну подают очередную двумерную матрицу и осуществляют требуемое позиционирование ее относительно платформы, обеспечивая зазор 25 мкм между очередной двумерной матрицей и зафиксированной к полученному слою биорезорбируемого полимера двумерной матрицей. Проводят очередное фотоэкспонирование жидкой среды в зазоре, согласно программе, задающей структуру формируемой костной ткани, проводя экспонирование и отверждение в локальных областях жидкой среды согласно программе, и фиксируя двумерную матрицу к очередному получаемому слою биорезорбируемого полимера, в котором заложена на микроуровне структура костной ткани. Экспонирование осуществляют видимым светом в течение 20 сек. После окончания экспонирования и получения слоя биорезорбируемого полимера толщиной 25 мкм в ванну подают очередную двумерную матрицу и осуществляют требуемое позиционирование ее относительно платформы, обеспечивая зазор 25 мкм между очередной двумерной матрицей и зафиксированной к полученному слою биорезорбируемого полимера двумерной матрицей. Проводят очередное фотоэкспонирование жидкой среды в зазоре, согласно программе, задающей структуру формируемой костной ткани, проводя экспонирование и отверждение в локальных областях жидкой среды согласно программе, и фиксируя двумерную матрицу к очередному получаемому слою биорезорбируемого полимера, в котором заложена на микроуровне структура костной ткани. Экспонирование осуществляют видимым светом в течение 20 сек. После окончания экспонирования получают слой биорезорбируемого полимера толщиной 25 мкм. В результате повторения операций собирают комплект из четырех двумерных матриц, получая в результате чередующиеся слои из двумерных матриц и биорезорбируемого полимера толщинами 50 мкм, 25 мкм, 25 мкм с заданной в нем на микроуровне структурой костной ткани. В процессе экспонирования получают слои биорезорбируемого полимера, содержащие массивы микрообъектов с индивидуальной архитектурой, системностью и взаимосвязанностью расположения их в архитектуре, с возможностью задания структуры костной ткани, подлежащей формированию, а именно, микрообъектов для формирования в матрице заготовок гаверсовых каналов, для формирования в матрице заготовок лакун, для соединения заготовок лакун с заготовками для гаверсовых каналов

При этом расположение микрообъектов слоя биорезорбируемого полимера стыкуют с расположением массивов нанообъектов двумерных матриц с возможностью задания структуры костной ткани, подлежащей формированию, с учетом ее биологических функций, с возможностью обеспечения механической поддержки, управления процессами дифференцировки и пролиферации клеток в ортогональном направлении относительно поверхности двумерных матриц.

Пример 3.

Для формирования биорезорбируемой полимерной клеточной матрицы для регенерации ткани сначала изготавливают литографией комплект двумерных матриц в виде пленки полимера с поверхностными массивами микро- и нанообъектов, которые для каждой двумерной матрицы выполняют с индивидуальной архитектурой, системностью и взаимосвязанностью расположения в архитектуре микро- и нанообъектов, с возможностью задания структуры костной ткани, подлежащей формированию, с учетом ее биологических функций, с возможностью обеспечения механической поддержки, управления процессами дифференцировки и пролиферации клеток.

В качестве материала пленки полимера для изготовления каждой из двумерных матриц используют биорезорбируемый материал - полилактид, а именно, «PURASORB PL 38».

При изготовлении каждую из двумерных матриц комплекта получают с помощью литографии в виде пленки полимера с поверхностными массивами микро- и нанообъектов, используя при этом штамповую литографию. Перед изготовлением матриц штамповой литографией осуществляют изготовление структурно-формирующих штампов, представляющих собой комплект штампов, с помощью которого осуществляют задание (копирование) в матрице, структуры костной ткани, подлежащей формированию, учет ее биологических функций, возможность обеспечения механической поддержки, управления процессами дифференцировки и пролиферации клеток. В процессе изготовления структурно-формирующие штампы снабжают рельефом, позволяющим задавать или копировать структуру костной ткани, рисунок рельефа выполняют с возможностью отпечатка на пленке полимера массивов микро- и нанообъектов, характеризующихся индивидуальной архитектурой, системностью и взаимосвязанностью расположения в архитектуре микро- и нанообъектов, с возможностью задания структуры костной ткани, подлежащей формированию, учета ее биологических функций, с возможностью обеспечения механической поддержки, управления процессами дифференцировки и пролиферации клеток: массива продольных углублений, для формирования в матрице заготовок гаверсовых каналов, массива локальных углублений, расположенных вдоль продольных углублений, для формирования в матрице заготовок лакун в отротогональных друг другу направлениях, массива углублений, соединяющих продольные и локальные углубления, - для соединения заготовок лакун с заготовками для гаверсовых каналов, массива наноканалов, расположенных по всей поверхности пленки полимера под углом относительно продольных углублений, массива наноотверстий в локальных областях для создания в матрице наноструктурированных областей для улучшения адгезии клеток, а также набор сквозных микроотверстий 10-100 мкм для обеспечения обмена между слоями.

