RU2615354C1 - Method for preparing peripheral blood for enzyme immunoassay determination of spontaneous cytokine production - Google Patents
Method for preparing peripheral blood for enzyme immunoassay determination of spontaneous cytokine production Download PDFInfo
- Publication number
- RU2615354C1 RU2615354C1 RU2015154941A RU2015154941A RU2615354C1 RU 2615354 C1 RU2615354 C1 RU 2615354C1 RU 2015154941 A RU2015154941 A RU 2015154941A RU 2015154941 A RU2015154941 A RU 2015154941A RU 2615354 C1 RU2615354 C1 RU 2615354C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cytokines
- concentration
- determination
- peripheral blood
- leukocytes
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицины, а именно к клинической лабораторной диагностике, и касается способа подготовки биологической жидкости, а именно периферической крови, к определению концентрации медиаторов межклеточных взаимодействий (цитокинов) методом иммуноферментного анализа (ИФА).The invention relates to medicine, namely to clinical laboratory diagnostics, and relates to a method for preparing a biological fluid, namely peripheral blood, to determining the concentration of mediators of intercellular interactions (cytokines) by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
Известно, что уровень цитокинов при разных патологических состояниях позволяет оценить состояние больного [1], прогнозировать исход заболевания [2], а также предвидеть риск возникновения различных осложнений [3]. При этом многие исследователи на практике сталкиваются с проблемой значительной вариабельности уровня цитокинов в сыворотке крови у обследуемых когорт больных [4, 5]. Это обусловлено высокой скоростью деградации пептидов после клеточной экскреции [6], способностью активно связываться в комплексы с различными сывороточными белками [7], а также различием функционального состояния отдельных клеток-продуцентов. Решение данной проблемы может быть связано с определением не только внеклеточной концентрации цитокинов, но, одновременно, и внутриклеточной.It is known that the level of cytokines in various pathological conditions allows us to assess the patient’s condition [1], to predict the outcome of the disease [2], and also to predict the risk of various complications [3]. Moreover, many researchers in practice are faced with the problem of significant variability in the level of cytokines in serum in the studied cohorts of patients [4, 5]. This is due to the high degradation rate of peptides after cell excretion [6], the ability to actively bind to complexes with various serum proteins [7], and also the difference in the functional state of individual producer cells. The solution to this problem may be associated with the determination of not only the extracellular concentration of cytokines, but, at the same time, intracellular.
Известен способ подготовки биологической жидкости (цервикального смыва) для определения цитокинового профиля методом ИФА, заключающийся в отборе образцов, замораживании при -70°С, тестировании их на содержание гемоглобина, разбавлении 1:2 фосфатно-солевым буфером с 1% сыворотки эмбрионов коров с последующим определением искомой концентрации [8]. Недостатком данного метода является необходимость тестирования образца на гемоглобин, отсутствие информации о точном количестве изучаемых клеток в образце.A known method of preparing biological fluid (cervical flushing) to determine the cytokine profile by ELISA, which consists in sampling, freezing at -70 ° C, testing them for hemoglobin, diluting 1: 2 with phosphate-buffered saline with 1% serum of cow embryos, followed by determination of the desired concentration [8]. The disadvantage of this method is the need to test the sample for hemoglobin, lack of information about the exact number of studied cells in the sample.
Известен способ определения стимулированной продукции цитокинов [9], заключающийся в предварительном выделении мононуклеарных клеток на градиенте плотности (фикол-урографин) методом центрифугирования в течение 40 мин, последующем трехразовом отмывании их средой RPMI-1640, стандартизации их количества, культивировании их с полной культуральной средой 24 или 48 ч во влажной камере с использованием СО2 инкубатора, последующем центрифугировании, сборе кондиционной среды и дальнейшем определении в ней концентрации цитокинов методом ИФА. Недостатком данного метода является длительность подготовки, необходимость специального оборудования (СО2-инкубатор, планшеточная центрифуга) и реагентов (эмбриональная телячья сыворотка, гентамицин, ампициллин, глутамин, меркаптоэтанол), невозможность получения информации о спонтанном уровне продукции цитокинов, отсутствии в исследовании нейтрофилов (не являются мононуклеарными клетками) продуцирующих, тем не менее, ряд цитокинов.A known method for determining the stimulated production of cytokines [9], which consists in the preliminary isolation of mononuclear cells on a density gradient (ficol-urographin) by centrifugation for 40 minutes, followed by three times washing them with RPMI-1640 medium, standardizing their number, culturing them with a complete culture medium 24 or 48 hours in a humid chamber using a CO 2 incubator, subsequent centrifugation, collection of the conditioned medium and further determination of the cytokine concentration in it by ELISA. The disadvantage of this method is the length of preparation, the need for special equipment (a CO 2 incubator, a tablet centrifuge) and reagents (fetal calf serum, gentamicin, ampicillin, glutamine, mercaptoethanol), the inability to obtain information about the spontaneous level of cytokine production, and the absence of neutrophils in the study (not are mononuclear cells) producing, however, a number of cytokines.
