RU2620167C1

RU2620167C1 - Method for obtaining preparation for stimulation of regeneration based on products of secretion of human multipotent mesenchymal stromal cells

Info

Publication number: RU2620167C1
Application number: RU2015154800A
Authority: RU
Inventors: Всеволод Арсеньевич Ткачук; Жанна Алексеевна Акопян; Анастасия Юрьевна Ефименко; Ольга Александровна Григорьева; Наталья Игоревна Калинина; Татьяна Николаевна Кочегура; Георгий Дмитриевич Сагарадзе; Вероника Юрьевна Сысоева; Елена Владимировна Тарасова; Александр Александрович Чапленко
Priority date: 2015-12-21
Filing date: 2015-12-21
Publication date: 2017-05-23

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: group of inventions relates to medicine and can be used for obtaining biomaterials for stimulation of tissue regeneration after injury. Method of preparation obtaining includes cultivation of human mesenchymal stromal cells of adipose tissue (MSC AT) to 4-5 passage in medium, supporting growth of non-differentiated human mesenchymal cells. Washing of cells with buffer solution, conditioning MSC AT in serum-free and deprived of animal-derived products growth medium, supporting cell viability not lower than 79% and suitable for therapeutic application, are performed. After sampling cultivation medium, containing products of human MSC AT secretion, remnants of cells are removed from it with purification from low-molecular components with the following lyophilisation of purified cultivation medium. Preparation contains products of human MSC, including key growth factors: VEGF in concentration not lower than 200 pkg/ml, HGF in concentration not lower than150 pkg/ml, FGF basic in concentration not lower than 0.29 pkg/ml, angiopoietin-1 in concentration not lower than145 pkg/ml, PEDF in concentration not lower than 500 pkg/ml, determined by method of enzyme immunoassay with reduction of lyophilisate in sterile physiological solution. Preparation efficiency is provided due to selected content in medium of key growth factors, required for realisation of regenerative MSC action, namely vessel endothelium growth factor (VEGF), hepatocyte growth factor (HGF), basic fibroplast growth factor (bFGF) and angiopoietin of type1 (Angpt-1), as well as antiangiogenic factor, obtained from pigment epithelium cells (PEDF).

EFFECT: application of the obtained preparation makes it possible to stimulate tissue regeneration in efficient way due to complex balanced action of growth factors and other biologically active molecules, secreted by human mesenchymal stem/stromal cells (MSC) into culture medium, which does not contain xenogenic components.

12 cl, 9 ex, 6 dwg

Description

Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION

Изобретение относится к области медицины и фармакологии и может быть использовано для получения лекарственных средств и биоматериалов для стимуляции регенерации тканей после повреждения, в том числе для реконструктивной хирургии, при лечении острых и хронических ран и ожогов различного генеза и тяжести, а также других заболеваний человека, связанных с нарушениями ангиогенеза и нейрогенеза, таких как трофические язвы, в том числе у больных диабетом, при заболеваниях пародонта, ишемии нижних конечностей, алопециях, при повреждениях нервной системы.The invention relates to medicine and pharmacology and can be used to obtain drugs and biomaterials to stimulate tissue regeneration after damage, including reconstructive surgery, in the treatment of acute and chronic wounds and burns of various genesis and severity, as well as other human diseases, associated with disorders of angiogenesis and neurogenesis, such as trophic ulcers, including in patients with diabetes, periodontal disease, lower limb ischemia, alopecia, and nerve damage th system.

Уровень техникиState of the art

Из уровня техники известен способ лечения ожогов с помощью лекарственного средства на основе кондиционированной среды, полученной при культивировании МСК костного мозга человека (RU 2292212 C1). Кондиционированная среда содержит солевой состав и аминокислоты, пенициллин, амфотерицин, L-глутамин и эмбриональную бычью сыворотку (ЭБС), достаточные для поддержания жизнеспособности и роста МСК костного мозга человека. При этом кондиционированную среду получают на стадии стационарного роста культуры стабильной клеточной линии МСК, находящихся в Go периоде клеточного цикла. Показано, что полученная среда обладает лечебным эффектом при термических ожогах. Однако следует отметить, что кондиционированная среда, приготовленная данным способом, содержит ЭБС, являющуюся потенциально опасным агентом при терапевтическом применении.The prior art method for treating burns with a medicament based on a conditioned medium obtained by culturing human bone marrow MSCs (RU 2292212 C1). The conditioned medium contains salt composition and amino acids, penicillin, amphotericin, L-glutamine and fetal bovine serum (EBS), sufficient to maintain the viability and growth of human bone marrow MSCs. In this case, the conditioned medium is obtained at the stage of stationary growth of a stable MSC cell line culture located in the Go period of the cell cycle. It is shown that the resulting medium has a therapeutic effect in thermal burns. However, it should be noted that the conditioned medium prepared by this method contains EBS, which is a potentially dangerous agent in therapeutic use.

Из уровня техники также известна композиция, предназначенная для регенерации кожи и слизистых оболочек, содержащая культуральную питательную среду, включающую биологически активные соединения на основе низкомолекулярных пептидов и цитокинов, используемая для культивирования in vitro эукариотических клеток и кондиционированная продуктами жизнедеятельности и ростовыми факторами эукариотических клеток, выделяемыми ими в питательную среду в процессе их культивирования (RU 2455354 C1). Данная композиция также содержит костномозговые МСК человека в количестве, по меньшей мере, 10⁵ клеток/мл, а в качестве кондиционированной среды содержит культуральную питательную среду, кондиционированную продуктами жизнедеятельности и ростовыми факторами МСК, полученную на стадиях логарифмической фазы и стационарной фазы роста стабильной клеточной культуры клеток, содержащую биологически активные соединения на основе низкомолекулярных пептидов с молекулярной массой 6-8 кДа и низкомолекулярных веществ с молекулярной массой 2-3 кДа, соответствующих активным цитокинам. Стоит отметить, что культуральная питательная среда содержит ЭБС.The prior art also known composition intended for the regeneration of the skin and mucous membranes, containing a culture nutrient medium including biologically active compounds based on low molecular weight peptides and cytokines, used for culturing in vitro eukaryotic cells and conditioned by the vital products and growth factors of eukaryotic cells secreted by them in a nutrient medium in the process of their cultivation (RU 2455354 C1). This composition also contains human bone marrow MSCs in an amount of at least 10 ⁵ cells / ml, and as a conditioned medium contains a culture medium conditioned with vital products and growth factors of MSC obtained at the stages of the logarithmic phase and stationary growth phase of a stable cell culture cells containing biologically active compounds based on low molecular weight peptides with a molecular weight of 6-8 kDa and low molecular weight substances with a molecular weight of 2-3 kDa, s corresponding to active cytokines. It should be noted that the culture medium contains EBS.

Кроме того, из уровня техники известны способ и композиция для предотвращения или лечения кожных дефектов, включающий нанесение на кожный дефект композиции, содержащей МСК костного мозга или кондиционную среду, полученную от МСК, или их комбинацию (WO 2008155659 А2). К числу кожных дефектов, для лечения которых может быть использована композиция, относятся морщины, рубец, возрастное пятно, порез или язва. Следует отметить, что и данном изобретении использована среда роста, содержащая ЭБС.In addition, a method and composition for preventing or treating skin defects is known from the prior art, comprising applying to a skin defect a composition containing bone marrow MSCs or a conditioned medium obtained from MSCs, or a combination thereof (WO 2008155659 A2). Skin defects that the composition can be used to treat include wrinkles, a scar, an age spot, a cut, or an ulcer. It should be noted that this invention also used a growth medium containing EB.

В указанных выше изобретениях для получения кондиционированной среды использованы МСК костного мозга. Однако по данным различных авторов МСК жировой ткани обладают более выраженными паракринными эффектами в отношении стимуляции роста кровеносных сосудов и нервов по сравнению с МСК костного мозга, использованными в данных изобретениях. Кроме того, в данных изобретениях кондиционированная среда включает в себя потенциально опасные животные компоненты в виде ЭБС.In the above inventions, bone marrow MSCs were used to produce the conditioned medium. However, according to various authors, MSCs of adipose tissue have more pronounced paracrine effects in relation to stimulation of the growth of blood vessels and nerves compared with bone marrow MSCs used in these inventions. In addition, in these inventions, the conditioned medium includes potentially hazardous animal components in the form of EBF.

Из уровня техники также известен способ получения обработанной среды, согласно которому проводят культивирование стволовых клеток в среде без факторов роста, содержащей десферроксамин, при этом стволовые клетки предварительно культивируют в ростовой среде, что обеспечивает получение кондиционированной среды, которая включает факторы, секретируемые данными стволовыми клетками (WO 2011127090 А1). Затем полученную кондиционированную среду отбирают и фильтруют с целью получения обработанной кондиционированной среды. Полученная таким способом среда может использоваться в составе композиции, дополнительно содержащей полимер, для лечения кожных ожогов.A method for producing a treated medium is also known from the prior art, according to which stem cells are cultured in a medium without growth factors containing desferroxamine, while the stem cells are pre-cultured in a growth medium, which provides a conditioned medium that includes factors secreted by these stem cells ( WO 2011127090 A1). Then, the resulting conditioned medium is taken and filtered to obtain a treated conditioned medium. The medium obtained in this way can be used as part of a composition additionally containing a polymer for the treatment of skin burns.

Однако в данном изобретении для получения кондиционированной среды используется среда, не предназначенная специально для поддержания функционального состояния стволовых клеток.However, the present invention uses a medium not specifically designed to maintain the functional state of stem cells to produce a conditioned medium.

Из уровня техники также известна кондиционированная культуральная среда, полученная при культивировании МСК, их потомства или клеточной линии, полученной из них, в культуральной среде. При этом МСК получают путем культивирования клеточной колонии эмбриональных стволовых клеток или их потомства, в отсутствие со-культуры и в бессывороточной среде, содержащей FGF2 (fibroblast growth factor 2) (US 2010323027 A1). Указанная среда может быть использована в составе композиции для лечения сердечной недостаточности, заболеваний костного мозга, заболеваний кожи, ожогов и дегенеративных заболеваний, таких как диабет, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и рак.The prior art also knows the conditioned culture medium obtained by culturing MSCs, their progeny or cell line derived from them in the culture medium. Moreover, MSCs are obtained by culturing a cell colony of embryonic stem cells or their offspring, in the absence of co-culture and in a serum-free medium containing FGF2 (fibroblast growth factor 2) (US 2010323027 A1). This medium can be used in the composition for the treatment of heart failure, bone marrow diseases, skin diseases, burns and degenerative diseases such as diabetes, Alzheimer's disease, Parkinson's disease and cancer.

Однако для поддержания МСК в функциональном состоянии при культивировании в бессывороточной среде добавления только одного ростового фактора - FGF2 может быть недостаточно, что оказывает негативное влияние на состав продуктов, секретируемых МСК в среду культивирования, и снижает регенеративный потенциал кондиционированной среды.However, to maintain the MSC in a functional state when cultured in a serum-free medium, the addition of only one growth factor, FGF2, may be insufficient, which negatively affects the composition of the products secreted by MSC in the culture medium and reduces the regenerative potential of the conditioned medium.

Из уровня техники также известен способ, включающий добавление регенеративных клеток в культуральную среду, при этом культуральная среда подобрана таким образом, чтобы обеспечивать рост и поддержание регенеративных клеток (в частности, МСК), и позволить секрецию благоприятствующих факторов из регенеративных клеток в культуральную среду так, чтобы образовывать кондиционированную среду. Затем из полученной кондиционированной среды выделяют экстракт, который не содержит целых клеток. Полученный экстракт и/или его компоненты используют для местного нанесения на участок кожи человека с целью стимулирования роста клеток кожи (WO 2010038232 А1). В заявке предлагается использование композиции, содержащей полученный экстракт, для лечения дерматологических нарушений и/или нарушений роста волос, но нет экспериментальных данных, подтверждающих возможность и эффективность лечения ожогов и ран предлагаемым средством.The prior art also known a method comprising adding regenerative cells to the culture medium, the culture medium being selected in such a way as to ensure the growth and maintenance of regenerative cells (in particular, MSCs), and to allow the secretion of favorable factors from regenerative cells into the culture medium so to form an air-conditioned environment. Then, an extract that does not contain whole cells is isolated from the resulting conditioned medium. The obtained extract and / or its components are used for topical application to an area of human skin in order to stimulate the growth of skin cells (WO 2010038232 A1). The application proposes the use of a composition containing the obtained extract for the treatment of dermatological disorders and / or hair growth disorders, but there are no experimental data confirming the feasibility and effectiveness of treating burns and wounds with the proposed agent.

Другим направлением в лечении заболеваний с помощью регенеративной терапии является использование частиц, секретируемых МСК. В частности, для лечения кожных заболеваний и ожогов могут быть использованы частицы, включающие везикулы или эксзосомы (WO 2009105044 А1). Описан способ получения частицы, включающий: получение среды, кондиционированной МСК; концентрирование полученной среды, кондиционированной МСК; обработку сконцентрированной среды, кондиционированной МСК, путем гель-фильтрации; отбор фракции, которая демонстрирует динамическое рассеяние света, путем УФ-детектирования при 220 нм. При этом этап отбора фракции включает сбор фракций, которые элюируют со временем удерживания 11-13 минут. Полученная частица может быть использована в составе фармацевтической композиции, применяемой для лечения заболеваний с помощью подходов регенеративной медицины.Another area in the treatment of diseases using regenerative therapy is the use of particles secreted by MSCs. In particular, particles including vesicles or exosomes can be used to treat skin diseases and burns (WO 2009105044 A1). A method for producing a particle is described, including: obtaining a medium conditioned by MSC; concentration of the resulting medium, conditioned by MSC; processing concentrated MSC-conditioned medium by gel filtration; selection of a fraction that exhibits dynamic light scattering by UV detection at 220 nm. The fraction selection step involves collecting fractions that elute with a retention time of 11-13 minutes. The resulting particle can be used as part of a pharmaceutical composition used to treat diseases using regenerative medicine approaches.

