RU2597290C2

RU2597290C2 - Method of determining errors in dna mating function

Info

Publication number: RU2597290C2
Application number: RU2014103137/10A
Authority: RU
Inventors: Минна НУСТРЁМ; Минтту КАНСИКАС; Пяиви ПЕЛТОМЯКИ
Original assignee: Хельсингин Улиописто
Priority date: 2011-07-01
Filing date: 2012-06-29
Publication date: 2016-09-10
Also published as: CA2840526C; ES2646394T3; CN103827316B; FI20115709A0; EP2726629A1; BR112013033478A2; CA2840526A1; CN103827316A; US20140220559A1; WO2013004618A1; BR112013033478B1; DK2726629T3; AU2012280397B2; JP5897706B2; EP2726629B1; IL230002A; US9994899B2; JP2014520515A; RU2014103137A; PT2726629T

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: method envisages production of nuclear extracts with normal function MMR and lost function MMR as positive and negative control from diagnostic sample. Then performing mixing of each nuclear extract with substrate-DNA molecule, including at least one error mating bases, analysis of erroneously paired bases repair. Finally, it is determined whether said nuclear extract of sample is capable to repair said substrate-DNA molecule; wherein said sample includes normal non-malignant constitutional cells, for example, fibroblasts. Invention also relates to kit comprising required reagents for use in above method.

EFFECT: present invention relates to quantitative determination of whether examined person has disturbed repair function of erroneously paired DNA bases.

20 cl, 6 dwg, 2 tbl, 9 ex

Description

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯFIELD OF THE INVENTION

Настоящее изобретение относится к диагностике рака и предлагает способы, основанные на анализе репарации ошибочно спаренных оснований ДНК, определения, нарушена ли у обследуемого человека функция репарации ошибочно спаренных оснований ДНК; а также определения дефектного гена репарации ошибочно спаренных оснований ДНК, и, следовательно, определения повышения риска развития наследственных видов рака, в частности, колоректального рака. Указанный способ обеспечивает также новый способ диагностики синдрома Линча. В заявленном способе используется образец, происходящий из нормальной ткани, например фибробластов.The present invention relates to the diagnosis of cancer and provides methods based on the analysis of the repair of mismatched DNA bases, determining whether the examined person has a malfunction in the repair of mismatched DNA bases; as well as determining the defective DNA repair gene for mismatched DNA bases, and, therefore, determining the increased risk of developing hereditary cancers, in particular colorectal cancer. This method also provides a new method for the diagnosis of Lynch syndrome. The claimed method uses a sample originating from normal tissue, such as fibroblasts.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND

Колоректальный рак (КРР) представляет собой вторую по распространенности причину смертности от онкологических заболеваний в США и Европе. Согласно недавней обзорной статье Pino, M.S. и Chung, D.D. (Expert Rev Mol Diagn, 10(5): 651-665, 2010), КРР приводит к приблизительно 52000 смертям в год в США и 146000 смертям в год в Европейском Союзе. Приблизительно 2-5% впервые диагностированных КРР могут быть связаны с синдромом Линча.Colorectal cancer (CRC) is the second leading cause of cancer mortality in the United States and Europe. According to a recent review article by Pino, M.S. and Chung, D.D. (Expert Rev Mol Diagn, 10 (5): 651-665, 2010), CRC results in approximately 52,000 deaths per year in the United States and 146,000 deaths per year in the European Union. Approximately 2-5% of newly diagnosed CRC can be associated with Lynch syndrome.

Синдром Линча (СЛ), или наследственный неполипозный колоректальный рак (НПКРР) отличается ранним развитием колоректального рака и рака эндометрия, а также увеличенным риском развития некоторых других видов рака, помимо рака толстой кишки, в том числе других опухолей желудочно-кишечного тракта (желудка, тонкого кишечника, желчевыводящих путей), выделительной системы (лоханки почки, мочеточников) и женской половой системы (яичников).Lynch’s Syndrome (SL), or hereditary non-polyposis colorectal cancer (NCDC), is characterized by the early development of colorectal cancer and endometrial cancer, as well as an increased risk of developing other types of cancer besides colon cancer, including other tumors of the gastrointestinal tract (stomach, small intestine, biliary tract), excretory system (pelvis of the kidney, ureter) and the female reproductive system (ovaries).

