RU2639247C1

RU2639247C1 - L-lysin-producing coryneformic bacterium with inactive ltbr genome and method for obtaining of l-lysin using this bacterium

Info

Publication number: RU2639247C1
Application number: RU2016150378A
Authority: RU
Inventors: Людмила Евгеньевна Рябченко; Татьяна Евгеньевна Шустикова; Марина Евгеньевна Шереметьева; Татьяна Евгеньевна Леонова; Татьяна Васильевна Герасимова; Александр Степанович Яненко
Priority date: 2016-12-21
Filing date: 2016-12-21
Publication date: 2017-12-20

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: invention is an L-lysine-producing bacterium belonging to the Corynebacterium genus or the Brevibacterium genus and modified so that the ltbR gene encoding the transcriptional regulator is inactivated. This invention also discloses a process for L-lysine production by the said bacterium by culturing under suitable conditions.

EFFECT: increased level of products.

3 cl, 1 tbl, 4 ex

Description

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения L-лизина с помощью ферментационного процесса с использованием модифицированной коринеформной бактерии, содержащей инактивированный ген ltbR, кодирующий транскрипционный регулятор.The invention relates to biotechnology, in particular to a method for producing L-lysine using a fermentation process using a modified coryneform bacterium containing the inactivated ltbR gene encoding a transcriptional regulator.

Незаменимую аминокислоту L-лизин, широко используемую в качестве кормовой добавки для животноводства и птицеводства, традиционно получают ферментацией сахаров с помощью коринеформных бактерий, таких как Corynebacterium glutamicum (US 3687810, US 3929571), Brevibacterium sp. (US 3687810, US 3929571, RU 2034921), а также кишечной палочки Escherichia coli (RU 2347807). Современные штаммы, используемые для промышленного производства L-лизина, содержат комплекс изменений (мутаций) в геноме, обеспечивающих сверхпродукцию L-лизина при росте на средах с сахарами. Для получения штаммов-продуцентов L-лизина используют различные селекционные и генетические подходы, включая мутагенез, амплификацию отдельных или нескольких генов (J. Becker, et al, 2005), усиление активности отдельных генов (М. Ikeda, et al, 2012) или инактивацию генов (С. Riedel, et al, 2001) и направленное конструирование штаммов с помощью методов генной и метаболической инженерии (J. Becker, et al, 2011).The essential amino acid L-lysine, widely used as a feed additive for livestock and poultry farming, is traditionally obtained by fermentation of sugars using coryneform bacteria, such as Corynebacterium glutamicum (US 3687810, US 3929571), Brevibacterium sp. (US 3687810, US 3929571, RU 2034921), as well as Escherichia coli Escherichia coli (RU 2347807). Modern strains used for the industrial production of L-lysine contain a complex of changes (mutations) in the genome that provide overproduction of L-lysine when grown on sugared media. Various breeding and genetic approaches are used to obtain L-lysine producing strains, including mutagenesis, amplification of individual or several genes (J. Becker, et al, 2005), increased activity of individual genes (M. Ikeda, et al, 2012) or inactivation genes (C. Riedel, et al, 2001) and the directed construction of strains using genetic and metabolic engineering methods (J. Becker, et al, 2011).

Несмотря на большое количество известных методов создания штаммов-продуцентов L-лизина, сохраняется потребность в разработке новых подходов для усовершенствования существующих способов синтеза L-лизина коринеформными бактериями.Despite the large number of known methods for creating strains producing L-lysine, there remains a need to develop new approaches to improve existing methods for the synthesis of L-lysine by coryneform bacteria.

Задачами настоящего изобретения являются создание с помощью новых методов штаммов с повышенным уровнем синтеза L-лизина, принадлежащих к роду Corynebacterium или роду Brevibacterium, и разработка способа получения L-лизина с использованием этих штаммов.The objectives of the present invention are the creation using new methods of strains with an increased level of L-lysine synthesis belonging to the genus Corynebacterium or the genus Brevibacterium, and the development of a method for producing L-lysine using these strains.

