RU2604302C2

RU2604302C2 - Method for assessing functional status of plants in vitro without violating sterility

Info

Publication number: RU2604302C2
Application number: RU2014138528/13A
Authority: RU
Inventors: Ольга Николаевна Будаговская; Андрей Валентинович Будаговский; Наталья Валентиновна Соловых; Иван Андреевич Будаговский
Priority date: 2014-09-23
Filing date: 2014-09-23
Publication date: 2016-12-10
Also published as: RU2014138528A

Abstract

FIELD: agriculture.

SUBSTANCE: invention relates to agriculture, biology and plant physiology. Method comprises assessing functional status of plants in vitro by determining chlorophyll fluorescence parameters. Wherewith the method comprises recording a signal of slow chlorophyll fluorescence induction in the wavelength range of 670-760 nm for 10-30 seconds, calculating rate of change of the SCHFI signal 10-30 seconds after reaching the maximum fluorescence level F_M, calculating the value of virtual stationary fluorescence level F_c* by extrapolation of the obtained data for 120-300th second of virtual measurements, determining the value of specific photosynthetic activity by formula Y=(F_M-F_c*)/F_c*. Functional status of plants is determined by the relation of specific photosynthetic activity, produced as a result of extrapolation, and rate of change of the SCHFI signal - higher one or both parameters indicate better functional status of plants in vitro.

EFFECT: method allows maintaining viability of plants, assessing the functional status and viability of cells, tissues and organs of plants in vitro without violating sterility of the habitat, as well as detecting the degree of plant resistance to various adverse factors.

1 cl, 1 dwg, 1 ex, 3 tbl

Description

Изобретение относится к биологии, физиологии растений и сельскому хозяйству и позволяет оценить функциональное состояние и жизнеспособность клеток, тканей и органов растений in vitro без нарушения стерильности среды обитания, в том числе при оптимизации условий выращивания, а также для выявления степени устойчивости растений к различным неблагоприятным факторам и т.п.The invention relates to biology, plant physiology and agriculture and allows to evaluate the functional state and viability of cells, tissues and organs of plants in vitro without violating the sterility of the environment, including the optimization of growing conditions, as well as to identify the degree of resistance of plants to various adverse factors etc.

В настоящее время при выращивании растений в культуре ткани используют визуальный контроль за состоянием растений [1, 2). Однако он не позволяет выявить наиболее важный физиологический параметр - активность фотосинтезирующего аппарата. Известны методы оценки функционального состояния растений, основанные на определении количественного содержания фотосинтезирующих пигментов и их качественного состояния по фотометрическим параметрам, когда определяются коэффициенты пропускания, отражения или поглощения на определенных длинах волн [3, 4]. Однако данные методы и реализующая их аппаратура в принципе не позволяют получить достоверную информацию. Получаемые фотометрические коэффициенты в существенной степени зависят от геометрии расположения объекта в оптическом тракте, и она должна быть строго фиксированная и неизменная, что при работе с культурой ткани без нарушения ее стерильности невозможно.Currently, when growing plants in tissue culture, visual monitoring of the state of plants is used [1, 2). However, it does not allow revealing the most important physiological parameter - the activity of the photosynthetic apparatus. Known methods for assessing the functional state of plants, based on the determination of the quantitative content of photosynthetic pigments and their qualitative state by photometric parameters, when transmittance, reflection or absorption coefficients at certain wavelengths are determined [3, 4]. However, these methods and the equipment that implements them, in principle, do not allow reliable information to be obtained. The obtained photometric coefficients substantially depend on the geometry of the object in the optical path, and it must be strictly fixed and unchanged, which is impossible when working with tissue culture without violating its sterility.