В некоторых исследованиях отдельных семей с синдромом Линча риск развития рака толстой кишки в течение жизни оценивается как 70-80% при этом диагноз ставится в среднем в 40-50 лет. Вторым по распространенности видом рака при СЛ является рак эндометрия; у женщин с синдромом Линча имеется суммарный риск развития рака эндометрия и рака яичников в течение жизни, со средним возрастом постановки диагноза на 10 лет ранее, чем в случае спорадического рака. Риск развития рака желудка у пациентов с ЛС отличается в зависимости от популяции, он особенно высок частотой в таких регионах как Китай или Корея, где имеется высокий эндемический риск развития рак желудка - приблизительно 30% в течение жизни. В таких регионах, риск рака желудка превышает риск рака эндометрия.In some studies of individual families with Lynch syndrome, the risk of developing colon cancer during life is estimated at 70-80%, with an average diagnosis of 40-50 years. The second most common type of cancer in AL is endometrial cancer; women with Lynch syndrome have a cumulative risk of developing endometrial and ovarian cancer throughout life, with an average age of diagnosis 10 years earlier than in the case of sporadic cancer. The risk of developing stomach cancer in patients with drugs differs depending on the population; it is especially high in regions such as China or Korea, where there is a high endemic risk of developing stomach cancer - approximately 30% over a lifetime. In such regions, the risk of stomach cancer exceeds the risk of endometrial cancer.

Синдром Линча тесно связан с наследуемыми по аутосомному доминантному типу мутациями генов, играющих основную роль в механизме репарации ошибочно спаренных оснований ДНК (mismatch repair, далее MMR), и вызван генеративными мутациями в одном из генов репарации ошибочно спаренных оснований ДНК (гены MMR): MLH1, MSH2, MSH6 и PMS2. Помимо этого, нарушения MMR отмечаются в 25% спорадических опухолей толстой кишки, а также в ряде опухолей эндометрия, яичника и некоторых других органов и тканей. В норме, белки MMR распознают и исправляют неправильно спаренные нуклеотиды и петли, возникшие в результате инсерций и делеций, вызванных «проскальзыванием» ДНК-полимеразы в процессе репликации коротких повторов, так называемых микросателлитов.Lynch’s syndrome is closely related to mutations of genes inheriting in an autosomal dominant type that play a major role in the mechanism of mismatch repair (hereinafter MMR) repair and is caused by generative mutations in one of the mismatch repair DNA bases (MMR genes): MLH1 , MSH2, MSH6, and PMS2. In addition, MMR disorders are noted in 25% of sporadic colon tumors, as well as in a number of tumors of the endometrium, ovary, and some other organs and tissues. Normally, MMR proteins recognize and correct incorrectly paired nucleotides and loops resulting from insertions and deletions caused by slipping of DNA polymerase during replication of short repeats, the so-called microsatellites.

В механизме репарации ошибочно спаренных оснований (MMR), направленном на сохранение генома в неизменном виде, у человека участвуют пять белков, функционирующих в форме гетеродимеров: MutLa (MLH1 + PMS2), MutSa (MSH2 + MSH6) и MutSp (MSH2 + MSH3). Белки MMR исправляют ошибки спаривания оснований и небольшие инсерционно-делеционные петли (IDL), появляющиеся в заново синтезированной цепи ДНК при репликации и рекомбинации.The human base pair repair mechanism (MMR) aimed at preserving the genome unchanged in humans involves five proteins that function in the form of heterodimers: MutLa (MLH1 + PMS2), MutSa (MSH2 + MSH6) and MutSp (MSH2 + MSH3). MMR proteins correct base pairing errors and small insertion deletion loops (IDLs) that appear in the newly synthesized DNA strand during replication and recombination.

Чаще всего затронутыми оказываются гены MLH1, MSH2, MSH6 и PMS2, случаи генеративной изменчивости которых имеются в открытой базе данных по изменчивости LOVD (http://www.insight-qroup.org/; http://www.lovd.nl/). Большинство мутаций в генах MMR приводят к синтезу «усеченных» форм белка, тем не менее значительная часть мутаций генов MMR приводит к замене одной аминокислоты или делециям внутри рамки считывания, и такие мутации сложно отличить от безвредного полиморфизма. Такие изменения часто описывают как варианты с неопределенными значением (VUS), поскольку влияние таких вариантов изменчивости на функцию полипептида не описан.The most affected genes are MLH1, MSH2, MSH6, and PMS2, the cases of generative variability of which are available in the open database on LOVD variability (http://www.insight-qroup.org/; http://www.lovd.nl/) . Most of the mutations in the MMR genes result in the synthesis of truncated forms of the protein, however, a significant part of the mutations in the MMR genes leads to the replacement of one amino acid or deletions within the reading frame, and such mutations are difficult to distinguish from harmless polymorphism. Such changes are often described as variants with uncertain value (VUS), since the effect of such variants of variability on the function of the polypeptide is not described.