Известна модификация вышеописанного способа определения стимулированной продукции цитокинов [10] с дополнительным предварительным фильтрованием размороженного для исследования супернатанта через одноразовые нитроцеллюлозные фильтры с порами 0,4 мкм в диаметре. Недостатком способа является его трудоемкость, длительность, необходимость дополнительных расходных материалов.A known modification of the above method for determining the stimulated production of cytokines [10] with additional preliminary filtration of supernatant thawed for research through disposable nitrocellulose filters with pores of 0.4 μm in diameter. The disadvantage of this method is its complexity, duration, the need for additional consumables.
Известен способ подготовки биологической жидкости [11], заключающийся в использовании цельной периферической гепаринизированной крови, разведенной средой RPMI 1640 с глутамином в соотношении 1:5. Кровь и грибной антиген в соотношении 1:1 помещаются в иммунологический планшет. В качестве контроля (оценка спонтанной индукции) используется кровь с добавлением культуральной среды без грибного антигена. Планшеты инкубируются 72 ч (для IFN-γ) и 24 ч (для остальных цитокинов) в условиях эксикатора (37°С, 0,5% СО2) с последующим снятием супернатанта, делении его на малые порции, замораживании при -70°C с последующим определением количества цитокинов в них методом ИФА. Недостатком данного метода является его трудоемкость, необходимость наличия специального оборудования и реагентов.A known method of preparing biological fluid [11], which consists in the use of whole peripheral heparinized blood diluted with RPMI 1640 medium with glutamine in a ratio of 1: 5. Blood and fungal antigen in a 1: 1 ratio are placed on an immunological plate. As a control (evaluation of spontaneous induction), blood is used with the addition of a culture medium without fungal antigen. The plates are incubated for 72 hours (for IFN-γ) and 24 hours (for the remaining cytokines) under desiccator conditions (37 ° C, 0.5% CO 2 ), followed by removal of the supernatant, dividing it into small portions, freezing at -70 ° C with subsequent determination of the number of cytokines in them by ELISA. The disadvantage of this method is its complexity, the need for special equipment and reagents.
Известен способ определения цитокинов и иммуноглобулина Е в конденсате выдыхаемой влаги (RU 2222015 С1, 2004) согласно которому конденсат концентрируют путем лиофильной сушки при комнатной температуре в течении 6 ч с последующим разведением забуференным физиологическим раствором в объеме, в 4-5 раз меньшем начального объема конденсата выдыхаемой влаги, стабилизируют бычьим сывороточным альбумином до конечной концентрации 1% с последующим определением концентрации цитокинов и IgE методом иммуноферментного анализа. Недостатком данного метода является длительная инкубация при комнатной температуре, приводящая к изменению концентрации цитокинов, риск контаминации бактериальными антигенами, необходимость использования специальных реагентов (бычий альбумин), влияющих на плотность белковой массы исследуемого раствора.A known method for the determination of cytokines and immunoglobulin E in an exhaled moisture condensate (RU 2222015 C1, 2004) according to which the condensate is concentrated by freeze drying at room temperature for 6 hours, followed by dilution with buffered saline in a volume 4-5 times smaller than the initial volume of the condensate exhaled moisture, stabilized with bovine serum albumin to a final concentration of 1%, followed by determination of the concentration of cytokines and IgE by enzyme-linked immunosorbent assay. The disadvantage of this method is prolonged incubation at room temperature, leading to a change in the concentration of cytokines, the risk of contamination with bacterial antigens, the need to use special reagents (bovine albumin), which affect the density of the protein mass of the test solution.
Известен способ получения биологической жидкости (смыва из полости носа) путем введения в носовой ход сухого марлевого тампона, который после извлечения переносят в пробирку, содержащую физиологический раствор и после 30 минутной инкубации отжимают [12]. Полученный раствор центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин, определяют оптическую плотность методом спектрофотометрии против физиологического раствора, стандартизируют путем разбавления/концентрирования до 0,4 единиц оптической плотности и используют для определения уровня содержания цитокинов. Недостатком данного метода является стандартизация по количеству всех растворенных метаболитов, среди которых присутствуют белки с различной молекулярной массой, не выполняющие функцию цитокинов (например, альбумины, глобулины, лизины и др.), не показана возможность использования способа для определения концентрации цитокинов крови.A known method for producing biological fluid (rinsing from the nasal cavity) by introducing a dry gauze swab into the nasal passage, which, after extraction, is transferred to a test tube containing saline and squeezed out after 30 minutes of incubation [12]. The resulting solution was centrifuged at 3000 rpm for 10 min, the optical density was determined by spectrophotometry against physiological saline, standardized by dilution / concentration to 0.4 units of optical density and used to determine the level of cytokines. The disadvantage of this method is the standardization of the amount of all dissolved metabolites, among which there are proteins with different molecular weights that do not fulfill the function of cytokines (e.g., albumin, globulins, lysines, etc.), the possibility of using the method for determining the concentration of blood cytokines is not shown.