Задачи решены путем:The tasks are solved by:

- получения L-лизин-продуцирующей бактерии, содержащей инактивированный ген ltbR и принадлежащей к роду Corynebacterium или роду Brevibacterium;- obtaining L-lysine-producing bacteria containing the inactivated ltbR gene and belonging to the genus Corynebacterium or the genus Brevibacterium;

- разработки способа получения L-лизина, включающего культивирование заявляемой бактерии в подходящих условиях и выделение указанной L-аминокислоты из культуральной жидкости.- development of a method for producing L-lysine, including culturing the inventive bacterium under suitable conditions and isolating said L-amino acid from the culture fluid.

Задачи настоящего изобретения решены благодаря обнаружению того факта, что штаммы Corynebacterium или Brevibacterium с инактивированным геном ltbR (вследствие делеции части гена) обладают более высокой продуктивностью по L-лизину.The objectives of the present invention are solved by the discovery of the fact that strains of Corynebacterium or Brevibacterium with the inactivated ltbR gene (due to deletion of a part of the gene) have higher L-lysine productivity.

В соответствие с настоящим описанием изобретения в качестве бактерии может быть использована коринеформная бактерия, продуцирующая L-лизин, при этом бактерия модифицирована таким образом, что содержит инактивированный ген ltbR, в том числе, за счет утраты (делеции) части гена.In accordance with the present description of the invention, a coryneform bacterium producing L-lysine can be used as a bacterium, the bacterium being modified in such a way that it contains an inactivated ltbR gene, including due to the loss (deletion) of a part of the gene.

Термин «коринеформная бактерия» обозначает бактерии рода Corynebacterium и бактерии роду Brevibacterium, часть которых в настоящее время классифицируют как бактерии рода Corynebacterium (W. Liebl, et al, 1991.)The term “coryneform bacterium” means bacteria of the genus Corynebacterium and bacteria of the genus Brevibacterium, some of which are currently classified as bacteria of the genus Corynebacterium (W. Liebl, et al, 1991.)

В качестве примеров коринеформной бактерии можно привести, но не ограничиться этим, штаммы Corynebacterium glutamicum DSM1412 (депонирован в немецкой коллекции типовых культур), Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-12773, Brevibacterium flavum ВКПМ В-10945 и его производный Brevibacterium flavum ВКПМ - В12771, депонированные во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов, ВКПМ.Examples of the coryneform bacterium include, but are not limited to, strains of Corynebacterium glutamicum DSM1412 (deposited in the German type culture collection), Corynebacterium glutamicum VKPM B-12773, Brevibacterium flavum VKPM B-10945 and its derivative Brevibacterium fl All-Russian Collection of Industrial Microorganisms, VKPM.

Термин «бактерия, способная продуцировать L-лизин» означает бактерию, способную накапливать L-лизин в культуральной среде в больших количествах по сравнению с природным или родительскими штаммами Corynebacterium glutamicum DSM1412, Corynebacterium glutamicum ВКПМ B-12773 или Brevibacterium flavum ВКПМ В-10945 и его производным Brevibacterium flavum ВКПМ В- В12771.The term "bacterium capable of producing L-lysine" means a bacterium capable of accumulating L-lysine in the culture medium in large quantities compared to the natural or parental strains of Corynebacterium glutamicum DSM1412, Corynebacterium glutamicum VKPM B-12773 or Brevibacterium b-4545 VKM derivative of Brevibacterium flavum VKPM B-B12771.

Термин «бактерия с инактивированным геном ltbR» означает, что бактерия модифицирована таким образом, что нуклеотидная последовательность гена ltbR из Brevibacterium flavum ВКПМ В-10945 (SEQ ID NO: 1) может содержать любые из известных мутаций (делеции, вставки, стоп-кодоны или мутации со сдвигом рамки считывания), которые приводят к инактивации функции гена, в том числе, делеция части гена.The term “bacterium with the inactivated ltbR gene” means that the bacterium is modified so that the nucleotide sequence of the ltbR gene from Brevibacterium flavum VKPM B-10945 (SEQ ID NO: 1) can contain any of the known mutations (deletions, insertions, stop codons or reading frame mutations) that lead to inactivation of gene function, including deletion of a part of the gene.