Опухоли с нарушением функции MMR тесно связаны с микросателлитной нестабильностью (MSI). Однако, степень и тип MSI различаются в зависимости от того, какой именно MMR-ген затронут мутацией (Kantelinen et al., British J Cancer, 1-6, 2010).Tumors with impaired MMR function are closely related to microsatellite instability (MSI). However, the degree and type of MSI varies depending on which particular MMR gene is affected by the mutation (Kantelinen et al., British J Cancer, 1-6, 2010).

Средний возраст возникновения рака при СЛ значительно ниже, чем средний возраст возникновения спорадического колоректального рака; это связано с тем, что пациент уже унаследовал предрасположенность, связанную с мутантным аллелем, и для потери активности MMR и образования опухоли необходима лишь вторая мутация того же гена в соматической клетке. Поэтому опухоли при СЛ отличаются отсутствием или сниженным уровнем соответствующего MMR белка, а также нарушенной репарацией ДНК, которая и приводит к MSI.The median age for cancer in SL is significantly lower than the median age for sporadic colorectal cancer; this is due to the fact that the patient has already inherited a predisposition associated with the mutant allele, and for the loss of MMR activity and tumor formation, only a second mutation of the same gene in the somatic cell is necessary. Therefore, tumors in SL are characterized by the absence or reduced level of the corresponding MMR protein, as well as impaired DNA repair, which leads to MSI.

Своевременная диагностика СЛ необходима для выявления пациентов, относящихся к группе риска, которым требуется интенсивная профилактика рака. Скрининг и удаление предраковых нарушений, аденом, существенно снижает заболеваемость и смертность у носителей мутацией в гене MMR (Järvinen et al., Gastroenterology 118: 829-834, 2000). Анализ соотношения эффективности и затрат, показывает, что скрининг и профилактика колоректального рака у носителей мутации в гене MMR эффективны и значительно менее затратны, чем последствия в случае их отсутствия. Согласно рекомендациям центров контроля и профилактики заболеваний (CDC) в США всем пациентам, у которых впервые диагностирован колоректальный рак, независимо от возраста и семейного анамнеза, предлагается пройти генетический тест на синдром Линча. В отчете CDC также указано, что имеющиеся в настоящее время данные не позволяют выбрать какую-либо конкретную стратегию скрининга из известных альтернативных стратегий.Timely diagnosis of SL is necessary to identify patients at risk who require intensive cancer prevention. Screening and removal of precancerous disorders, adenomas, significantly reduces the incidence and mortality of carriers with a mutation in the MMR gene (Järvinen et al., Gastroenterology 118: 829-834, 2000). An analysis of the ratio of efficiency and costs shows that screening and prevention of colorectal cancer in carriers of mutations in the MMR gene are effective and significantly less costly than the consequences if they are absent. According to the recommendations of the Centers for Disease Control and Prevention (CDC) in the United States, all patients who are diagnosed with colorectal cancer for the first time, regardless of age or family history, are invited to undergo a genetic test for Lynch syndrome. The CDC report also indicated that the current data does not allow the selection of any particular screening strategy from known alternative strategies.

При этом, большое разнообразие клинических фенотипов затрудняет диагностику СЛ и к настоящему времени разработано несколько клинических протоколов, направленных на то чтобы различить семьи с СЛ и общую заболеваемость КРК. В настоящее время, клинический диагноз СЛ основан преимущественного на Амстердамских критериях и уточненных протоколах Бетезда, которые учитывают возраст возникновения рака, число и распределение лиц с этим заболеванием в семье, а также уровень MSI (Pino & Chung, Supra). Однако многие семьи с СЛ не соответствуют этим критериям и могут быть распознаны как семьи с СЛ только при описании в этих семьях патогенной генеративной мутации гена MMR.At the same time, a wide variety of clinical phenotypes makes it difficult to diagnose SL and several clinical protocols have been developed to distinguish between families with SL and the general incidence of CRC. Currently, the clinical diagnosis of SL is based primarily on the Amsterdam criteria and Bethesda's updated protocols, which take into account the age of cancer, the number and distribution of people with this disease in the family, and the level of MSI (Pino & Chung, Supra). However, many families with AL do not meet these criteria and can be recognized as families with AL only when the pathogenic gene gene mutation of the MMR gene is described in these families.