Известен способ определения концентрации цитокинов в сыворотке крови, заключающийся в получении ее стандартным методом - коагуляции сгустка эритроцитов и фибрина при комнатной температуре в течение 30 мин, отделении его методом центрифугирования с последующим изучением концентрации цитокинов методом ИФА [13]. Недостатком способа является значительная вариабельность концентрации цитокинов в индивидуальных образцах, не позволяющая в целом оценить спонтанную продукцию цитокинов.A known method for determining the concentration of cytokines in blood serum, which consists in obtaining it by the standard method - coagulation of a clot of red blood cells and fibrin at room temperature for 30 minutes, separating it by centrifugation, followed by studying the concentration of cytokines by ELISA [13]. The disadvantage of this method is the significant variability in the concentration of cytokines in individual samples, which does not allow in general to evaluate the spontaneous production of cytokines.
Известен способ подготовки пробы периферической крови для ИФА, взятый в качестве прототипа (Меньшиков В.В. Руководство по клинической лабораторной диагностике. - М.: Медицина, 1982. - 420 с.). Производят забор 5 мл периферической крови из локтевой вены. В пробирку с кровью добавляют антикоагулянт (гепарин) из расчета на 1 мл крови - 5 Ед. гепарина. Тщательно перемешивают. Пробу центрифугируют в течение 5 мин со скоростью 3000 об/мин. После этого забирают 0,1 мл надосадочной жидкости и помещают в лунку планшета для определения содержания цитокинов с помощью ИФА по стандартной методике в соответствии с протоколом фирмы-производителя.A known method of preparing a peripheral blood sample for ELISA, taken as a prototype (Menshikov V.V. Guide to clinical laboratory diagnostics. - M .: Medicine, 1982. - 420 S.). 5 ml of peripheral blood are taken from the ulnar vein. An anticoagulant (heparin) is added to a test tube with blood per 1 ml of blood - 5 units. heparin. Mix thoroughly. The sample is centrifuged for 5 min at a speed of 3000 rpm. After that, 0.1 ml of the supernatant is collected and placed in the well of the plate to determine the cytokine content using ELISA according to the standard method in accordance with the manufacturer's protocol.
Недостатком способа является невозможность определения в периферической крови общей концентрации внутри- и внеклеточных цитокинов, а также значительная вариабельность концентрации цитокинов в индивидуальных образцах, что влияет на точность измерения цитокинов методом ИФА.The disadvantage of this method is the inability to determine in the peripheral blood the total concentration of intracellular and extracellular cytokines, as well as the significant variability of the concentration of cytokines in individual samples, which affects the accuracy of the measurement of cytokines by ELISA.
Технический результат - повышение точности определения спонтанной продукции цитокинов, снижение индивидуальной вариабельности показателей за счет полного высвобождения вне- и внутриклеточных цитокинов из лимфоцитов периферической крови.The technical result is an increase in the accuracy of determining the spontaneous production of cytokines, a decrease in individual variability of indicators due to the complete release of extra- and intracellular cytokines from peripheral blood lymphocytes.
Технический результат достигается тем, что в способе подготовки периферической крови для иммуноферментного определения спонтанной продукции цитокинов, включающем забор крови и смешивание его с антикоагулянтом, согласно технического решения после перемешивания антигаулянта с кровью смесь оставляют при комнатной температуре на 20 мин для свободного осаждения эритроцитов, затем забирают 0,5 мл надосадочной лейкоцитарной взвеси и разводят ее дистиллированной водой до концентрации 5*109 лейкоцитов/л, замораживают при температуре -20°С, после размораживания полученную биологическую жидкость используют для определения цитокинов.The technical result is achieved by the fact that in the method of preparing peripheral blood for enzyme-linked immunosorbent assay for determining the spontaneous production of cytokines, including blood sampling and mixing it with an anticoagulant, according to the technical solution, after mixing the antigauler with blood, the mixture is left at room temperature for 20 minutes to freely precipitate red blood cells, then taken 0.5 ml of the leukocyte suspension and supernatant was diluted with distilled water to a concentration of 5 * 10 September leukocytes / liter, frozen at -20 ° C after thawing the biological fluid obtained was used to determine cytokine.
