RU2612159C1

RU2612159C1 - L-lysine-producing coryneform bacterium with mutant gene fusa and method for obtaining l-lysine with application thereof

Info

Publication number: RU2612159C1
Application number: RU2015156336A
Authority: RU
Inventors: Ирина Петровна Токмакова; Людмила Евгеньевна Рябченко; Татьяна Васильевна Герасимова; Александр Степанович Яненко
Priority date: 2015-12-28
Filing date: 2015-12-28
Publication date: 2017-03-02

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: group of the inventions relates to field of biotechnology. Claimed is L-lysine-producing bacterium of genus Corynebacterium, modified in such a way that amino acid substitution H461Q is contained in amino acid sequence of product of mutant gene fusA. Claimed is L-lysine-producing bacterium of genus Brevibacterium, modified in such a way that amino acid substitution H461Q is contained in amino acid sequence of product of mutant gene fusA. Claimed is method for obtaining L-lysine, which includes cultivation of any of said modified bacteria.

EFFECT: group of inventions makes it possible to increase level of L-lysine production in said strains-producents by not less than 9% in comparison with parential strains-producents of L-lysine.

3 cl, 1 tbl, 3 ex

Description

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения L-лизина, с использованием модифицированной коринеформной бактерии, содержащей мутантный ген fusA, кодирующий фактор элонгации G.The invention relates to biotechnology, in particular to a method for producing L-lysine, using a modified coryneform bacterium containing a mutant fusA gene encoding an elongation factor G.

Незаменимую аминокислоту L-лизин, широко используемую в качестве кормовой добавки для животноводства и птицеводства, традиционно получают ферментацией сахаров с помощью коринеформных бактерий, таких как Corynebacterium glutamicum (US 3687810, US 3929571), Brevibacterium sp. (US 3687810, US 3929571, RU 2034921), а также кишечной палочки Escherichia coli (RU 2347807). Для увеличения продукции L-лизина, как правило, используют модифицированные (генетически измененные) штаммы бактерий с повышенной продуктивностью, полученные либо с помощью генетической инженерии, либо традиционными селекционными методами.The essential amino acid L-lysine, widely used as a feed additive for livestock and poultry farming, is traditionally obtained by fermentation of sugars using coryneform bacteria, such as Corynebacterium glutamicum (US 3687810, US 3929571), Brevibacterium sp. (US 3687810, US 3929571, RU 2034921), as well as Escherichia coli Escherichia coli (RU 2347807). To increase the production of L-lysine, as a rule, modified (genetically modified) strains of bacteria with increased productivity are obtained, obtained either using genetic engineering or traditional breeding methods.

Одним из подходов к повышению продуктивности штаммов является получение мутантных штаммов, устойчивых к антибиотикам. Известны способы получения L-лизина, в которых используют бактерии, устойчивые к антибиотикам рифампицину (US 4623623), стрептомицину (US 3929571, US 4623623), канамицину (US 7736880, US 8361758) или одновременно к нескольким антибиотикам (US 3687810, US 4623623). Как правило, у бактерий, устойчивых к перечисленным выше антибиотикам, наблюдают изменения в системах транскрипции и трансляции, что и является причиной повышения продукции L-лизина.One approach to increasing the productivity of strains is to obtain mutant strains resistant to antibiotics. Known methods for producing L-lysine, which use bacteria that are resistant to antibiotics rifampicin (US 4,623,623), streptomycin (US 3,929,571, US 4,623,623), kanamycin (US 7736880, US 8361758) or simultaneously to several antibiotics (US 3687810, US 4623623) . As a rule, in bacteria resistant to the antibiotics listed above, changes in transcription and translation systems are observed, which is the reason for the increase in L-lysine production.

Недавно предложен способ получения L-лизина с использованием мутантных штаммов Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-11609 или Brevibacterium flavum ВКПМ В-11404, Brevibacterium flavum ВКПМ В-11635, устойчивых к фузидиновой кислоте (RU 2549690). Природа мутаций устойчивости к фузидиновой кислоте в штаммах Corynebacterium glutamicum или Brevibacterium flavum, приводящих к повышенной продуктивности по L-лизину, не известна.Recently, a method for producing L-lysine using mutant strains of Corynebacterium glutamicum VKPM B-11609 or Brevibacterium flavum VKPM B-11404, Brevibacterium flavum VKPM B-11635 resistant to fusidic acid (RU 2549690) has been recently proposed. The nature of mutations of resistance to fusidic acid in strains of Corynebacterium glutamicum or Brevibacterium flavum, leading to increased L-lysine productivity, is not known.