Однако, несмотря на то, что в последнее время получено значительное количество данных, указывающих на важную роль экзосом в реализации паракринных эффектов МСК, нет доказательств того, что именно фракция, описанная в изобретении, является ключевой для регенеративного действия этих клеток. Помимо этого использование представленной в изобретении технологии значительно усложняет процесс производства конечного продукта.However, despite the fact that recently a significant amount of data has been obtained indicating the important role of exosomes in the realization of the paracrine effects of MSCs, there is no evidence that the fraction described in the invention is the key to the regenerative action of these cells. In addition, the use of the technology presented in the invention greatly complicates the production process of the final product.

Кроме того, недостатком указанных выше изобретений является отсутствие указаний на количественное содержание факторов, обеспечивающих эффективность изобретений.In addition, the disadvantage of the above inventions is the lack of indications of the quantitative content of factors that ensure the effectiveness of the inventions.

Из уровня техники известен также препарат «Солкосерил», содержащий депротеинизированный диализат из крови здоровых молочных телят, стандартизированный химически и биологически и обладающий регенеративным действием. Однако этот препарат представляет собой комплекс пептидов неизвестного состава, полученных из тканей животных, потенциально способный вызывать иммунные реакции и содержать инфекционные агенты животного происхождения.The Solcoseryl preparation is also known in the art, containing deproteinized dialysate from the blood of healthy dairy calves, standardized chemically and biologically, and having a regenerative effect. However, this drug is a complex of peptides of unknown composition derived from animal tissues, potentially capable of inducing immune responses and containing infectious agents of animal origin.

Из уровня техники также известно, что в качестве материалов для закрытия дефектов кожи используют коммерческие продукты на основе живых кожных заменителей дермального, эпидермального или двойного типа:It is also known from the prior art that commercial products based on live skin substitutes for dermal, epidermal or double type are used as materials for closing skin defects:

1) Dermagraft (криоконсервированные аллогенные фибробласты человека из кожи крайней плоти новорожденных, выращенные на биосорбирующей сетчатой подложке из полиглактина);1) Dermagraft (cryopreserved allogeneic human fibroblasts from the skin of the foreskin of newborns grown on a biosorbent mesh substrate made of polyglactin);

2) OrCel (двухслойный матрикс из бычьего коллагена типа 1, на поверхности и в пористом слое которого культивируются аллогенные дермальные фибробласты, а на непористом слое - эпидермальные кератиноциты от того же донора);2) OrCel (a bilayer matrix of bovine collagen type 1, on the surface and in the porous layer of which allogeneic dermal fibroblasts are cultured, and on the non-porous layer - epidermal keratinocytes from the same donor);

3) Epicel (искусственно полученный эпидермальный аутотрансплантат, представляющий собой слой (от 2 до 8 слоев клеток) аутологичных кератиноцитов, культивированных ex vivo в присутствии мышиных фибробластов);3) Epicel (artificially produced epidermal autograft representing a layer (from 2 to 8 layers of cells) of autologous keratinocytes cultivated ex vivo in the presence of murine fibroblasts);

4) Invitrx CSS (Composite Skin Substitute), представляет собой 3-мерный кожный эквивалент, состоящий из дермальных аутологичных фибробластов, помещенных на коллаген/викриловую сетку, и верхнего слоя кератиноцитов.4) Invitrx CSS (Composite Skin Substitute), is a 3-dimensional skin equivalent, consisting of dermal autologous fibroblasts placed on a collagen / vicryl network, and an upper layer of keratinocytes.

Кроме того, среди таких решений стоит отметить перевязочное средство, которое может быть использовано для лечения нарушений кожного покрова различного генеза, в том числе ожогов (RU 103474 U1). Перевязочное средство включает биосовместимую прозрачную полимерную пленку толщиной 3-100 мкм со сквозными отверстиями диаметром 0,01-3,00 мкм, на одной из поверхностей которой выращен слой диплоидных клеток фибробластов легкого эмбриона человека, взятых от 6-20 пассажа и выращенных на пленке в бессывороточной среде в присутствии кондиционной среды от аналогичной культуры. Средство эффективно при лечении обширных трофических поражений кожи.In addition, among these solutions, it is worth noting a dressing that can be used to treat disorders of the skin of various origins, including burns (RU 103474 U1). The dressing includes a biocompatible transparent polymer film 3-100 microns thick with through holes with a diameter of 0.01-3.00 microns, on one surface of which a layer of diploid fibroblast cells of human lung embryo is grown, taken from passage 6-20 and grown on film in serum-free medium in the presence of a conditioned medium from a similar culture. The tool is effective in the treatment of extensive trophic skin lesions.

Помимо этого известно двухслойное раневое покрытие с использованием клеточного материала человека, которое применяется для заживления ран разной площади и содержит гидратированную микробную целлюлозу с наслоенным на нее коллагеновым гелем (RU 94151 U1). В слоях или на их границе присутствует, по крайней мере, один источник ростовых факторов, ускоряющий эпителизацию раны. В качестве источников ростовых факторов применяют клетки мезодермального и/или эктодермального типа и/или тромбоциты крови. Описаны комбинации клеточного материала, дающие высокий лечебный эффект заявляемого лекарственного раневого покрытия. Сочетание бактериальной целлюлозы и коллагенового геля в двухслойном покрытии для ран создает оптимальные условия для проявления свойств ростовых факторов.In addition, a two-layer wound dressing using human cellular material is known, which is used to heal wounds of different sizes and contains hydrated microbial cellulose with collagen gel layered on it (RU 94151 U1). At least one source of growth factors is present in the layers or at their boundary, accelerating wound epithelization. Mesodermal and / or ectodermal type cells and / or blood platelets are used as sources of growth factors. Combinations of cellular material are described that give a high therapeutic effect of the claimed medicinal wound dressing. The combination of bacterial cellulose and collagen gel in a two-layer coating for wounds creates optimal conditions for the manifestation of the properties of growth factors.

Однако все указанные выше продукты содержат живые клетки человека, что увеличивает риски, связанные с биобезопасностью препаратов, усложняет процессы их производства, стандартизации и контроля качества, кроме того, с учетом отсутствия в РФ законов, регулирующих использование клеточных технологий, коммерциализация подобных продуктов в России затруднена.However, all of the above products contain living human cells, which increases the risks associated with the biosafety of drugs, complicates the processes of their production, standardization and quality control, in addition, given the absence of laws in the Russian Federation regulating the use of cell technologies, the commercialization of such products in Russia is difficult .

Наиболее близким к заявляемому решению является средство для изменения скорости роста или репродукции клеток и для лечения, в том числе ран и ожогов, содержащее кондиционированную клеточную культуральную среду, полученную при культивировании эукариотических клеток в трех измерениях, и способ его получения (RU 2280459 C1). Клеточные культуры, культивированные в трех измерениях, могут включать различные типы клеток, в том числе МСК, нервные стволовые клетки, фибробласты, эмбриональные стволовые клетки и др. Способ получения указанного средства предполагает получение кондиционированной культуральной среды, из которой отделены клеточные культуры, включающей такие внеклеточные продукты, как факторы роста, противовоспалительные медиаторы, ферменты, цитокины, гормоны, факторы свертывания крови, регуляторные факторы, ангиогенные факторы или антиангиогенные факторы.Closest to the claimed solution is a tool for changing the growth rate or reproduction of cells and for treatment, including wounds and burns, containing an conditioned cell culture medium obtained by culturing eukaryotic cells in three dimensions, and a method for producing it (RU 2280459 C1). Cell cultures cultured in three dimensions can include various types of cells, including MSCs, nerve stem cells, fibroblasts, embryonic stem cells, etc. The method for producing this agent involves obtaining a conditioned culture medium from which cell cultures, including such extracellular, are separated products like growth factors, anti-inflammatory mediators, enzymes, cytokines, hormones, blood coagulation factors, regulatory factors, angiogenic factors or anti-angiogenic actors.

Однако в описании данного изобретения не представлено количественное содержание в кондиционированной среде факторов, обеспечивающих эффективность средства для лечения ран и ожогов, не раскрыты способы ее очистки, не подтверждено сохранение фармакологических свойств среды после процедуры лиофилизации.However, the description of the present invention does not show the quantitative content in the conditioned medium of factors ensuring the effectiveness of the agent for treating wounds and burns, does not disclose methods for cleaning it, and does not confirm the preservation of the pharmacological properties of the medium after the lyophilization procedure.

Раскрытие изобретенияDisclosure of invention

Задачей изобретения является создание нового лекарственного средства для стимуляции регенерации поврежденных тканей, обладающего комплексным воздействием на различные этапы раневого процесса.The objective of the invention is the creation of a new drug to stimulate the regeneration of damaged tissues with a complex effect on the various stages of the wound process.

Техническим результатом, на достижение которого направлено заявленное изобретение, является получение средства, эффективно стимулирующего регенерацию тканей за счет комплексного сбалансированного действия факторов роста и других биологически активных молекул, секретируемых мезенхимными стволовыми/стромальными клетками (МСК) человека в культуральную среду, не содержащую ксеногенных компонентов. Эффективность средства обеспечивается за счет подобранного содержания в среде ключевых факторов роста, необходимых для реализации регенеративного действия МСК, концентрацию которых измеряют с помощью иммуноферментного анализа (ELISA), а именно фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), фактора роста гепатоцитов (HGF), основного фактора роста фибробластов (bFGF) и ангиопоэтина 1 типа (Angpt-1), а также антиангиогенного фактора, полученного из клеток пигментного эпителия (PEDF), отражающего сбалансированность эффектов данного средства.The technical result to which the claimed invention is directed is to obtain an agent that effectively stimulates tissue regeneration due to the complex balanced action of growth factors and other biologically active molecules secreted by human mesenchymal stem / stromal cells (MSCs) in a culture medium that does not contain xenogenic components. The effectiveness of the drug is ensured by the selected content in the medium of key growth factors necessary for the regenerative action of MSCs, the concentration of which is measured using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), namely, vascular endothelial growth factor (VEGF), hepatocyte growth factor (HGF), the main factor fibroblast growth (bFGF) and type 1 angiopoietin (Angpt-1), as well as an anti-angiogenic factor derived from pigment epithelial cells (PEDF), which reflects the balanced effects of this drug.

Поставленная задача решается тем, что способ получения средства для регенерации тканей включает культивирование мезенхимных стромальных клеток жировой ткани (МСК ЖТ) человека 4-5 пассажей в бессывороточной и лишенной продуктов животного происхождения среде роста, поддерживающей жизнеспособность клеток не менее 70% и пригодной для терапевтического применения, отбор среды культивирования, содержащей продукты секреции МСК ЖТ человека, и удаление из нее остатков клеток, ее очистку от низкомолекулярных компонентов методом ультрафильтрации с последующей лиофилизацией для получения средства, содержащего продукты секреции МСК человека, включающие ключевые факторы роста: VEGF в концентрации не менее 200 пкг/мл, HGF в концентрации не менее 150 пкг/мл, FGF basic в концентрации не менее 0,29 пкг/мл, ангиопоэтин-1 в концентрации не менее 145 пкг/мл, PEDF в концентрации не менее 500 пкг/мл, определяемые методом иммуноферментного анализа при восстановлении лиофилизата в стерильном физиологическом растворе. При этом МСК ЖТ наращивают в специфической среде, поддерживающей рост недифференцированных мезенхимных клеток человека (AdvanceSTEM Cell Culture Media, содержащей 9-11% добавки к среде роста AdvanceSTEM Stem Cell Growth Supplement, HyClone, USA), но для получения кондиционированной среды клетки тщательно отмывают от компонентов среды раствором Хэнкса (фирмы ПанЭко или аналогичным) и помещают в бессывороточную и лишенную продуктов животного происхождения среду роста, в качестве последней используют DMEM с низким содержанием глюкозы (HyClone, USA) или другую среду роста, поддерживающую жизнеспособность МСК человека (не ниже 70%) в течение всего срока кондиционирования и пригодную для терапевтического применения.The problem is solved in that the method of obtaining funds for tissue regeneration involves the cultivation of mesenchymal stromal cells of adipose tissue (MSCs) of a human being for 4-5 passages in a serum-free and animal-free growth medium that supports cell viability of at least 70% and is suitable for therapeutic use , selection of a culture medium containing the secretion products of human MJ VT, and the removal of cell debris from it, its purification from low molecular weight components by ultrafiltration followed by lyophilization to obtain a product containing human MSC secretion products, including key growth factors: VEGF at a concentration of at least 200 pkg / ml, HGF at a concentration of at least 150 pkg / ml, FGF basic at a concentration of at least 0.29 pkg / ml , angiopoietin-1 at a concentration of not less than 145 pcg / ml, PEDF at a concentration of not less than 500 pcg / ml, determined by enzyme-linked immunosorbent assay when restoring the lyophilisate in sterile physiological saline. At the same time, adrenal MSCs are grown in a specific medium that supports the growth of undifferentiated human mesenchymal cells (AdvanceSTEM Cell Culture Media, containing 9-11% AdvanceSTEM Stem Cell Growth Supplement, HyClone, USA), but cells are thoroughly washed from components of the medium with a Hanks solution (PanEco or similar) and placed in a serum-free and devoid of animal products growth medium, the latter using low glucose DMEM (HyClone, USA) or another growth medium that supports Human MSCs viability (not less than 70%) during the whole period and conditioning suitable for therapeutic use.