Осаждение эритроцитов из смеси антикоагулянта с кровью в течение 20 мин при комнатной температуре позволяет получить стандартизованную лейкоцитарную взвесь, необходимую для дальнейшего приготовления биологической жидкости. Разбавление лейкоцитарной взвеси до 5*109 лейкоцитов/л дистиллированной водой и полное замораживание ее при температуре -20°С позволяет разрушить клеточные мембраны, приводящие к выходу внутриклеточных цитокинов во внеклеточную среду, что при размораживании полученной биологической жидкости дает повышение точности измерения общей концентрации цитокинов, при этом снижается индивидуальная вариабельность показателей.The deposition of red blood cells from a mixture of anticoagulant with blood for 20 min at room temperature allows to obtain a standardized leukocyte suspension necessary for further preparation of biological fluid. Dilution of the leukocyte suspension to 5 * 10 9 leukocytes / l with distilled water and its complete freezing at a temperature of -20 ° C allows to destroy cell membranes, leading to the release of intracellular cytokines into the extracellular medium, which, when thawing the obtained biological fluid, improves the accuracy of measuring the total concentration of cytokines , while the individual variability of indicators is reduced.
Как известно, животные клетки по-разному реагируют на замораживание [14], это обусловлено, в том числе, присутствием в их структуре белков, дифференцируемых на гидрофильные, к которым относится большинство белков цитоплазмы, ядра и межклеточные вещества, и гидрофобные - включающие белки, входящие в состав биологических мембран. Также известно, что лейкоциты имеют необходимость индивидуального подбора режима замораживания и оттаивания, связанную с особенностями кристаллизации воды [15], кроме того, воздействие низких температур в результате кристаллообразования при фазовом переходе вода-лед приводит к разрушению клеточных мембран [16, 17]. При этом отрицательные температуры ниже 15 градусов приводят к разрушению плазматической мембраны [18].As you know, animal cells react differently to freezing [14], this is due, inter alia, to the presence in their structure of proteins that are differentiable into hydrophilic, which include most cytoplasmic proteins, nuclei and intercellular substances, and hydrophobic - including proteins, included in biological membranes. It is also known that leukocytes have the need for individual selection of the freezing and thawing regimen associated with the features of water crystallization [15], in addition, the effect of low temperatures as a result of crystal formation during the water-ice phase transition destroys cell membranes [16, 17]. In this case, negative temperatures below 15 degrees lead to the destruction of the plasma membrane [18].
Проведенные исследования и статистическая обработка результатов позволили авторам подобрать оптимальный режим подготовки периферической крови для иммуноферментного анализа, что позволяет достоверно оценить концентрацию спонтанной продукции цитокинов.The studies and statistical processing of the results allowed the authors to choose the optimal mode of peripheral blood preparation for enzyme-linked immunosorbent assay, which allows reliable estimation of the concentration of spontaneous cytokine production.
Для сравнения методом иммуноферментного анализа была определена концентрация цитокинов в плазме крови и периферической крови, подготовленной предлагаемым способом, были обследованы 150 человек, из которых: 50 - здоровые добровольцы, 100 - имели воспалительные заболевания. Больные находились на лечении в Уральский НИИ травматологии и ортопедии. Больные были поделены на 3 когорты в зависимости от тяжести течения заболевания: Первая когорта - 40 человек (20 мужчин и 20 женщин, средний возраст - 33,4±1,7 года, сопутствующая патология встречалась у 20 больных (50%)). Вторая когорта - 30 человек (15 мужчин, 15 женщин, средний возраст - 36,2±4,5 года, сопутствующая патология встречалась у 15 больных (50%)). Третья когорта - 30 человек (15 мужчин и 15 женщин, средний возраст - 32,8±1,9 года; сопутствующая патология встречалась у 15 больных (50%)). Группа здоровых добровольцев 50 человек (27 мужчин, 23 женщины, средний возраст 35,8 лет). Исследование показало, что содержание различных цитокинов (IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, INFγ, TNF-α) в биологической жидкости, подготовленной предлагаемым способом выше концентрации в плазме крови на величину от 7,4 до 43,3%. Это доказывает, что при определении концентрации цитокинов иммуноферментным методом использование периферической крови, подготовленной предлагаемым способом, является предпочтительным.For comparison, the method of enzyme immunoassay was determined by the concentration of cytokines in plasma and peripheral blood prepared by the proposed method, 150 people were examined, of which 50 were healthy volunteers, 100 had inflammatory diseases. Patients were treated at the Ural Research Institute of Traumatology and Orthopedics. Patients were divided into 3 cohorts depending on the severity of the disease: The first cohort was 40 people (20 men and 20 women, average age 33.4 ± 1.7 years, concomitant pathology was observed in 20 patients (50%)). The second cohort was 30 people (15 men, 15 women, average age 36.2 ± 4.5 years, concomitant pathology was observed in 15 patients (50%)). The third cohort was 30 people (15 men and 15 women, average age 32.8 ± 1.9 years; concomitant pathology was observed in 15 patients (50%)). The group of healthy volunteers is 50 people (27 men, 23 women, average age 35.8 years). The study showed that the content of various cytokines (IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, INFγ, TNF-α) in the biological fluid prepared by the proposed method is higher than the plasma concentration by a value of 7 , 4 to 43.3%. This proves that when determining the concentration of cytokines by the enzyme immunoassay, the use of peripheral blood prepared by the proposed method is preferred.