Нуклеотидные последовательности гена в различных видах и штаммах коринеформных бактерий могут незначительно отличаться, поэтому нуклеотидная последовательность гена ltbR не ограничивается нуклеотидной последовательностью гена, приведенного в SEQ ID NO: 1, она может включать гены, гомологичные (не менее 95%) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1.The nucleotide sequences of the gene in different types and strains of coryneform bacteria may vary slightly, therefore the nucleotide sequence of the ltbR gene is not limited to the nucleotide sequence of the gene shown in SEQ ID NO: 1, it can include genes homologous to (at least 95%) of the nucleotide sequence of SEQ ID NO : one.

Направленное введение мутаций, включая делеции, приводящие к инактивации гена ltbR в хромосоме, может быть осуществлено с помощью известных методов генной инженерии, в частности метода замещения, основанного на гомологичной рекомбинации (Schafer A. et al, 1994).The directed introduction of mutations, including deletions leading to inactivation of the ltbR gene in the chromosome, can be carried out using known methods of genetic engineering, in particular, the substitution method based on homologous recombination (Schafer A. et al, 1994).

С помощью ПЦР получают мутантный ген ltbR и бактерию для ее модификации трансформируют фрагментом ДНК, содержащим мутантный ген. Затем исходный ген на хромосоме замещают мутантным геном с помощью гомологичной рекомбинации и полученный штамм отбирают. Замещение гена с использованием гомологичной рекомбинации может быть проведено с использованием плазмиды, не способной к автономному поддержанию в клетке хозяина.Using PCR, the mutant ltbR gene is obtained and the bacterium is transformed with a DNA fragment containing the mutant gene to modify it. Then, the original gene on the chromosome is replaced by the mutant gene using homologous recombination and the resulting strain is selected. Substitution of a gene using homologous recombination can be carried out using a plasmid incapable of autonomously maintaining in the host cell.

Способ в общем виде согласно настоящему изобретению.The method in General form according to the present invention.

Способом, согласно настоящему изобретению, является получение L-лизина, включающее стадии выращивания L-лизин-продуцирующей коринеформной бактерии с инактивированным геном ltbR в питательной среде с целью продукции и накопления L-лизина в питательной среде и выделения L-лизина из культуральной жидкости.The method according to the present invention is the production of L-lysine, comprising the steps of growing an L-lysine-producing coryneform bacterium with an inactivated ltbR gene in a culture medium in order to produce and accumulate L-lysine in the culture medium and isolate L-lysine from the culture fluid.

В качестве питательной среды для культивирования используют минеральную среду, включающую фосфаты натрия или калия, соли магния, а при необходимости соли марганца и железа и содержащую в качестве источника углерода глюкозу или глюкозные сиропы или сахарозу, в качестве источника азота - аммонийные соли или мочевину, а также необходимые для роста аминокислоты и витамины. В качестве компонентов, ускоряющих рост бактерий, дополнительно добавляют кукурузный экстракт или гидролизаты глютена или сои. Культивирование бактерий проводят при 24-42°C, преимущественно при 30-32°C, и pH среды в интервале 6,0-8,5, преимущественно в интервале 6,8-7,2.As a culture medium, a mineral medium is used, including sodium or potassium phosphates, magnesium salts, and, if necessary, manganese and iron salts and containing glucose or glucose syrups or sucrose as a carbon source, ammonium salts or urea as a nitrogen source, and amino acids and vitamins also necessary for growth. As components that accelerate the growth of bacteria, corn extract or gluten or soy hydrolysates are additionally added. The cultivation of bacteria is carried out at 24-42 ° C, mainly at 30-32 ° C, and the pH of the medium in the range of 6.0-8.5, mainly in the range of 6.8-7.2.