Процедуру штамповой литографии структурно-формирующими штампами проводят при температуре 185°С и давлении 30 атм, в течение времени 10 минут.

После изготовления двумерные матрицы собирают в каркас-носитель для клеточных культур и биологических агентов, ориентируя их друг относительно друга с возможностью задания структуры костной ткани и фиксируя в стопку.

Сборку осуществляют в жидкой среде, отверждаемой при фотоэкспонировании в биорезорбируемый полимер. В качестве жидкой среды, отверждаемой при фотоэкспонировании в биорезорбируемый полимер, используют среду с составом: 74% дивиниловый эфир адипиновой кислоты, 23% тривиниловый эфир жирных кислот, 3% фотоинициатор ((бис(2,4,6-триметилбензол)-фенилфосфин оксид). Компоненты взяты в весовом соотношении.

Управляемую от компьютера платформу перемещают вертикально к дну ванны заполненной жидкой средой, отверждаемой при фотоэкспонировании, на точно заданное программой расстояние 25 мкм, соответствующее толщине формируемого слоя биорезорбируемого полимера. На платформе, посредством проекционной трехмерной печати с использованием цифрового проектора, формируют слой биорезорбируемого полимера отверждаемый согласно проецируемому изображению. Фотоэкспонирование осуществляют в течение 25 сек в локальных областях жидкой среды зазора, засветкой изображения, задающего структуру формируемой костной ткани, согласно трехмерной компьютерной модели кости. Затем подают на дно ванны двумерную матрицу и осуществляют требуемое позиционирование платформы, зазором 12,5 мкм между двумерной матрицей и слоем отверженного биорезорбируемого полимера на платформе. Затем проводят фотоэкспонирование жидкой среды в зазоре, согласно программе, задающей структуру формируемой костной ткани, проводя экспонирование и отверждение в локальных областях жидкой среды согласно программе, и фиксируя двумерную матрицу к получаемому слою биорезорбируемого полимера. Фотоэкспонирование осуществляют в течение 10 сек. После окончания экспонирования, платформу перемещают так, чтобы создать зазор 50 мкм между дном ванны и слоем отвержденного биорезорбируемого полимера. На платформе, посредством проекционной трехмерной печати с использованием цифрового проектора, формируют слой биорезорбируемого полимера отверждаемый согласно проецируемому изображению. Фотоэкспонирование осуществляют в течение 35 сек. Затем платформу перемещают так, чтобы создать зазор 50 мкм между дном ванны и слоем отвержденного биорезорбируемого полимера. Фотоэкспонирование осуществляют в течение 35 сек в локальных областях жидкой среды зазора, засветкой изображения, задающего структуру формируемой костной ткани, согласно трехмерной компьютерной модели кости. Таким образом, на платформе, посредством проекционной трехмерной печати с использованием цифрового проектора, формируют два, а затем и более слоев биорезорбируемого полимера, отвержденного согласно трехмерной компьютерной модели кости, что позволяет создавать трехмерную биорезорбируемую матрицу, соответствующую кости по форме и внутренней трехмерной структуре. После формирования второго слоя биорезорбируемого полимера в ванну подают двумерную матрицу и осуществляют позиционирование платформы, обеспечивая зазор 12,5 мкм между очередной двумерной матрицей слоем отвержденного биорезорбируемого полимера на платформе. Проводят очередное фотоэкспонирование жидкой среды в зазоре, согласно программе, задающей структуру формируемой костной ткани, проводя экспонирование и отверждение в локальных областях жидкой среды согласно программе, и фиксируя двумерную матрицу к очередному получаемому слою биорезорбируемого полимера, в котором заложена на микроуровне структура костной ткани. Фотоэкспонирование осуществляют в течение 10 сек. После окончания экспонирования и отверждения слоя биорезорбируемого полимера, платформу отодвигают от дна ванны, создавая зазор 50 мкм. Осуществляют фотоэкспонирование в течение 35 сек. Затем платформу перемещают еще раз, чтобы создать зазор 50 мкм между дном ванны и слоем отвержденного биорезорбируемого полимера. Фотокспонирование осуществляют в течение 35 сек в локальных областях жидкой среды зазора, засветкой изображения, задающего структуру формируемой костной ткани, согласно трехмерной компьютерной модели кости. Затем в ванну подают очередную двумерную матрицу и позиционируют платформу, обеспечивая зазор 12,5 мкм между очередной двумерной матрицей и слоем отвержденного биорезорбируемого полимера. Проводят очередное фотоэкспонирование жидкой среды в зазоре, в течение 10 сек. После окончания экспонирования и отверждения слоя биорезорбируемого полимера, платформу отодвигают от дна ванны, создавая зазор 50 мкм. Осуществляют фотоэкспонирование в течение 35 сек. Затем платформу перемещают еще раз, чтобы создать зазор 50 мкм между дном ванны и слоем отвержденного биорезорбируемого полимера. Фотокспонирование осуществляют в течение 35 сек. Затем в ванну подают очередную двумерную матрицу и позиционируют платформу, обеспечивая зазор 12,5 мкм между очередной двумерной матрицей и слоем отвержденного биорезорбируемого полимера. Проводят очередное фотоэкспонирование жидкой среды в зазоре, в течение 10 сек.