Культивирование может быть осуществлено в культуральных флаконах или чашках Петри (фирмы Corning или аналогичные), при этом клетки выращивают на плоской подложке с плотностью 5-15*10³/см² в среде роста в объеме 0,1-0,2 мл/см² в условиях СО₂ инкубатора при 37±1°С, 5%-ном содержании СО₂ и относительной влажности ≥95% в течение 7±1 дней. Удаление из среды культивирования остатков клеток (клеточного дебриса) может быть реализовано центрифугированием, например, при 5000±10 об/мин, температуре 6±2°С в течение 10 минут. Очистку среды культивирования осуществляют посредством ее ультрафильтрации с удалением низкомолекулярных соединений массой менее 5 кДа, при этом для получения стерильного продукта дополнительно осуществляют микрофильтрацию полученного раствора через фильтры с диаметром пор 0,22 мкм. Очистка может быть осуществлена с использованием системы фильтрации в тангенциальном потоке Minim II (Life Sciences, США) или аналогичной с использованием ультрафильтрационных кассет (Minimate TFF capsule, PALL) или аналогичных. Лиофилизация может быть осуществлена в 8-14 стадий при давлении 0,013 кПа, температуре от -40°С до -5°С, время лиофилизации не более 36 часов при максимальной загрузке лиофильной сушки.Cultivation can be carried out in culture bottles or Petri dishes (Corning or similar), while the cells are grown on a flat substrate with a density of 5-15 * 10 ³ / cm ² in a growth medium in a volume of 0.1-0.2 ml / cm ² under the conditions of a СО ₂ incubator at 37 ± 1 ° С, 5% content of СО ₂ and relative humidity ≥95% for 7 ± 1 days. Removal of cell debris (cell debris) from the culture medium can be carried out by centrifugation, for example, at 5000 ± 10 rpm, temperature 6 ± 2 ° C for 10 minutes. The cultivation medium is purified by ultrafiltration with the removal of low molecular weight compounds weighing less than 5 kDa, while microfiltration of the resulting solution is additionally carried out through filters with a pore diameter of 0.22 μm to obtain a sterile product. Cleaning can be carried out using a Minim II tangential flow filtration system (Life Sciences, USA) or similar using ultrafiltration cassettes (Minimate TFF capsule, PALL) or similar. Lyophilization can be carried out in 8-14 stages at a pressure of 0.013 kPa, temperature from -40 ° C to -5 ° C, lyophilization time of not more than 36 hours at maximum load of freeze drying.

Поставленная задача решается также тем, что средство для регенерации тканей включает среду роста в виде лиофилизата, полученного по способу, описанному выше, который содержит ключевые биологически активные факторы роста: VEGF в концентрации не менее 200 пкг/мл, HGF в концентрации не менее 150 пкг/мл, FGF basic в концентрации не менее 0,29 пкг/мл, ангиопоэтин-1 в концентрации не менее 145 пкг/мл, PEDF в концентрации не менее 500 пкг/мл, определяемые методом иммуноферментного анализа при восстановлении 0,1±0,005 г лиофилизата в 10 мл стерильного физиологического раствора.The problem is also solved by the fact that the means for tissue regeneration includes a growth medium in the form of a lyophilisate obtained by the method described above, which contains key biologically active growth factors: VEGF at a concentration of at least 200 pkg / ml, HGF at a concentration of at least 150 pkg / ml, FGF basic at a concentration of at least 0.29 pg / ml, angiopoietin-1 at a concentration of at least 145 pg / ml, PEDF at a concentration of at least 500 pg / ml, determined by enzyme-linked immunosorbent assay when recovering 0.1 ± 0.005 g lyophilisate in 10 ml of sterile physiological solution of creation.

Таким образом, технический результат достигается за счет того, что средство для регенерации тканей получают при культивировании МСК человека в бессывороточной среде, лишенной животных компонентов, с потенциально безопасным для клинического применения составом, поддерживающей жизнеспособность клеток в течение подобранного срока кондиционирования, путем сбора кондиционированной среды, содержащей биологически активные факторы, секретируемые клетками в культуральную среду, очистки полученной среды с помощью центрифугирования и ультрафильтрации и ее стабилизации путем лиофилизации. Полученный лиофилизат, разведенный в стерильном физиологическом растворе, можно использовать как лекарственное средство или как компонент биоматериалов при комбинировании с биосовместимыми носителями для стимуляции регенерации тканей после повреждения.Thus, the technical result is achieved due to the fact that the tissue regeneration agent is obtained by culturing human MSCs in a serum-free medium devoid of animal components, with a potentially safe composition for clinical use, supporting cell viability during the selected conditioning period, by collecting conditioned medium, containing biologically active factors secreted by cells into the culture medium, purification of the resulting medium by centrifugation and ultra filtration and its stabilization by lyophilization. The obtained lyophilisate, diluted in sterile saline, can be used as a medicine or as a component of biomaterials when combined with biocompatible carriers to stimulate tissue regeneration after damage.

Эффективность разрабатываемого средства предполагает наличие целого комплекса воздействий, направленных на стимулирование пролиферации и миграции специализированных клеток, участвующих в процессах репарации и регенерации, таких как эндотелиальные клетки, фибробласты и др., регуляцию процессов воспаления и, наконец, формирование стабильной сети сосудов и подрастание нервов. При этом необходимость адекватного восстановления сосудистой сети и нервных окончаний в зоне регенерации поврежденной ткани является актуальной задачей. Использование среды культивирования, кондиционированной МСК человека, позволит обеспечить комплексное решение проблем, возникающих при регенерации тканей после повреждения. Предполагается, что ускоренное заживление различных повреждений, в том числе за счет стимуляции васкуляризации и реиннервации, может быть осуществлено с помощью бессывороточной среды, содержащей комбинацию цитокинов и факторов роста и других биологически активных компонентов, секретированных МСК человека. Данное решение позволяет получить оптимальное сочетание факторов роста, секретированных клетками человека, т.е. прошедших необходимые модификации и способствующее ангиогенезу и нейрогенезу в среде, не содержащей белков животного происхождения и бактериальных фрагментов, а также обеспечить сбалансированный эффект секретируемых клетками продуктов за счет наличия разнонаправленных по механизму действия факторов, среди которых для разрабатываемого средства контролируется содержание антиангиогенного фактора PEDF.The effectiveness of the developed product implies the presence of a whole range of effects aimed at stimulating the proliferation and migration of specialized cells involved in repair and regeneration processes, such as endothelial cells, fibroblasts, etc., regulation of inflammation and, finally, the formation of a stable vascular network and nerve growth. Moreover, the need for adequate restoration of the vascular network and nerve endings in the area of regeneration of damaged tissue is an urgent task. The use of a culture medium conditioned by human MSCs will provide a comprehensive solution to the problems that arise during tissue regeneration after damage. It is believed that accelerated healing of various injuries, including by stimulating vascularization and reinnervation, can be carried out using a serum-free medium containing a combination of cytokines and growth factors and other biologically active components secreted by human MSCs. This solution allows you to get the optimal combination of growth factors secreted by human cells, i.e. having undergone the necessary modifications and promoting angiogenesis and neurogenesis in an environment that does not contain animal proteins and bacterial fragments, as well as providing a balanced effect of cell-secreted products due to the presence of factors that are multidirectional in terms of the mechanism of action, among which the content of the antiangiogenic factor PEDF is controlled.

Для получения кондиционированной среды нами использованы мультипотентные мезенхимные стволовые/стромальные клетки (МСК) человека, отвечающие за репарацию и регенерацию тканей и органов как в норме, так и при повреждениях. Одним из наиболее богатых источников МСК у человека является жировая ткань. МСК могут быть легко выделены в результате ферментативной обработки образцов жировой ткани, полученной в результате косметической липосакции или в ходе хирургического удаления жирового отложения. Культивирование изолированных МСК ЖТ приводит к получению относительно гомогенной популяции мультипотентных стромальных фибробластоподобных клеток.To obtain a conditioned environment, we used multipotent human mesenchymal stem / stromal cells (MSCs), which are responsible for the repair and regeneration of tissues and organs both in normal and in case of damage. One of the richest sources of MSCs in humans is adipose tissue. MSCs can be easily isolated as a result of enzymatic processing of adipose tissue samples obtained as a result of cosmetic liposuction or during surgical removal of body fat. The cultivation of isolated MSC in adipose tissue results in a relatively homogeneous population of multipotent stromal fibroblast-like cells.

В заявляемом изобретении могут быть использованы МСК, полученные самостоятельно по любому известному из уровня техники способу (см. Пример 1), так и в виде коммерческих препаратов МСК, имеющих сертификат качества и предназначенных, в том числе, для клинического применения, например, такие как продукт АТСС (АТСС^® PCS-500-011), представляющий собой МСК человека, выделенные из липоаспирата, культивированные до 2 пассажа и подвергнутые криоконсервации, или аналогичные.In the claimed invention can be used MSCs obtained independently by any method known from the prior art (see Example 1), and in the form of commercial preparations of MSCs with a quality certificate and intended, including, for clinical use, for example, such as ATCC product (ATCC ^® PCS-500-011), which is a human MSC isolated from lipoaspirate, cultured up to 2 passages and subjected to cryopreservation, or similar.

Ранее на моделях ишемии конечности и инфаркта миокарда и подкожно имплантированного матригеля у животных нами было показано, что локальное и системное введение МСК ЖТ способствует увеличению количества сосудов в тканях с нарушенным кровоснабжением, приводит к улучшению кровотока в этих тканях и уменьшению или исчезновению симптомов ишемии. Кроме того, нами было выявлено, что введение МСК ЖТ способствует прорастанию нервных окончаний в подкожно имплантированный матригель и улучшает восстановление периферических нервов после травматического повреждения. Согласно данным наших исследований и работ других научных коллективов основным механизмом, лежащим в основе регенеративного эффекта МСК ЖТ, является продукция этими клетками широкого спектра биологически активных цитокинов и факторов роста, ускоряющих процессы заживления и восстановления тканей после повреждения.Previously, on models of limb ischemia and myocardial infarction and subcutaneously implanted matrigel in animals, we showed that local and systemic administration of VT MSCs increases the number of vessels in tissues with impaired blood supply, leads to an improvement in blood flow in these tissues and a decrease or disappearance of symptoms of ischemia. In addition, we found that the introduction of MSC in the VT promotes the germination of nerve endings in the subcutaneously implanted matrigel and improves the recovery of peripheral nerves after traumatic injury. According to the data of our studies and the work of other scientific teams, the main mechanism underlying the regenerative effect of MSC in VT is the production by these cells of a wide range of biologically active cytokines and growth factors that accelerate the healing and restoration of tissues after damage.

В большинстве протоколов выделения и культивирования МСК ЖТ используется среда с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) или фетальной бычьей сыворотки (ФБС). Эти сыворотки содержат необходимый коктейль факторов роста, гормонов и витаминов, стимулирующих клеточную адгезию и пролиферацию в условиях культивирования in vitro. В то же время накапливается все больше сведений о том, что клетки, выращенные с использованием сывороток животных, потенциально небезопасны, в частности, существует риск заражения прионами или вирусами культуры клеток при культивировании с использованием сывороток животных, а также возможность иммунной реакции со стороны организма реципиента. Кроме того, было показано, что длительное культивирование в присутствии ФБС значительно изменяет свойства клеток различного происхождения. Так, мезенхимные клетки костного мозга, культивированные в присутствии ФБС, характеризуются нестабильностью транскриптома, включая изменение экспрессии генов, ответственных за регуляцию клеточного цикла, апоптоз и клеточную адгезию.Most protocols for isolation and cultivation of MSC in adipose tissue use a medium supplemented with fetal calf serum (ETS) or fetal bovine serum (FBS). These serums contain the necessary cocktail of growth factors, hormones and vitamins that stimulate cell adhesion and proliferation in vitro. At the same time, more and more information is accumulating that cells grown using animal sera are potentially unsafe, in particular, there is a risk of infection of the cell culture by prions or viruses during cultivation using animal sera, as well as the possibility of an immune reaction from the recipient’s body . In addition, it was shown that long-term cultivation in the presence of PBS significantly changes the properties of cells of various origins. Thus, bone marrow mesenchymal cells cultured in the presence of PBS are characterized by transcriptome instability, including a change in the expression of genes responsible for the regulation of the cell cycle, apoptosis and cell adhesion.

