RU2522816C1 - Composition for cell-replacement therapy of soft tissue defects - Google Patents
Composition for cell-replacement therapy of soft tissue defects Download PDFInfo
- Publication number
- RU2522816C1 RU2522816C1 RU2013105782/10A RU2013105782A RU2522816C1 RU 2522816 C1 RU2522816 C1 RU 2522816C1 RU 2013105782/10 A RU2013105782/10 A RU 2013105782/10A RU 2013105782 A RU2013105782 A RU 2013105782A RU 2522816 C1 RU2522816 C1 RU 2522816C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- composition
- soft tissue
- cell
- amniotic fluid
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и регенеративной медицины, в частности к биомедицинским клеточным продуктам, и может быть использовано для устранения врожденных и приобретенных дефектов мягких тканей, возникающих в результате травм, после удаления опухолей, врожденных заболеваний, возрастных изменений или иных повреждений.The invention relates to the field of biotechnology and regenerative medicine, in particular to biomedical cell products, and can be used to eliminate congenital and acquired defects of soft tissues resulting from injuries after removal of tumors, congenital diseases, age-related changes or other injuries.
Основной проблемой при восстановлении структурной и функциональной целости поврежденных мягких тканей является дефицит ткани для трансплантации, опасность отторжения и некроза, а также недостаточный регенеративный потенциал и низкая активность собственных клеточных элементов данного типа тканей у пациентов.The main problem in restoring the structural and functional integrity of damaged soft tissues is tissue deficiency for transplantation, the risk of rejection and necrosis, as well as insufficient regenerative potential and low activity of the patient’s own cellular elements of this type of tissue.
Известные средства для клеточной терапии дефектов мягких тканей в подавляющем большинстве направлены на коррекцию возрастных изменений кожи (морщины, стрии, рубцы). Они позволяют лишь временно улучшить состояние кожи, поскольку не приводят к количественному увеличению у пациента собственных жизнеспособных и функционирующих фибробластов и других мезенхимальных клеток в зоне лечения. Средства для клеточно-заместительной терапии, которые способны замещать значительную потерю мягких тканей, например восполнять обширные посттравматические или послеоперационные дефекты, на сегодняшний день практически отсутствуют.Known means for cell therapy of soft tissue defects are overwhelmingly aimed at correcting age-related skin changes (wrinkles, striae, scars). They allow only temporarily improving the skin condition, since they do not lead to a quantitative increase in the patient's own viable and functioning fibroblasts and other mesenchymal cells in the treatment area. Means for cell replacement therapy, which can replace significant soft tissue loss, for example, to compensate for extensive post-traumatic or postoperative defects, are practically absent today.
Сдерживающим фактором в получении эффективных средств для регенерации мягких тканей является высокая уязвимость клеточных компонентов и маловыраженный регенеративный эффект. Помимо этого, не решена проблема значимой стимуляции васкуляризации после трансплантации клеточного продукта и его защиты от неблагоприятных воздействий раневого микроокружения (протеаз, ишемии, неорганизованного внеклеточного матрикса), приводящих к преждевременной гибели клеточного компонента и сокращению времени терапевтического действия на раневой процесс.The limiting factor in obtaining effective means for the regeneration of soft tissues is the high vulnerability of cellular components and a mild regenerative effect. In addition, the problem of significant stimulation of vascularization after transplantation of the cellular product and its protection from the adverse effects of the wound microenvironment (proteases, ischemia, unorganized extracellular matrix), leading to premature death of the cell component and shortening the time of the therapeutic effect on the wound process, has not been solved.
Известна композиция филлера для мягких тканей, предназначенная для облегчения или лечения повреждения кожи вследствие механических или физиологических причин, которая содержит от 1×107 до 8×107 клеток/мл аутологичных клеток дермального происхождения и от 10 до 100 мг/мл коллагена в качестве эффективного ингредиента (Патент RU 2396084, A61K 35/36, опубл. 10.08.2010).A known soft tissue filler composition is intended to alleviate or treat skin damage due to mechanical or physiological reasons, which contains from 1 × 10 7 to 8 × 10 7 cells / ml of autologous cells of dermal origin and from 10 to 100 mg / ml of collagen as effective ingredient (Patent RU 2396084, A61K 35/36, publ. 08/10/2010).
Недостатком известной композиции является невысокий пролиферативный потенциал клеток дермального происхождения, клетки быстро разрушаются и гибнут в местах инъекций и, кроме того, не индуцируют васкуляризацию, необходимую для формирования соединительной ткани при повреждениях. Вследствие этого данная композиция обеспечивает лишь временный косметический эффект и не предназначена для восполнения обширных дефектов мягких тканей посттравматического, послеоперационного или иного характера.A disadvantage of the known composition is the low proliferative potential of cells of dermal origin, the cells are rapidly destroyed and die at the injection sites and, moreover, do not induce the vascularization necessary for the formation of connective tissue during damage. As a result of this, this composition provides only a temporary cosmetic effect and is not intended to make up for extensive soft tissue defects of a post-traumatic, postoperative or other nature.
Известна композиция для мезотерапии, содержащая смесь аллогенных фибробластов, полученных из пуповины новорожденного, и аутологичных фибробластов из кожи собственно пациента в соотношении 1:1 в количестве 1-5 млн клеток в 5 мл (Патент RU 2308957, A61K 35/36, опубл. 27.10.2007).A known composition for mesotherapy, containing a mixture of allogeneic fibroblasts obtained from the umbilical cord of a newborn, and autologous fibroblasts from the skin of the patient proper in a ratio of 1: 1 in the amount of 1-5 million cells in 5 ml (Patent RU 2308957, A61K 35/36, publ. 27.10 .2007).