Культивирование бактерий осуществляют в пробирках, колбах или специальных реакторах при аэробных условиях.The cultivation of bacteria is carried out in test tubes, flasks or special reactors under aerobic conditions.

Примеры осуществления настоящего изобретенияExamples of the implementation of the present invention

Пример 1. Конструирование штамма Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-12772, содержащего инактивированный ген ltbR.Example 1. Construction of a strain of Corynebacterium glutamicum VKPM B-12772 containing the inactivated ltbR gene.

Штамм Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-12772 был сконструирован на основе штамма Corynebacterium glutamicum DSM1412 В-12773, производного штамма Corynebacterium glutamicum DSM1412, имеющего мутацию в гене lysC^Tre311Ser, путем замены нативного гена ltbR (SEQ ID NO: 1) мутантной копией гена (SEQ ID NO: 2). Для этого с помощью ПЦР была получена мутантная копия гена ltbR с делецией между 223 и 480 нуклеотидами в центральной части, которая была вставлена в плазмиду pIKA, полученную путем клонирования на векторе pUC19 ("Thermo scientific"), гена sacB из B. subtilis 168 (NC_000964, Accession Number X02730) и гена Km^R. Так как плазмида pIKA-ΔltbR не способна автономно поддерживаться в клетках Corynebacterium glutamicum, то после введения плазмиды с помощью электропорации в клетки С. glutamicum В-12773 были отобраны клоны, в хромосоме которых в результате двух циклов гомологичной рекомбинации происходило замещение нативного гена ltbR мутантной копией гена ΔltbR. Наличие замены в гене ltbR подтверждали с помощью ПЦР анализа и секвенирования. Полученный штамм Corynebacterium glutamicum с инактивированным геномом ΔltbR депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ГосНИИгенетика как Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-12772.The strain Corynebacterium glutamicum VKPM B-12772 was constructed on the basis of the strain Corynebacterium glutamicum DSM1412 B-12773, a derivative of the strain Corynebacterium glutamicum DSM1412 having a mutation in the lysC ^Tre311Ser gene, by replacing the native number 1 NO: 2). For this, a mutant copy of the ltbR gene with a deletion between 223 and 480 nucleotides in the central part, which was inserted into the pIKA plasmid obtained by cloning on the pUC19 vector ("Thermo scientific"), of the sacB gene from B. subtilis 168 ( NC_000964, Accession Number X02730) and the Km ^R gene. Since the plasmid pIKA-ΔltbR is not able to autonomously maintain in Corynebacterium glutamicum cells, after the plasmid was introduced by electroporation into C. glutamicum B-12773 cells, clones were selected whose chromosome resulted in the replacement of the native mutant lt gene as a result of two cycles of homologous recombination ΔltbR gene. The presence of a replacement in the ltbR gene was confirmed by PCR analysis and sequencing. The obtained strain of Corynebacterium glutamicum with the inactivated ΔltbR genome was deposited in the All-Russian collection of industrial microorganisms of the State Research Institute of Genetics as Corynebacterium glutamicum VKPM B-12772.

Пример 2. Конструирование штамма Brevibacterium flavum ВКПМ В-12774, содержащего инактивированный ген ltbR.Example 2. Construction of a strain of Brevibacterium flavum VKPM B-12774 containing the inactivated ltbR gene.

