RU2612159C1 - L-lysine-producing coryneform bacterium with mutant gene fusa and method for obtaining l-lysine with application thereof - Google Patents

L-lysine-producing coryneform bacterium with mutant gene fusa and method for obtaining l-lysine with application thereof Download PDF

Info

Publication number
RU2612159C1
RU2612159C1 RU2015156336A RU2015156336A RU2612159C1 RU 2612159 C1 RU2612159 C1 RU 2612159C1 RU 2015156336 A RU2015156336 A RU 2015156336A RU 2015156336 A RU2015156336 A RU 2015156336A RU 2612159 C1 RU2612159 C1 RU 2612159C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
lysine
fusa
amino acid
gene
strains
Prior art date
Application number
RU2015156336A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Ирина Петровна Токмакова
Людмила Евгеньевна Рябченко
Татьяна Васильевна Герасимова
Александр Степанович Яненко
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГБУ "ГосНИИгенетика")
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГБУ "ГосНИИгенетика") filed Critical Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГБУ "ГосНИИгенетика")
Priority to RU2015156336A priority Critical patent/RU2612159C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2612159C1 publication Critical patent/RU2612159C1/en

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20Bacteria; Culture media therefor
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

FIELD: medicine.
SUBSTANCE: group of the inventions relates to field of biotechnology. Claimed is L-lysine-producing bacterium of genus Corynebacterium, modified in such a way that amino acid substitution H461Q is contained in amino acid sequence of product of mutant gene fusA. Claimed is L-lysine-producing bacterium of genus Brevibacterium, modified in such a way that amino acid substitution H461Q is contained in amino acid sequence of product of mutant gene fusA. Claimed is method for obtaining L-lysine, which includes cultivation of any of said modified bacteria.
EFFECT: group of inventions makes it possible to increase level of L-lysine production in said strains-producents by not less than 9% in comparison with parential strains-producents of L-lysine.
3 cl, 1 tbl, 3 ex

Description

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения L-лизина, с использованием модифицированной коринеформной бактерии, содержащей мутантный ген fusA, кодирующий фактор элонгации G.The invention relates to biotechnology, in particular to a method for producing L-lysine, using a modified coryneform bacterium containing a mutant fusA gene encoding an elongation factor G.

Незаменимую аминокислоту L-лизин, широко используемую в качестве кормовой добавки для животноводства и птицеводства, традиционно получают ферментацией сахаров с помощью коринеформных бактерий, таких как Corynebacterium glutamicum (US 3687810, US 3929571), Brevibacterium sp. (US 3687810, US 3929571, RU 2034921), а также кишечной палочки Escherichia coli (RU 2347807). Для увеличения продукции L-лизина, как правило, используют модифицированные (генетически измененные) штаммы бактерий с повышенной продуктивностью, полученные либо с помощью генетической инженерии, либо традиционными селекционными методами.The essential amino acid L-lysine, widely used as a feed additive for livestock and poultry farming, is traditionally obtained by fermentation of sugars using coryneform bacteria, such as Corynebacterium glutamicum (US 3687810, US 3929571), Brevibacterium sp. (US 3687810, US 3929571, RU 2034921), as well as Escherichia coli Escherichia coli (RU 2347807). To increase the production of L-lysine, as a rule, modified (genetically modified) strains of bacteria with increased productivity are obtained, obtained either using genetic engineering or traditional breeding methods.

Одним из подходов к повышению продуктивности штаммов является получение мутантных штаммов, устойчивых к антибиотикам. Известны способы получения L-лизина, в которых используют бактерии, устойчивые к антибиотикам рифампицину (US 4623623), стрептомицину (US 3929571, US 4623623), канамицину (US 7736880, US 8361758) или одновременно к нескольким антибиотикам (US 3687810, US 4623623). Как правило, у бактерий, устойчивых к перечисленным выше антибиотикам, наблюдают изменения в системах транскрипции и трансляции, что и является причиной повышения продукции L-лизина.One approach to increasing the productivity of strains is to obtain mutant strains resistant to antibiotics. Known methods for producing L-lysine, which use bacteria that are resistant to antibiotics rifampicin (US 4,623,623), streptomycin (US 3,929,571, US 4,623,623), kanamycin (US 7736880, US 8361758) or simultaneously to several antibiotics (US 3687810, US 4623623) . As a rule, in bacteria resistant to the antibiotics listed above, changes in transcription and translation systems are observed, which is the reason for the increase in L-lysine production.