Отличительной особенностью данного изобретения является использование специализированной среды, поддерживающей рост и функциональные свойства недифференцированных МСК человека, на этапах, предшествующих кондиционированию МСК: AdvanceSTEM Cell Culture Media (HyClone, USA) с добавлением раствора антибиотиков Penicillin-Streptomycin (HyClone, USA) и добавки к среде роста AdvanceSTEM Stem Cell Growth Supplement (HyClone, USA), которые берут при следующем соотношении компонентов, об. %:A distinctive feature of this invention is the use of a specialized environment that supports the growth and functional properties of undifferentiated human MSCs, at the stages preceding the conditioning of MSCs: AdvanceSTEM Cell Culture Media (HyClone, USA) with the addition of Penicillin-Streptomycin antibiotic solution (HyClone, USA) and a medium supplement growth AdvanceSTEM Stem Cell Growth Supplement (HyClone, USA), which are taken in the following ratio of components, vol. %:

AdvanceSTEM Cell Culture Media - 89-91;AdvanceSTEM Cell Culture Media - 89-91;

Раствор антибиотиков Penicillin-Streptomycin - 0,95-1,05;Penicillin-Streptomycin antibiotic solution - 0.95-1.05;

Добавки к среде роста AdvanceSTEM Stem Cell Growth Supplement - 9,5-10,5.AdvanceSTEM Stem Cell Growth Supplement - 9.5-10.5.

МСК выделяют из подкожной жировой ткани человека и культивируют в приготовленной по указанной выше схеме среде роста до 4-5 пассажа. Затем клетки тщательно отмывают от компонентов среды роста раствором Хэнкса (фирмы ПанЭко или аналогичным) и помещают в бессывороточную и лишенную продуктов животного происхождения среду роста, в качестве последней используют DMEM с низким содержанием глюкозы (HyClone, USA) или другую среду роста, поддерживающую жизнеспособность МСК человека (не ниже 70%) в течение всего срока кондиционирования и пригодную для терапевтического применения. Указанную среду для кондиционирования клеткам добавляют в объеме 0,1-0,2 мл/см² и культивируют в условиях СО₂ инкубатора при 37±1°С, 5%-ном содержании СО₂ и относительной влажности ≥95% в течение 7±1 дней. Кондиционированную среду, содержащую все продукты секреции МСК человека, собирают в стерильные емкости для центрифугирования, удаляют путем центрифугирования остатки клеток и полученный супернатант подвергают очистке с помощью процедуры ультрафильтрации, удаляя все низкомолекулярные соединения массой менее 5 кДа. На этапе ультрафильтрации при использовании соответствующего оборудования и соблюдении асептических условий можно получить стерильный продукт. Если невозможно обеспечить стерильность продукта при процедуре ультрафильтрации, то добавляют этап микрофильтрации. Для этого концентрированную среду фильтруют через одноразовые стерильные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм, достаточным для очистки от потенциально содержащихся в продукте микроорганизмов, а затем подвергают процедуре лиофилизации для получения итогового продукта (лиофилизат кондиционированной среды, содержащей продукты секреции МСК человека), содержащего в том числе ключевые биологически активные факторы, по которым проводится стандартизация конечного продукта. Так, при восстановлении 0,1±0,005 г лиофилизата в 10 мл стерильного физиологического раствора методом иммуноферментного анализа в растворе должны определяться VEGF в концентрации не менее 200 пкг/мл, HGF в концентрации не менее 150 пкг/мл, FGF basic в концентрации не менее 0,29 пкг/мл, ангиопоэтин-1 в концентрации не менее 145 пкг/мл, PEDF в концентрации не менее 500 пкг/мл.MSCs are isolated from human subcutaneous adipose tissue and cultured in growth medium prepared according to the above scheme up to 4-5 passage. Then, the cells are thoroughly washed from the components of the growth medium with Hanks solution (PanEco or similar) and placed in a serum-free and animal-free growth medium, the latter using low glucose DMEM (HyClone, USA) or another growth medium that supports MSC viability person (not lower than 70%) during the entire period of conditioning and suitable for therapeutic use. The specified medium for conditioning cells is added in a volume of 0.1-0.2 ml / cm ² and cultured in a CO ₂ incubator at 37 ± 1 ° C, 5% CO ₂ and relative humidity ≥95% for 7 ± 1 days. The conditioned medium containing all the secretion products of human MSCs is collected in sterile centrifugation containers, the remaining cells are removed by centrifugation, and the resulting supernatant is purified by ultrafiltration, removing all low molecular weight compounds weighing less than 5 kDa. At the ultrafiltration stage, using appropriate equipment and observing aseptic conditions, a sterile product can be obtained. If it is not possible to ensure sterility of the product during the ultrafiltration procedure, then the microfiltration step is added. To do this, the concentrated medium is filtered through disposable sterile filters with a pore diameter of 0.22 μm, sufficient to purify microorganisms potentially contained in the product, and then subjected to a lyophilization procedure to obtain the final product (lyophilisate of the conditioned medium containing human MSC secretion products) containing including key biologically active factors that standardize the final product. So, when restoring 0.1 ± 0.005 g of lyophilisate in 10 ml of sterile physiological saline by enzyme-linked immunosorbent assay, VEGF at a concentration of at least 200 pkg / ml, HGF at a concentration of at least 150 pkg / ml, FGF basic at a concentration of at least 0.29 pkg / ml, angiopoietin-1 at a concentration of not less than 145 pkg / ml, PEDF at a concentration of not less than 500 pkg / ml.

Другой технической особенностью данного изобретения является возможность очищать, а при необходимости и одновременно концентрировать кондиционированную среду с использованием системы фильтрации в тангенциальном потоке Minim II (Life Sciences, США) или аналогичной, используя ультрафильтрационные кассеты (Minimate TFF capsule, PALL) или аналогичные, что позволяет значительно ускорить процесс очистки и/или концентрирования и способствует лучшему сохранению биологически активных веществ в кондиционированной среде.Another technical feature of this invention is the ability to clean, and if necessary, and simultaneously concentrate the conditioned medium using a Minim II tangential flow filtration system (Life Sciences, USA) or similar, using ultrafiltration cassettes (Minimate TFF capsule, PALL) or similar, which allows significantly accelerate the process of purification and / or concentration and contributes to the better preservation of biologically active substances in an air-conditioned environment.

В результате осуществления данного изобретения получают средство на основе продуктов секреции МСК человека, которое может быть использовано как лекарственное средство или как компонент биоматериала для стимуляции регенерации тканей.As a result of the implementation of this invention, an agent is obtained based on the secretion products of human MSCs, which can be used as a medicine or as a component of a biomaterial to stimulate tissue regeneration.

Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings

Изобретение поясняется чертежами, где на фигурах представлены:The invention is illustrated by drawings, where the figures show:

Фигура 1. Диаграмма, отражающая оценку жизнеспособности МСК-ЖТ человека при длительном кондиционировании сред без питательных добавок. Синяя кривая - процент живых клеток при кондиционировании среды DMEM-LG. Оранжевая кривая - процент живых клеток при кондиционировании среды NutriStem. Статистическая оценка жизнеспособности проводилась с использованием критерия Краскела-Уоллиса с последующим применением критерия Данна. Использованы критические значения для сравнения групп с контрольной (3 дня). Статистически значимых различий не выявлено; n=3 для каждой временной точки.Figure 1. A chart reflecting the assessment of the viability of human MSC in adipose tissue during prolonged conditioning of media without nutritional supplements. The blue curve is the percentage of living cells when conditioning DMEM-LG medium. The orange curve is the percentage of living cells when conditioning NutriStem medium. Statistical assessment of viability was carried out using the Kruskal-Wallis test followed by the use of the Dunn test. Critical values were used to compare groups with control (3 days). No statistically significant differences were found; n = 3 for each time point.

Фигура 2. Диаграмма, отражающая динамику изменения содержания ключевых факторов при кондиционировании МСК-ЖТ человека среды DMEM-LG. По горизонтальной оси указана продолжительность кондиционирования среды в днях, по вертикальной - концентрация факторов в пг/мл. Число выборок для каждой временной точки - 3. A. VEGF. В. HGF Концентрации факторов на 7 день значимо выше концентраций при меньшей длительности кондиционирования, но не отличается от концентраций при более длительном кондиционировании С. FGF2. Пиковая концентрация достигается на 7 день кондиционирования. Разница концентраций 3- и 7-дневного кондиционирования статистически не значима (р=0,072). D. Angpt-1. Концентрация фактора на 7 день кондиционирования выше, чем на 3. Концентрация фактора в продукте 12-дневного кондиционирования значимо больше 7-дневного (p<0,004). Анализ проводили с помощью ПО Statistica 10 методом ANOVA с последующим использованием критерия Даннета. Различия считали значимыми при p<0,05.Figure 2. A diagram reflecting the dynamics of changes in the content of key factors during conditioning of human MSC-VT in DMEM-LG medium. The horizontal axis indicates the duration of air conditioning in days, and the vertical axis shows the concentration of factors in pg / ml. The number of samples for each time point is 3. A. VEGF. B. HGF Concentrations of factors on day 7 are significantly higher than concentrations for shorter conditioning times, but do not differ from concentrations for longer conditioning C. FGF2. Peak concentration is reached on day 7 of conditioning. The difference in the concentrations of 3- and 7-day conditioning is not statistically significant (p = 0.072). D. Angpt-1. The concentration of the factor on day 7 of conditioning is higher than by 3. The concentration of factor in the product of 12-day conditioning is significantly greater than 7-day (p <0.004). The analysis was performed using Statistica 10 software using the ANOVA method followed by the Dunnet test. Differences were considered significant at p <0.05.

Фигура 3. Диаграмма, отражающая динамику изменения содержания ключевых факторов при кондиционировании МСК-ЖТ человека среды NutriStem. По горизонтальной оси указана продолжительность кондиционирования среды в днях, по вертикальной - концентрация факторов в кондиционированной среде, пг/мл. Выборка для каждой временной точки - 3. A. VEGF. В. HGF. С. FGF2. Концентрации факторов на 7 день значимо выше концентраций при меньшей длительности кондиционирования, но не отличается от концентраций при более длительном кондиционировании. D. Angpt-1. Концентрация фактора на 7 день кондиционирования значимо выше, чем на 3. Концентрация фактора в продукте 12-дневного кондиционирования значимо больше 7-дневного (p<0,0030). Анализ проводили с помощью ПО Statistica 10 методом ANOVA с последующим использованием критерия Даннета. Различия считали значимыми при p<0,05.Figure 3. A diagram reflecting the dynamics of changes in the content of key factors during conditioning of human MSC in adipose tissue environment NutriStem. The horizontal axis indicates the duration of conditioning of the medium in days, the vertical axis shows the concentration of factors in the conditioned medium, pg / ml. The sample for each time point is 3. A. VEGF. B. HGF. C. FGF2. Concentrations of factors on day 7 are significantly higher than concentrations for shorter conditioning times, but do not differ from concentrations for longer conditioning. D. Angpt-1. The concentration of the factor on day 7 of conditioning is significantly higher than by 3. The concentration of factor in the product of 12-day conditioning is significantly greater than 7-day (p <0.0030). The analysis was performed using Statistica 10 software using the ANOVA method followed by the Dunnet test. Differences were considered significant at p <0.05.

Фигура 4. Диаграмма, отражающая сравнение количественного содержания ключевых активных факторов в средах DMEM-LG и NutriStem через 7 дней кондиционирования. Столбиками отмечены значения медиан по каждому фактору. Планками ограничиваются 25-тые и 75-тые процентили. Над планками показан уровень значимости различий. А. Сравнение концентраций фактора VEGF. В. Сравнение концентраций фактора HGF. С. Сравнение концентраций фактора FGF2. D. Сравнение концентраций фактора Angpt-1. Е. Сравнение концентраций фактора PEDF. Различия устанавливали с помощью критерия Манна-Уитни. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.Figure 4. Diagram showing a comparison of the quantitative content of key active factors in DMEM-LG and NutriStem environments after 7 days of conditioning. The bars indicate the median values for each factor. Planks are limited to the 25th and 75th percentiles. Above the planks, the significance level of the differences is shown. A. Comparison of VEGF factor concentrations. B. Comparison of HGF factor concentrations. C. Comparison of FGF2 factor concentrations. D. Comparison of Angpt-1 Factor Concentrations E. Comparison of PEDF factor concentrations. Differences were established using the Mann-Whitney test. Differences were considered statistically significant at p <0.05.

Фигура 5. Диаграммы, отражающие результаты оценки специфической активности разрабатываемого средства на модели миграции фибробластов в клеточную рану. А. Скорость миграции фибробластов (модель клеточной раны) при стимуляции базовой средой DMEM-LG (отрицательный контроль; DMEMneg; n=6), образцами кондиционирования МСК ЖТ человека в среде DMEM-LG (DMEM 7d), DMEM-LG + 10% ФБС (положит. контроль; DMEMpos, n=5). В. Скорость миграции фибробластов при стимуляции базовой средой NutriStem (Nutrineg; n=4), образцами кондиционирования МСК-ЖТ человека в среде NutriStem (Nutri 7d), NutriStem с добавлением 10% добавки «NutriStem supplement» (положительный контроль; Nutripos, n=5). Квадратными точками отмечены медианы, прямоугольными блоками - значения 25-75 процентилей, планки отмечают максимальные и минимальные значения выборок. Статистическую оценку проводили с использованием критерия Краскела-Уоллиса с последующим применением критерия Данна. Использованы критические значения для сравнения групп с контрольной (DMEMneg для A; Nutrineg для В). * - p<0,05. ** - p<0,01.Figure 5. Diagrams reflecting the results of the assessment of the specific activity of the developed product on the model of fibroblast migration into the cell wound. A. Fibroblast migration rate (cell wound model) upon stimulation with DMEM-LG basal medium (negative control; DMEMneg; n = 6), conditioning samples of human MTC in DMEM-LG (DMEM 7d), DMEM-LG + 10% FBS (positive control; DMEMpos, n = 5). B. Fibroblast migration rate upon stimulation with NutriStem basal medium (Nutrineg; n = 4), human MSC-VT conditioning samples in NutriStem medium (Nutri 7d), NutriStem supplemented with 10% NutriStem supplement (positive control; Nutripos, n = 5). The square dots indicate the medians, the rectangular blocks indicate the values of 25-75 percentiles, the bars indicate the maximum and minimum values of the samples. Statistical evaluation was performed using the Kruskal-Wallis test followed by the Dunn test. Critical values were used to compare groups with control (DMEMneg for A; Nutrineg for B). * - p <0.05. ** - p <0.01.