Традиционная схема диагностики для выявления носителей мутаций генов MMR, т.е. лиц с синдромом Линча, состоит из нескольких стадий, в том числе исследование опухоли, анализе ДНК, тестах патогенности мутации in vitro, от выявления генетического нарушения до последующим исследования связи такого нарушения с способностью к MMR. Первая клиническая стадия диагностики опухолей, связанных с синдромом Линча, включает иммуногистохимический анализ (IHC) и анализ MSI с последующим скринингом мутаций на основании результатов IHC и MSI. Одной из стратегий скрининга мутаций является анализ всех четырех генов MMR (MLH1, MSH2, MSH6 и PMS2). При обнаружения патогенной мутации, диагноз СЛ может быть подтвержден, а в отсутствии изменений генов MMR такой диагноз можно считать маловероятным, но нельзя исключить (поскольку ни один из методов, ни по отдельности, ни в комбинации, не обладает 100% специфичностью и чувствительностью).The traditional diagnostic scheme for identifying carriers of MMR gene mutations, i.e. individuals with Lynch syndrome, consists of several stages, including a tumor study, DNA analysis, in vitro mutation pathogenicity tests, from the identification of a genetic disorder to the subsequent investigation of the relationship of such a disorder with the ability to MMR. The first clinical stage in the diagnosis of tumors associated with Lynch syndrome includes immunohistochemical analysis (IHC) and MSI analysis, followed by screening of mutations based on the results of IHC and MSI. One of the mutation screening strategies is the analysis of all four MMR genes (MLH1, MSH2, MSH6 and PMS2). If a pathogenic mutation is detected, the diagnosis of SL can be confirmed, and in the absence of changes in the MMR genes, such a diagnosis can be considered unlikely, but cannot be excluded (since none of the methods, either individually or in combination, has 100% specificity and sensitivity).

В недавней публикации авторов настоящего изобретения (Kansikas et al., Hum Mutat 32: 107-115, 2011) раскрыто, что оценка патогенности может быть основана на тестировании эффективности MMR для синтезированных in vitro мутантных белков. В опубликованном анализе MMR in vitro исследование фенотипические последствия мутаций СЛ в гомологичной человеческой системе MMR. Конструирование белка с искусственными мутациям СЛ требует обнаружения и полного описания соответствующего генетического дефекта на уровне последовательности ДНК.. Было предложено трехступенчатое дерево принятия решения (Couch et al., Hum Mutat 29: 1314-1326, 2008):A recent publication by the authors of the present invention (Kansikas et al., Hum Mutat 32: 107-115, 2011) discloses that pathogenicity assessment can be based on testing the effectiveness of MMR for in vitro synthesized mutant proteins. In a published in vitro MMR assay, the study of the phenotypic effects of SL mutations in a homologous human MMR system. The construction of a protein with artificial SL mutations requires the detection and full description of the corresponding genetic defect at the DNA sequence level. A three-step decision tree has been proposed (Couch et al., Hum Mutat 29: 1314-1326, 2008):

Однако современные тесты, применяемые для постановки клинического диагноза, обладают несколькими недостатками:However, modern tests used to make a clinical diagnosis have several drawbacks:

Исследование MSI требует значительных трудозатрат и экспертного уровня диагностики молекулярных патологий, при этом, хотя MSI и является отличительным признаком ЛС, это не специфический признак. Приблизительно в 10-25% спорадических случаев колоректального рака и многих видов рака, не связанных с толстым кишечником, отмечается MSI. Кроме того, случи связанного с ЛС и спорадического колоректального рака имеют много сходных гистопатологических признаков, однако различаются тем, что спорадические случае колоректального рака с MSI не связаны с семейным анамнезом.MSI research requires significant labor costs and an expert level in the diagnosis of molecular pathologies, although MSI is a hallmark of drugs, it is not a specific feature. In approximately 10–25% of sporadic cases of colorectal cancer and many non-colon cancers, MSI is noted. In addition, cases of drug-related and sporadic colorectal cancer have many similar histopathological features, however, they differ in that sporadic cases of colorectal cancer with MSI are not associated with a family history.

Потенциальный неустранимый недостаток теста IHC состоит в том, что его методика отчасти субъективна и зависит от качества изготовления препарата ткани, окрашивания и интерпретации результатов. Интересно, что аномальная картина окрашивания может быть связана с сохранностью ткани и микроокружением опухоли. Так, например, гипоксия ткани или окислительный стресс могут снижать функцию белков MMR даже в тканях с эффективной функций MMR, что приводит к потере окраски или слабой окраске. Вторичные аномалии генов MMR также могут приводить к необычной картине окрашивания.A potential fatal flaw in the IHC test is that its methodology is partly subjective and depends on the quality of fabric preparation, staining and interpretation of the results. Interestingly, the abnormal staining pattern may be associated with tissue preservation and the tumor microenvironment. So, for example, tissue hypoxia or oxidative stress can reduce the function of MMR proteins even in tissues with effective MMR functions, which leads to loss of color or weak coloring. Secondary abnormalities of the MMR genes can also lead to an unusual staining pattern.