Таким образом, предлагаемый способ подготовки периферической крови для иммуноферментного определения спонтанной продукции цитокинов методом стандартизации количества лейкоцитов с последующим криогидролизом их мембран является новым и соответствует критерию «изобретательский уровень».Thus, the proposed method for preparing peripheral blood for enzyme-linked immunosorbent assay for determining the spontaneous production of cytokines by standardizing the number of leukocytes with subsequent cryohydrolysis of their membranes is new and meets the criterion of "inventive step".
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом. У пациента в условиях соблюдения правил асептики и антисептики стандартным образом забирается периферическая кровь в пробирку, содержащую антикоагулянт (гепарин лития) в объеме 5-7 мл. После аккуратного перемешивания пробирку оставляют на 20 мин при комнатной температуре для свободного осаждения эритроцитов. После их седиментации на дно пробирки производят взятие 0,5 мл располагающейся над эритроцитами фракции лейкоцитарной взвеси, в которой производят точное определение концентрации лейкоцитов - источника цитокинов - любым удобным способом (на гематологическом анализаторе, в камере Горяева) и доводят ее до концентрации 5*109 лейкоцитов/л дистиллированной водой, что позволяет стандартизировать исследование и дает возможность сравнительного анализа образцов с разным количеством клеток между собой. Подготовленную лейкоцитарную взвесь помещают в морозильную камеру с температурой -20°С до полного замораживания, приводящего к деструкции клеточных мембран, и высвобождения цитокинов из клеток. После размораживания полученную биологическую жидкость используют для определения спонтанной продукции цитокинов, содержащихся в клетке и внеклеточном пространстве методом иммуноферментного анализа с использованием стандартных коммерческих наборов реагентов в зависимости от варианта исследуемого цитокина, используя ручной метод или любой автоматический или полуавтоматический анализатор. Предлагаемый способ легко воспроизводим в условиях любого лечебного учреждения.The proposed method is as follows. In a patient subject to aseptic and antiseptic rules, peripheral blood is collected in a standard manner in a test tube containing an anticoagulant (lithium heparin) in a volume of 5-7 ml. After gentle mixing, the tube is left for 20 min at room temperature for free deposition of red blood cells. After sedimentation to the bottom of the tube, 0.5 ml of the leukocyte suspension fraction located above the erythrocytes is taken, in which the concentration of leukocytes, the source of cytokines, is accurately determined using any convenient method (on a hematological analyzer, in the Goryaev chamber) and adjusted to a concentration of 5 * 10 9 leukocytes / l with distilled water, which makes it possible to standardize the study and enables comparative analysis of samples with different numbers of cells among themselves. The prepared leukocyte suspension is placed in a freezer with a temperature of -20 ° C until complete freezing, leading to the destruction of cell membranes, and the release of cytokines from cells. After thawing, the obtained biological fluid is used to determine the spontaneous production of cytokines contained in the cell and extracellular space by enzyme-linked immunosorbent assay using standard commercial reagent kits depending on the variant of the cytokine being studied, using the manual method or any automatic or semi-automatic analyzer. The proposed method is easily reproducible in the conditions of any medical institution.
Предлагаемый способ иллюстрируется следующими примерами: в таблице представлена сравнительная оценка определения концентрации цитокинов в плазме крови стандартным методом и биологической жидкости, полученной предложенным методом.The proposed method is illustrated by the following examples: the table presents a comparative assessment of the determination of the concentration of cytokines in blood plasma by the standard method and biological fluid obtained by the proposed method.
ЛитератураLiterature
1. Е.Ф. Чернушенко, Л.П. Кадан. О.Р. Панасюкова, В.Н. Петишкина, Л.М. Цыганкова Цитокины в оценке иммунной системы у больных туберкулезом легких // Украинский пульмонологический журнал. - 2010. - №2. - 39-43.1. E.F. Chernushenko, L.P. Kadan. O.R. Panasyukova, V.N. Petishkina, L.M. Tsygankova Cytokines in the assessment of the immune system in patients with pulmonary tuberculosis // Ukrainian Pulmonary Journal. - 2010. - No. 2. - 39-43.