Задачами настоящего изобретения являются повышение продуктивности штаммов-продуцентов L-лизина, принадлежащих к роду Corynebacterium или роду Brevibacterium, и разработка способа получения L-лизина с использованием этих штаммов.The objectives of the present invention are to increase the productivity of producer strains of L-lysine belonging to the genus Corynebacterium or the genus Brevibacterium, and to develop a method for producing L-lysine using these strains.

Задачи решены путем:The tasks are solved by:

- получения L-лизин-продуцирующей бактерии, принадлежащей к роду Corynebacterium или роду Brevibacterium и модифицированной таким образом, что в аминокислотной последовательности продукта гена fusA в 461 положении аминокислотный остаток гистидина заменен на аминокислотный остаток глутамина.- obtaining L-lysine-producing bacteria belonging to the genus Corynebacterium or the genus Brevibacterium and modified in such a way that in the amino acid sequence of the product of the fusA gene at the 461 position, the amino acid residue of histidine is replaced by the amino acid residue of glutamine.

- разработки способа получения L-лизина, включающего культивирование заявляемой бактерии в подходящих условиях и выделение указанной L-аминокислоты из культуральной жидкости.- development of a method for producing L-lysine, including culturing the inventive bacterium under suitable conditions and isolating said L-amino acid from the culture fluid.

Задачи настоящего изобретения решены благодаря обнаружению того факта, что штаммы Corynebacterium или Brevibacterium, устойчивые к фузидиновой кислоте, обладают более высокой продуктивностью по L-лизину, если они содержат специфическую мутацию в гене fusA, кодирующем фактор элонгации G.The objectives of the present invention are solved by the discovery of the fact that strains of Corynebacterium or Brevibacterium resistant to fusidic acid have higher L-lysine productivity if they contain a specific mutation in the fusA gene encoding the elongation factor G.

В соответствии с настоящим описанием изобретения в качестве бактерии может быть использована коринеформная бактерия, продуцирующая L-лизин, при этом бактерия модифицирована таким образом, что содержит специфические мутации в гене fusA, приводящие к образованию в клетке измененного фактора элонгации G (продукт гена fusA), в аминокислотной последовательности которого в 461 положении аминокислотный остаток гистидина заменен на аминокислотный остаток глутамина.In accordance with the present description of the invention, a coryneform bacterium producing L-lysine can be used as a bacterium, the bacterium being modified in such a way as to contain specific mutations in the fusA gene, leading to the formation of an altered elongation factor G in the cell (fusA gene product), in the amino acid sequence of which at position 461 the amino acid residue of histidine is replaced by the amino acid residue of glutamine.

Термин «коринеформная бактерия», согласно настоящему изобретению, обозначает бактерии рода Corynebacterium и бактерии рода Brevibacterium, часть которых в настоящее время классифицируют как бактерии рода Corynebacterium (W.Liebl, et al, 1991).The term "coryneform bacterium" according to the present invention refers to bacteria of the genus Corynebacterium and bacteria of the genus Brevibacterium, some of which are currently classified as bacteria of the genus Corynebacterium (W. Liebl, et al, 1991).

В качестве примеров коринеформной бактерии можно привести, но не ограничиться этим, штаммы Corynebacterium glutamicum АТСС13032 (депонирован в американской коллекции типовых культур), Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-11608 и Brevibacterium flavum ВКПМ В-5593, депонированные во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов, ВКПМ.Examples of the coryneform bacterium include, but are not limited to, strains of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (deposited in the American type culture collection), Corynebacterium glutamicum VKPM B-11608 and Brevibacterium flavum VKPM B-5593, deposited in the All-Russian microorganism collection.