Недавно предложен способ получения L-лизина с использованием мутантных штаммов Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-11609 или Brevibacterium flavum ВКПМ В-11404, Brevibacterium flavum ВКПМ В-11635, устойчивых к фузидиновой кислоте (RU 2549690). Природа мутаций устойчивости к фузидиновой кислоте в штаммах Corynebacterium glutamicum или Brevibacterium flavum, приводящих к повышенной продуктивности по L-лизину, не известна.Recently, a method for producing L-lysine using mutant strains of Corynebacterium glutamicum VKPM B-11609 or Brevibacterium flavum VKPM B-11404, Brevibacterium flavum VKPM B-11635 resistant to fusidic acid (RU 2549690) has been recently proposed. The nature of mutations of resistance to fusidic acid in strains of Corynebacterium glutamicum or Brevibacterium flavum, leading to increased L-lysine productivity, is not known.

Задачами настоящего изобретения являются повышение продуктивности штаммов-продуцентов L-лизина, принадлежащих к роду Corynebacterium или роду Brevibacterium, и разработка способа получения L-лизина с использованием этих штаммов.The objectives of the present invention are to increase the productivity of producer strains of L-lysine belonging to the genus Corynebacterium or the genus Brevibacterium, and to develop a method for producing L-lysine using these strains.

Задачи решены путем:The tasks are solved by:

- получения L-лизин-продуцирующей бактерии, принадлежащей к роду Corynebacterium или роду Brevibacterium и модифицированной таким образом, что в аминокислотной последовательности продукта гена fusA в 461 положении аминокислотный остаток гистидина заменен на аминокислотный остаток глутамина.- obtaining L-lysine-producing bacteria belonging to the genus Corynebacterium or the genus Brevibacterium and modified in such a way that in the amino acid sequence of the product of the fusA gene at the 461 position, the amino acid residue of histidine is replaced by the amino acid residue of glutamine.

- разработки способа получения L-лизина, включающего культивирование заявляемой бактерии в подходящих условиях и выделение указанной L-аминокислоты из культуральной жидкости.- development of a method for producing L-lysine, including culturing the inventive bacterium under suitable conditions and isolating said L-amino acid from the culture fluid.

Задачи настоящего изобретения решены благодаря обнаружению того факта, что штаммы Corynebacterium или Brevibacterium, устойчивые к фузидиновой кислоте, обладают более высокой продуктивностью по L-лизину, если они содержат специфическую мутацию в гене fusA, кодирующем фактор элонгации G.The objectives of the present invention are solved by the discovery of the fact that strains of Corynebacterium or Brevibacterium resistant to fusidic acid have higher L-lysine productivity if they contain a specific mutation in the fusA gene encoding the elongation factor G.

В соответствии с настоящим описанием изобретения в качестве бактерии может быть использована коринеформная бактерия, продуцирующая L-лизин, при этом бактерия модифицирована таким образом, что содержит специфические мутации в гене fusA, приводящие к образованию в клетке измененного фактора элонгации G (продукт гена fusA), в аминокислотной последовательности которого в 461 положении аминокислотный остаток гистидина заменен на аминокислотный остаток глутамина.In accordance with the present description of the invention, a coryneform bacterium producing L-lysine can be used as a bacterium, the bacterium being modified in such a way as to contain specific mutations in the fusA gene, leading to the formation of an altered elongation factor G in the cell (fusA gene product), in the amino acid sequence of which at position 461 the amino acid residue of histidine is replaced by the amino acid residue of glutamine.