Наиболее близким к заявляемому способу являются методы определения функционального состояния растений по параметрам медленной индукции флуоресценции хлорофилла (МИФХ), когда в течение нескольких десятков секунд снимают кривую Каутского и о функциональном состоянии судят по удельной фотосинтетической активности Y, которая определяется какClosest to the claimed method are methods for determining the functional state of plants by the parameters of slow induction of chlorophyll fluorescence (MIFH), when a Kautsky curve is taken within a few tens of seconds and the functional state is judged by the specific photosynthetic activity Y, which is defined as

$Y = (F_{м} - F_{c}) / F_{c}, (1)$

Y = (F_{m} - F_{c}) / F_{c}, (one)

где F_м - максимальный уровень сигнала флуоресценции, определяемый в течение первых 2-5 секунд возбуждения флуоресценции, F_c - стационарный уровень сигнала флуоресценции, определяемый на 120-180 секунде возбуждения флуоресценции [5-8]. Данный критерий является относительным и поэтому может использоваться для работы с растениями, находящимися в пробирках или колбах и по-разному ориентированных в зоне измерений относительно источника и приемника оптического излучения [8]. Недостатками данного метода является длительное время проведения измерений - не менее 2 минут. Растения в культуре ткани отличаются от полевых существенно меньшим порогом устойчивости к фотоокислению. Поэтому в процессе измерений высокие уровни оптического излучения, используемые для возбуждения флуоресценции, могут привести к фотодеструктивному повреждению хлоропластов. Основная проблема заключается в том, что и процессы индукции флуоресценции и процессы фотодеструкции отражаются на стационарном уровне кривой Каутского одинаково. В результате происходит завышение оценки удельной фотосинтетической активности из-за наличия фотодеструкции. Кроме этого, растения получают необратимые фотодеструктивные повреждения, что сказывается на их последующей жизнедеятельности. Заведомо низкие уровни возбуждающего излучения устанавливать неэффективно, так как в этом случае не происходит достаточного восстановления реакционных центров фотосистемы 2 (ФС 2), и значение удельной фотосинтетической активности определяется с занижением ее истинной величины.where F _m - the maximum level of the fluorescence signal, determined during the first 2-5 seconds of excitation of fluorescence, F _c - the stationary level of the fluorescence signal, determined at 120-180 seconds of excitation of fluorescence [5-8]. This criterion is relative and therefore can be used to work with plants located in test tubes or flasks and differently oriented in the measurement zone relative to the source and receiver of optical radiation [8]. The disadvantages of this method is the long measurement time of at least 2 minutes. Plants in tissue culture differ from field plants by a significantly lower threshold for photooxidation resistance. Therefore, during the measurement process, high levels of optical radiation used to excite fluorescence can lead to photodestructive damage to chloroplasts. The main problem is that both fluorescence induction processes and photodegradation processes are reflected at the stationary level of the Kautsky curve equally. As a result, the estimation of specific photosynthetic activity is overestimated due to the presence of photodegradation. In addition, plants receive irreversible photodestructive damage, which affects their subsequent life. It is inefficient to establish known low levels of exciting radiation, since in this case there is not enough recovery of the reaction centers of photosystem 2 (PS 2), and the value of the specific photosynthetic activity is determined by underestimating its true value.

Целью данного изобретения является увеличение достоверности информации о функциональном состоянии растений in vitro без нарушения стерильности среды, а также сохранение жизнеспособности растений.The aim of this invention is to increase the reliability of information about the functional state of plants in vitro without violating the sterility of the environment, as well as maintaining the viability of plants.

Способ осуществляется следующим образом. Оптическое излучение с длиной волны 460…470 нм и выходной мощностью 4…7 мВт направляют через стенку сосуда (пробирки, колбы) на хлорофилл-содержащий участок растения in vitro, регистрируют динамику изменения сигнала МИФХ в диапазоне длин волн от 670 до 760 нм в течение 10-30 секунд, рассчитывают скорость изменения сигнала МИФХ на 10…30 секунде после достижения максимального уровня флуоресценции F_M, рассчитывают значение виртуального стационарного уровня флуоресценции $F_{c}^{*}$

методом экстраполяции полученных данных для 120…300 секунды виртуальных измерений и определяют величину удельной фотосинтетической активности по формулеThe method is as follows. Optical radiation with a wavelength of 460 ... 470 nm and an output power of 4 ... 7 mW is sent through the wall of the vessel (test tubes, flasks) to the chlorophyll-containing portion of the plant in vitro, the dynamics of the MIFC signal is recorded in the wavelength range from 670 to 760 nm for 10-30 seconds, calculate the rate of change of the MIFC signal at 10 ... 30 seconds after reaching the maximum level of fluorescence F _M , calculate the value of the virtual stationary level of fluorescence