В результате повторения операций собирают комплект из двумерных матриц, с расстоянием между двумерными матрицами 112,5 мкм, получая в результате чередующиеся слои из двумерных матриц и биорезорбируемого полимера с заданной в нем на микроуровне структурой костной ткани. Форма и микроструктура слоя биорезорбируемого полимера стыкуется с наноструктурой двумерных матриц с возможностью задания структуры костной ткани, подлежащей формированию, с учетом ее биологических функций, с возможностью обеспечения механической поддержки, управления процессами дифференцировки и пролиферации клеток в ортогональном направлении относительно поверхности двумерных матриц.

Claims (12)

1. Способ формирования биорезорбируемой полимерной клеточной матрицы для регенерации ткани, заключающийся в том, что изготавливают литографией комплект двумерных матриц в виде пленки полимера с поверхностными массивами микро- и нанообъектов, которые для каждой двумерной матрицы выполняют с индивидуальной архитектурой, системностью и взаимосвязанностью расположения в архитектуре микро- и нанообъектов, с возможностью задания структуры костной ткани, подлежащей формированию, с учетом ее биологических функций, с возможностью обеспечения механической поддержки, управления процессами дифференцировки и пролиферации клеток, затем двумерные матрицы собирают в каркас-носитель для клеточных культур и биологических агентов, ориентируя их друг относительно друга с возможностью задания структуры костной ткани и фиксируя в стопку, отличающийся тем, что сборку осуществляют в жидкой среде, отверждаемой при фотоэкспонировании в биорезорбируемый полимер, двумерные матрицы последовательно устанавливают друг относительно друга с зазором, в котором в процессе последовательной установки посредством проекционной трехмерной печати с использованием цифрового проектора получают слои биорезорбируемого полимера, содержащие массивы микрообъектов с индивидуальной архитектурой, системностью и взаимосвязанностью расположения их в архитектуре возможностью задания внешней формы и внутренней трехмерной структуры матрицы, согласно трехмерной компьютерной модели кости, с возможностью обеспечения механической поддержки, управления процессами дифференцировки и пролиферации клеток в ортогональном направлении относительно поверхности двумерных матриц.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве материала пленки полимера для изготовления каждой из двумерных матриц используют биорезорбируемый материал - полилактид.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что при изготовлении каждую из двумерных матриц комплекта получают с помощью литографии в виде пленки полимера с поверхностными массивами микро- и нанообъектов, используя при этом штамповую литографию.