Термин «коринеформная бактерия», согласно настоящему изобретению, обозначает бактерии рода Corynebacterium и бактерии рода Brevibacterium, часть которых в настоящее время классифицируют как бактерии рода Corynebacterium (W.Liebl, et al, 1991).The term "coryneform bacterium" according to the present invention refers to bacteria of the genus Corynebacterium and bacteria of the genus Brevibacterium, some of which are currently classified as bacteria of the genus Corynebacterium (W. Liebl, et al, 1991).

В качестве примеров коринеформной бактерии можно привести, но не ограничиться этим, штаммы Corynebacterium glutamicum АТСС13032 (депонирован в американской коллекции типовых культур), Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-11608 и Brevibacterium flavum ВКПМ В-5593, депонированные во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов, ВКПМ.Examples of the coryneform bacterium include, but are not limited to, strains of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (deposited in the American type culture collection), Corynebacterium glutamicum VKPM B-11608 and Brevibacterium flavum VKPM B-5593, deposited in the All-Russian microorganism collection.

Термин «бактерия, способная продуцировать L-лизин» означает бактерию, способную накапливать L-лизин в культуральной среде в больших количествах по сравнению с природным или родительским штаммом Corynebacterium glutamicum АТСС 13032 или Brevibacterium flavum ВКПМ В-5593.The term "bacterium capable of producing L-lysine" means a bacterium capable of accumulating L-lysine in the culture medium in large quantities in comparison with the natural or parental strain of Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 or Brevibacterium flavum VKPM B-5593.

Термин «бактерия содержит специфические мутации в гене fusA» означает, что бактерия модифицирована таким образом, что нуклеотидная последовательность гена fusA из Corynebacterium glutamicum ATCC13032 или Brevibacterium flavum ВКПМ B-5593 (SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, соответственно) в положении 1383 вместо цитозина содержит гуанин или аденин, что в свою очередь приводит к образованию в клетках Corynebacterium glutamicum или Brevibacterium flavum измененного фактора элонгации G (продукт гена fusA), в аминокислотной последовательности которого в 461 положении аминокислотный остаток гистидина заменен на аминокислотный остаток глутамина (SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4).The term “bacterium contains specific mutations in the fusA gene” means that the bacterium is modified so that the nucleotide sequence of the fusA gene from Corynebacterium glutamicum ATCC13032 or Brevibacterium flavum VKPM B-5593 (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, respectively) in position 1383 instead of cytosine contains guanine or adenine, which in turn leads to the formation of altered elongation factor G (product of the fusA gene) in Corynebacterium glutamicum or Brevibacterium flavum cells, in the amino acid sequence of which at the 461 position the amino acid residue of histidine is replaced by aminokis glutamine residue (SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4).

Наличие замен в гене fusA в бактериальной хромосоме определяют при помощи известных методов, например, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и секвенирования.The presence of substitutions in the fusA gene in the bacterial chromosome is determined using known methods, for example, by polymerase chain reaction (PCR) and sequencing.

Нуклеотидные последовательности гена в различных видах и штаммах коринеформных бактерии могут незначительно отличаться, поэтому нуклеотидные последовательности гена fusA не ограничиваются нуклеотидными последовательностями генов, приведенных в SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, однако могут включать гены, гомологичные нуклеотидным последовательностям SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, кодирующие варианты белка EF-G, продукта гена fusA.The nucleotide sequences of the gene in different types and strains of coryneform bacteria may vary slightly, therefore the nucleotide sequences of the fusA gene are not limited to the nucleotide sequences of the genes shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, but may include genes homologous to the nucleotide sequences of SEQ ID NO : 1 and SEQ ID NO: 2 encoding variants of the EF-G protein, fusA gene product.