Фигура 6. Диаграммы, отражающие результаты оценки специфической активности разрабатываемого средства на модели направленной миграции эндотелиальных клеток. А. Оценка относительной средней скорости эндотелиальных клеток человека (EA.hy926) за первые 4 часа миграции при стимуляции образцами кондиционированной среды, полученной при культивировании МСК-ЖТ человека в средах DMEM-LG и NutriStem в течение 7 дней по сравнению с базовой средой DMEM-LG (отрицательный контроль, n=4) и DMEM-LG + 10% FBS (положительный контроль, n=4). Представлена скорость миграции относительно отрицательного контроля. На диаграмме представлены медианы по выборкам. Планки ограничивают 25 и 75 процентили. Статистическую оценку проводили с использованием критерия Манна-Уитни с помощью ПО Statistica 10. В. Оценка относительной средней скорости эндотелиальных клеток человека (EA.hy926) за первые 4 часа миграции при стимуляции образцами кондиционированной среды, полученной при культивировании МСК-ЖТ человека, разведенными в 2, 4 и 8 раз.Figure 6. Diagrams reflecting the results of the assessment of the specific activity of the developed product on the model of directed migration of endothelial cells. A. Estimation of the relative average speed of human endothelial cells (EA.hy926) for the first 4 hours of migration upon stimulation with samples of the conditioned medium obtained by culturing human MSC in adipose tissue in DMEM-LG and NutriStem environments for 7 days compared to the baseline DMEM- LG (negative control, n = 4) and DMEM-LG + 10% FBS (positive control, n = 4). The migration rate relative to the negative control is presented. The chart shows the medians for the samples. The trims limit 25 and 75 percentiles. Statistical evaluation was performed using the Mann-Whitney test using Statistica 10 software. B. Assessment of the relative average speed of human endothelial cells (EA.hy926) for the first 4 hours of migration when stimulated with samples of conditioned medium obtained by culturing human MSC-VT diluted in 2, 4 and 8 times.

Осуществление изобретенияThe implementation of the invention

Ниже представлено подробное описание изобретения на примерах конкретного выполнения, которые демонстрируют практическую осуществимость изобретения, но не ограничивают возможность осуществления изобретения с помощью иных средств и методов.Below is a detailed description of the invention by examples of specific performance, which demonstrate the practical feasibility of the invention, but do not limit the possibility of carrying out the invention using other means and methods.

Пример 1. Получение МСК жировой ткани человека.Example 1. Obtaining MSCs of human adipose tissue.

МСК выделяют из подкожного жирового отложения здоровых доноров обоих полов. Клетки выделяют из материала, полученного при проведении малого хирургического вмешательства под местной анестезией или в ходе плановых хирургических операций. Хирургический материал (15 г жировой ткани, взятой из околопупочной области или другой области локализации подкожного жира) помещают в одноразовую пробирку с буфером HBSS (HyClone), содержащим 5-кратную концентрацию антибиотика 500 ед/мл (HyClone).MSCs are isolated from subcutaneous fat deposits of healthy donors of both sexes. Cells are isolated from material obtained during minor surgery under local anesthesia or during routine surgical operations. Surgical material (15 g of adipose tissue taken from the umbilical region or other area of localization of subcutaneous fat) is placed in a disposable tube with HBSS buffer (HyClone) containing a 5-fold antibiotic concentration of 500 units / ml (HyClone).

В стерильных условиях культурального бокса биоптат фрагментируют до однородной массы, используя стерильные инструменты, после чего подвергают его ферментативной обработке в растворе, содержащем среду AdvanceSTEM™ (HyClone)/500 ед/мл антибиотика (HyClone), 200 ед/мл коллагеназы I типа и диспазы (40 ед/ml) (Worthington Biochemical) (соотношение объема ферментов и жира должно быть 1:1:1), при 37°С в течение 30-45 минут при постоянном помешивании. По окончании инкубации к образцу добавляют равный объем среды с сывороткой и фильтруют через нейлоновые мембраны с размером пор 100 мкм (BD). Профильтрованную суспензию центрифугируют в течение 5 мин при 200 g, после чего супернатант полностью удаляют. Осадок клеток подвергают обработке буфером для лизиса эритроцитов (BD) до покраснения раствора, после чего центрифугируют в течение 5 мин при 200 g. Супернатант полностью удаляют, а осажденные клетки ресуспендируют в среде роста МСК. Для культивирования мезенхимных клеток используют среду AdvanceSTEM™ support expansion and maintenance of undifferentiated human MSCs (HyClone) в сочетании с добавлением 10% раствора добавок AdvanceSTEM™ Stem Cell Growth Supplement (HyClone) и 100 ед/мл антибиотика (HyClone). Эта среда была разработана фирмой-производителем (HyClone) для культивирования недифференцированных МСК, в частности клеток, происходящих из жировой ткани, без добавления сыворотки (http://www.thermo.com).Under sterile conditions of the culture box, the biopsy is fragmented to a homogeneous mass using sterile instruments, and then subjected to enzymatic treatment in a solution containing AdvanceSTEM ™ medium (HyClone) / 500 u / ml antibiotic (HyClone), 200 u / ml type I collagenase and dispase (40 units / ml) (Worthington Biochemical) (the ratio of the volume of enzymes and fat should be 1: 1: 1), at 37 ° C for 30-45 minutes with constant stirring. At the end of the incubation, an equal volume of serum medium is added to the sample and filtered through nylon membranes with a pore size of 100 μm (BD). The filtered suspension is centrifuged for 5 min at 200 g, after which the supernatant is completely removed. The cell pellet is subjected to treatment with erythrocyte lysis buffer (BD) until the solution is reddened, and then centrifuged for 5 min at 200 g. The supernatant is completely removed, and the precipitated cells are resuspended in MSC growth medium. AdvanceSTEM ™ support expansion and maintenance of undifferentiated human MSCs (HyClone) combined with 10% AdvanceSTEM ™ Stem Cell Growth Supplement (HyClone) and 100 u / ml antibiotic (HyClone) are used to cultivate mesenchymal cells. This medium was developed by the manufacturer (HyClone) for the cultivation of undifferentiated MSCs, in particular cells derived from adipose tissue, without the addition of serum (http://www.thermo.com).

Выделенные МСК высевают в концентрации 200 тыс. в мл в чашках Петри и культивируют в среде роста в инкубаторе при 37°С и при 5%-ной концентрации СО₂. При достижении 80% монослоя МСК ЖТ (0 пассаж) замораживают в жидком азоте и хранят в мастер-банке для дальнейшего использования с целью наработки среды.Isolated MSCs are seeded at a concentration of 200 thousand per ml in Petri dishes and cultivated in growth medium in an incubator at 37 ° C and at a 5% concentration of CO ₂ . Upon reaching 80% of the monolayer of MSC ZhT (0 passage), they are frozen in liquid nitrogen and stored in a master bank for further use in order to accumulate the medium.

Для наработки среды МСК ЖТ масштабируют. Перед снятием с поверхности культурального пластика клетки трехкратно промывают раствором Версена. Затем наносят в каждую чашку по 1 мл реагента для диссоциации клеток HyQTase (HyClone). При приобретении клетками округлой формы и откреплении их от подложки в каждую культуральную емкость вносят по 9 мл среды роста и интенсивно пипетируют клеточную суспензию. Затем клетки рассевают в соотношении 1:4.To produce the medium, MSCs of VT are scaled. Before removing from the surface of the culture plastic, the cells are washed three times with Versen's solution. Then, 1 ml of HyQTase (HyClone) cell dissociation reagent is applied to each dish. When the cells acquire a rounded shape and detach them from the substrate, 9 ml of growth medium is introduced into each culture container and the cell suspension is intensively pipetted. Then the cells are seeded in a ratio of 1: 4.

Пример 2. Получение кондиционированной среды, содержащей продукты секреции МСК жировой ткани человека.Example 2. Obtaining a conditioned medium containing the secretion products of MSCs in human adipose tissue.

Для получения кондиционированной среды МСК ЖТ наращивают до 2-5 пассажа. МСК ЖТ человека добавляют в количестве 5-15*10³/см² в культуральные емкости для выращивания эукариотических клеток, после прикрепления промывают культуральные сосуды с клетками солевым раствором Хэнкса (Панэко, Россия) (в количестве 0,1-0,2 мл/см² трижды по 10 минут) и заполняют их свежей средой роста для кондиционирования в количестве 0,1-0,2 мл/см². В качестве последней используют универсальную среду роста для разных типов клеток DMEM with Low Glucose (HyClone, USA) или среду роста для поддержания роста МСК человека MSC NutriStem® XF Basal Medium (Biological Industries, Israel), с добавлением раствора антибиотиков Penicillin-Streptomycin (HyClone, USA) (1,00±0,05 мл на 100±5 мл среды). Затем клетки культивируют в условиях СО₂ инкубатора при 37±1°С, 5%-ном содержании СО₂ и относительной влажности ≥95% в течение 7 суток.To obtain a conditioned environment, MSCs of VT are increased to 2-5 passage. MSCs of human gastrointestinal tract are added in an amount of 5-15 * 10 ³ / cm ² in culture containers for growing eukaryotic cells, after attachment, the culture vessels with cells are washed with Hanks saline solution (Paneko, Russia) (in an amount of 0.1-0.2 ml / cm ² three times for 10 minutes) and fill them with fresh growth medium for conditioning in the amount of 0.1-0.2 ml / cm ² . As the latter, a universal growth medium for different types of DMEM with Low Glucose cells (HyClone, USA) or growth medium to support the growth of human MSC MSC NutriStem® XF Basal Medium (Biological Industries, Israel), with the addition of Penicillin-Streptomycin antibiotic solution (HyClone) is used , USA) (1.00 ± 0.05 ml per 100 ± 5 ml of medium). Then the cells were cultured in a CO ₂ incubator at 37 ± 1 ° C, 5% CO ₂ and relative humidity ≥95% for 7 days.

В качестве культуральных емкостей для выращивания эукариотических клеток используют культуральные флаконы или чашки Петри (фирмы Corning или аналогичные), при этом клетки выращивают на плоской подложке плотностью 5-15*10³/см².As culture containers for growing eukaryotic cells, culture bottles or Petri dishes (Corning or the like) are used, and the cells are grown on a flat substrate with a density of 5-15 * 10 ³ / cm ² .

Пример 3. Очистка кондиционированной среды, содержащей продукты секреции МСК жировой ткани человека, методом ультрафильтрации.Example 3. The purification of the conditioned medium containing the secretion products of MSCs of human adipose tissue, ultrafiltration.

Кондиционированную среду, содержащую все продукты секреции МСК ЖТ человека, собирают в стерильные емкости для центрифугирования, центрифугируют при (5000±10) об/мин, температуре (6±2)°С, в течение 10 минут для удаления клеточного дебриса. Полученный супернатант отбирают в новые стерильные емкости объемом 250-500 мл.An air-conditioned medium containing all the secretion products of human gastrointestinal MSCs is collected in sterile centrifugation containers, centrifuged at (5000 ± 10) rpm, temperature (6 ± 2) ° C, for 10 minutes to remove cell debris. The resulting supernatant is taken into new sterile containers with a volume of 250-500 ml.

Очистку среды от низкомолекулярных компонентов проводят с помощью системы фильтрации в тангенциальном потоке Minim II (Life Sciences), используя ультрафильтрационные кассеты (Minimate TFF capsule, PALL, 5 кДа) или аналогичные. Для этого питающий резервуар заполняют 100 мл кондиционированной среды. Производительность насоса устанавливают на уровне 90-120 мл/мин, давление не более 2 атмосфер, скорость потока фильтрата не более 20-30 мл/мин. Проводят 5-6 раундов очистки, восполняя объем добавлением раствора Хэнкса в питающий резервуар. После этого выключают насос, переносят возвращающий шланг в сосуд для сбора очищенного раствора, включают насос и дожидаются осушения питающего резервуара. Для вытеснения остатков очищенной среды в питающий резервуар добавляют раствор Хэнкса, включают насос и под визуальным контролем собирают очищенную среду до момента выхода из системы всего раствора.Purification of the medium from low molecular weight components is carried out using a Minim II tangential flow filtration system (Life Sciences) using ultrafiltration cartridges (Minimate TFF capsule, PALL, 5 kDa) or similar. For this, the feed tank is filled with 100 ml of conditioned medium. The pump performance is set at 90-120 ml / min, the pressure is not more than 2 atmospheres, the filtrate flow rate is not more than 20-30 ml / min. 5-6 rounds of purification are carried out, replenishing the volume by adding Hanks solution to the feed tank. After that, turn off the pump, transfer the return hose to the vessel to collect the purified solution, turn on the pump and wait for the drainage of the supply tank. To displace the residues of the purified medium, Hanks solution is added to the feed tank, the pump is turned on and the purified medium is collected under visual control until the entire solution leaves the system.