Однако, наиболее очевидное ограничение современных способов диагностики ЛС связано с тем, что эти тесты основаны на генетическом исследовании и мутационном анализе лиц из семей с известным или предполагаемым СЛ в семейном анамнезе, или же пациентов, уже страдающим от рака. Этот факт делает современные способы диагностики неприменимыми при рутинном скрининге здоровых людей, которые предположительно могут быть носителями СЛ. Кроме того, схемы исследования требуют больших трудозатрат, хорошо оборудованных лабораторий и высококвалифицированного лабораторного персонала. По оценками, стоимость всех стадий, включая IHC, MSI и мутационный анализ составляет порядка 3500 евро за каждый тест, что слишком дорого для рутинного тестирования.However, the most obvious limitation of modern methods for diagnosing drugs is that these tests are based on a genetic study and mutational analysis of individuals from families with a known or suspected family history of SL, or patients already suffering from cancer. This fact makes modern diagnostic methods inapplicable in routine screening of healthy people who are suspected to be carriers of SL. In addition, research schemes require large labor costs, well-equipped laboratories and highly qualified laboratory personnel. According to estimates, the cost of all stages, including IHC, MSI and mutation analysis, is about 3,500 euros for each test, which is too expensive for routine testing.

Таким образом, существует определенная и признанная потребность в точном, более простом, но при этом более дешевом и применимом в условиях клиники тесте для определения того, является ли человек носителем мутаций в генах MMR, связанных с синдромом Линча, и, соответственно, относится ли он к группе повышенного риска развития колоректального рака, а также других видов рака.Thus, there is a definite and recognized need for an exact, simpler, but cheaper and more applicable test in a clinic to determine whether a person is a carrier of mutations in the MMR genes associated with Lynch syndrome and, accordingly, whether to an increased risk of developing colorectal cancer, as well as other types of cancer.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION

Целью настоящего изобретения является создание новых способов и средств выполнения аккуратных, простых, дешевых и походящих для клинического применения тестов выявления снижения эффективности MMR без предварительного знания анамнеза СЛ или рака у исследуемых лиц, и, таким образом, преодоление недостатков существующих способов диагностики. Настоящее изобретение относится к количественному способу определения, обладает ли обследуемый человек нарушенной функцией репарации ошибочно спаренных оснований ДНК, причем указанный способ включает а) получение ядерного экстракта образца, полученного у обследуемого человека, б) получение экстрактов ядерных белков, способных к MMR и неспособных к MMR в качестве положительного и отрицательного контроля, соответственно, в) комбинирование в отдельных сосудах каждого ядерного экстракта с гетеродуплексным ДНК-субстратом, включающим по меньшей мере одну ошибку спаривания оснований г) выполнение анализа репарации ошибочно спаренных оснований с указанным образцом и указанным субстратом и контрольными экстрактами ядерных белков и указанным субстратом, и д) определение, способен ли указанный ядерный экстракт к репарации указанного субстрата - молекулы ДНК. Предпочтительно, указанный образец включает нормальные клетки, полученные из конститутивной ткани, более предпочтительно фибробласты или клетки, полученные из крови.The aim of the present invention is the creation of new methods and means of performing accurate, simple, cheap and suitable for clinical use tests to detect a decrease in the effectiveness of MMR without prior knowledge of the history of SL or cancer in the subjects, and, thus, overcoming the disadvantages of existing diagnostic methods. The present invention relates to a quantitative method for determining whether an examined person has impaired DNA pair repair function, said method comprising a) obtaining a nuclear extract of a sample obtained from an examined person, b) obtaining extracts of nuclear proteins capable of MMR and not capable of MMR as a positive and negative control, respectively, c) combining in separate vessels of each nuclear extract with a heteroduplex DNA substrate, including necks least one error basepairing g) performing analysis of the repair of mismatched bases with said sample and said control substrate and extracts nuclear proteins and said substrate, and d) determining whether said is capable of nuclear extract to repair said substrate - DNA molecule. Preferably, said sample includes normal cells derived from constitutive tissue, more preferably fibroblasts or cells derived from blood.

В одном варианте осуществления изобретения, указанный субстрат получают из плазмиды, включающей последовательность SEQ ID N0: 1, и предпочтительно указанный субстрат дополнительно включает нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID N0: 2 и SEQ ID N0: 3.In one embodiment of the invention, said substrate is obtained from a plasmid comprising the sequence of SEQ ID N0: 1, and preferably said substrate further comprises a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID N0: 2 and SEQ ID N0: 3.