Направленное введение замен в положении 1383 нуклеотидной последовательности гена fusA в хромосоме может быть осуществлено с помощью известных методов генной инженерии, в частности метода замещения, основанного на гомологичной рекомбинации (

Figure 00000001
A. et al, 1994).The targeted introduction of substitutions at position 1383 of the fusA gene nucleotide sequence on the chromosome can be carried out using known methods of genetic engineering, in particular, a substitution method based on homologous recombination (
Figure 00000001
A. et al, 1994).

С помощью ПЦР получают мутантный ген fusA, содержащий замены в положении 1383 и бактерию для ее модификации трансформируют фрагментом ДНК, содержащим мутантный ген. Затем исходный ген на хромосоме замещают мутантным геном с помощью гомологичной рекомбинации, и полученный штамм отбирают. Замещение гена с использованием гомологичной рекомбинации может быть проведено с использованием плазмиды, не способной к автономному поддержанию в клетке хозяина.Using PCR, the fusA mutant gene is obtained, containing substitutions at position 1383, and the bacterium is transformed with a DNA fragment containing the mutant gene to modify it. Then, the original gene on the chromosome is replaced by the mutant gene using homologous recombination, and the resulting strain is selected. Substitution of a gene using homologous recombination can be carried out using a plasmid incapable of autonomously maintaining in the host cell.

Способ в общем виде согласно настоящему изобретениюGeneral method according to the present invention

Способом согласно настоящему изобретению является способ получения L-лизина, включающий стадии выращивания L-лизин-продуцирующей коринеформной бактерии с мутантным геном fusA в питательной среде с целью продукции и накопления L-лизина в питательной среде и выделения L-лизина из культуральной жидкости.The method according to the present invention is a method for producing L-lysine, comprising the steps of growing an L-lysine-producing coryneform bacterium with a mutant fusA gene in a culture medium in order to produce and accumulate L-lysine in the culture medium and isolate L-lysine from the culture fluid.

В качестве питательной среды для культивирования используют минеральную среду, включающую фосфаты натрия или калия, соли магния, а при необходимости соли марганца и железа, и содержащую в качестве источника углерода глюкозу или глюкозные сиропы или сахарозу, в качестве источника азота - аммонийные соли или мочевину, а также необходимые для роста аминокислоты и витамины. В качестве компонентов, ускоряющих рост бактерий, дополнительно добавляют кукурузный экстракт или гидролизаты глютена или сои. Культивирование бактерий проводят при 24-42°С, преимущественно при 30-32°С, и рН среды в интервале 6,0-8,5, преимущественно в интервале 6,8-7,2.As a culture medium, a mineral medium is used, including sodium or potassium phosphates, magnesium salts, and, if necessary, manganese and iron salts, and containing glucose or glucose syrups or sucrose as a carbon source, ammonium salts or urea as a nitrogen source, as well as amino acids and vitamins necessary for growth. As components that accelerate the growth of bacteria, corn extract or gluten or soy hydrolysates are additionally added. The cultivation of bacteria is carried out at 24-42 ° C, mainly at 30-32 ° C, and the pH of the medium in the range of 6.0-8.5, mainly in the range of 6.8-7.2.

Культивирование бактерий осуществляют в пробирках, колбах или специальных реакторах при аэробных условиях.The cultivation of bacteria is carried out in test tubes, flasks or special reactors under aerobic conditions.

Примеры осуществления настоящего изобретенияExamples of the implementation of the present invention

Пример 1. Конструирование штамма Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-12500, содержащего мутантный ген fusAExample 1. Construction of a strain of Corynebacterium glutamicum VKPM B-12500 containing the mutant fusA gene