При невозможности соблюсти стерильность при проведении ультрафильтрации очищенную среду подвергают микрофильтрации. Фильтрацию очищенной среды осуществляют через одноразовые стерильные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм, обеспечивающие стерилизацию продукта. Среду подают на фильтры перистальтическим насосом. Фильтрат собирают в стерильную полипропиленовую емкость.If it is not possible to maintain sterility during ultrafiltration, the purified medium is subjected to microfiltration. Filtration of the purified medium is carried out through disposable sterile filters with a pore diameter of 0.22 μm, ensuring sterilization of the product. The medium is fed to the filters by a peristaltic pump. The filtrate is collected in a sterile polypropylene container.

Пример 4. Лиофилизация очищенной кондиционированной среды, содержащей продукты секреции МСК жировой ткани человека.Example 4. Lyophilization of purified conditioned medium containing the secretion products of MSCs in human adipose tissue.

Очищенную фильтрованную среду подвергают процедуре лиофилизации для получения итогового продукта (лиофилизат кондиционированной среды, содержащей продукты секреции МСК человека). Для этого разливают очищенную фильтрованную среду по (10,0±0,1) мл в стерильные стеклянные флаконы емкостью 100 мл. Флаконы укупоривают бутиловыми резиновыми пробками для лиофилизации. Затем флаконы помещают в лиофильную сушку. Охлаждают до -45°C с контролем по температуре продукта, затем 1 час выдерживают при указанной температуре. После этого включают конденсор, охлаждают его до -45°С, включают вакуумный насос и доводят давление до 0,027 кПа. Проводят следующие шаги:The purified filtered medium is subjected to a lyophilization procedure to obtain the final product (lyophilisate of an air-conditioned medium containing human MSC secretion products). To do this, pour purified filtered medium of (10.0 ± 0.1) ml into sterile glass bottles with a capacity of 100 ml. Vials are sealed with butyl rubber stoppers for lyophilization. Then the bottles are placed in freeze drying. It is cooled to -45 ° C with a temperature control of the product, then it is kept at the indicated temperature for 1 hour. After that, turn on the condenser, cool it to -45 ° C, turn on the vacuum pump and bring the pressure to 0.027 kPa. Perform the following steps:

1) Ступенчатое охлаждение до 10°С за 20 минут при давлении 66,6 кПа;1) Step cooling to 10 ° C in 20 minutes at a pressure of 66.6 kPa;

2) Плавное охлаждение до -15°С за 25 минут при давлении 66,6 кПа;2) Smooth cooling to -15 ° C in 25 minutes at a pressure of 66.6 kPa;

3) Выдерживание на -15°С за 120 минут при давлении 66,6 кПа;3) Holding at -15 ° C for 120 minutes at a pressure of 66.6 kPa;

4) Плавное охлаждение до -40°С за 25 минут при давлении 66,6 кПа;4) Smooth cooling to -40 ° C in 25 minutes at a pressure of 66.6 kPa;

5) Выдерживание на -40°С за 150 минут при давлении 0,013 кПа;5) Holding at -40 ° C for 150 minutes at a pressure of 0.013 kPa;

6) Плавный нагрев до -30°С за 150 минут при давлении 0,013 кПа;6) Smooth heating to -30 ° C in 150 minutes at a pressure of 0.013 kPa;

7) Плавный нагрев до -20°С за 150 минут при давлении 0,013 кПа;7) Smooth heating to -20 ° C in 150 minutes at a pressure of 0.013 kPa;

8) Плавный нагрев до -10°С за 150 минут при давлении 0,013 кПа;8) Smooth heating to -10 ° C in 150 minutes at a pressure of 0.013 kPa;

9) Плавный нагрев до -5°С за 150 минут при давлении 0,013 кПа;9) Smooth heating to -5 ° C in 150 minutes at a pressure of 0.013 kPa;

10) Выдерживание на -5°С (в течение 20 часов до отключения оператором) при давлении 0,066 кПа;10) Holding at -5 ° C (within 20 hours before shutting down by the operator) at a pressure of 0.066 kPa;

11) Девакуумирование до 66,6 кПа;11) Devacuation up to 66.6 kPa;

12) Полная автоматическая укупорка резиновыми пробками;12) Full automatic corking with rubber stoppers;

13) Сброс вакуума;13) Vacuum discharge;

14) Выгрузка флаконов.14) Unloading bottles.

Общая продолжительность процедуры лиофилизации не превышает 36 часов при полной загрузке лиофильной сушки. После выгрузки на флаконы надевают алюминиевые колпачки и завальцовывают их с помощью ручной машины для обжима колпачков.The total duration of the lyophilization procedure does not exceed 36 hours with a full load of freeze drying. After unloading, aluminum caps are put on the vials and rolled up using a manual machine for crimping the caps.

Пример 5. Определение жизнеспособности МСК жировой ткани при длительном культивировании в среде без добавления сыворотки.Example 5. Determination of the viability of MSCs of adipose tissue during prolonged cultivation in a medium without the addition of serum.

Для выбора оптимального срока кондиционирования клеток была проведена оценка выживаемости клеток при культивировании в бессывороточных средах методом окраски раствором трипанового синего (HyClone, USA). Процент жизнеспособных клеток определяли на 3, 5, 7, 10, 12, 14 и 21 сутки после начала культивирования (Фигура 1). Статистический анализ показателей выживаемости клеток в среде DMEM не выявил значимых различий между сроком в 3 суток и другими временными точками, при этом уровень жизнеспособности клеток составлял не ниже 70%. На 21 день опыта клетки в среде DMEM погибли. Данные по выживаемости МСК-ЖТ человека в среде NutriStem при коротком и длительном периодах кондиционирования также не отличаются друг от друга. После 21 дня опыты по оценке жизнеспособности МСК в среде NutriStem были закончены. Таким образом, длительность кондиционирования среды может варьировать по крайней мере от 3 до 14 дней при сохранении жизнеспособности клеток не менее 70%.To select the optimal period for cell conditioning, cell survival was assessed by culturing in serum-free media by staining with trypan blue solution (HyClone, USA). The percentage of viable cells was determined on 3, 5, 7, 10, 12, 14 and 21 days after the start of cultivation (Figure 1). Statistical analysis of cell survival in DMEM did not reveal significant differences between 3 days and other time points, while the cell viability was not less than 70%. On the 21st day of the experiment, cells in DMEM medium died. The data on the survival of human MSC in adipose tissue in NutriStem medium with short and long conditioning periods also do not differ from each other. After 21 days, experiments on assessing the viability of MSCs in NutriStem medium were completed. Thus, the duration of the conditioning of the medium can vary from at least 3 to 14 days while maintaining cell viability of at least 70%.

Пример 6. Метод оценки концентрации ключевых факторов, опосредующих регенеративные эффекты среды, кондиционированной МСК жировой ткани человека.Example 6. A method for assessing the concentration of key factors mediating the regenerative effects of an environment conditioned by MSCs of human adipose tissue.

Оценку содержания VEGF, HGF, FGF basic (FGFb), Angpt-1 и PEDF в восстановленном в 10 мл стерильного физиологического раствора лиофилизате кондиционированной среды, содержащей продукты секреции МСК ЖТ человека, проводят методом иммуноферментного анализа (ELISA). В растворе должны определяться VEGF в концентрации не менее 200 пкг/мл, HGF в концентрации не менее 150 пкг/мл, FGF basic в концентрации не менее 0,29 пкг/мл, ангиопоэтин-1 в концентрации не менее 145 пкг/мл, PEDF в концентрации не менее 500 пкг/мл.Evaluation of the content of VEGF, HGF, FGF basic (FGFb), Angpt-1 and PEDF in reconstituted in 10 ml of sterile physiological solution lyophilisate conditioned medium containing the secretion products of MSCs of human VT, carried out by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). VEGF at a concentration of at least 200 pkg / ml, HGF at a concentration of at least 150 pkg / ml, FGF basic at a concentration of at least 0.29 pkg / ml, Angiopoietin-1 at a concentration of at least 145 pkg / ml, PEDF should be determined in the solution at a concentration of not less than 500 pcg / ml.

Оценка содержания FGFb с использованием набора фирмы R&D Systems Human FGF basic Quantikine ELISA Kit.Evaluation of FGFb content using the R&D Systems Human FGF basic Quantikine ELISA Kit.

Для определения концентрации FGFb методом ELISA используют коммерческий набор фирмы R&D Systems (Human FGF basic Quantikine ELISA Kit, cat#DFB50) или аналогичный.To determine the concentration of FGFb by ELISA, a commercial kit from R&D Systems (Human FGF basic Quantikine ELISA Kit, cat # DFB50) or a similar one is used.

Используя стандартизированный раствор FGFb, готовят калибровочные пробы известной концентрации так, чтобы проба №1 содержала 500 пг/мл FGFb, каждая последующая содержала FGFb в 2 раза меньше. Проба №0 должна содержать только раствор Sample Diluent. Исследуемые образцы в количестве 100 мкл, а также стандартизированные образцы раствора FGFb троекратно наносят в лунки 96-луночного планшета и инкубируют на шейкере в течение 12 часов при 4°С. Планшет отмывают буфером Wash Buffer, и в каждую из лунок добавляют по 100 мкл биотинилированных мышиных моноклональных антител против FGFb человека. Через 3 часа инкубации планшет отмывают, как описано выше. В каждую лунку наносят по 100 мкл раствора комплекса стрептавидин-пероксидаза хрена. Через 1 час планшет тщательно промывают и вносят в каждую лунку по 100 мкл прилагаемого к набору раствора субстрата ТМВ/Е. Планшет инкубируют при комнатной температуре в течение 15 минут, затем в каждую из лунок добавляют по 100 мкл стоп-буфера, и оценивают реакцию на спектрофотометре ELISA READER MICROPLATE READER Spectro при длине волны 450 нм. В качестве референсного используют уровень оптической плотности при длине волны 570 нм. Работу на аппарате осуществляют в соответствии с инструкцией.Using a standardized FGFb solution, calibration samples of known concentration are prepared so that sample No. 1 contains 500 pg / ml FGFb, each subsequent one contains 2 times less FGFb. Sample No. 0 should contain only Sample Diluent. The test samples in an amount of 100 μl, as well as standardized samples of the FGFb solution, are applied three times to the wells of a 96-well plate and incubated on a shaker for 12 hours at 4 ° C. The plate is washed with Wash Buffer, and 100 μl of biotinylated murine monoclonal anti-human FGFb antibodies are added to each well. After 3 hours of incubation, the plate is washed as described above. In each well, 100 μl of horseradish streptavidin-peroxidase complex solution is applied. After 1 hour, the plate was washed thoroughly and 100 μl of TMB / E substrate solution supplied with the kit was added to each well. The plate was incubated at room temperature for 15 minutes, then 100 μl of a stop buffer was added to each well, and the reaction was evaluated on an ELISA READER MICROPLATE READER Spectro spectrophotometer at a wavelength of 450 nm. The optical density level at a wavelength of 570 nm is used as a reference. Work on the device is carried out in accordance with the instructions.

Оценка содержания HGF с использованием набора фирмы R&D Systems Human HGF Quantikine ELISA Kit.Evaluation of HGF content using the R&D Systems Human HGF Quantikine ELISA Kit.

Для определения концентрации HGF методом ELISA используют коммерческий набор фирмы R&D Systems (Human HGF Quantikine ELISA Kit, cat#DHG00) или аналогичный.To determine the concentration of HGF by ELISA, a commercial kit from R&D Systems (Human HGF Quantikine ELISA Kit, cat # DHG00) or similar is used.

Используя стандартизированный раствор HGF, готовят калибровочные пробы известной концентрации так, чтобы проба №1 содержала 500 пг/мл HGF, каждая последующая содержала HGF в 2 раза меньше. Проба №0 должна содержать только раствор Sample Diluent. Исследуемые образцы в количестве 100 мкл, а также стандартизированные образцы раствора HGF троекратно наносят в лунки 96-ти луночного планшета и инкубируют на шейкере в течение 12 часов при 4°С. Планшет отмывают буфером Wash Buffer, и в каждую из лунок добавляют по 100 мкл биотинилированных мышиных моноклональных антител против HGF человека. Через 3 часа инкубации планшет отмывают, как описано выше. В каждую лунку наносят по 100 мкл раствора комплекса стрептавидин-пероксидаза хрена. Через 1 час планшет тщательно промывают и вносят в каждую лунку по 100 мкл прилагаемого к набору раствора субстрата ТМВ/Е. Планшет инкубируют при комнатной температуре в течение 15 минут, затем в каждую из лунок добавляют по 100 мкл стоп-буфера и оценивают реакцию на спектрофотометре ELISA READER MICROPLATE READER Spectra при длине волны 450 нм. В качестве референсного используют уровень оптической плотности при длине волны 570 нм. Работу на аппарате осуществляют в соответствии с инструкцией.Using a standardized HGF solution, calibration samples of known concentration are prepared so that sample No. 1 contains 500 pg / ml HGF, each subsequent one contains 2 times less HGF. Sample No. 0 should contain only Sample Diluent. The investigated samples in an amount of 100 μl, as well as standardized samples of the HGF solution, are applied three times to the wells of a 96-well plate and incubated on a shaker for 12 hours at 4 ° C. The plate is washed with Wash Buffer, and 100 μl of biotinylated murine monoclonal anti-human HGF antibodies are added to each well. After 3 hours of incubation, the plate is washed as described above. In each well, 100 μl of horseradish streptavidin-peroxidase complex solution is applied. After 1 hour, the plate was washed thoroughly and 100 μl of TMB / E substrate solution supplied with the kit was added to each well. The plate was incubated at room temperature for 15 minutes, then 100 μl stop buffer was added to each well and the reaction was evaluated on an ELISA READER MICROPLATE READER Spectra spectrophotometer at a wavelength of 450 nm. The optical density level at a wavelength of 570 nm is used as a reference. Work on the device is carried out in accordance with the instructions.