В другом варианте осуществления изобретения, ядерный экстракт с дефектной функцией MMR получен из линии клеток, выбранной из группы, состоящий из клеток НСТ116 и LoVo. В конкретном варианте осуществления изобретения, количество ядерного экстракта в каждом сосуде находится в диапазоне 50-500 мкг, предпочтительно 50-200 мкг, более предпочтительно 75-100 мкг.In another embodiment, a defective MMR nuclear extract is obtained from a cell line selected from the group consisting of HCT116 and LoVo cells. In a specific embodiment, the amount of nuclear extract in each vessel is in the range of 50-500 μg, preferably 50-200 μg, more preferably 75-100 μg.

Настоящее изобретение дополнительно относится к количественному способу выявления гена репарации ошибочно спаренных оснований, обладающего дефектной функцией, причем указанный способ включает а) получение ядерного экстракта образца, полученного у обследуемого человека, б) получение экстрактов ядерных белков с нормальной функцией MMR и дефектной функцией MMR в качестве положительного и отрицательного контроля, соответственно в) смешивание по крайней мере одного экстракта ядерных белков, с нормальный функцией MMR, с указанным ядерным экстрактом образца, г) комбинирование в отдельных сосудах каждого ядерного экстракта, полученного на стадиях а)-в) с гетеродуплексным ДНК-субстратом, включающим по меньшей мере одну ошибку спаривания оснований, д) выполнение анализа репарации ошибочно спаренных оснований с указанными ядерными экстрактами и указанным субстратом и е) выявление указанного дефектного гена путем определения того, способен ли указанный образец ядерного экстракта к репарации указанного субстрата и комплементации указанного ядерного экстракта с дефектной функцией MMR. Предпочтительно, указанный образец включает нормальные клетки, полученные из конститутивной ткани, более предпочтительно фибробласты или клетки, полученные из крови.The present invention further relates to a quantitative method for detecting a mismatch repair gene having a defective function, said method comprising a) obtaining a nuclear extract of a sample obtained from a subject, b) obtaining extracts of nuclear proteins with normal MMR function and defective MMR function as positive and negative controls, respectively c) mixing at least one nuclear protein extract, with normal MMR function, with the specified nuclear ext by sample cancer, d) combining in separate vessels of each nuclear extract obtained in stages a) -c) with a heteroduplex DNA substrate, including at least one base pairing error, e) analysis of the repair of incorrectly paired bases with the indicated nuclear extracts and the indicated substrate and e) detecting said defective gene by determining whether said sample of nuclear extract is capable of repairing said substrate and complementing said nuclear extract with defective function second MMR. Preferably, said sample includes normal cells derived from constitutive tissue, more preferably fibroblasts or cells derived from blood.

В одном из вариантов осуществления изобретения, указанный субстрат получают из плазмиды, включающей последовательность SEQ ID N0: 1, и предпочтительно указанный субстрат дополнительно включает нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID N0: 2 и SEQ ID N0: 3.In one embodiment of the invention, said substrate is obtained from a plasmid comprising the sequence of SEQ ID N0: 1, and preferably said substrate further comprises a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID N0: 2 and SEQ ID N0: 3.

Еще в одном варианте осуществления изобретения, ядерный экстракт с дефектной функцией MMR получен из линии клеток, выбранной из группы, состоящий из клеток НСТ116 и LoVo. В конкретном варианте осуществления изобретения, количество ядерного экстракта в каждом сосуде находится в диапазоне 50-500 мкг, предпочтительно 50-200 мкг, более предпочтительно 75-100 мкг.In yet another embodiment, a nuclear extract with a defective MMR function is obtained from a cell line selected from the group consisting of HCT116 and LoVo cells. In a specific embodiment, the amount of nuclear extract in each vessel is in the range of 50-500 μg, preferably 50-200 μg, more preferably 75-100 μg.

Дополнительно, настоящее изобретение относится к новому способу диагностики синдрома Линча у человека, основанному на выявлении дефектного гена репарации ошибочно спаренных оснований ДНК, на основании клинического образца, полученного из конститутивной ткани человека.Additionally, the present invention relates to a new method for the diagnosis of Lynch syndrome in humans, based on the identification of a defective DNA repair gene for mismatched DNA bases, based on a clinical sample obtained from human constitutive tissue.