Штамм Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-12500 был сконструирован путем замены нативного гена fusA (SEQ ID NO: 1) мутантной копией гена, в нуклеотидной последовательности которого в положении 1383 остаток цитозина заменен на остаток гуанина. Для этого с помощью ПЦР была получена мутантная копия гена fusA с заменой в положении 1383 остатка цитозина на остаток гуанина, которая была вставлена в плазмиду pIKA, полученную путем клонирования на векторе pUC19 ("Thermo scientific"), гена sacB из B.subtilis 168 (NC_000964, Accession Number X02730) и гена KmR. Так как плазмида pIKA-fusA-C1383G не способна автономно поддерживаться в клетках Corynebacterium glutamicum, то после введения плазмиды с помощью электропорации в клетки С. glutamicum ВКПМ В-11608, были отобраны клоны, в хромосоме которых в результате двух циклов гомологичной рекомбинации происходило замещения нативного гена fusA мутантной копией гена fusA-C1383G. Наличие замены в гене fusA подтверждали с помощью ПЦР анализа с SNP-полимеразой и секвенирования. Полученный штамм Corynebacterium glutamicum с мутантным геном fusA-C1383G депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ГосНИИгенетика как Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-12500.The strain Corynebacterium glutamicum VKPM B-12500 was constructed by replacing the native fusA gene (SEQ ID NO: 1) with a mutant copy of the gene, in the nucleotide sequence of which at position 1383 the cytosine residue was replaced with the guanine residue. For this, a mutant copy of the fusA gene was obtained by PCR with the replacement of the cytosine residue at position 1383 with the guanine residue, which was inserted into the pIKA plasmid obtained by cloning on pUC19 vector ("Thermo scientific"), the sacB gene from B. subtilis 168 ( NC_000964, Accession Number X02730) and the Km R gene. Since the plasmid pIKA-fusA-C1383G is not able to autonomously maintain in Corynebacterium glutamicum cells, after the introduction of the plasmid by electroporation into C. glutamicum VKPM B-11608 cells, clones were selected whose chromosome was replaced by two cycles of homologous recombination fusA gene mutant copy of the fusA-C1383G gene. The presence of a substitution in the fusA gene was confirmed by PCR analysis with SNP polymerase and sequencing. The obtained strain of Corynebacterium glutamicum with the fusA-C1383G mutant gene was deposited in the All-Russian collection of industrial microorganisms of the State Research Institute of Genetics as Corynebacterium glutamicum VKPM B-12500.

Пример 2. Конструирование штамма Brevibacterium flavum ВКПМ В-12501, содержащего мутантный ген fusAExample 2. Construction of a strain of Brevibacterium flavum VKPM B-12501 containing the mutant fusA gene

Штамм Brevibacterium flavum ВКПМ В-12501 был сконструирован путем замены нативного гена fusA (SEQ ID NO: 2) мутантной копией гена, в нуклеотидной последовательности которого в положении 1383 остаток цитозина заменен на остаток гуанина. Для этого с помощью ПЦР была получена мутантная копия гена fusA с заменой в положении 1383 остатка цитозина на остаток гуанина, которая была вставлена в плазмиду pIKA, полученную путем клонирования на векторе pUC19 ("Thermo scientific"), гена sacB из B.subtilis 168 (NC_000964, Accession Number X02730) и гена KmR. Так как плазмида pIKA-fusA-C1383G не способна автономно поддерживаться в клетках Brevibacterium flavum, то после введения плазмиды с помощью электропорации в клетки Brevibacterium flavum ВКПМ В-5593, были отобраны клоны, в хромосоме которых в результате двух циклов гомологичной рекомбинации происходило замещения нативного гена fusA мутантной копией гена fusA-C1383G. Наличие замены в гене fusA подтверждали с помощью ПЦР анализа с SNP-полимеразой и секвенирования. Полученный штамм Brevibacterium flavum с мутантным геном fusA-C1383G был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ГосНИИгенетика как Brevibacterium flavum ВКПМ В-12501.The strain Brevibacterium flavum VKPM B-12501 was constructed by replacing the native fusA gene (SEQ ID NO: 2) with a mutant copy of the gene, in the nucleotide sequence of which at position 1383 the cytosine residue was replaced by the guanine residue. For this, a mutant copy of the fusA gene was obtained by PCR with the replacement of the cytosine residue at position 1383 with the guanine residue, which was inserted into the pIKA plasmid obtained by cloning on pUC19 vector ("Thermo scientific"), the sacB gene from B. subtilis 168 ( NC_000964, Accession Number X02730) and the Km R gene. Since the plasmid pIKA-fusA-C1383G is not able to autonomously maintain in Brevibacterium flavum cells, after the plasmid was introduced by electroporation into Brevibacterium flavum VKPM B-5593 cells, clones were selected whose chromosome resulted in the replacement of two gene after two cycles of homologous recombination fusA mutant copy of the fusA-C1383G gene. The presence of a substitution in the fusA gene was confirmed by PCR analysis with SNP polymerase and sequencing. The resulting Brevibacterium flavum strain with the fusA-C1383G mutant gene was deposited at the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms of the State Research Institute of Genetics as Brevibacterium flavum VKPM B-12501.