F_{c}^{*}

by extrapolating the data for 120 ... 300 seconds of virtual measurements and determine the specific photosynthetic activity by the formula

$Y = (F_{м} - F_{c}^{*}) / F_{c}^{*}, (2)$

Y = (F_{m} - F_{c}^{*}) / F_{c}^{*}, (2)

Функциональное состояния растений in vitro оценивается по соотношению значения удельной фотосинтетической активности, полученной в результате экстраполяции и скорости изменения сигнала МИФХ - чем выше один или оба параметра, тем лучше функциональное состояния растений in vitro. Благодаря тому, что измерительный цикл сокращается, уменьшается доза излучения до уровней, не приводящих к фотодеструктивным повреждениям клеток, и данный способ можно использовать для оценки активности фотосинтетического аппарата растений in vitro.The functional state of plants in vitro is assessed by the ratio of the specific photosynthetic activity obtained as a result of extrapolation and the rate of change of the MIFC signal — the higher one or both parameters, the better the functional state of plants in vitro. Due to the fact that the measuring cycle is reduced, the radiation dose is reduced to levels that do not lead to photodestructive damage to cells, and this method can be used to assess the activity of the photosynthetic apparatus of plants in vitro.

Устройство для осуществления предлагаемого способа включает источник оптического излучения синей области спектра (460…470 нм) 1; блок управления мощностью источника 2; регистратор интенсивности рассеянного объектом излучения 3, предварительный усилитель с блоком оцифровки сигналов 4; интерфейс 5; расчетное устройство 6 (фиг. 1). Поток монохроматического излучения направляется на актуальную зону измеряемого объекта 7. Рассеянное от объекта 7 излучение воспринимается регистратором 3, где оптическое излучение преобразуется в электрический сигнал, пропорциональный МИФХ (690-740 нм), и направляется в блок 4 для усиления и оцифровки. С помощью интерфейса 5 данные передаются в расчетное устройство 6, производящее расчет скорости изменения сигнала МИФХ, экстраполяцию кривой МИФХ на 120…300 секунд виртуального времени измерений по 10…30 секундам реального времени измерений и определение удельной фотосинтетической активности на заданное виртуальное время измерений. В качестве расчетного устройства может использоваться компьютер, оснащенный специализированной программой.A device for implementing the proposed method includes a source of optical radiation in the blue region of the spectrum (460 ... 470 nm) 1; power control unit source 2; the intensity recorder of the radiation scattered by the object 3, a preamplifier with a block for digitizing signals 4; interface 5; settlement device 6 (Fig. 1). The flow of monochromatic radiation is directed to the actual zone of the measured object 7. The radiation scattered from the object 7 is received by the recorder 3, where the optical radiation is converted into an electrical signal proportional to the IIHF (690-740 nm), and sent to block 4 for amplification and digitization. Using interface 5, the data are transmitted to calculating device 6, which calculates the rate of change of the MIFC signal, extrapolates the MIFC curve to 120 ... 300 seconds of virtual measurement time from 10 ... 30 seconds of real-time measurement, and determines the specific photosynthetic activity for a given virtual measurement time. As a calculation device, a computer equipped with a specialized program can be used.