Настоящее изобретение относится также к набору для применения в способах, согласно настоящему изобретению, который включает, по меньшей мере, один гетеродуплексный ДНК субстрат, включающий ошибку спаривания оснований, по меньшей мере один ядерный экстракт с дефектной функцией MMR, и ядерный экстракт с нормальной функцией MMR в качестве положительного контроля. Предпочтительно, указанные ядерные экстракты с дефектной функцией MMR получены из линии клеток, с потерей способности к MMR, обусловленной дефектами генов MLH1, MSH2 или MSH6, предпочтительно из клеток НСТ116 или LoVo.The present invention also relates to a kit for use in the methods of the present invention, which includes at least one heteroduplex DNA substrate, including base pairing error, at least one nuclear extract with a defective MMR function, and a nuclear extract with a normal MMR function as a positive control. Preferably, said nuclear extracts with a defective MMR function are obtained from a cell line, with loss of MMR ability due to defects in the MLH1, MSH2 or MSH6 genes, preferably from HCT116 or LoVo cells.

B конкретном варианте осуществления настоящего изобретения, указанный набор включает по меньшей мере два ядерных экстракта с дефектной функцией MMR.In a specific embodiment of the present invention, said kit comprises at least two nuclear extracts with a defective MMR function.

Еще в одном варианте осуществления, указанный набор может включать также дополнительные реактивы, необходимые для выполнения анализа MMR, например 10-кратный MMR буфер, включающий 200 мМ Трис-HCl с рН 7,6, 400 мМ KCl, 50 мМ MgCl₂, 10 мМ глутатиона, 500 мкг/мл БСА, 1 мМ каждого дНТФ и 15 мМ АТФ; а также СТОП раствор для анализа MMR, включающий 42 мМ ЭДТА, 1,2% СДС и 50,4 мкг/мл протеиназы К. Необязательно, указанный набор может также включать реактивы для осветления образца, например ТЭ буфер, фенол/хлороформ/изамиловый спирт и хлороформ; реагены для осаждения указанного образца, например NaCl и этиловый спирт; а также реагенты для выявления репарации, например РНКазу и ферменты рестрикции BglW и Eco31I с буфером и загрузочной краской.In yet another embodiment, the kit may also include additional reagents necessary for performing MMR analysis, for example a 10-fold MMR buffer comprising 200 mM Tris-HCl with a pH of 7.6, 400 mM KCl, 50 mM MgCl ₂ , 10 mm glutathione, 500 μg / ml BSA, 1 mM each dNTP and 15 mM ATP; as well as a STOP solution for MMR analysis, including 42 mM EDTA, 1.2% SDS and 50.4 μg / ml proteinase K. Optionally, this kit may also include reagents for clarifying the sample, for example, TE buffer, phenol / chloroform / isamyl alcohol and chloroform; reagents for precipitation of the specified sample, for example NaCl and ethyl alcohol; and repair reagents, such as RNase and BglW and Eco31I restriction enzymes with buffer and loading paint.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

Ниже изобретение будет описано более подробно с указанием предпочтительных вариантов воплощения изобретения и со ссылками на прилагаемые фигуры, на которых:Below the invention will be described in more detail indicating preferred embodiments of the invention and with reference to the accompanying figures, in which:

Фиг. 1: обзор способа согласно настоящему изобретению;FIG. 1: overview of a method according to the present invention;

Фиг. 2: анализ функции MMR в ядерном экстракте здоровых фибробластов (FB-WT, дикий тип) в сравнении с ядерным экстрактом, полученным из клеток с нормальной функцией MMR (HeLa) и контролем с дефектной функцией (MOCK) без ядерных белков;FIG. 2: analysis of MMR function in a healthy fibroblast nuclear extract (FB-WT, wild type) compared to a nuclear extract obtained from cells with normal MMR function (HeLa) and defective function control (MOCK) without nuclear proteins;

Фиг. 3: анализ Вестерн-блот, который показывает а) содержание белка MMR (MLH1 и его партнер PMS2) в ядерном экстракте здоровых фибробластов (FB-WT, дикий тип) в сравнении с полученной из фибробласта клеточной линией FB-M1 с частичной подавленной экспрессией MLH1 и б) содержание белка MMR (MSH2 и его партнера MSH6) в FB-WT в сравнении с полученной из фибробласта клеточной линией FB-SH13 с частичным подавленной экспрессией MSH2.FIG. 3: Western blot analysis, which shows a) the content of the MMR protein (MLH1 and its partner PMS2) in the nuclear extract of healthy fibroblasts (FB-WT, wild type) compared with fibroblast-derived cell line FB-M1 with partial suppressed expression of MLH1 and b) the content of the MMR protein (MSH2 and its partner MSH6) in FB-WT compared to fibroblast-derived FB-SH13 cell line with partial suppressed expression of MSH2.