Оценка содержания ангиопоэтина-1 с использованием набора фирмы R&D Systems Human Angiopoietin-1 Quantikine ELISA Kit.Evaluation of angiopoietin-1 content using the R&D Systems Human Angiopoietin-1 Quantikine ELISA Kit.

Для определения концентрации ангиопоэтина-1 методом ELISA используют коммерческий набор фирмы R&D Systems (Human Angiopoietin-1 Quantikine ELISA Kit, cat#DANG10) или аналогичный.To determine the concentration of angiopoietin-1 by ELISA, a commercial kit from R&D Systems (Human Angiopoietin-1 Quantikine ELISA Kit, cat # DANG10) or similar is used.

Используя стандартизированный раствор ангиопоэтина-1, готовят калибровочные пробы известной концентрации так, чтобы проба №1 содержала 500 пг/мл ангиопоэтина-1, каждая последующая содержала ангиопоэтина-1 в 2 раза меньше. Проба №0 должна содержать только раствор Sample Diluent. Исследуемые образцы в количестве 100 мкл, а также стандартизированные образцы раствора ангиопоэтина-1 троекратно наносят в лунки 96-луночного планшета и инкубируют на шейкере в течение 12 часов при 4°С. Планшет отмывают буфером Wash Buffer, и в каждую из лунок добавляют по 100 мкл биотинилированных мышиных моноклональных антител против ангиопоэтина-1 человека. Через 3 часа инкубации планшет отмывают, как описано выше. В каждую лунку наносят по 100 мкл раствора комплекса стрептавидин-пероксидаза хрена. Через 1 час планшет тщательно промывают и вносят в каждую лунку по 100 мкл прилагаемого к набору раствора субстрата ТМВ/Е. Планшет инкубируют при комнатной температуре в течение 15 минут, затем в каждую из лунок добавляют по 100 мкл стоп-буфера и оценивают реакцию на спектрофотометре ELISA READER MICROPLATE READER Spectra при длине волны 450 нм. В качестве референсного используют уровень оптической плотности при длине волны 570 нм. Работу на аппарате осуществляют в соответствии с инструкцией.Using a standardized solution of angiopoietin-1, calibration samples of known concentration are prepared so that sample No. 1 contains 500 pg / ml of angiopoietin-1, each subsequent one contains 2 times less angiopoietin-1. Sample No. 0 should contain only Sample Diluent. The test samples in an amount of 100 μl, as well as standardized samples of the angiopoietin-1 solution, are applied three times to the wells of a 96-well plate and incubated on a shaker for 12 hours at 4 ° C. The plate was washed with Wash Buffer, and 100 μl of biotinylated murine monoclonal anti-human angiopoietin-1 antibody was added to each well. After 3 hours of incubation, the plate is washed as described above. In each well, 100 μl of horseradish streptavidin-peroxidase complex solution is applied. After 1 hour, the plate was washed thoroughly and 100 μl of TMB / E substrate solution supplied with the kit was added to each well. The plate was incubated at room temperature for 15 minutes, then 100 μl stop buffer was added to each well and the reaction was evaluated on an ELISA READER MICROPLATE READER Spectra spectrophotometer at a wavelength of 450 nm. The optical density level at a wavelength of 570 nm is used as a reference. Work on the device is carried out in accordance with the instructions.

Оценка содержания VEGF с использованием набора фирмы R&D Systems Human VEGF Quantikine ELISA KitEvaluation of VEGF content using the R&D Systems Human VEGF Quantikine ELISA Kit

Для определения концентрации VEGF методом ELISA используют коммерческий набор фирмы R&D Systems (Human VEGF Quantikine ELISA Kit, cat#DVE00) или аналогичный.To determine the concentration of VEGF by ELISA, a commercial kit from R&D Systems (Human VEGF Quantikine ELISA Kit, cat # DVE00) or a similar one is used.

Используя стандартизированный раствор VEGF, готовят калибровочные пробы известной концентрации так, чтобы проба №1 содержала 500 пг/мл VEGF, каждая последующая содержала VEGF в 2 раза меньше. Проба №0 должна содержать только раствор Sample Diluent. Исследуемые образцы в количестве 100 мкл, а также стандартизированные образцы раствора VEGF троекратно наносят в лунки 96-ти луночного планшета и инкубируют на шейкере в течение 12 часов при 4°С. Планшет отмывают буфером Wash Buffer, и в каждую из лунок добавляют по 100 мкл биотинилированных мышиных моноклональных антител против VEGF человека. Через 3 часа инкубации планшеты отмывают, как описано выше. В каждую лунку наносят по 100 мкл раствора комплекса стрептавидин-пероксидаза хрена. Через 1 час планшет тщательно промывают и вносят в каждую лунку по 100 мкл прилагаемого к набору раствора субстрата ТМВ/Е. Планшет инкубируют при комнатной температуре в течение 15 минут, затем в каждую из лунок добавляют по 100 мкл стоп-буфера и оценивают реакцию на спектрофотометре ELISA READER MICROPLATE READER Spectro при длине волны 450 нм. В качестве референсного используют уровень оптической плотности при длине волны 570 нм. Работу на аппарате осуществляют в соответствии с инструкцией.Using a standardized VEGF solution, calibration samples of known concentration are prepared so that sample No. 1 contains 500 pg / ml VEGF, each subsequent one contains 2 times less VEGF. Sample No. 0 should contain only Sample Diluent. The test samples in an amount of 100 μl, as well as standardized samples of a VEGF solution, are applied three times to the wells of a 96-well plate and incubated on a shaker for 12 hours at 4 ° C. The plate is washed with Wash Buffer, and 100 μl of biotinylated murine monoclonal anti-human VEGF antibodies are added to each well. After 3 hours of incubation, the plates are washed as described above. In each well, 100 μl of horseradish streptavidin-peroxidase complex solution is applied. After 1 hour, the plate was washed thoroughly and 100 μl of TMB / E substrate solution supplied with the kit was added to each well. The plate is incubated at room temperature for 15 minutes, then 100 μl stop buffer is added to each well and the reaction is evaluated on an ELISA READER MICROPLATE READER Spectro spectrophotometer at a wavelength of 450 nm. The optical density level at a wavelength of 570 nm is used as a reference. Work on the device is carried out in accordance with the instructions.

Оценка содержания PEDF с использованием набора фирмы Cusabio Human PEDF ELISA Kit.Evaluation of PEDF content using a Cusabio Human PEDF ELISA Kit.

Для определения концентрации PEDF методом ELISA используют коммерческий набор фирмы Cusabio (Human PEDF ELISA Kit) или аналогичный.To determine the concentration of PEDF by ELISA, a commercial kit from Cusabio (Human PEDF ELISA Kit) or the like is used.

Готовят серийные разведения стандарта PEDF согласно инструкции, приложенной к набору. Готовят раствор биотинилированных антител к человеческому PEDF и 1х раствор пероксидазы хрена, конъюгированной с авидином. Наносят на каждую лунку микропланшета по 100 мкл стандартного раствора или образца. Накрывают клейкой пленкой и оставляют при 37°С на 2 часа. После двух часов инкубации аккуратно отклеивают липкую пленку и удаляют жидкость из всех лунок без промывания. К каждой лунке добавляют 100 мкл 1х раствора биотинилированных антител. Накрывают липкой пленкой и оставляют микропланшет на 1 час при 37°С. После повторной инкубации убирают все содержимое из лунок. 4х-кратно промывают лунки путем добавления к каждой из них 200 мкл буфера для промывки. Оставляют буфер для промывки в лунке в течение двух минут и тщательно отбирают жидкость после каждого этапа промывки. В конце промывки переворачивают микропланшет вверх дном и промакивают листом фильтровальной бумаги. Добавляют к лункам 100 мкл 1х раствора пероксидазы хрена, конъюгированной с авидином. Накрывают микропланшет клейкой лентой и оставляют на инкубацию на 1 час при 37°С. После инкубации шестикратно промывают лунки по описанной ранее процедуре. Добавляют 90 мкл субстрата «ТМВ Substrate» к каждой лунке. Инкубируют лунки при 37°С в течение 15-30 мин. Добавляют к лункам 50 мкл раствора «Stop Solution», хорошо перемешивают содержимое каждой лунки. Не позднее 5 мин после добавления раствора «Stop Solution» определяют оптическую плотность раствора в каждой лунке при длине волны 450 нм. В качестве референсного используют уровень оптической плотности при длине волны 540 нм.Prepare serial dilutions of the PEDF standard according to the instructions attached to the kit. A solution of biotinylated antibodies to human PEDF and a 1x solution of horseradish peroxidase conjugated with avidin are prepared. Apply 100 μl of a standard solution or sample to each well of the microplate. Cover with adhesive film and leave at 37 ° C for 2 hours. After two hours of incubation, the adhesive film is carefully peeled off and the liquid removed from all wells without rinsing. 100 μl of 1x biotinylated antibody solution is added to each well. Cover with a sticky film and leave the microplate for 1 hour at 37 ° C. After re-incubation, remove all contents from the wells. Wash the wells 4 times by adding 200 μl of washing buffer to each of them. Leave the wash buffer in the well for two minutes and carefully select the liquid after each washing step. At the end of washing, turn the microplate upside down and blot with a sheet of filter paper. Add to the wells 100 μl of 1x solution of horseradish peroxidase conjugated with avidin. Cover the microplate with adhesive tape and leave to incubate for 1 hour at 37 ° C. After incubation, the wells are washed six times according to the previously described procedure. Add 90 μl of TMB Substrate to each well. Incubate the wells at 37 ° C for 15-30 minutes. Add 50 μl of Stop Solution to the wells, mix the contents of each well. Not later than 5 minutes after adding the Stop Solution, the optical density of the solution in each well is determined at a wavelength of 450 nm. As a reference, the level of optical density at a wavelength of 540 nm is used.

Пример 7. Определение срока кондиционирования на основании динамики накопления факторов роста в среде.Example 7. Determination of the conditioning period based on the dynamics of the accumulation of growth factors in the environment.

Проверка содержания производимых биоактивных факторов (VEGF, bFGF, HGF, Angpt-1) на различных сроках кондиционирования (3, 5, 7, 10, 12, 14 суток) проводили с помощью метода ELISA. Полученные данные показали, что количественное содержание большинства ключевых факторов статистически значимо повышается к 7 дню кондиционирования, после чего выходит на плато или снижается. На основании полученных результатов оптимальным сроком кондиционирования среды МСК ЖТ человека был выбран 7-дневный срок (Фигуры 2, 3).The content of produced bioactive factors (VEGF, bFGF, HGF, Angpt-1) was checked for various conditioning periods (3, 5, 7, 10, 12, 14 days) using the ELISA method. The data obtained showed that the quantitative content of most key factors is statistically significantly increased by the 7th day of conditioning, after which it reaches a plateau or decreases. Based on the results, the optimal period for conditioning the medium of MSCs of human VT was chosen 7-day period (Figures 2, 3).

Пример 8. Сравнение концентрации ростовых факторов в кондиционированной среде при культивировании в средах DMEM и NutriStem.Example 8. Comparison of the concentration of growth factors in a conditioned medium when cultured in DMEM and NutriStem.

Образцы, полученные при кондиционировании среды МСК ЖТ человека в течение 7 дней, были проверены на содержание ключевых биоактивных факторов методом ELISA. Количество VEGF, секретированного МСК-ЖТ, было значимо больше в среде DMEM-LG. Напротив, содержание в кондиционированной среде HGF и Angpt-1 оказалось выше при использовании для кондиционирования среды NutriStem (Фигура 4). Таким образом, для кондиционирования могут быть использованы различные базовые среды, как специфичные для культивирования МСК человека, так и универсальные.Samples obtained by conditioning the human gastrointestinal MSC MSC environment for 7 days were tested for the content of key bioactive factors by ELISA. The amount of VEGF secreted by MSC-VT was significantly greater in DMEM-LG medium. In contrast, the HGF and Angpt-1 content in the conditioned medium was higher when NutriStem was used for conditioning (Figure 4). Thus, various basic media can be used for conditioning, both specific for the cultivation of human MSCs and universal.

Пример 9. Специфическая активность средства на основе продуктов секреции МСК жировой ткани человека на моделях in vitro.Example 9. The specific activity of the agent based on the secretion products of MSCs from human adipose tissue in in vitro models.

Для оценки способности разрабатываемого средства эффективно стимулировать регенерацию тканей использовали два типа клеток - линейные эндотелиальные клетки EA.hy926 и первичные дермальные фибробласты человека 4-5 пассажа, полученные от здоровых доноров.To assess the ability of the developed product to effectively stimulate tissue regeneration, two types of cells were used: EA.hy926 linear endothelial cells and passage 4-5 human primary dermal fibroblasts obtained from healthy donors.