Термин «бактерия, способная продуцировать L-лизин» означает бактерию, способную накапливать L-лизин в культуральной среде в больших количествах по сравнению с природным или родительским штаммом Corynebacterium glutamicum АТСС 13032 или Brevibacterium flavum ВКПМ В-5593.The term "bacterium capable of producing L-lysine" means a bacterium capable of accumulating L-lysine in the culture medium in large quantities in comparison with the natural or parental strain of Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 or Brevibacterium flavum VKPM B-5593.

Термин «бактерия содержит специфические мутации в гене fusA» означает, что бактерия модифицирована таким образом, что нуклеотидная последовательность гена fusA из Corynebacterium glutamicum ATCC13032 или Brevibacterium flavum ВКПМ B-5593 (SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, соответственно) в положении 1383 вместо цитозина содержит гуанин или аденин, что в свою очередь приводит к образованию в клетках Corynebacterium glutamicum или Brevibacterium flavum измененного фактора элонгации G (продукт гена fusA), в аминокислотной последовательности которого в 461 положении аминокислотный остаток гистидина заменен на аминокислотный остаток глутамина (SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4).The term “bacterium contains specific mutations in the fusA gene” means that the bacterium is modified so that the nucleotide sequence of the fusA gene from Corynebacterium glutamicum ATCC13032 or Brevibacterium flavum VKPM B-5593 (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, respectively) in position 1383 instead of cytosine contains guanine or adenine, which in turn leads to the formation of altered elongation factor G (product of the fusA gene) in Corynebacterium glutamicum or Brevibacterium flavum cells, in the amino acid sequence of which at the 461 position the amino acid residue of histidine is replaced by aminokis glutamine residue (SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4).

Наличие замен в гене fusA в бактериальной хромосоме определяют при помощи известных методов, например, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и секвенирования.The presence of substitutions in the fusA gene in the bacterial chromosome is determined using known methods, for example, by polymerase chain reaction (PCR) and sequencing.

Нуклеотидные последовательности гена в различных видах и штаммах коринеформных бактерии могут незначительно отличаться, поэтому нуклеотидные последовательности гена fusA не ограничиваются нуклеотидными последовательностями генов, приведенных в SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, однако могут включать гены, гомологичные нуклеотидным последовательностям SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, кодирующие варианты белка EF-G, продукта гена fusA.The nucleotide sequences of the gene in different types and strains of coryneform bacteria may vary slightly, therefore the nucleotide sequences of the fusA gene are not limited to the nucleotide sequences of the genes shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, but may include genes homologous to the nucleotide sequences of SEQ ID NO : 1 and SEQ ID NO: 2 encoding variants of the EF-G protein, fusA gene product.

Направленное введение замен в положении 1383 нуклеотидной последовательности гена fusA в хромосоме может быть осуществлено с помощью известных методов генной инженерии, в частности метода замещения, основанного на гомологичной рекомбинации (

A. et al, 1994).The targeted introduction of substitutions at position 1383 of the fusA gene nucleotide sequence on the chromosome can be carried out using known methods of genetic engineering, in particular, a substitution method based on homologous recombination (

A. et al, 1994).

С помощью ПЦР получают мутантный ген fusA, содержащий замены в положении 1383 и бактерию для ее модификации трансформируют фрагментом ДНК, содержащим мутантный ген. Затем исходный ген на хромосоме замещают мутантным геном с помощью гомологичной рекомбинации, и полученный штамм отбирают. Замещение гена с использованием гомологичной рекомбинации может быть проведено с использованием плазмиды, не способной к автономному поддержанию в клетке хозяина.Using PCR, the fusA mutant gene is obtained, containing substitutions at position 1383, and the bacterium is transformed with a DNA fragment containing the mutant gene to modify it. Then, the original gene on the chromosome is replaced by the mutant gene using homologous recombination, and the resulting strain is selected. Substitution of a gene using homologous recombination can be carried out using a plasmid incapable of autonomously maintaining in the host cell.

Способ в общем виде согласно настоящему изобретениюGeneral method according to the present invention

Способом согласно настоящему изобретению является способ получения L-лизина, включающий стадии выращивания L-лизин-продуцирующей коринеформной бактерии с мутантным геном fusA в питательной среде с целью продукции и накопления L-лизина в питательной среде и выделения L-лизина из культуральной жидкости.The method according to the present invention is a method for producing L-lysine, comprising the steps of growing an L-lysine-producing coryneform bacterium with a mutant fusA gene in a culture medium in order to produce and accumulate L-lysine in the culture medium and isolate L-lysine from the culture fluid.