Недостатком известной композиции является непродолжительность ее терапевтического действия, а также невозможность регенерации обширных дефектов тканей. Это связано с тем, что композиция представлена в форме суспензии для инъекций, которая быстро распределяется в тканях и инактивируется под воздействием факторов иммунной системы, протеаз и других неблагоприятных агентов. Кроме того, композиция не способна стимулировать васкуляризацию, необходимую для формирования мягких тканей при повреждениях.A disadvantage of the known composition is the short duration of its therapeutic effect, as well as the inability to regenerate extensive tissue defects. This is due to the fact that the composition is presented in the form of a suspension for injection, which is rapidly distributed in the tissues and inactivated under the influence of factors of the immune system, proteases and other adverse agents. In addition, the composition is not able to stimulate the vascularization necessary for the formation of soft tissues in case of damage.
Известен биотрансплантат для коррекции дефектов мягких тканей, представляющий собой суспензию клеток аутологичной культуры фибробластов в 0,9% растворе хлорида натрия в концентрации 0,6-3,0×106 в 1 мл биотрансплантата, интегрированных на фармацевтически приемлемой биосовместимой биодеградируемой измельченной до размера 100-200 мкм бесклеточной матрице в растворе фармацевтически приемлемого биосовместимого биодеградируемого препарата гиалуроновой кислоты, при этом объемное соотношение аутологичной культуры фибробластов, бесклеточной матрицы и препарата гиалуроновой кислоты составляет 4:1:1 соответственно, а в качестве фармацевтически приемлемой биосовместимой биодеградируемой бесклеточной матрицы используют препарат «Сайметра», представляющий собой переработанную донорскую кожу человека, лишенную клеток и структурных иммуноспецифических белков, основу которого составляет коллаген и эластин, представленный в виде инъекционной формы (Патент RU 2428996, A61K 35/36, опубл. 20.09.2011).Known biograft for the correction of soft tissue defects, which is a suspension of cells of an autologous fibroblast culture in a 0.9% sodium chloride solution at a concentration of 0.6-3.0 × 10 6 in 1 ml of biograft integrated on a pharmaceutically acceptable biocompatible biodegradable crushed to size 100 -200 μm cell-free matrix in a solution of a pharmaceutically acceptable biocompatible biodegradable preparation of hyaluronic acid, while the volume ratio of autologous culture of fibroblasts, cell-free ma of hyaluronic acid and the preparation is 4: 1: 1, respectively, and as a pharmaceutically acceptable biocompatible biodegradable cell-free matrix, the Saymetra preparation is used, which is processed human donor skin, devoid of cells and structural immunospecific proteins based on collagen and elastin, presented in the form of an injection form (Patent RU 2428996, A61K 35/36, publ. 09/20/2011).
Достоинством известного биотрансплантата является способность корректировать дефекты мягких тканей, универсальные для соединительной ткани всех органов, а также повышение жизнеспособности инъецируемых клеток и обеспечение их длительного сохранения в поврежденной ткани. Однако данный биотрансплантат не обеспечивает должной васкуляризации и содержит клетки с невысоким регенеративным потенциалом. Использование в биотрансплантате собственных клеток пациента делает затруднительным его применение в случае обширных дефектов мягких тканей.The advantage of the known biograft is the ability to correct soft tissue defects that are universal for the connective tissue of all organs, as well as increasing the viability of injected cells and ensuring their long-term preservation in damaged tissue. However, this biograft does not provide proper vascularization and contains cells with a low regenerative potential. The use of the patient’s own cells in the biograft makes it difficult to use it in case of extensive soft tissue defects.
Б патенте RU 2273458 описан клеточный продукт для коррекции дефектов мягких тканей лица и шеи, представляющий собой аутожировой трансплантат, полученный в результате липосакции и содержащий клетки жировой ткани (адипоциты), с добавлением в него фермента супероксид-дисмутазы в концентрации 0,01-0,1 мас.% (Патент RU2273458, A61B 17/00, опубл. 10.04.2006).Patent RU 2273458 describes a cell product for the correction of defects in soft tissues of the face and neck, which is an autograft transplant obtained as a result of liposuction and containing adipose tissue cells (adipocytes), with the addition of superoxide dismutase enzyme in a concentration of 0.01-0, 1 wt.% (Patent RU2273458, A61B 17/00, publ. 10.04.2006).
Недостатками известной композиций является то, что она не обеспечивает стимуляцию васкуляризации и не поддерживает длительное терапевтическое воздействие. В ней не предусмотрены компоненты, защищающие композицию от неблагоприятного воздействия раневого окружения. Кроме того, в ней отсутствует носитель, поддерживающий жизнеспособность клеточного компонента, а используемые клетки (адипоциты) обладают невысокими регенеративными способностями.The disadvantages of the known compositions is that it does not provide stimulation of vascularization and does not support long-term therapeutic effects. It does not provide components that protect the composition from the adverse effects of the wound environment. In addition, it lacks a carrier that supports the viability of the cellular component, and the cells used (adipocytes) have low regenerative abilities.
Известна также фармацевтическая композиция для лечения ран на коже и мягких тканях нижней конечности у больного диабетом, содержащая в водном растворе фактор эпидермального роста (EGF) в количестве от 10 до 1000 микрограмм EGF на миллилитр и дополнительно содержащая, по крайней мере, один представитель из группы, состоящей из фибронектина, О-рафинозы, левана и полиэтиленимина (PEI) в количестве от 10 микрограмм до 500 микрограмм на миллилитр, а также один природный изофлавоноид в количестве от 20 до 1000 микрограмм на миллилитр (Патент RU 2289424, A61K 38/18, опубл. 20.12.2006).Also known is a pharmaceutical composition for treating wounds on the skin and soft tissues of the lower limb in a patient with diabetes, containing in an aqueous solution epidermal growth factor (EGF) in an amount of from 10 to 1000 micrograms of EGF per milliliter and additionally containing at least one representative from the group consisting of fibronectin, O-raffinose, levan and polyethyleneimine (PEI) in an amount of from 10 micrograms to 500 micrograms per milliliter, as well as one natural isoflavonoid in an amount of 20 to 1000 micrograms per milliliter (Patent RU 2289424, A61K 38/18, opub . 20.12.2006).