Штамм Brevibacterium flavum ВКПМ В-12774 был сконструирован на основе штамма Brevibacterium, flavum 90 ВКПМ В-10945 путем замены нативного гена ltbR (SEQ ID NO: 1) мутантной копией гена (SEQ ID NO: 2). Конструирование мутантной копии гена и замену нативного гена мутантной копией гена проводили как описано в Примере 1. Наличие замены в гене ltbR подтверждали с помощью ПЦР анализа и секвенирования. Полученный штамм с инактивированным геном ΔltbR депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ГосНИИгенетика как Brevibacterium flavum ВКПМ В-12774.The strain Brevibacterium flavum VKPM B-12774 was constructed on the basis of the strain Brevibacterium flavum 90 VKPM B-10945 by replacing the native ltbR gene (SEQ ID NO: 1) with a mutant copy of the gene (SEQ ID NO: 2). The construction of the mutant gene copy and the replacement of the native gene with the mutant gene copy was performed as described in Example 1. The presence of the substitution in the ltbR gene was confirmed by PCR analysis and sequencing. The obtained strain with the inactivated ΔltbR gene was deposited in the All-Russian collection of industrial microorganisms of the State Research Institute of Genetics as Brevibacterium flavum VKPM B-12774.

Пример 3. Конструирование штамма Brevibacterium flavum ВКПМ В-12770, содержащего инактивированный ген ltbR.Example 3. Construction of a strain of Brevibacterium flavum VKPM B-12770 containing the inactivated ltbR gene.

Штамм Brevibacterium flavum ВКПМ В-12770 был сконструирован на основе штамма Brevibacterium flavum ВКПМ В-12771 мутанта штамма Brevibacterium flavum 90 ВКПМ В-10945. Штамм Brevibacterium flavum ВКПМ B-12771 является прототрофом по лейцину, не способен использовать ацетат в качестве единственного источника углерода, устойчив к дезоксиглюкозе, обладает повышенной активностью аспартаткиназы, диаминопимелатдегидрогеназы, пируваткарбоксилазы, диаминопимелатдекарбоксилазы, дигидропиколинатредуктазы, транскетолазы, фруктозо-1,6-дифосфатазы, обладает пониженной активностью изоцитратдегидрогеназы и UDP-N-ацетилмурамилтрипептидсинтазы.The strain Brevibacterium flavum VKPM B-12770 was constructed on the basis of the strain Brevibacterium flavum VKPM B-12771 mutant strain Brevibacterium flavum 90 VKPM B-10945. The strain Brevibacterium flavum VKPM B-12771 is a leucine prototroph, is not able to use acetate as the sole carbon source, is resistant to deoxyglucose, has an increased activity of aspartate kinase, diaminopimelate dehydrogenase, pyruvate carboxylase, diaminopimelate decarboxylase, dihydrogen phosphate dihydrogen phosphate azide decreased activity of isocitrate dehydrogenase and UDP-N-acetylmuramyl tripeptide synthase.

Конструирование мутантной копии гена и замену нативного гена мутантной копией гена проводили как описано в Примере 1. Наличие замены в гене ltbR подтверждали с помощью ПЦР анализа и секвенирования. Полученный штамм с инактивированным геном ΔltbR депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ГосНИИгенетика как Brevibacterium flavum ВКПМ В-12770.The construction of the mutant gene copy and the replacement of the native gene with the mutant gene copy was performed as described in Example 1. The presence of the substitution in the ltbR gene was confirmed by PCR analysis and sequencing. The resulting strain with the inactivated ΔltbR gene was deposited in the All-Russian collection of industrial microorganisms of the State Research Institute of Genetics as Brevibacterium flavum VKPM B-12770.

Пример 4. Продукция L-лизина полученными штаммамиExample 4. The production of L-lysine obtained strains