Пример 3. Продукция L-лизина полученными штаммамиExample 3. The production of L-lysine obtained strains

Оценку проводят в пробирочных тестах. Для этого 0,3 мл культуры каждого из сконструированных штаммов, предварительно выращенных в течение 22 ч с перемешиванием (240 об/мин) при 30°С, вносят в пробирки с 3 мл среды следующего состава (мас. %): глюкоза - 10,0 хлорид аммония - 2,5, фосфат калия однозамещенный - 0,1, сульфат магния семиводный - 0,1, мел - 2,5, биотин - 0,00001, тиамин - 0,00002, с добавлением кислотного гидролизата пшеничного глютена* 50,0 мл/л, вода - остальное. *Гидролизат пшеничного глютена получают путем гидролиза пшеничного глютена серной кислотой согласно известным способам гидролиза различного сырья с целью получения источника ростовых факторов при микробиологическом производстве аминокислот (Биотехнология и биоинженерия, Рига, 1978). Перед внесением в среду гидролизат нейтрализуют концентрированным аммиаком. В качестве штаммов сравнения используют родительские штаммы Brevibacterium flavum ВКПМ В-5593 и Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-11608.Evaluation is carried out in vitro tests. For this, 0.3 ml of the culture of each of the constructed strains, previously grown for 22 hours with stirring (240 rpm) at 30 ° C, is introduced into test tubes with 3 ml of medium of the following composition (wt.%): Glucose - 10, 0 ammonium chloride - 2.5, potassium phosphate monosubstituted - 0.1, magnesium sulphate - 0.1, chalk - 2.5, biotin - 0.00001, thiamine - 0.00002, with the addition of wheat gluten acid hydrolyzate * 50 , 0 ml / l, water - the rest. * Wheat gluten hydrolyzate is obtained by hydrolysis of wheat gluten with sulfuric acid according to known methods of hydrolysis of various raw materials in order to obtain a source of growth factors in the microbiological production of amino acids (Biotechnology and Bioengineering, Riga, 1978). Before entering the medium, the hydrolyzate is neutralized with concentrated ammonia. Parent strains of Brevibacterium flavum VKPM B-5593 and Corynebacterium glutamicum VKPM B-11608 are used as comparison strains.

Пробирки с культурами инкубируют в течение 48 ч с перемешиванием (250 об/мин) при 30°С и затем в культуральной жидкости определяют содержание L-лизина методом тонкослойной хроматографии. Результаты представлены в таблице.Tubes with cultures are incubated for 48 hours with stirring (250 rpm) at 30 ° C and then the content of L-lysine is determined in the culture fluid by thin layer chromatography. The results are presented in the table.

Figure 00000002
Figure 00000002

Из результатов, представленных в таблице, следует, что штаммы Brevibacterium flavum ВКПМ В-12501 и Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-12500, содержащие мутантный ген fusA, продуцируют на 9-18% больше лизина, чем родительские штаммы.From the results presented in the table, it follows that the strains of Brevibacterium flavum VKPM B-12501 and Corynebacterium glutamicum VKPM B-12500 containing the mutant fusA gene produce 9-18% more lysine than the parent strains.