Недостатком известной композиции является неустойчивость и ограниченность терапевтического эффекта из-за неэффективной доставки и быстрого разрушения фактора эпидермального роста в зоне дефекта, что диктует необходимость его использования в высоких дозах. Наносимый на рану эпидермальный фактор роста контактирует, в основном, с омертвевшими или вяло регенерирующими тканями диабетической язвы и протеазами, находящимися в ране. Это обуславливает его быстрое разрушение и отсутствие стимуляции здоровых тканей. Кроме того, известная композиция не обеспечивает регенерацию обширных структурных дефектов мягкой ткани и предназначена для лечения только диабетической стопы.A disadvantage of the known composition is the instability and limited therapeutic effect due to ineffective delivery and rapid destruction of the epidermal growth factor in the defect zone, which necessitates its use in high doses. The epidermal growth factor applied to the wound contacts mainly with the dead or sluggishly regenerating tissues of the diabetic ulcer and proteases located in the wound. This leads to its rapid destruction and the absence of stimulation of healthy tissues. In addition, the known composition does not provide for the regeneration of extensive structural defects in soft tissue and is intended to treat only diabetic foot.
Известна композиция для заживления раны в случае механических или патологических повреждений или ожогов, содержащая эритропоэтин (ЭПО) и по меньшей мере один гелеобразующий полисахарид, поддающийся разбуханию, в концентрации 0,4-4% мас./мас, выбранный из группы, состоящей из: гидроксиэтилцеллюлозы, гидроксиметилцеллюлозы, карбоксиэтилцеллюлозы, карбоксиметилцеллюлозы, которая может быть получена путем смешивания ЭПО в лиофилизированной или суспендированной форме с предварительно разбухшим полисахаридом, имеющим вязкость менее 5000 мПа·с, и инициации полного разбухания, где полностью разбухший полисахарид имеет вязкость 20000-60000 мПа·с, и ЭПО присутствует в концентрации 100-500 МЕ/г гелеобразной композиции, где указанное смешивание ЭПО достигается путем диффузии ЭПО в геле в течение по меньшей мере 24 ч (Патент RU2465003, А61К 38/18, опубл. 27.10.2012).A known composition for wound healing in case of mechanical or pathological injuries or burns, containing erythropoietin (EPO) and at least one gelling polysaccharide swellable in a concentration of 0.4-4% wt./wt., Selected from the group consisting of: hydroxyethyl cellulose, hydroxymethyl cellulose, carboxyethyl cellulose, carboxymethyl cellulose, which can be obtained by mixing EPO in lyophilized or suspended form with a pre-swollen polysaccharide having a viscosity of less than 5000 MPa · and initiating a complete swelling, where the completely swollen polysaccharide has a viscosity of 20,000-60000 mPa · s, and EPO is present at a concentration of 100-500 IU / g of the gel-like composition, wherein said mixing of EPO is achieved by diffusion of the EPO in the gel for at least 24 hours (Patent RU2465003, A61K 38/18, publ. 27.10.2012).
Недостатком известной композиции является невозможность коррекции обширных структурных дефектов соединительной ткани, длительность лечения и вялость заживления раны, поскольку терапевтическое действие не сопровождается стимуляцией клеточной пролиферации и миграцией. Композиция не содержит живых клеток, и регенерация может идти только за счет собственных клеточных резервов организма.A disadvantage of the known composition is the inability to correct extensive structural defects of connective tissue, the duration of treatment and the lethargy of wound healing, since the therapeutic effect is not accompanied by stimulation of cell proliferation and migration. The composition does not contain living cells, and regeneration can only go at the expense of the body's own cellular reserves.
Наиболее близким аналогом является фармацевтическая композиция, содержащая в мезенхимные стволовые клетки с фенотипом CD13+/CD29+/CD44+, выделенные из амниотической жидкости человека, и культуральную питательную среду (заявка US 2012/0141399, A61K 8/98, опубл. 07.06.2012).The closest analogue is a pharmaceutical composition containing in mesenchymal stem cells with the phenotype CD13 + / CD29 + / CD44 + isolated from human amniotic fluid, and culture medium (application US 2012/0141399, A61K 8/98, published 07/07/2012).
Однако ближайший аналог не обеспечивает длительность и стабильность терапевтического эффекта, поскольку композиция представляет собой суспензию для инъекций, которая быстро распределяется в тканях и инактивируется под воздействием факторов иммунной системы, протеаз и других неблагоприятных агентов. Кроме того, недостатком ближайшего аналога является невозможность коррекции обширных трехмерных дефектов ткани, поскольку композиция не обеспечивает активизацию васкуляризации в месте дефекта.However, the closest analogue does not provide the duration and stability of the therapeutic effect, since the composition is a suspension for injection, which is rapidly distributed in the tissues and inactivated under the influence of factors of the immune system, proteases and other adverse agents. In addition, the disadvantage of the closest analogue is the impossibility of correcting extensive three-dimensional tissue defects, since the composition does not provide activation of vascularization at the defect site.
Задачей изобретения является создание универсальной композиции на основе стволовых клеток человека, пригодной для коррекции структурно-функциональных дефектов мягких тканей любых размеров и локализации, с улучшенным приживлением и длительными сроками хранения, способной стимулировать васкуляризацию и регенерацию в области дефекта, и тем самым обеспечивающей устойчиво высокий терапевтический эффект.The objective of the invention is to create a universal composition based on human stem cells, suitable for the correction of structural and functional defects of soft tissues of any size and localization, with improved engraftment and long shelf life, capable of stimulating vascularization and regeneration in the area of the defect, and thereby ensuring a consistently high therapeutic Effect.
Технический результат изобретения заключается в повышении пролиферативного потенциала и жизнеспособности клеток композиции, снижении концентрации инъецируемых клеток, активизации васкуляризации и регенерации в месте дефекта.The technical result of the invention is to increase the proliferative potential and viability of the cells of the composition, reduce the concentration of injected cells, activate vascularization and regeneration at the site of the defect.
Технический результат изобретения достигается за счет качественного и количественного состава компонентов, представляющих собой композицию взаимодополняющих по направленности действия, существенно усиливающих пролиферацию и жизнеспособность клеток и стимулирующих васкуляризацию и регенерацию в области дефекта.The technical result of the invention is achieved due to the qualitative and quantitative composition of the components, which are a composition of complementary action direction, significantly enhancing cell proliferation and vitality and stimulating vascularization and regeneration in the defect area.