Оценку проводят в пробирочных тестах. Для этого 0,3 мл культуры каждого из сконструированных штаммов, предварительно выращенных в течение 22 ч с перемешиванием (240 об/мин) при 30°C, вносят в пробирки с 3 мл среды следующего состава (мас. %): глюкоза - 10,0, хлорид аммония - 2,5, фосфат калия однозамещенный - 0,1, сульфат магния семиводный - 0,1, мел - 2,5, биотин - 0,00001, тиамин - 0,00002, с добавлением кислотного гидролизата пшеничного глютена* 50,0 мл/л, вода - остальное. *Гидролизат пшеничного глютена получают путем гидролиза пшеничного глютена серной кислотой согласно известным способам гидролиза различного сырья с целью получения источника ростовых факторов при микробиологическом производстве аминокислот (Биотехнология и биоинженерия, Рига, 1978). Перед внесением в среду гидролизат нейтрализуют концентрированным аммиаком. В качестве штаммов сравнения используют родительские штаммы Corynebacterium glutamicum DSM1412 В-12773, Brevibacterium flavum ВКПМ В-10945 и Brevibacterium flavum ВКПМ В-12771.Evaluation is carried out in vitro tests. For this, 0.3 ml of the culture of each of the constructed strains, previously grown for 22 h with stirring (240 rpm) at 30 ° C, is introduced into test tubes with 3 ml of medium of the following composition (wt.%): Glucose - 10, 0, ammonium chloride - 2.5, potassium phosphate monosubstituted - 0.1, magnesium sulphate - 0.1, chalk - 2.5, biotin - 0.00001, thiamine - 0.00002, with the addition of wheat gluten acid hydrolyzate * 50.0 ml / l, water - the rest. * Wheat gluten hydrolyzate is obtained by hydrolysis of wheat gluten with sulfuric acid according to known methods of hydrolysis of various raw materials in order to obtain a source of growth factors in the microbiological production of amino acids (Biotechnology and Bioengineering, Riga, 1978). Before entering the medium, the hydrolyzate is neutralized with concentrated ammonia. Parent strains of Corynebacterium glutamicum DSM1412 B-12773, Brevibacterium flavum VKPM B-10945 and Brevibacterium flavum VKPM B-12771 are used as comparison strains.

Пробирки с культурами инкубируют в течение 36 ч с перемешиванием (250 об/мин) при 30°C и затем в культуральной жидкости определяют содержание L-лизина методом тонкослойной хроматографии. Результаты представлены в таблице.Tubes with cultures are incubated for 36 hours with stirring (250 rpm) at 30 ° C and then the content of L-lysine is determined in the culture fluid by thin layer chromatography. The results are presented in the table.

Из результатов, представленных в таблице, следует, что штамм Corynebacterium glutamicum ВКПМ - В-12772, содержащий инактивированный ген ltbR, продуцирует в 2 раза больше L-лизина, чем родительский штамм. Штамм Brevibacterium flavum ВКПМ В-12770, содержащий мутантный ген ltbR, продуцирует на 14% больше L-лизина, чем родительский штамм. Продукция L-лизина в штамме Brevibacterium flavum ВКПМ В-12774 повышена не более чем на 2%.From the results presented in the table, it follows that the Corynebacterium glutamicum VKPM-B-12772 strain containing the inactivated ltbR gene produces 2 times more L-lysine than the parent strain. The strain Brevibacterium flavum VKPM B-12770, containing the mutant ltbR gene, produces 14% more L-lysine than the parent strain. The production of L-lysine in the strain Brevibacterium flavum VKPM B-12774 increased by no more than 2%.

Из результатов, представленных в таблице, следует, что различные штаммы коринеформных бактерий, содержащие инактивированный ген ltbR (Corynebacterium glutamicum ВКПМ - В-12772, Brevibacterium flavum ВКПМ В-12770, Brevibacterium flavum ВКПМ В-12774), обеспечивают увеличение продукции L-лизина до двухратного по сравнению с контрольными штаммами. При этом эффект, который оказывает инактивированный ген ltbR, снижается с ростом продуктивности родительских штаммов.From the results presented in the table, it follows that various strains of coryneform bacteria containing the inactivated ltbR gene (Corynebacterium glutamicum VKPM - B-12772, Brevibacterium flavum VKPM B-12770, Brevibacterium flavum VKPM B-12774) provide an increase in the production of L-lysine to twofold compared with control strains. In this case, the effect of the inactivated ltbR gene decreases with increasing productivity of the parental strains.