2. Притулина Ю.Г., Криворучко И.В., Шенцова В.В., Филь Г.В., Астапченко Д.С., Сахарова Л.А. Анализ цитокинового статуса при ряде инфекционных заболеваний // Успехи современного естествознания. - 2014. - №2. - С. 16-20.2. Pritulina Yu.G., Krivoruchko IV, Shentsova VV, Fil G.V., Astapchenko D.S., Sakharova L.A. Analysis of the cytokine status in a number of infectious diseases // Successes in modern science. - 2014. - No. 2. - S. 16-20.
3. Исаева Р.Х., Антонюк И.А., Гридякина А.В., Евстафьева А.Е. Иммунологические изменения при черепно-мозговой травме // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. - 2014. - №8-2. - С. 41-47).3. Isaeva R.Kh., Antonyuk I.A., Gridyakina A.V., Evstafieva A.E. Immunological changes in traumatic brain injury // International Journal of Applied and Basic Research. - 2014. - No. 8-2. - S. 41-47).
4. Убшаева Ю.Б. Комплексный анализ уровня сывороточных цитокинов и полиморфизма их генов в прогнозе течения и эффективности терапии ревматоидного артрита: автореф. дис. канд. мед. наук: 14.01.22 / Ю.Б. Убшаева. - Волгоград, 2013. - 23 с. - С. 10.4. Ubshaeva Yu.B. A comprehensive analysis of the level of serum cytokines and the polymorphism of their genes in the prognosis of the course and effectiveness of the treatment of rheumatoid arthritis: author. dis. Cand. honey. Sciences: 14.01.22 / Yu.B. Ubshaeva. - Volgograd, 2013 .-- 23 p. - S. 10.
5. Малинин С.А. Профилактика и лечение острого послеоперационного панкреатита после спленэктомий у онкологических больных: автореф. дис. канд. мед. наук: 14.01.12 / С.А.Малинин. - Ростов-на-Дону, 2011. - С. 15.5. Malinin S.A. Prevention and treatment of acute postoperative pancreatitis after splenectomy in cancer patients: author. dis. Cand. honey. Sciences: 01/14/12 / S.A. Malinin. - Rostov-on-Don, 2011 .-- S. 15.
6. Плотникова М.А. Мультиплексные методы определения вирус-индуцированной экспрессии цитокинов на основе микроципов и ПЦР: дис. канд. биол. наук / М.А. Плотникова. - Санкт-Петербург, 2014. - 117 с. - С. 33.6. Plotnikova M.A. Multiplex methods for determining the virus-induced expression of cytokines based on microcyps and PCR: dis. Cand. biol. sciences / M.A. Plotnikova. - St. Petersburg, 2014 .-- 117 p. - S. 33.
7. Коненков В.И., Ракова И.Г., Авдошина В.В., Гельфгат Е.Л. Комплексная оценка уровня спонтанной продукции цитокинов в культуре мононуклеарных клеток периферической крови здорового человека // Цитокины и воспаление. - 2005. - №2. - С. 33-37.7. Konenkov V.I., Rakova I.G., Avdoshina V.V., Gelfgat E.L. A comprehensive assessment of the level of spontaneous production of cytokines in a culture of mononuclear cells of the peripheral blood of a healthy person // Cytokines and inflammation. - 2005. - No. 2. - S. 33-37.
8. Кубанов А.А. Содержание интерферона-g, фактора некроза опухоли-а, интерлейкинов-4 и -12 в цервикальном секрете у пациенток с папилломавирусной инфекцией // Вестник дерматологии и венерологии. - 2005. - №2. - (http://www.mediasphera.ru/journals/vestnik/120/1417).8. Kubanov A.A. The content of interferon-g, tumor necrosis factor-a, interleukins-4 and -12 in cervical secretion in patients with papillomavirus infection // Bulletin of Dermatology and Venereology. - 2005. - No. 2. - (http://www.mediasphera.ru/journals/vestnik/120/1417).
9. Итоговый отчет по теме «Оценка иммуномодулирующего действия биологически активной добавки «Кавесан» в экспериментальных мышиных моделях и в условиях in vitro на человеческих клетках» / под ред. В.А. Козлова. - Новосибирск: ФГБУ «НИКИ» СО РАМН, 2013. - 38 с. - С. 10, 12.9. The final report on the topic "Evaluation of the immunomodulatory effect of the dietary supplement" Cavesan "in experimental mouse models and in vitro on human cells" / ed. V.A. Kozlova. - Novosibirsk: FSBI "NIKI" SB RAMS, 2013. - 38 p. - S. 10, 12.