Сущность изобретения заключается в следующем: композиция для клеточно-заместительной терапии дефектов мягких тканей содержит стволовые клетки из амниотической жидкости человека в культуральной среде и отличается тем, что дополнительно содержит коллаген, эритропоэтин (ЭПО) и эпидермальный фактор роста (ЭФР), а из клеток амниотической жидкости она содержит стволовые клетки фенотипа CD73+/CD90+/CD105+/CK19+ при следующей соотношении компонентов в 1 мл:The essence of the invention is as follows: a composition for cell replacement therapy of soft tissue defects contains stem cells from human amniotic fluid in a culture medium and is characterized in that it additionally contains collagen, erythropoietin (EPO) and epidermal growth factor (EGF), and from amniotic cells liquid it contains stem cells of the phenotype CD73 + / CD90 + / CD105 + / CK19 + in the following ratio of components in 1 ml:
Амниотическая жидкость считается в настоящее время оптимальным источником получения нескольких типов клеток, среди которых: мезенхимные стволовые клетки, эпителиоциты и другие популяции амниоцитов. Однако стволовые клетки амниотической жидкости гетерогенны по происхождению и культуральным характеристикам и не все способны поддерживать стволовой статус и жизнеспособность в культуре в течение достаточного времени (Rennie К., Gruslin A., Hengstschlager М., Pei D., Cai J., Nikaido Т., Bani-Yaghoub M. Application of amniotic membrane and fluid in stem cell biology and regenerative medicine. Stem Cells Int. 2012; 2012:721538. doi: 10.1155/2012/721538. Epub 2012 Oct 10).Amniotic fluid is currently considered the optimal source of several types of cells, including: mesenchymal stem cells, epithelial cells and other populations of amniocytes. However, the stem cells of amniotic fluid are heterogeneous in origin and cultural characteristics and not all are able to maintain stem status and vitality in culture for a sufficient time (Rennie K., Gruslin A., Hengstschlager M., Pei D., Cai J., Nikaido T. , Bani-Yaghoub M. Application of amniotic membrane and fluid in stem cell biology and regenerative medicine. Stem Cells Int. 2012; 2012: 721538. Doi: 10.1155 / 2012/721538. Epub 2012 Oct 10).
Изобретательский уровень настоящего изобретения обеспечивается тем, что из стволовых клеток амниотической жидкости была выделена уникальная популяция клеток, одновременно экспрессирующая маркеры мезенхимных стволовых клеток: CD73 (5' -нуклеотидаза), CD90 (Thy-1), CD 105 (Эндоглин) и маркер эпителия - цитокератин-19(СК-19), которая в присутствии коллагена, ЭПО и ЭФР достоверно способна индуцировать быструю эндотелиализацию и васкуляризацию, приводя в результате к регенерации мягких тканей и образованию новых капилляров в области поврежденной ткани. Сочетание коллагена, ЭПО и ЭФР в составе клеточной композиции позволило увеличить ее эффективность, обеспечив одновременно цитопротекторный эффект в отношении клеток трансплантата и стимуляцию регенерации тканей в ране.The inventive step of the present invention is ensured by the fact that a unique population of cells that expresses markers of mesenchymal stem cells: CD73 (5'-nucleotidase), CD90 (Thy-1), CD 105 (Endoglin) and the epithelial marker - is isolated from stem cells of amniotic fluid cytokeratin-19 (SK-19), which in the presence of collagen, EPO and EGF is reliably able to induce rapid endothelialization and vascularization, resulting in the regeneration of soft tissues and the formation of new capillaries in the area of damaged tissue. The combination of collagen, EPO and EGF in the composition of the cell composition made it possible to increase its effectiveness, while simultaneously providing a cytoprotective effect on transplant cells and stimulating tissue regeneration in the wound.
Композицию для клеточно-заместительной терапии дефектов мягких тканей применяют путем инъекций в поврежденные ткани или нанесением на поврежденную ткань. Заявленный состав композиции позволяет обеспечить эффективную дозу при более низких концентрациях инъецируемых клеток и факторов роста для индуцирования нового местного кровоснабжения в области дефекта и поддержания быстрого реконструирования ткани.The composition for cell replacement therapy for soft tissue defects is administered by injection into damaged tissues or by application to damaged tissue. The claimed composition composition allows to provide an effective dose at lower concentrations of injectable cells and growth factors to induce a new local blood supply in the area of the defect and maintain rapid tissue reconstruction.
Композиция по изобретению может быть использована для наращивания мягкой ткани в целях исправления или коррекции врожденных аномалий, приобретенных дефектов или косметических дефектов вне зависимости от локализации дефектов или изменений.The composition according to the invention can be used to build up soft tissue in order to correct or correct congenital malformations, acquired defects or cosmetic defects, regardless of the location of the defects or changes.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.The invention is illustrated by the following examples.
Пример 1. Получение композиции для клеточно-заместительной терапии дефектов мягких тканей.Example 1. Obtaining a composition for cell replacement therapy of soft tissue defects.
Технология получения композиции по изобретению состоит из следующих основных этапов: получение популяции стволовых клеток, культивирование клеток в питательной среде, смешивание всех компонентов композиции с последующей расфасовкой готового продукта.The technology for producing the composition according to the invention consists of the following main steps: obtaining a stem cell population, culturing cells in a nutrient medium, mixing all components of the composition, followed by packaging of the finished product.
Получение популяции стволовых клеток (СК) из амниотической жидкости.Obtaining a stem cell population (SC) from amniotic fluid.