Список источников информацииList of sources of information

1. US 3687810.1. US 3687810.

2. US 3929571.2. US 3929571.

3. US 3687810.3. US 3687810.

4. US 3929571.4. US 3929571.

5. RU 2034921.5. RU 2034921.

6. RU 2347807.6. RU 2347807.

7. Becker, J., Klopprogge, C., Zelder, O., Heinzle, E., and Wittmann, C. / Amplified Expression of Fructose 1,6-Bisphosphatase in Corynebacterium glutamicum Increases In Vivo Flux through the Pentose Phosphate Pathway and Lysine Production on Different Carbon Sources. // Applied and Environmental Microbiology. (2005). V. 71 (12). - P. 8587-8596.7. Becker, J., Klopprogge, C., Zelder, O., Heinzle, E., and Wittmann, C. / Amplified Expression of Fructose 1,6-Bisphosphatase in Corynebacterium glutamicum Increases In Vivo Flux through the Pentose Phosphate Pathway and Lysine Production on Different Carbon Sources. // Applied and Environmental Microbiology. (2005). V. 71 (12). - P. 8587-8596.

8. M. Ikeda. / Sugar transport systems in Corynebacterium glutamicum: features and applications to strain development. // Appl Microbiol Biotechnol (2012) 96: 1191-1200.8. M. Ikeda. / Sugar transport systems in Corynebacterium glutamicum: features and applications to strain development. // Appl Microbiol Biotechnol (2012) 96: 1191-1200.

9. Riedel C., Rittmann D., Dangel P. et al. / Characterization of phosphoenolpyruvate carboxykinase gene from Corynebacterium glutamicum and significance of the enzyme for growth and amino acid production. // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. (2001) 3, 573-583.9. Riedel C., Rittmann D., Dangel P. et al. / Characterization of phosphoenolpyruvate carboxykinase gene from Corynebacterium glutamicum and significance of the enzyme for growth and amino acid production. // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. (2001) 3, 573-583.

10. Becker, J., Zelder, O., Hafner, S., Schroder, H., and Wittmann C. / From zero to hero - Design-based systems metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for L-lysine production. // Metabolic Engineering. (2011). V. 13. P. 159-168.10. Becker, J., Zelder, O., Hafner, S., Schroder, H., and Wittmann C. / From zero to hero - Design-based systems metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for L-lysine production. // Metabolic Engineering. (2011). V. 13. P. 159-168.

11. W. Liebl, M. Ehrmann, W. Ludwig and K.H. Schleifer. / Transfer of Brevibacterium divaricatum DSM 20297, Brevibacterium flavum DSM 20411, Brevibacterium lacfofermentum DSM 20412 and DSM 1412, and Corynebacterium lilium DSM 20137 to Corynebacterium glutamicum and Their Distinction by rRNA Gene Restriction Patterns // International Journal of Systematic Bacteriology (1991). - V. 41. - P. 255-260.11. W. Liebl, M. Ehrmann, W. Ludwig and K.H. Schleifer. / Transfer of Brevibacterium divaricatum DSM 20297, Brevibacterium flavum DSM 20411, Brevibacterium lacfofermentum DSM 20412 and DSM 1412, and Corynebacterium lilium DSM 20137 to Corynebacterium glutamicum and Their Distinction Journal of rrnative generative Journal of rutility - V. 41. - P. 255-260.

12.

A., Tauch A.,

W., Kalinowski J., Thierbach G., and

A. / Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the E. coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum.” // Gene. - (1994). - V. 145. P. 69-73.12.

A., Tauch A.,

W., Kalinowski J., Thierbach G., and

A. / Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the E. coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum. ”// Gene. - (1994). - V. 145. P. 69-73.

13. Биотехнология и биоинженерия, Рига, 1978.13. Biotechnology and bioengineering, Riga, 1978.

Claims

1. L-Lysine-producing bacterium with inactivated ltbR gene, belonging to the genus Corynebacterium.

2. L-Lysine-producing bacterium with the inactivated ltbR gene, belonging to the genus Brevibacterium.

3. A method for producing L-lysine, comprising culturing the bacterium according to claim 1 or 2 under suitable conditions and isolating said L-amino acid from the culture fluid.