Список источников информацииList of sources of information

1. US 36878101. US 3687810

2. US 39295712. US 3929571

3. US 36878103. US 3687810

4. US 39295714. US 3929571

5. RU 20349215. RU 2034921

6. RU 23478076. RU 2347807

7. US 46236237. US 4,623,623

8. US 39295718. US 3929571

9. US 77368809. US 7736880

10. US 836175810. US 8361758

11. RU 254969011. RU 2549690

12. W. Liebl, M. Ehrmann, W. Ludwig and K.H. Schleifer. "Transfer of Brevibacterium divaricatum DSM 20297T, "Brevibacterium flavum" DSM 20411, "Brevibacterium lactofermentum" DSM 20412 and DSM 1412, and Corynebacterium lilium DSM 20137T to Corynebacterium glutamicum and Their Distinction by rRNA Gene Restriction Patterns» International Journal of Systematic Bacteriology - 1991. - V. 41. - P. 255-260.12. W. Liebl, M. Ehrmann, W. Ludwig and KH Schleifer. "Transfer of Brevibacterium divaricatum DSM 20297 T ," Brevibacterium flavum "DSM 20411," Brevibacterium lactofermentum "DSM 20412 and DSM 1412, and Corynebacterium lilium DSM 20137 T to Corynebacterium glutamicum and Their Distinctivity Distraction 1991. - V. 41. - P. 255-260.

13.

Figure 00000003
Α., Tauch Α.,
Figure 00000004
W., Kalinowski J., Thierbach G., and
Figure 00000005
A. "Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the E.coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum."// Gene. - 1994. - V.145. P. - 69-73.)13.
Figure 00000003
Α., Tauch Α.,
Figure 00000004
W., Kalinowski J., Thierbach G., and
Figure 00000005
A. "Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the E. coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum." // Gene. - 1994 .-- V.145. P. - 69-73.)

14. Биотехнология и биоинженерия, Рига, 1978.14. Biotechnology and bioengineering, Riga, 1978.

Claims (3)

1. L-Лизин-продуцирующая бактерия, принадлежащая к роду Corynebacterium и модифицированная таким образом, что в аминокислотной последовательности продукта мутантного гена fusA в 461 положении аминокислотный остаток гистидина заменен на аминокислотный остаток глутамина.1. L-Lysine-producing bacterium belonging to the genus Corynebacterium and modified so that in the amino acid sequence of the product of the mutant fusA gene at the 461 position, the amino acid residue of histidine is replaced by the amino acid residue of glutamine. 2. L-Лизин-продуцирующая бактерия, принадлежащая к роду Brevibacterium и модифицированная таким образом, что в аминокислотной последовательности продукта мутантного гена fusA в 461 положении аминокислотный остаток гистидина заменен на аминокислотный остаток глутамина.2. L-Lysine-producing bacterium belonging to the genus Brevibacterium and modified so that in the amino acid sequence of the product of the mutant fusA gene at the 461 position, the amino acid residue of histidine is replaced by the amino acid residue of glutamine. 3. Способ получения L-лизина, включающий культивирование бактерии по п. 1 или п. 2 в подходящих условиях и выделение указанной L-аминокислоты из культуральной жидкости.3. A method for producing L-lysine, comprising culturing a bacterium according to claim 1 or claim 2 under suitable conditions and isolating said L-amino acid from the culture fluid.
RU2015156336A 2015-12-28 2015-12-28 L-lysine-producing coryneform bacterium with mutant gene fusa and method for obtaining l-lysine with application thereof RU2612159C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015156336A RU2612159C1 (en) 2015-12-28 2015-12-28 L-lysine-producing coryneform bacterium with mutant gene fusa and method for obtaining l-lysine with application thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015156336A RU2612159C1 (en) 2015-12-28 2015-12-28 L-lysine-producing coryneform bacterium with mutant gene fusa and method for obtaining l-lysine with application thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2612159C1 true RU2612159C1 (en) 2017-03-02

Family

ID=58459659

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2015156336A RU2612159C1 (en) 2015-12-28 2015-12-28 L-lysine-producing coryneform bacterium with mutant gene fusa and method for obtaining l-lysine with application thereof