Клетки выделяют из амниотической жидкости центрифугированием (10 мин, 1100 об/мин) и культивируют в среде α-МЕМ (Gibco) с добавлением 15% ES-FBS (HyClone), 1% глутамина (Invitrogen), 18% Chang В и 2% Chang С (Irvine Scientific), 1% пенициллина/стрептомицина (Sigma) при 37°С в атмосфере, содержащей 5% CO2. Пассирование проводят 1:3 на 2-3 сут, когда клетки достигают монослоя.Cells were isolated from the amniotic fluid by centrifugation (10 min, 1100 rpm) and cultured in α-MEM (Gibco) supplemented with 15% ES-FBS (HyClone), 1% glutamine (Invitrogen), 18% Chang B and 2% Chang C (Irvine Scientific), 1% penicillin / streptomycin (Sigma) at 37 ° C in an atmosphere containing 5% CO 2 . Passaging is carried out 1: 3 for 2-3 days, when the cells reach the monolayer.
Выявление маркеров и идентификация клеток.Identification of markers and cell identification.
Полученные клетки идентифицируют по морфологическим характеристикам и иммунофенотипу.The resulting cells are identified by morphological characteristics and immunophenotype.
Анализ клеток проводят следующим образом.Cell analysis is carried out as follows.
Морфологический анализ.Morphological analysis.
Морфологические характеристики СК амниотической жидкости оценивают визуально с помощью фазовоконтрастного микроскопа (Olympus, СКХ31).The morphological characteristics of the SC of amniotic fluid are assessed visually using a phase contrast microscope (Olympus, SKX31).
Иммунофенотипический анализ.Immunophenotypic analysis.
Экспрессию поверхностных антигенов клеток АЖ (7 пассаж) оценивают на проточном цитофлуориметре (Becton Dickinson FACSCalibur). Клетки трипсинизируют и окрашивают связанными с флуоресцеин изито-ционатом (FITC) или фикоэритрином (РЕ) антителами против CD73, CD90, CD 105, цитокератина 19 (BD Pharmingen или Millipore или Abcam) или неконъюгированные антитела против тех же антигенов со вторыми антителами Alexa Fluor 488 (Molecular Probes). Контролем служат FITC-или РЕ-связанные иммуноглобулины тех же изотипов и/или пробы без первых антител.The expression of surface antigens of AF cells (passage 7) was evaluated on a flow cytometer (Becton Dickinson FACSCalibur). Cells are trypsinized and stained with fluorescein-linked isito-isocyanate (FITC) or phycoerythrin (PE) antibodies against CD73, CD90, CD 105, cytokeratin 19 (BD Pharmingen or Millipore or Abcam) or unconjugated antibodies against the same antigens with second Alexa Fluor 488 antibodies (Molecular Probes). The control is FITC or PE-linked immunoglobulins of the same isotypes and / or samples without the first antibodies.
По результатам морфологического анализа выявлена однородная по фенотипу клеточная популяция. Стволовые клетки амниотической жидкости представляют собой вытянутые фибробластоподобные клетки. Проточная цитофлуориметрия показала, что 92-99% клеток положительны по маркерам CD73, CD90, CD 105 и цитокератину 19 (т.е. культура обладает уникальными свойствами стволовых клеток амниотической жидкости).According to the results of morphological analysis revealed a homogeneous phenotype of the cell population. Amniotic fluid stem cells are elongated fibroblast-like cells. Flow cytofluorimetry showed that 92-99% of cells are positive for the markers CD73, CD90, CD 105 and cytokeratin 19 (i.e., the culture has unique properties of stem cells of amniotic fluid).
Для внесения в композицию клеток используется среда ДМЕМ с предварительно внесенными в нее факторами роста ЭФР и ЭПО - далее среда ДМЕМ ФР. Для приготовления среды ДМЕМ ФР в стандартную среду ДМЕМ с глутамином вносят ЭФР и ЭПО в конечной концентрации 80 нг/мл и 800 ME соответственно. ДМЕМ ФР может храниться в холодильной камере при +4°C не более 7 суток.For introducing cells into the composition, DMEM medium with EGF and EPO growth factors previously introduced into it is used - hereinafter, DMEM FR medium. To prepare the DMEM FR medium, EGF and EPO were added to the standard DMEM medium with glutamine at a final concentration of 80 ng / ml and 800 ME, respectively. DMEM FR can be stored in a refrigerator at + 4 ° C for no more than 7 days.
Коллагеновый гель «Коллост» поставляется производителем в стерильном виде в шприцах.Collost gel “Kollost” is supplied by the manufacturer in sterile form in syringes.
За 1 час до начала приготовления композиции шприцы с коллагеновым гелем помещают в термостат при 37°C для расплавления. После этого в стерильных условиях гель выдавливают из шприцов в необходимом количестве (3/4 от конечного объема композиции) в стеклянные или пластиковые флаконы и смешивают с суспензией клеток.1 hour before the preparation of the composition, syringes with collagen gel are placed in a thermostat at 37 ° C for melting. Then, under sterile conditions, the gel is squeezed out of syringes in the required amount (3/4 of the final volume of the composition) into glass or plastic bottles and mixed with a suspension of cells.
Для внесения в композицию допускаются только клетки, прошедшие тестирование на отсутствие инфекционных агентов и с нормальным кариотипом.For inclusion in the composition, only cells that have been tested for the absence of infectious agents and with a normal karyotype are allowed.
Клетки СК амниотической жидкости снимают с культурального флакона обычным способом, при помощи смеси растворов трипсина и Версена (1:1). Концентрацию и общее количество подсчитывают при помощи камеры Горяева, клетки отмывают от остатков трипсина центрифугированием и ресуспендируют в среде ДМЕМ ФР объемом, составляющим 1/4 от конечного объема композиции, и содержащей МСКэ в концентрации 8×105 кл/мл. Полученную суспензию смешивают с расплавленным коллагеновым гелем. Затем композицию помещают при температуре +22°C на 1 час для застывания геля.SC cells of amniotic fluid are removed from the culture vial in the usual way using a mixture of trypsin and Versen solutions (1: 1). The concentration and total amount are counted using a Goryaev camera, the cells are washed from trypsin residues by centrifugation and resuspended in DMEM FR medium with a volume of 1/4 of the final volume of the composition and containing MSCe at a concentration of 8 × 10 5 cells / ml. The resulting suspension is mixed with molten collagen gel. Then the composition is placed at a temperature of + 22 ° C for 1 hour to solidify the gel.