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что перед изготовлением матриц штамповой литографией осуществляют изготовление структурно-формирующих штампов, представляющих собой комплект штампов, с помощью которого осуществляют задание в матрице структуры костной ткани, подлежащей формированию, учет ее биологических функций, возможность обеспечения механической поддержки, управления процессами дифференцировки и пролиферации клеток.

5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что структурно-формирующие штампы снабжены рельефом, позволяющим задавать или копировать структуру костной ткани, рисунок рельефа выполняют с возможностью отпечатка на пленке полимера массивов микро- и нанообъектов, характеризующихся индивидуальной архитектурой, системностью и взаимосвязанностью расположения в архитектуре микро- и нанообъектов, с возможностью задания структуры костной ткани, подлежащей формированию, учета ее биологических функций, с возможностью обеспечения механической поддержки, управления процессами дифференцировки и пролиферации клеток: массива продольных углублений, для формирования в матрице заготовок гаверсовых каналов, массива локальных углублений, расположенных вдоль продольных углублений, для формирования в матрице заготовок лакун в ортогональных друг другу направлениях, массива углублений, соединяющих продольные и локальные углубления, - для соединения заготовок лакун с заготовками для гаверсовых каналов, массива наноканалов, расположенных по всей поверхности пленки полимера под углом относительно продольных углублений, массива наноотверстий в локальных областях для создания в матрице наноструктурированных областей для улучшения адгезии клеток.

6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что процедуру штамповой литографии структурно-формирующими штампами проводят при температуре от 180^°С до 195^°С, включая указанные значения, и давлении от 30 до 50 атм, включая указанные значения, в течение времени от 5 до 10 минут, включая указанные значения.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве жидкой среды, отверждаемой при фотоэкспонировании в биорезорбируемый полимер, используют среду с составом: 54% вода, 33% полиэтилен гликоль/полилактид олигомер, 11% диметил сульфоксид, 1,7% этил-триметилобензоил фенилфосфинат, 0,19% краситель феноловый красный, компоненты взяты в весовом соотношении.

8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что двумерные матрицы последовательно устанавливают друг относительно друга с зазором, в котором в процессе

последовательной установки посредством проекционной трехмерной печати с использованием цифрового проектора получают слои биорезорбируемого полимера, а именно, первую из собираемых двумерных матриц устанавливают на платформе, погруженной в ванну с жидкой средой, отверждаемой при фотоэкспонировании в биорезорбируемый полимер, либо на слой отвержденного биорезорбируемого полимера, двумерную матрицу подают в ванну и осуществляют позиционирование платформы, обеспечивая зазор между двумерной матрицей и платформой, проводят фотоэкспонирование жидкой среды в зазоре, согласно программе, задающей структуру формируемой костной ткани, проводя экспонирование и отверждение в локальных областях жидкой среды согласно программе и фиксируя двумерную матрицу к получаемому слою биорезорбируемого полимера, затем в ванну подают очередную двумерную матрицу и осуществляют требуемое позиционирование платформы, обеспечивая зазор между очередной двумерной матрицей и зафиксированной к полученному слою биорезорбируемого полимера двумерной матрицей, проводят очередное фотоэкспонирование жидкой среды в зазоре, согласно программе, задающей структуру формируемой костной ткани, проводя экспонирование и отверждение в локальных областях жидкой среды согласно программе и фиксируя двумерную матрицу к очередному получаемому слою биорезорбируемого полимера, в котором заложена на микроуровне структура костной ткани, указанные операции повторяют до сборки всего комплекта двумерных матриц, получая в результате чередующиеся слои из двумерных матриц и биорезорбируемого полимера с заданной в нем на микроуровне структурой костной ткани.

9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что получают слои биорезорбируемого полимера толщиной от 12 до 500 мкм, включая указанные значения.

10. Способ по п. 8, отличающийся тем, что проводят фотоэкспонирование в течение от 10 до 90 сек, включая указанные значения.

11. Способ по п. 1, отличающийся тем, что получают слои биорезорбируемого полимера, содержащие массивы микрообъектов с индивидуальной архитектурой, системностью и взаимосвязанностью расположения их в архитектуре, с возможностью задания структуры костной ткани, подлежащей формированию, а именно, для формирования в матрице заготовок гаверсовых каналов, для формирования в матрице заготовок лакун, для соединения заготовок лакун с заготовками для гаверсовых каналов.

Images