10. Коненков В.И., Ракова И.Г., Авдошина В.В., Гельфгат Е.Л. Комплексная оценка уровня спонтанной продукции цитокинов в культуре мононуклеарных клеток периферической крови здорового человека // Цитокины и воспаление. - 2005. - №2. - С. 33-37.10. Konenkov V.I., Rakova I.G., Avdoshina V.V., Gelfgat E.L. A comprehensive assessment of the level of spontaneous production of cytokines in a culture of mononuclear cells of the peripheral blood of a healthy person // Cytokines and inflammation. - 2005. - No. 2. - S. 33-37.
11. Поспелова А.В., Бурмистрова А.Л., Хомич Ю.С., Самышкина Н.Е., Бахарева Л.И. Влияние грибов рода Candida на синтез цитокинов иммунными клетками периферической крови человека in vitro // Успехи современного естествознания. - 2006. - №2 - С. 86.11. Pospelova A.V., Burmistrova A.L., Khomich Yu.S., Samyshkina N.E., Bakhareva L.I. The influence of Candida fungi on the synthesis of cytokines by immune cells of human peripheral blood in vitro // Successes in modern science. - 2006. - No. 2 - S. 86.
12. Пересторонин В.И. Патофизиологические аспекты развития хронического гнойного риносинусита: автореф. дис. канд. мед. наук: 14.03.03 / Пересторонин В.И. - Чита, 2013. - 24 с.12. Perestoronin V.I. Pathophysiological aspects of the development of chronic purulent rhinosinusitis: author. dis. Cand. honey. Sciences: 14.03.03 / Perestoronin V.I. - Chita, 2013 .-- 24 p.
13. Егорова Е.В., Пересторонин В.И., Цыбиков Н.Н. Уровень цитокинов и аутоантител к ним в сыворотке крови и назальном секрете у больных хроническим гнойным риносинуситом // Врач-аспирант. - 2013. - №2. - http://vrach-aspirant.ru/articles/otorhinolaryngology/12578/.13. Egorova E.V., Perestoronin V.I., Tsybikov N.N. The level of cytokines and autoantibodies to them in the blood serum and nasal secretion in patients with chronic purulent rhinosinusitis // Postgraduate doctor. - 2013. - No. 2. - http://vrach-aspirant.ru/articles/otorhinolaryngology/12578/.
14. Сведенцов Е.П. Функциональное состояние лейкоцитов после выхода из криоанабиоза: научное издание / Е.П. Сведенцов, Т.В. Туманова. - Екатеринбург: УрО РАН, 2007. - 80 с.14. Swedentsov E.P. The functional state of leukocytes after exiting cryoanabiosis: scientific publication / E.P. Swedentsov, T.V. Tumanova. - Yekaterinburg: Ural Branch of the Russian Academy of Sciences, 2007. - 80 p.
15. Щеглова О.О. Функциональное состояние лейкоцитов после выхода из холодового анабиоза при умеренно-низкой температуре: дисс. канд. биол. наук: 03.00.13, 14.00.29 / Щеглова О.О. - Киров, 2005. - 116 с.15. Scheglova O.O. The functional state of leukocytes after exiting cold suspended animation at a moderately low temperature: diss. Cand. biol. Sciences: 03.00.13, 14.00.29 / Scheglova O.O. - Kirov, 2005 .-- 116 p.
16. Зайцева О.О., Полежаева Т.В., Сведенцов Е.П., Соломина О.Н., Утемов С.В. Эффективность применения оригинальных криофилактиков для сохранности лейкоцитов при -40°С // Cjournal of stress physiology & biochemistry. - 2011. - Vol. 7. - №4. - С. 198-206. - C. 204.16. Zaitseva O.O., Polezhaeva T.V., Swedentsov E.P., Solomina O.N., Utemov S.V. The effectiveness of the use of original cryophylaxis for the preservation of leukocytes at -40 ° C // Cjournal of stress physiology & biochemistry. - 2011 .-- Vol. 7. - No. 4. - S. 198-206. - C. 204.
17. Svedentsov E.P., Chtcheglova O.O., Tumanova T.V., Solomina O.N. Conservation leukocytes in the conditions of cryoanabiosis (-40°C) // Journal of Stress Physiology & Biochemistry. - 2006. - Vol. 2. - №1, pp. 28-34. - P. 32.17. Svedentsov E.P., Chtcheglova O.O., Tumanova T.V., Solomina O.N. Conservation leukocytes in the conditions of cryoanabiosis (-40 ° C) // Journal of Stress Physiology & Biochemistry. - 2006. - Vol. 2. - No. 1, pp. 28-34. - P. 32.