В результате получают композицию следующего состава:The result is a composition of the following composition:
Пример 2. Оценка пролиферативного потенциала композиции для клеточно-заместительной терапии дефектов мягких тканей.Example 2. Evaluation of the proliferative potential of a composition for cell replacement therapy of soft tissue defects.
Композицию, полученную по примеру 1, заливают культуральной средой и через 18 ч добавляют 10 мкМ предшественника синтеза ДНК BrdU (Sigma, США). Контролем служат клетки, культивированные на пластике.The composition obtained in Example 1 was poured into the culture medium, and after 18 h, 10 μM BrdU DNA synthesis precursor (Sigma, USA) was added. The control is cells cultured on plastic.
Фиксацию осуществляют через 24 ч после добавления BrdU. Клетки, культивированные на пластике, снимают 0,25% трипсином/EDTA(Gibco, Invitrogen), далее коллагеновый гель растворяют коллагеназой I типа (Sigma), после чего клетки дважды отмывают PBS и фиксируют ледяным 70° этанолом в течение 30 мин.Fixation is carried out 24 hours after the addition of BrdU. Cells cultured on plastic were removed with 0.25% trypsin / EDTA (Gibco, Invitrogen), then the collagen gel was dissolved with type I collagenase (Sigma), after which the cells were washed twice with PBS and fixed with ice-cold 70 ° ethanol for 30 minutes.
Затем к суспензии добавляют равный объем 4N HCl и инкубируют еще 30 мин при комнатной температуре. После этого клетки осаждают центрифугированием (5 мин, 1500 об/мин) и ресуспендируют в 0,1М тетраборате натрия (рН 8,5) для нейтрализации кислоты. Затем клетки снова центрифугируют (5 мин, 1500 об/мин), ресуспендируют в 70°° этаноле и хранят при -20°C до окрашивания. Окрашивание проводят мышиными антителами против BrdU (Millipore) с последующим выявлением вторичными антителами к мышиным иммуноглобулинам, конъюгированными с флуорохромом Alexa 488 (Molecular Probes).Then an equal volume of 4N HCl was added to the suspension and incubated for another 30 minutes at room temperature. After this, the cells are precipitated by centrifugation (5 min, 1500 rpm) and resuspended in 0.1 M sodium tetraborate (pH 8.5) to neutralize the acid. Then the cells are centrifuged again (5 min, 1500 rpm), resuspended in 70 °° ethanol and stored at -20 ° C until staining. Staining is performed with murine anti-BrdU antibodies (Millipore), followed by detection of secondary antibodies to murine immunoglobulins conjugated with Alexa 488 fluorochrome (Molecular Probes).
Подсчет окрашенных (пролиферирующих) клеток проводят с помощью флуоресцентного микроскопа (Olympus, СКХ31).Counting of stained (proliferating) cells is carried out using a fluorescence microscope (Olympus, SKX31).
При подсчете доли клеток, включивших BrdU (синтезирующих ДНК), было выявлено, что в композиции доля таких клеток достоверно выше, чем в контроле (24,5±4% - в контроле и 38+5% в композиции).When calculating the proportion of cells that included BrdU (synthesizing DNA), it was found that the proportion of such cells in the composition was significantly higher than in the control (24.5 ± 4% in the control and 38 + 5% in the composition).
Таким образом, пролиферативный потенциал клеток амниотической жидкости в составе композиции достоверно увеличивается по сравнению с контролем.Thus, the proliferative potential of amniotic fluid cells in the composition significantly increases compared to the control.
Пример 3. Оценка жизнеспособности клеток в составе композиции для клеточно-заместительной терапии дефектов мягких тканей.Example 3. Assessment of cell viability in the composition for cell replacement therapy of soft tissue defects.
Для определения жизнеспособности клеток используют метод TUNEL. Композицию получают по примеру 1 и заливают культуральной средой. В качестве контроля используют клетки, культивированные на пластике. Затем индуцируют апоптоз 300 мМ перекисью водорода в течение 30 минут. После этого клетки изолируют из композиции с помощью коллагеназы, фиксируют 4%-ным раствором параформальдегида, пермеабилизовывают протеиназой К.To determine the viability of the cells using the TUNEL method. The composition is prepared according to example 1 and poured into the culture medium. As a control, cells cultured on plastic are used. Apoptosis is then induced with 300 mM hydrogen peroxide for 30 minutes. After that, the cells are isolated from the composition using collagenase, fixed with 4% paraformaldehyde solution, permeabilized with proteinase K.
Далее клетки инкубируют с 3%-ным раствором перекиси водорода для ингибирования эндогенной пероксидазной активности, затем с антителами (TdT Ensyme, Br-dUTP) в течение часа при 37°С во влажной камере, после чего промывают и наносят вторые антитела (Anti-BrdU-Biotin mAb), инкубируют в течение часа в темноте.The cells are then incubated with a 3% hydrogen peroxide solution to inhibit endogenous peroxidase activity, then with antibodies (TdT Ensyme, Br-dUTP) for an hour at 37 ° C in a humid chamber, after which they are washed and applied with second antibodies (Anti-BrdU -Biotin mAb), incubated for an hour in the dark.
Окраску визуализируют с помощью диаминобензидина (DAB). Подсчет окрашенных (апоптотических) клеток проводят с помощью фазово-контрастного микроскопа (Olympus, СКХ31).Coloring is visualized using diaminobenzidine (DAB). Counting stained (apoptotic) cells is carried out using a phase contrast microscope (Olympus, SKX31).
При подсчете доли апоптотических клеток в культуре стволовых клеток амниотической жидкости было выявлено, что в композиции этот показатель меньше, чем в контроле примерно на 30% (0,981±0,08% - в контроле и 0,6013%±0,06% в композиции).When calculating the proportion of apoptotic cells in the culture of stem cells of amniotic fluid, it was found that in the composition this indicator is less than in the control by about 30% (0.981 ± 0.08% in the control and 0.6013% ± 0.06% in the composition )
Таким образом, жизнеспособность клеток амниотической жидкости в составе композиции достоверно увеличивается по сравнению с контролем.Thus, the viability of amniotic fluid cells in the composition significantly increases compared to the control.