В качестве питательной среды для культивирования используют минеральную среду, включающую фосфаты натрия или калия, соли магния, а при необходимости соли марганца и железа, и содержащую в качестве источника углерода глюкозу или глюкозные сиропы или сахарозу, в качестве источника азота - аммонийные соли или мочевину, а также необходимые для роста аминокислоты и витамины. В качестве компонентов, ускоряющих рост бактерий, дополнительно добавляют кукурузный экстракт или гидролизаты глютена или сои. Культивирование бактерий проводят при 24-42°С, преимущественно при 30-32°С, и рН среды в интервале 6,0-8,5, преимущественно в интервале 6,8-7,2.As a culture medium, a mineral medium is used, including sodium or potassium phosphates, magnesium salts, and, if necessary, manganese and iron salts, and containing glucose or glucose syrups or sucrose as a carbon source, ammonium salts or urea as a nitrogen source, as well as amino acids and vitamins necessary for growth. As components that accelerate the growth of bacteria, corn extract or gluten or soy hydrolysates are additionally added. The cultivation of bacteria is carried out at 24-42 ° C, mainly at 30-32 ° C, and the pH of the medium in the range of 6.0-8.5, mainly in the range of 6.8-7.2.

Культивирование бактерий осуществляют в пробирках, колбах или специальных реакторах при аэробных условиях.The cultivation of bacteria is carried out in test tubes, flasks or special reactors under aerobic conditions.

Примеры осуществления настоящего изобретенияExamples of the implementation of the present invention

Пример 1. Конструирование штамма Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-12500, содержащего мутантный ген fusAExample 1. Construction of a strain of Corynebacterium glutamicum VKPM B-12500 containing the mutant fusA gene

Штамм Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-12500 был сконструирован путем замены нативного гена fusA (SEQ ID NO: 1) мутантной копией гена, в нуклеотидной последовательности которого в положении 1383 остаток цитозина заменен на остаток гуанина. Для этого с помощью ПЦР была получена мутантная копия гена fusA с заменой в положении 1383 остатка цитозина на остаток гуанина, которая была вставлена в плазмиду pIKA, полученную путем клонирования на векторе pUC19 ("Thermo scientific"), гена sacB из B.subtilis 168 (NC_000964, Accession Number X02730) и гена Km^R. Так как плазмида pIKA-fusA-C1383G не способна автономно поддерживаться в клетках Corynebacterium glutamicum, то после введения плазмиды с помощью электропорации в клетки С. glutamicum ВКПМ В-11608, были отобраны клоны, в хромосоме которых в результате двух циклов гомологичной рекомбинации происходило замещения нативного гена fusA мутантной копией гена fusA-C1383G. Наличие замены в гене fusA подтверждали с помощью ПЦР анализа с SNP-полимеразой и секвенирования. Полученный штамм Corynebacterium glutamicum с мутантным геном fusA-C1383G депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ГосНИИгенетика как Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-12500.The strain Corynebacterium glutamicum VKPM B-12500 was constructed by replacing the native fusA gene (SEQ ID NO: 1) with a mutant copy of the gene, in the nucleotide sequence of which at position 1383 the cytosine residue was replaced with the guanine residue. For this, a mutant copy of the fusA gene was obtained by PCR with the replacement of the cytosine residue at position 1383 with the guanine residue, which was inserted into the pIKA plasmid obtained by cloning on pUC19 vector ("Thermo scientific"), the sacB gene from B. subtilis 168 ( NC_000964, Accession Number X02730) and the Km ^R gene. Since the plasmid pIKA-fusA-C1383G is not able to autonomously maintain in Corynebacterium glutamicum cells, after the introduction of the plasmid by electroporation into C. glutamicum VKPM B-11608 cells, clones were selected whose chromosome was replaced by two cycles of homologous recombination fusA gene mutant copy of the fusA-C1383G gene. The presence of a substitution in the fusA gene was confirmed by PCR analysis with SNP polymerase and sequencing. The obtained strain of Corynebacterium glutamicum with the fusA-C1383G mutant gene was deposited in the All-Russian collection of industrial microorganisms of the State Research Institute of Genetics as Corynebacterium glutamicum VKPM B-12500.