18. Кузнецов K.B. Консервирование тромбоцитов замораживанием (экспериментальное исследование): автореф. дис. анд. мед. наук: 14.00.29 / К.В. - Киров, 2006. - 24 с. - С. 10.18. Kuznetsov K.B. Platelet preservation by freezing (experimental study): author. dis. and. honey. Sciences: 14.00.29 / K.V. - Kirov, 2006 .-- 24 p. - S. 10.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015154941A RU2615354C1 (en) | 2015-12-21 | 2015-12-21 | Method for preparing peripheral blood for enzyme immunoassay determination of spontaneous cytokine production |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015154941A RU2615354C1 (en) | 2015-12-21 | 2015-12-21 | Method for preparing peripheral blood for enzyme immunoassay determination of spontaneous cytokine production |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2615354C1 true RU2615354C1 (en) | 2017-04-04 |
Family
ID=58505808
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015154941A RU2615354C1 (en) | 2015-12-21 | 2015-12-21 | Method for preparing peripheral blood for enzyme immunoassay determination of spontaneous cytokine production |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2615354C1 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2196334C2 (en) * | 2001-02-20 | 2003-01-10 | Смоленская государственная медицинская академия | Method for diagnosing progredient course of cerebral injury disease |
| US20130224148A1 (en) * | 2010-09-09 | 2013-08-29 | Mitchell Shirvan | Activated leukocyte conditioned supernatant and uses for wound healing |
-
2015
- 2015-12-21 RU RU2015154941A patent/RU2615354C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2196334C2 (en) * | 2001-02-20 | 2003-01-10 | Смоленская государственная медицинская академия | Method for diagnosing progredient course of cerebral injury disease |
| US20130224148A1 (en) * | 2010-09-09 | 2013-08-29 | Mitchell Shirvan | Activated leukocyte conditioned supernatant and uses for wound healing |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Меньшиков В.В. Руководство по клинической лабораторной диагностике. М.: Медицина, 1982. 420с.. * |
| С.В. Сенников, А.Н. Силков. М ()ЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИТОКИНОВ. Журнал 'Цитокины и воспаление', 2005, 1. http://www.cytokines.ru/2005/1/Art3.php. ГРАЧЕВ Л. А. ЦИТОКИНЫ в ОНКОГЕМАТОЛОГИИ. Автореф. Д.м.н. Москва, 1997, 49с... * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Csernok et al. | Cytokine profiles in Wegener's granulomatosis: predominance of type 1 (Th1) in the granulomatous inflammation | |
| Witwer et al. | Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research | |
| Stuart | Erythrocyte rheology. | |
| JP4761448B2 (en) | Blood endotoxin measurement method | |
| CN108795869A (en) | A kind of circulating tumor cell positive enrichment method | |
| Gamonet et al. | Processing methods and storage duration impact extracellular vesicle counts in red blood cell units | |
| RU2310850C1 (en) | Method for predicting postoperative wound suppuration | |
| Glasser | Effect of storage on normal neutrophils collected by discontinuous-flow centrifugation leukapheresis | |
| Fumeaux et al. | Immune monitoring of patients with septic shock by measurement of intraleukocyte cytokines | |
| RU2615354C1 (en) | Method for preparing peripheral blood for enzyme immunoassay determination of spontaneous cytokine production | |
| CN113552347A (en) | Application of reagent for detecting follicular regulatory T cells in preparation of diagnostic reagent for prognosis of immunotherapy of allergic rhinitis | |
| RU2478966C1 (en) | Method for evaluating severity of preeclampsia | |
| Nguyen et al. | Placental Exosomes as Biomarkers for Maternal Diseases: Current Advances in Isolation, Characterization, and Detection | |
| CN114113631B (en) | Sepsis detection kit | |
| JP5016676B2 (en) | Methods for detecting the degree of immune system activation or cell death | |
| Sokolovskaya et al. | Assessment of the State of Platelet Haemostasis and Adhesive-Aggregation Properties of Platelets as a Factor of Increasing the Tendency to Thrombosis in Chronic Inflammation | |
| RU2704121C1 (en) | Screening test for determining the functional activity of the classic complement pathway | |
| US20100173403A1 (en) | Non-isopycnic cell purification using percoll | |
| RU2330286C1 (en) | Method of viral herpes gestationis diagnostics by herpes bodies estimation in peripheral blood | |
| RU2601111C1 (en) | Method for assessing hemostatic activity | |
| RU2331883C1 (en) | Method of angiopathy development risk diagnostics in arterial hypertension cases with metabolic syndrome | |
| RU2637652C1 (en) | Method for determination of mitogen-induced leukocytes adhesiveness | |
| RU2362997C2 (en) | Way of revealing disturbance of function of phagocytes at development of relapsing infectious processes | |
| RU2712643C1 (en) | Method for determining fibrinogen and evaluating its functionality | |
| RU2054172C1 (en) | Method for studying phagocytosis in the whole blood |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20171222 |