Пример 4. Оценка эффективности композиции при репарации дефектов мягких тканей и васкуляризации.Example 4. Evaluation of the effectiveness of the composition in the repair of soft tissue defects and vascularization.
В эксперименте in vivo изучалось влияние полученной по примеру 1 композиции на раневое заживление при ее введении в искусственно вызванный дефект мягких тканей - резаную рану. В качестве контроля используют раствор ЭПО и ЭФР в физиологическом растворе в концентрации 200 ME и 20 нг/мл соответственно и чистый коллаген без добавок.In an in vivo experiment, the effect of the composition obtained according to Example 1 on wound healing when introduced into an artificially caused soft tissue defect — a cut wound — was studied. As a control, a solution of EPO and EGF in physiological saline at a concentration of 200 ME and 20 ng / ml, respectively, and pure collagen without additives are used.
Эксперимент проводят на 4-х группах животных (лабораторных мышах): одной опытной и трех контрольных группах по 20 животных в каждой группе. У животных всех исследуемых групп создают искусственный дефект - резаную рану. Для этого под эфирным наркозом мышам выбривают участок кожи на спине, обрабатывают 700 спиртом и вырезают лоскут стандартного размера в среднем 10×10 мм до глубоких слоев фасции.The experiment is carried out on 4 groups of animals (laboratory mice): one experimental and three control groups of 20 animals in each group. In animals of all studied groups, an artificial defect is created - a cut wound. To do this, under ether anesthesia, the mice are shaved with a skin on their back, treated with 700 alcohol and a standard size flap is cut out on average 10 × 10 mm to the deep layers of the fascia.
В рану вводят: биофармацевтическую композицию (опытная группа), коллаген (контрольная группа 1), раствор ЭПО и ЭФР (контрольная группа 2) или оставляют раны без лечения (контрольная группа 3).Enter into the wound: a biopharmaceutical composition (experimental group), collagen (control group 1), EPO and EGF solution (control group 2) or leave the wounds untreated (control group 3).
Проводят измерение размеров раны (длина и ширина) сразу после нанесения и затем каждый день в течение 14 дней. Изменения площади ран выражают в процентах от начальной.Measure the size of the wound (length and width) immediately after application and then every day for 14 days. Changes in the area of wounds are expressed as a percentage of the initial.
На 3, 7, 10 и 14 день лечения забивают по пять случайно взятых животных из каждой группы.On the 3rd, 7th, 10th and 14th day of treatment, five randomly taken animals from each group are killed.
Биопсии раны фиксируют в забуференном 10%-ном формалине, заключают в парафин и делают срезы на микротоме толщиной 5-7 мкм. Срезы окрашивают гематоксилин-эозином. Полученные препараты (по три от каждого животного) анализируют под прямым световым микроскопом и фотографируют с помощью цифровой фотокамеры. Составляют описание препаратов слепым методом (оператор не знает параметров животного). Для определения плотности сосудов срезы окрашивают антителами против маркеров эндотелия. Результаты исследования представлены в табл.1 и табл.2Wound biopsies are fixed in buffered 10% formalin, enclosed in paraffin and cut on a microtome 5-7 microns thick. Sections stained with hematoxylin-eosin. The resulting preparations (three from each animal) are analyzed under a direct light microscope and photographed using a digital camera. They compose a description of drugs using the blind method (the operator does not know the parameters of the animal). To determine the density of blood vessels, sections were stained with antibodies against endothelial markers. The results of the study are presented in table 1 and table 2
Как видно из табл.1 и табл.2, показатели раневого заживления (сокращение площади раны; формирование сосудов) значительно улучшены по сравнению с контрольными группами животных, не получавших лечение композицией.As can be seen from table 1 and table 2, the indicators of wound healing (reduction of the area of the wound; the formation of blood vessels) are significantly improved in comparison with the control groups of animals not treated with the composition.
Гистологическое исследование дефекта мягких тканей показало, что при лечении дефектов мягкой ткани композицией по изобретению раньше происходит формирование, созревание и фиброзирование грануляционной ткани, нормализация клеточного состава зоны дефекта, а также происходит стимулирование образования новой системы кровеносных сосудов.Histological examination of the soft tissue defect showed that in the treatment of soft tissue defects by the composition of the invention, granulation tissue is formed, matured and fibrosed earlier, the cell composition of the defect zone is normalized, and a new blood vessel system is stimulated.
На основании анализа гистологических препаратов и данных табл.1 и табл.2 можно заключить, что трансплантация биофармацевтической композиции значительно ускоряет заживление дефекта, приводит к ускорению формирования зрелой стромы и стимулирует васкуляризацию.Based on the analysis of histological preparations and the data of Table 1 and Table 2, it can be concluded that transplantation of the biopharmaceutical composition significantly accelerates the healing of the defect, accelerates the formation of mature stroma and stimulates vascularization.
Эффект ускорения заживления хорошо выражен начиная с ранних сроков ранозаживления, что, вероятно, связано с эффективной стимуляцией собственной регенерации, ускоренным формированием грануляционной ткани, образование новых капилляров и кровеносных сосудов и созданием условий для миграции эпителиального пласта. К 10 суткам на гистологических препаратах отмечается формирование эпителиального пласта. Отмечается интенсивный рост сосудов, на краях дефекта наблюдается формирование придатков кожи.The healing acceleration effect is well expressed starting from the early stages of wound healing, which is probably associated with effective stimulation of one's own regeneration, accelerated formation of granulation tissue, the formation of new capillaries and blood vessels and the creation of conditions for the migration of the epithelial layer. By 10 days on the histological preparations, the formation of the epithelial layer is noted. Intense vascular growth is noted, at the edges of the defect, the formation of skin appendages is observed.