Пример 2. Конструирование штамма Brevibacterium flavum ВКПМ В-12501, содержащего мутантный ген fusAExample 2. Construction of a strain of Brevibacterium flavum VKPM B-12501 containing the mutant fusA gene

Штамм Brevibacterium flavum ВКПМ В-12501 был сконструирован путем замены нативного гена fusA (SEQ ID NO: 2) мутантной копией гена, в нуклеотидной последовательности которого в положении 1383 остаток цитозина заменен на остаток гуанина. Для этого с помощью ПЦР была получена мутантная копия гена fusA с заменой в положении 1383 остатка цитозина на остаток гуанина, которая была вставлена в плазмиду pIKA, полученную путем клонирования на векторе pUC19 ("Thermo scientific"), гена sacB из B.subtilis 168 (NC_000964, Accession Number X02730) и гена Km^R. Так как плазмида pIKA-fusA-C1383G не способна автономно поддерживаться в клетках Brevibacterium flavum, то после введения плазмиды с помощью электропорации в клетки Brevibacterium flavum ВКПМ В-5593, были отобраны клоны, в хромосоме которых в результате двух циклов гомологичной рекомбинации происходило замещения нативного гена fusA мутантной копией гена fusA-C1383G. Наличие замены в гене fusA подтверждали с помощью ПЦР анализа с SNP-полимеразой и секвенирования. Полученный штамм Brevibacterium flavum с мутантным геном fusA-C1383G был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ГосНИИгенетика как Brevibacterium flavum ВКПМ В-12501.The strain Brevibacterium flavum VKPM B-12501 was constructed by replacing the native fusA gene (SEQ ID NO: 2) with a mutant copy of the gene, in the nucleotide sequence of which at position 1383 the cytosine residue was replaced by the guanine residue. For this, a mutant copy of the fusA gene was obtained by PCR with the replacement of the cytosine residue at position 1383 with the guanine residue, which was inserted into the pIKA plasmid obtained by cloning on pUC19 vector ("Thermo scientific"), the sacB gene from B. subtilis 168 ( NC_000964, Accession Number X02730) and the Km ^R gene. Since the plasmid pIKA-fusA-C1383G is not able to autonomously maintain in Brevibacterium flavum cells, after the plasmid was introduced by electroporation into Brevibacterium flavum VKPM B-5593 cells, clones were selected whose chromosome resulted in the replacement of two gene after two cycles of homologous recombination fusA mutant copy of the fusA-C1383G gene. The presence of a substitution in the fusA gene was confirmed by PCR analysis with SNP polymerase and sequencing. The resulting Brevibacterium flavum strain with the fusA-C1383G mutant gene was deposited at the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms of the State Research Institute of Genetics as Brevibacterium flavum VKPM B-12501.

Пример 3. Продукция L-лизина полученными штаммамиExample 3. The production of L-lysine obtained strains

Оценку проводят в пробирочных тестах. Для этого 0,3 мл культуры каждого из сконструированных штаммов, предварительно выращенных в течение 22 ч с перемешиванием (240 об/мин) при 30°С, вносят в пробирки с 3 мл среды следующего состава (мас. %): глюкоза - 10,0 хлорид аммония - 2,5, фосфат калия однозамещенный - 0,1, сульфат магния семиводный - 0,1, мел - 2,5, биотин - 0,00001, тиамин - 0,00002, с добавлением кислотного гидролизата пшеничного глютена* 50,0 мл/л, вода - остальное. *Гидролизат пшеничного глютена получают путем гидролиза пшеничного глютена серной кислотой согласно известным способам гидролиза различного сырья с целью получения источника ростовых факторов при микробиологическом производстве аминокислот (Биотехнология и биоинженерия, Рига, 1978). Перед внесением в среду гидролизат нейтрализуют концентрированным аммиаком. В качестве штаммов сравнения используют родительские штаммы Brevibacterium flavum ВКПМ В-5593 и Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-11608.Evaluation is carried out in vitro tests. For this, 0.3 ml of the culture of each of the constructed strains, previously grown for 22 hours with stirring (240 rpm) at 30 ° C, is introduced into test tubes with 3 ml of medium of the following composition (wt.%): Glucose - 10, 0 ammonium chloride - 2.5, potassium phosphate monosubstituted - 0.1, magnesium sulphate - 0.1, chalk - 2.5, biotin - 0.00001, thiamine - 0.00002, with the addition of wheat gluten acid hydrolyzate * 50 , 0 ml / l, water - the rest. * Wheat gluten hydrolyzate is obtained by hydrolysis of wheat gluten with sulfuric acid according to known methods of hydrolysis of various raw materials in order to obtain a source of growth factors in the microbiological production of amino acids (Biotechnology and Bioengineering, Riga, 1978). Before entering the medium, the hydrolyzate is neutralized with concentrated ammonia. Parent strains of Brevibacterium flavum VKPM B-5593 and Corynebacterium glutamicum VKPM B-11608 are used as comparison strains.