Пример. Способ был применен для инструментальной оценки влияния ультрафиолетового излучения на функциональное состояние микропобегов ежевики сорта Блэк сэтин. Для атонального размножения in vitro применяли питательную среду по прописи Murashige, Skoog (MS) [9] с добавлением 1,0 мг/л 6-бензиламинопурина (6-БАП), 0,1 мг/л β-индолил-3-масляной кислоты (ИМК) и 1,0 мг/л гибберелловой кислоты. Культивирование осуществляли при 16-часовом световом дне, освещенности 2500 лк (люминесцентные лампы) и температуре 23±2°С. Через несколько дней после высадки на питательную среду экспланты были подвергнуты облучению ультрафиолетовым излучением УФ-А (300-400 им по уровню 0,1 спектральной кривой) дозами 180 и 540 кДж/м². Через 1 час после облучения ультрафиолетом и далее в то же самое время суток каждые 24 часа в течение последующих 4 дней проводили оценку функционального состояния фотосинтетического аппарата растений in vitro по заявленным способу и устройству. Запись медленной индукции флуоресценции осуществляли в течение 20 секунд при интенсивности возбуждающего излучения 6500 мкМ/м²с с длиной волны 470±10 нм. Измерения осуществляли через стеклянные стенки колб, без нарушения стерильности культуры, выбирая участки листовой поверхности микропобегов, максимально приближенных к стенке колбы. Определяли максимальный уровень флуоресценции, скорость спада флуоресценции на 5, 10 и 15 секунде от времени отсчета максимума, осуществляли экстраполяцию полученных данных на виртуальное время измерений, равное 120 секундам, по логарифмическому закону, для определения стационарного уровня флуоресценции и рассчитывали удельную фотосинтетическую активность по формуле (2).Example. The method was applied for instrumental assessment of the effect of ultraviolet radiation on the functional state of microprobe shoots of Black Setin blackberry. For atonal propagation in vitro, Murashige, Skoog (MS) formulation medium was used [9] with the addition of 1.0 mg / L 6-benzylaminopurine (6-BAP), 0.1 mg / L β-indolyl-3-butyric acid (IMA) and 1.0 mg / L of gibberellic acid. Cultivation was carried out at a 16-hour daylight, illumination of 2500 lux (fluorescent lamps) and a temperature of 23 ± 2 ° C. A few days after landing on a nutrient medium, the explants were irradiated with ultraviolet radiation UV-A (300-400 im level 0.1 spectral curve) doses of 180 and 540 kJ / m ² . 1 hour after irradiation with ultraviolet light and then at the same time every 24 hours for the next 4 days, the functional state of the photosynthetic apparatus of plants was assessed in vitro by the claimed method and device. The slow fluorescence induction was recorded for 20 seconds at an excitation radiation intensity of 6500 μM / m ² s with a wavelength of 470 ± 10 nm. The measurements were carried out through the glass walls of the flasks, without violating the sterility of the culture, choosing sections of the leaf surface of the microturns as close as possible to the wall of the flask. The maximum fluorescence level was determined, the fluorescence decay rate at 5, 10 and 15 seconds from the maximum reading time, the data were extrapolated to a virtual measurement time of 120 seconds, according to the logarithmic law, to determine the stationary level of fluorescence and the specific photosynthetic activity was calculated by the formula ( 2).

Заявляемые способ и устройство позволили уже через 1 час после УФ-облучения зафиксировать достоверное снижение функционального состояния растений in vitro (табл. 1 и 2). Как и следовало ожидать, более негативная реакция соответствует более высоким дозам ультрафиолетового излучения. Благодаря малой длительности измерений кривой МИФХ непосредственно через стенку колбы, без нарушения стерильности культивируемых, растений, можно следить за динамикой изменения функционального состояния растений в пострадиационный период. Растения in vitro, обученные УФ в дозе 180 кДж/м², практически полностью восстановили свою фотосинтетическую активность на 5 сутки после обработки. А растения, обработанные УФ в дозе 540 кДж/м², несмотря на попытку запуска репарационных процессов на 2 сутки после облучения, так и не смогли восстановиться ни по одному из измеренный показателей.The inventive method and device allowed 1 hour after UV irradiation to fix a significant decrease in the functional state of plants in vitro (Tables 1 and 2). As expected, a more negative reaction corresponds to higher doses of ultraviolet radiation. Due to the short duration of measurements of the MIFC curve directly through the wall of the flask, without violating the sterility of cultivated plants, one can monitor the dynamics of changes in the functional state of plants in the post-radiation period. In vitro plants trained in UV at a dose of 180 kJ / m ² almost completely restored their photosynthetic activity on the 5th day after treatment. And plants treated with UV at a dose of 540 kJ / m ² , despite the attempt to start repair processes on the 2nd day after irradiation, could not recover from any of the measured parameters.

Данный способ и устройство позволяют практически мгновенно определять изменения функционального состояния растений in vitro с минимальным влиянием на их жизнедеятельность и благодаря этому их можно использовать для оптимизации условий выращивания, выявления порога устойчивости к различным неблагоприятным факторам, следить за динамикой развития репарационных процессов на всех этапах культивирования, не нарушая при этом условия стерильности.This method and device allows almost instantly to determine changes in the functional state of plants in vitro with minimal impact on their livelihoods and due to this they can be used to optimize growing conditions, identify the threshold of resistance to various adverse factors, monitor the dynamics of the development of repair processes at all stages of cultivation, without violating the conditions of sterility.