Таким образом, биофармацевтическая композиция, полученная по настоящему изобретению, может быть использована для лечения дефектов мягких тканей.Thus, the biopharmaceutical composition obtained according to the present invention can be used to treat soft tissue defects.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013105782/10A RU2522816C1 (en) | 2013-02-12 | 2013-02-12 | Composition for cell-replacement therapy of soft tissue defects |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013105782/10A RU2522816C1 (en) | 2013-02-12 | 2013-02-12 | Composition for cell-replacement therapy of soft tissue defects |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2522816C1 true RU2522816C1 (en) | 2014-07-20 |
Family
ID=51217497
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013105782/10A RU2522816C1 (en) | 2013-02-12 | 2013-02-12 | Composition for cell-replacement therapy of soft tissue defects |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2522816C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2620167C1 (en) * | 2015-12-21 | 2017-05-23 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Method for obtaining preparation for stimulation of regeneration based on products of secretion of human multipotent mesenchymal stromal cells |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080131410A1 (en) * | 2002-02-13 | 2008-06-05 | Hariri Robert J | Placental stem cells derived from post-partum mammalian placenta, and uses and methods of treatment using said cells |
| US20080131966A1 (en) * | 2001-02-14 | 2008-06-05 | Hariri Robert J | Renovation and repopulation of decellularized tissues and cadaveric organs by stem cells |
| RU2392314C2 (en) * | 2003-12-30 | 2010-06-20 | Аугустинус БАДЕР | Tissue regeneration method |
| EP2359877A1 (en) * | 2010-02-11 | 2011-08-24 | Universidad de Salamanca | Bicompatible vascularising and cicatrizing drug-delivery matrix |
| RU2468818C2 (en) * | 2007-09-11 | 2012-12-10 | ВТОРОЙ Уилльям Г. ФРЕЙ | Methods, pharmaceutical compositions and products for therapeutic cell introduction into animal's central nervous system |
-
2013
- 2013-02-12 RU RU2013105782/10A patent/RU2522816C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080131966A1 (en) * | 2001-02-14 | 2008-06-05 | Hariri Robert J | Renovation and repopulation of decellularized tissues and cadaveric organs by stem cells |
| US20080131410A1 (en) * | 2002-02-13 | 2008-06-05 | Hariri Robert J | Placental stem cells derived from post-partum mammalian placenta, and uses and methods of treatment using said cells |
| RU2392314C2 (en) * | 2003-12-30 | 2010-06-20 | Аугустинус БАДЕР | Tissue regeneration method |
| RU2468818C2 (en) * | 2007-09-11 | 2012-12-10 | ВТОРОЙ Уилльям Г. ФРЕЙ | Methods, pharmaceutical compositions and products for therapeutic cell introduction into animal's central nervous system |
| EP2359877A1 (en) * | 2010-02-11 | 2011-08-24 | Universidad de Salamanca | Bicompatible vascularising and cicatrizing drug-delivery matrix |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2620167C1 (en) * | 2015-12-21 | 2017-05-23 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Method for obtaining preparation for stimulation of regeneration based on products of secretion of human multipotent mesenchymal stromal cells |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ter Horst et al. | Advances in keratinocyte delivery in burn wound care | |
| Silva et al. | Injectable and tunable hyaluronic acid hydrogels releasing chemotactic and angiogenic growth factors for endodontic regeneration | |
| Zhou et al. | A human umbilical cord mesenchymal stem cell‐conditioned medium/chitosan/collagen/β‐glycerophosphate thermosensitive hydrogel promotes burn injury healing in mice | |
| Ansari et al. | Alginate/hyaluronic acid hydrogel delivery system characteristics regulate the differentiation of periodontal ligament stem cells toward chondrogenic lineage | |
| Pereira et al. | Effects of human mesenchymal stem cells isolated from Wharton’s jelly of the umbilical cord and conditioned media on skeletal muscle regeneration using a myectomy model | |
| ES2677945T3 (en) | Production of artificial tissues by tissue engineering using fibrin and agarose biomaterials | |
| JP2014520844A (en) | Chondrocyte therapeutic agent comprising collagen, hyaluronic acid derivative and mammalian umbilical cord-derived stem cells | |
| CN104055795B (en) | A kind of injectable implant and preparation method thereof | |
| US11260077B2 (en) | Process for obtaining a sprinkling compound of microvascular endothelial skin cells and mesenchymal stem cells and method of application for tissue regeneration | |
| US20120027732A1 (en) | Thermoreversible collagen | |
| Tan et al. | Biofunctionalized fibrin gel co-embedded with BMSCs and VEGF for accelerating skin injury repair | |
| US20120115222A1 (en) | Composition and method for maintenance, differentiation, and proliferation of stem cells | |
| Cheng et al. | Influence of human platelet lysate on extracellular matrix deposition and cellular characteristics in adipose-derived stem cell sheets | |
| Naasani et al. | Decellularized human amniotic membrane associated with adipose derived mesenchymal stromal cells as a bioscaffold: physical, histological and molecular analysis | |
| JP2020172536A (en) | Stem cells for wound healing | |
| CN113924132A (en) | Novel polysaccharide-based hydrogel scaffold for wound care | |
| Huang et al. | In vivo differentiation of adipose-derived stem cells in an injectable poloxamer-octapeptide hybrid hydrogel | |
| US20030202965A1 (en) | Methods and compositions for the preparation of cell transplants | |
| JP2018534353A (en) | Composition for soft tissue augmentation providing protection against infection | |
| Chen et al. | Injectable and biofunctionalized fibrin hydrogels co-embedded with stem cells induce hair follicle genesis | |
| Deng et al. | Exosomes from umbilical cord-derived mesenchymal stem cells combined with gelatin methacryloyl inhibit vein graft restenosis by enhancing endothelial functions | |
| RU2522816C1 (en) | Composition for cell-replacement therapy of soft tissue defects | |
| CN114269362A (en) | Method for promoting angiogenesis | |
| US20160129045A1 (en) | Composition for wound-healing comprising adult stem cells and elastin-like polypeptides | |
| Jin et al. | ADSC-derived exosomes-coupled decellularized matrix for endometrial regeneration and fertility restoration |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20160213 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20161120 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20180213 |