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2612159C1 (en)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2000117837A (en) * 1999-07-07 2002-12-27 Дегусса Аг CORINEBACTERIA PRODUCING L-LYSINE AND METHOD FOR PRODUCING L-LYSINE
CN104212756A (en) * 2014-06-03 2014-12-17 江南大学 Construction method and application of over-expressing fusA genetic engineering bacterium
RU2549690C1 (en) * 2013-10-08 2015-04-27 Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") L-LYSINE PRODUCING Corynebacterium glutamicum OR Brevibacterium flavum BACTERIA, RESISTANT TO FUSIDIC ACID, AND METHOD FOR MICROBIOLOGICAL SYNTHESIS OF L-LYSINE USING SAME

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19931317A1 (en) * 1999-07-07 2001-01-11 Degussa L-lysine-producing coryneform bacteria and method for producing L-lysine

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2000117837A (en) * 1999-07-07 2002-12-27 Дегусса Аг CORINEBACTERIA PRODUCING L-LYSINE AND METHOD FOR PRODUCING L-LYSINE
RU2549690C1 (en) * 2013-10-08 2015-04-27 Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") L-LYSINE PRODUCING Corynebacterium glutamicum OR Brevibacterium flavum BACTERIA, RESISTANT TO FUSIDIC ACID, AND METHOD FOR MICROBIOLOGICAL SYNTHESIS OF L-LYSINE USING SAME
CN104212756A (en) * 2014-06-03 2014-12-17 江南大学 Construction method and application of over-expressing fusA genetic engineering bacterium

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2018226964A2 (en) Promoters from corynebacterium glutamicum and uses thereof in regulating ancillary gene expression
US8187842B2 (en) Altered glyoxylate shunt for improved production of aspartate-derived amino acids and chemicals
WO2017100376A2 (en) Promoters from corynebacterium glutamicum
CN101946002B (en) L-threonine producing escherichia coli and process for producing l-threonine using same
JP2017523787A (en) Feedback-resistant acetohydroxy acid synthase mutant and method for producing L-valine using the same
EP2841568B1 (en) Feedback-resistant alpha-isopropylmalate synthases
EP1725672A2 (en) Process for the production of l-amino acids using coryneform bacteria
JP5853695B2 (en) Method for producing cadaverine
US8119374B2 (en) Nucleotide sequences of coryneform bacteria coded for proteins participating in L-serine metabolism and method for microbial production of L-serine
CN107922955A (en) For producing the microorganism of putrescine or ornithine and producing the method for putrescine or ornithine using it
CN109517751A (en) The method of fermentation producing L-amino-acid
EP3498854B1 (en) Method for the fermentative production of l-lysine
WO2011129293A1 (en) Method for producing 1,5-pentanediamine
DK2089525T3 (en) OXYR GENETIC GENES FROM CORYNEFORM BACTERIA
WO2022017223A1 (en) Mutant of pyruvate carboxylase gene promoter and use thereof
WO2012077744A1 (en) Method for producing cadaverine
US20160244490A1 (en) Microorganism and Method for the Fermentative Production of an Organic-Chemical Compound
US20200017893A1 (en) Method for the fermentative production of L-lysine
CN111334534A (en) Method for the fermentative production of L-lysine using a strain of Corynebacterium glutamicum having a mutated Kup transporter
RU2612159C1 (en) L-lysine-producing coryneform bacterium with mutant gene fusa and method for obtaining l-lysine with application thereof
US20240271084A1 (en) Microorganism strain and method for antibiotic-free plasmid-based fermentation
JPWO2012077741A1 (en) Method for producing cadaverine
RU2639247C1 (en) L-lysin-producing coryneformic bacterium with inactive ltbr genome and method for obtaining of l-lysin using this bacterium
CN111471631A (en) Process for the fermentative production of L-lysine
EP3660158A1 (en) Method for the fermentative production of l-lysine

Legal Events

Date Code Title Description
PD4A Correction of name of patent owner