ЛитератураLiterature

1. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнология на их основе: Учебное пособие. - М: ФБК-ПРЕСС, 1999. - 160 с.1. Butenko R.G. Biology of cells of higher plants in vitro and biotechnology based on them: Textbook. - M: FBK-PRESS, 1999 .-- 160 p.

2. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. - Киев: Наукова думка, 1980. - 487 с.2. Kalinin F.L., Sarnatskaya V.V., Polishchuk V.E. Methods of tissue culture in the physiology and biochemistry of plants. - Kiev: Naukova Dumka, 1980 .-- 487 p.

3. Мерзляк, М.Н. Гительсон Α.Α., Чивкунова О.Б., Соловченко А.Е., Погосян С.И. Использование спектроскопии отражения в анализе пигментов высших растений // Физиология растений. - 2003. - Т. 50, №5. - С. 785-792.3. Merzlyak, M.N. Gitelson Α.Α., Chivkunova O.B., Solovchenko A.E., Pogosyan S.I. The use of reflection spectroscopy in the analysis of pigments of higher plants // Plant Physiology. - 2003. - T. 50, No. 5. - S. 785-792.

4. Кувалдин, Э.В. Специализированный фотометр для измерения патологических и физиологических изменений в растениях / Э.В. Кувалдин, В.Г. Сурин // Оптический журнал. - 1998. - Т. 65, №5. - С. 43-46.4. Kuvaldin, E.V. Specialized photometer for measuring pathological and physiological changes in plants / E.V. Kuvaldin, V.G. Surin // Optical Journal. - 1998. - T. 65, No. 5. - S. 43-46.

5. Веселовский R.A., Веселова Т.В. Люминесценция растений. Теоретические и практические аспекты. - М.: Наука, 1990. - 200 с.5. Veselovsky R.A., Veselova T.V. Luminescence of plants. Theoretical and practical aspects. - M .: Nauka, 1990 .-- 200 p.

6. Корнеев, Д.Ю. Информационные возможности метода индукции флуоресценции хлорофилла / Д.Ю. Корнеев. - Киев: Альтенпресс, 2002. - 188 с.6. Korneev, D.Yu. Information possibilities of chlorophyll fluorescence induction method / D.Yu. Korneev. - Kiev: Altenpress, 2002 .-- 188 p.

7. Веселова, Т.В. Оценка состояния растений земляники, культивируемых in vitro, люминесцентным методом / Т.В. Веселова, О.Н. Высоцкая, В.А. Веселовский // Физиология растений. - 1994. - Т. 41, №6. - С. 942-946.7. Veselova, T.V. Assessment of the status of strawberry plants cultivated in vitro by the luminescent method / T.V. Veselova, O.N. Vysotskaya, V.A. Veselovsky // Plant Physiology. - 1994. - T. 41, No. 6. - S. 942-946.

8. А.с. №1750556 Способ отбора пробирочных растений земляники для беспересадочного хранения / В.А. Веселовский, Т.В. Веселова, О.Н. Самсонова // Б.И. 1992, №28, с. 18.8. A.S. No. 1750556 A method for the selection of test plants of strawberries for direct storage / V.A. Veselovsky, T.V. Veselova, O.N. Samsonova // B.I. 1992, No. 28, p. eighteen.

9. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plarit. - 1962. - V. 15, №13. - P. 473-497.9. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plarit. - 1962. - V. 15, No. 13. - P. 473-497.

Claims

A method for assessing the functional state of plants in vitro, which consists in determining the parameters of chlorophyll fluorescence, characterized in that they record the dynamics of the signal of slow induction of chlorophyll fluorescence in the wavelength range from 670 to 760 nm for 10-30 s, calculate the MIF signal change rate by 10 -30 second after reaching the maximum level of fluorescence F _M , calculate the value of the virtual stationary level of fluorescence

by extrapolating the obtained data for 120-300 seconds of virtual measurements and determine the specific photosynthetic activity by the formula:

, while the functional state of plants is judged by the ratio of the specific photosynthetic activity obtained as a result of extrapolation and the rate of change of the MIFC signal — the higher one or both parameters, the better the functional state of plants in vitro.