Влияние кондиционированной среды от МСК жировой ткани человека на скорость миграции фибробластов в модели клеточной раны.The effect of conditioned medium from MSCs of human adipose tissue on the rate of fibroblast migration in a cell wound model.

Фибробласты кожи человека культивировали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Для моделирования условий зарастания раны использовали модель клеточной раны (scratch assay), воспроизводящую условия зарастания раны после повреждения. Для этого фибробласты высаживали на чашки Петри в концентрации 100 тыс. кл./мл и культивировали в стандартных условиях до достижения субконфлюентного монослоя. Затем клетки депривировали 12 часов.Human skin fibroblasts were cultured in DMEM supplemented with 10% fetal calf serum. To model the conditions for wound overgrowth, a cell wound model (scratch assay) was used that reproduces the conditions for wound overgrowth after damage. For this, fibroblasts were planted on Petri dishes at a concentration of 100 thousand cells / ml and cultured under standard conditions until a subconfluent monolayer was reached. Then the cells were deprived for 12 hours.

Стерильным наконечником 1000 мкл на монослое клеток наносили стандартную по ширине царапину длиной 2 см и заливали клетки концентрированной кондиционированной средой, содержащей продукты секреции МСК ЖТ человека. В качестве отрицательного контроля использовали среду DMEM без сыворотки. В качестве положительного контроля использовали среду DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Планшет с фибробластами помещали в CO2-камеру автоматического инвертированного микроскопа Nikon Ti для прижизненных наблюдений, использовали режим съемки в фазовом контрасте с помощью объектива 5х в течение 24 часов с шагом съемки 15 минут. Получившиеся серии изображений анализировали с помощью программного обеспечения ImajeJ, подсчитывая скорость миграции 50 случайных клеток в каждом поле зрения в мкм/час. С образцами, полученными при кондиционировании МСК-ЖТ в течение 7 дней в средах DMEM и NutriStem, были проведены функциональные тесты. Образцы, полученные при семидневном кондиционировании среды DMEM-LG, продемонстрировали значимую специфическую активность (Фигура 5, А). Показатели специфической активности образцов кондиционирования среды NutriStem не достигли статистической значимости различий с отрицательным контролем, хотя эффект стимуляции миграции фибробластов наблюдался на уровне тенденции (р=0,08) (Фигура 5, В).A sterile tip of 1000 μl was applied to the cell monolayer with a standard 2 cm wide scratch and the cells were poured with concentrated conditioned medium containing the secretion products of human MJ in the VT. Serum free DMEM was used as a negative control. As a positive control, DMEM medium supplemented with 10% fetal calf serum was used. The fibroblast plate was placed in a CO2 camera of a Nikon Ti automatic inverted microscope for intravital observations; the phase contrast mode was used using a 5x lens for 24 hours with a recording step of 15 minutes. The resulting series of images were analyzed using ImajeJ software, counting the migration speed of 50 random cells in each field of view in microns / hour. Functional tests were carried out with samples obtained by conditioning MSC-VT for 7 days in DMEM and NutriStem environments. Samples obtained by seven-day conditioning of DMEM-LG medium showed significant specific activity (Figure 5, A). The specific activity indices of NutriStem conditioning samples did not reach the statistical significance of the negative control differences, although the effect of stimulation of fibroblast migration was observed at the trend level (p = 0.08) (Figure 5, B).

Влияние кондиционированной среды от МСК жировой ткани человека на скорость направленной миграции клеток эндотелия человека в системе xCELLigence.The effect of the conditioned medium from MSCs of human adipose tissue on the rate of directed migration of human endothelial cells in the xCELLigence system.

Ангиогенез является необходимым для успешной регенерации тканей. Миграция эндотелиальных клеток является ключевым процессом для ангиогенеза. Поэтому для оценки специфической активности была выбрана также модель, отражающая регенераторный эффект разрабатываемого средства на основе продуктов секреции МСК ЖТ человека в контексте стимуляции направленной миграции эндотелиальных клеток человека в область повреждения. Для оценки направленной миграции использовали CIM-plate (16-луночные планшеты) для прибора xCELLigence (ACEA Biosciences, USA), которые представляют собой автоматизированные камеры Бойдена, позволяющие наблюдать клеточную миграцию в режиме реального времени. Камера делится на верхнюю и нижнюю части, которые разделены мембраной с диаметром пор 8 мкм. В нижнюю камеру помещали исследуемые образцы кондиционированной среды от МСК ЖТ. На нижней части мембраны располагается золотой электрод, показания сопротивления которого прибор фиксировал через заданные промежутки времени. В нулевой момент времени снимали базовое значение показания сопротивления электрода в лунке, которое изменялось по мере того, как мигрирующие эндотелиальные клетки человека (линия EA.hy926) из верхней камеры перемещались на нижнюю сторону мембраны и распластывались на ней (увеличивали площадь). На основании показаний сопротивления рассчитывали клеточный индекс (cell index, CI), который связан прямой зависимостью с числом мигрировавших через мембрану клеток. Скорость миграции клеток рассчитывали как отношение изменения CI за заданный промежуток времени к величине этого промежутка в единицах CI/час. Исследовали изменение скорости направленной миграции эндотелиальных клеток линии EA.hy926 в системе xCELLigence, предварительно депривированных в течение 6-8 часов. Клетки снимали с чашек Петри путем обработки раствором HyQTase (HyClone, США), проводили их подсчет с помощью прибора CellCounter (Invitrogen). Клетки разводили до конечной концентрации 600 тыс. кл./мл в среде DMEM (HyClone, США) без добавления сыворотки. В качестве положительного контроля миграции в нижнюю камеру добавляли среду культивирования DMEM с 10% ФБС, в качестве отрицательного - DMEM без сыворотки. Для оценки миграции эндотелиальных клеток в нижнюю камеру добавляли по 160 мкл образцов кондиционированной среды от МСК ЖТ. В верхнюю камеру добавляли 100 мкл среды без клеток, начинали измерения. Через 30 минут снимали фоновые значения клеточного индекса с лунок. Затем в верхнюю камеру добавляли 50 мкл суспензии EA.hy296 до конечной концентрации 30*10⁴ кл. в лунке. Значения клеточного индекса (cell index) регистрировали помощью прибора в течение последующих 4 часов с интервалом 15 минут. Полученные данные были проанализированы с помощью программного обеспечения RTCASoftware (ACEA Biosciences, USA). Образцы кондиционированной среды, полученной при культивировании МСК-ЖТ человека в среде DMEM-LG и NutriStem в течение 7 дней, статистически значимо стимулируют миграцию клеток EA.hy926 в течение первых 4 часов миграции, демонстрируя свою специфическую активность на этой модели (Фигура 6, А). Эффект стимуляции миграции снижался при разведении образцов (Фигура 6, В). Аналогичные результаты были получены при использовании эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC).Angiogenesis is essential for successful tissue regeneration. Endothelial cell migration is a key process for angiogenesis. Therefore, to evaluate the specific activity, a model was also selected that reflects the regenerative effect of the developed product based on the secretion products of human MSC in the VT in the context of stimulating the directed migration of human endothelial cells into the area of damage. To evaluate directional migration, we used a CIM plate (16-well plates) for the xCELLigence instrument (ACEA Biosciences, USA), which are automated Boyden cameras that allow real-time cellular migration to be observed. The chamber is divided into upper and lower parts, which are separated by a membrane with a pore diameter of 8 μm. In the lower chamber, the studied samples of the conditioned medium from MSC VT were placed. On the bottom of the membrane is a gold electrode, the resistance readings of which the device recorded at predetermined intervals. At zero time, the basic value of the electrode resistance in the well was taken, which changed as the migrating human endothelial cells (line EA.hy926) from the upper chamber moved to the lower side of the membrane and spread on it (increased area). Based on the resistance readings, the cell index (CI) was calculated, which is directly related to the number of cells migrated through the membrane. The cell migration rate was calculated as the ratio of the CI change over a given period of time to the value of this interval in units of CI / hour. We studied the change in the rate of directed migration of endothelial cells of the EA.hy926 line in the xCELLigence system, previously deprived for 6-8 hours. Cells were removed from Petri dishes by treatment with a HyQTase solution (HyClone, USA), they were counted using a CellCounter (Invitrogen). Cells were diluted to a final concentration of 600 thousand cells / ml in DMEM (HyClone, USA) without serum. As a positive migration control, DMEM culture medium with 10% PBS was added to the lower chamber, and serum-free DMEM was added as a negative control. To assess the migration of endothelial cells into the lower chamber, 160 μl of samples of conditioned medium from MSCs of VT were added. 100 μl of cell-free medium was added to the upper chamber; measurements were started. After 30 minutes, the background values of the cell index were removed from the wells. Then, 50 μl of EA.hy296 suspension was added to the upper chamber to a final concentration of 30 * 10 ⁴ cells. in the hole. The values of the cell index (cell index) were recorded using the device for the next 4 hours with an interval of 15 minutes. The data obtained were analyzed using RTCASoftware software (ACEA Biosciences, USA). Samples of the conditioned medium obtained by culturing human MSC-VT in DMEM-LG and NutriStem for 7 days statistically significantly stimulate the migration of EA.hy926 cells during the first 4 hours of migration, demonstrating their specific activity in this model (Figure 6, A ) The effect of stimulation of migration decreased with the dilution of samples (Figure 6, B). Similar results were obtained using human umbilical vein endothelial cells (HUVEC).

Claims

1. A method of obtaining a means for stimulating the regeneration of damaged tissues, including cultivating human mesenchymal stromal adipose tissue cells (VT MSC) up to passage 4-5 in an environment that supports the growth of undifferentiated human mesenchymal cells, washing the cells with buffer solution, conditioning the MSC of VT in serum free and devoid animal products growth medium supporting cell viability of at least 70% and suitable for therapeutic use, selection of a culture medium containing food the secretion cells of human gastrointestinal tract MSCs, removal of cell debris from it and purification from low molecular weight components, followed by lyophilization of the purified culture medium to obtain a product containing human MSC secretion products, including key growth factors: VEGF at a concentration of at least 200 pcg / ml, HGF at a concentration not less than 150 pkg / ml, FGF basic at a concentration of not less than 0.29 pkg / ml, angiopoietin-1 at a concentration of not less than 145 pkg / ml, PEDF at a concentration of not less than 500 pkg / ml, determined by enzyme-linked immunosorbent assay during restoration of lyophilisate and in sterile saline.

2. The method according to p. 1, characterized in that the environment that supports the growth of undifferentiated human mesenchymal cells is a solution containing the base medium - AdvanceSTEM Cell Culture Media, and the additive - AdvanceSTEM Stem Cell Growth Supplement (HyClone, USA), the additive is taken in the amount of 9-11% per 100% of the volume of the base medium.

3. The method according to p. 1, characterized in that the conditioning is carried out in culture bottles or Petri dishes (Corning or the like), while MSCs of human VT are placed on a flat substrate with a density of 5-15 * 10 ³ / cm ² in a conditioning medium in a volume of 0.1-0.2 ml / cm ² , then the culture containers with cells are placed for 6-8 days in a CO ₂ incubator at 37 ± 1 ° C, 5% CO ₂ and relative humidity ≥ 95%.

4. The method according to p. 1, characterized in that as a buffer solution for washing cells from the components of the growth medium using a Hanks solution (PanEco or similar), while washing the cells is carried out by three to five-fold placement of cells in the said solution at a rate of 0, 1-0.2 ml of solution per cm ² cells for 5-10 minutes.

5. The method according to p. 1, characterized in that the medium for conditioning use DMEM with a low glucose content (HyClone, USA)

or another growth medium that supports the viability of human MSCs throughout the entire conditioning period.

6. The method according to p. 1, characterized in that the removal from the medium of cultivation of cell debris is carried out by centrifugation.

7. The method according to p. 1, characterized in that the purification of the cultivation medium is carried out by ultrafiltration with the removal of low molecular weight compounds weighing less than 5 kDa.

8. The method according to p. 1, characterized in that after purification of the culture medium from low molecular weight compounds, microfiltration of the obtained concentrate is additionally carried out through filters with a pore diameter of 0.22 μm.

9. The method according to p. 1, characterized in that the lyophilization is carried out in 8-14 stages at a pressure of 0.013-0.027 kPa, temperature from -40 ° C to -5 ° C, lyophilization time of not more than 36 hours at maximum load of freeze drying.

10. The method according to p. 6, characterized in that the centrifugation is carried out at 5000 ± 10 rpm, a temperature of 6 ± 2 ° C for 10 minutes to remove cell debris.

11. The method according to p. 1, characterized in that the purification from low molecular weight components is carried out using a filter system in the tangential flow Minim II (Life Sciences, USA) or similar using ultrafiltration cassettes (Minimate TFF capsule, PALL) or similar.

12. A tool for stimulating the regeneration of damaged tissues in the form of a lyophilisate obtained according to claim 1, containing human MSC secretion products, including key growth factors: VEGF at a concentration of at least 200 pkg / ml, HGF at a concentration of at least 150 pkg / ml, FGF basic at a concentration of at least 0.29 pg / ml, angiopoietin-1 at a concentration of at least 145 pg / ml, PEDF at a concentration of at least 500 pg / ml, determined by enzyme-linked immunosorbent assay when restoring the lyophilisate in sterile saline.