Пробирки с культурами инкубируют в течение 48 ч с перемешиванием (250 об/мин) при 30°С и затем в культуральной жидкости определяют содержание L-лизина методом тонкослойной хроматографии. Результаты представлены в таблице.Tubes with cultures are incubated for 48 hours with stirring (250 rpm) at 30 ° C and then the content of L-lysine is determined in the culture fluid by thin layer chromatography. The results are presented in the table.

Из результатов, представленных в таблице, следует, что штаммы Brevibacterium flavum ВКПМ В-12501 и Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-12500, содержащие мутантный ген fusA, продуцируют на 9-18% больше лизина, чем родительские штаммы.From the results presented in the table, it follows that the strains of Brevibacterium flavum VKPM B-12501 and Corynebacterium glutamicum VKPM B-12500 containing the mutant fusA gene produce 9-18% more lysine than the parent strains.

Список источников информацииList of sources of information

1. US 36878101. US 3687810

2. US 39295712. US 3929571

3. US 36878103. US 3687810

4. US 39295714. US 3929571

5. RU 20349215. RU 2034921

6. RU 23478076. RU 2347807

7. US 46236237. US 4,623,623

8. US 39295718. US 3929571

9. US 77368809. US 7736880

10. US 836175810. US 8361758

11. RU 254969011. RU 2549690

12. W. Liebl, M. Ehrmann, W. Ludwig and K.H. Schleifer. "Transfer of Brevibacterium divaricatum DSM 20297^T, "Brevibacterium flavum" DSM 20411, "Brevibacterium lactofermentum" DSM 20412 and DSM 1412, and Corynebacterium lilium DSM 20137^T to Corynebacterium glutamicum and Their Distinction by rRNA Gene Restriction Patterns» International Journal of Systematic Bacteriology - 1991. - V. 41. - P. 255-260.12. W. Liebl, M. Ehrmann, W. Ludwig and KH Schleifer. "Transfer of Brevibacterium divaricatum DSM 20297 ^T ," Brevibacterium flavum "DSM 20411," Brevibacterium lactofermentum "DSM 20412 and DSM 1412, and Corynebacterium lilium DSM 20137 ^T to Corynebacterium glutamicum and Their Distinctivity Distraction 1991. - V. 41. - P. 255-260.

13.

Α., Tauch Α.,

W., Kalinowski J., Thierbach G., and

A. "Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the E.coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum."// Gene. - 1994. - V.145. P. - 69-73.)13.

Α., Tauch Α.,

W., Kalinowski J., Thierbach G., and

A. "Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the E. coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum." // Gene. - 1994 .-- V.145. P. - 69-73.)

14. Биотехнология и биоинженерия, Рига, 1978.14. Biotechnology and bioengineering, Riga, 1978.

Claims

1. L-Lysine-producing bacterium belonging to the genus Corynebacterium and modified so that in the amino acid sequence of the product of the mutant fusA gene at the 461 position, the amino acid residue of histidine is replaced by the amino acid residue of glutamine.

2. L-Lysine-producing bacterium belonging to the genus Brevibacterium and modified so that in the amino acid sequence of the product of the mutant fusA gene at the 461 position, the amino acid residue of histidine is replaced by the amino acid residue of glutamine.

3. A method for producing L-lysine, comprising culturing a bacterium according to claim 1 or claim 2 under suitable conditions and isolating said L-amino acid from the culture fluid.