Фиг. 4: количественный анализ функции MMR, показывающий, что дефицит MLH1 a FB-M1 и MSH2 a FB-SH13 выявляется по снижению эффективности репарации различной степени выраженности. Сравнительная доля успешной репарации показана в сравнении с эффективностью репарации в FB-WT; иFIG. 4: quantitative analysis of the MMR function, showing that deficiency of MLH1 a FB-M1 and MSH2 a FB-SH13 is detected by a decrease in the efficiency of repair of varying severity. The comparative success rate of repair is shown in comparison with the efficiency of repair in FB-WT; and

Фиг. 5 количественный анализ функции MMR где показано, что различная эффективность MMR клеток FB-WT и FB-M1 может выявляться при применении ядерного экстракта НСТ116 с дефицитом MLH1); иFIG. 5 quantitative analysis of the MMR function, where it is shown that the different MMR efficiencies of FB-WT and FB-M1 cells can be detected by using HCT116 nuclear extract with MLH1 deficiency) and

Фиг. 6 представляет собой схематическое изображение получения субстрата, в том числе показаны плазмиды pGEM-IDL40, pGEM-IDLGT и pGEM-IDL39, и их производные конструкции 5′IDLGT и 54DL1.FIG. 6 is a schematic representation of substrate preparation, including plasmids pGEM-IDL40, pGEM-IDLGT and pGEM-IDL39, and their derivative constructs 5′IDLGT and 54DL1.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Неожиданно было обнаружено, что функциональный анализ эффективности репарации ошибочно спаренных оснований ДНК (MMR) может применяться для выявления индивидуумов с наследственным нарушением MMR, у которых существует связанный с таким нарушением существенный риск развития рака. В настоящем изобретении предложен новый анализ функции MMR, направленный на выявление нарушенной способности к MMR (Фиг. 1). Анализ, согласно настоящему изобретению, применим в отсутствии предварительной информации о последовательности соответствующего гена MMR или регуляторного изменения, семейного анамнеза, онкологического анамнеза или результатов иммуногистохимического анализа, и поэтому представляет собой новый подход к диагностике. Заявленный способ анализа идеально подходит для скрининга носителей MMR мутаций в больших популяциях и, таким образом, для обнаружения лиц с высоким риском развития рака.Unexpectedly, it was found that a functional analysis of the efficiency of repair of mismatched DNA bases (MMR) can be used to identify individuals with a hereditary MMR disorder who have a significant risk of developing cancer associated with this disorder. The present invention proposed a new analysis of the function of MMR, aimed at identifying impaired ability to MMR (Fig. 1). The analysis according to the present invention is applicable in the absence of preliminary information about the sequence of the corresponding MMR gene or regulatory change, family history, cancer history or the results of immunohistochemical analysis, and therefore represents a new diagnostic approach. The claimed assay method is ideally suited for screening carriers of MMR mutations in large populations and thus for detecting individuals at high risk of developing cancer.

Настоящее изобретение относится к простому протоколу теста, включающему только один анализ, в то время как стандартная схема диагностики для выявления носителей мутаций гена MMR (синдрома Линча) включает несколько тестов, от выявления генетического дефекта до оценки того, связан ли выявленный дефект со сниженной способностью к MMR. В настоящем изобретении предложен одностадийный способ, позволяющий оценить, является ли индивидуум носителем дефекта MMR с помощью количественного анализа функции MMR. Способ согласно настоящему изобретению основан на выявлении сниженной способности к MMR в образце нормальной ткани, например, крови, слизистой или фибробластов, предпочтительно фибробластов или лимфобластов, полученных у обследуемого пациента.The present invention relates to a simple test protocol that includes only one analysis, while the standard diagnostic scheme for detecting carriers of mutations of the MMR gene (Lynch syndrome) includes several tests, from identifying a genetic defect to assessing whether a detected defect is associated with a reduced ability to MMR The present invention provides a one-step method for assessing whether an individual is a carrier of an MMR defect by quantitative analysis of the MMR function. The method according to the present invention is based on the detection of reduced ability to MMR in a sample of normal tissue, for example, blood, mucous membranes or fibroblasts, preferably fibroblasts or lymphoblasts obtained from an examined patient.

В настоящей заявке, термин «нормальная» ткань подразумевает любую здоровую, незлокачественную ткань, предпочтительно конститутивную ткань.As used herein, the term “normal” tissue refers to any healthy, non-cancerous tissue, preferably constitutive tissue.

В настоящей заявке, термин «конститутивная ткань», обозначает ткань, состоящую из незлокачественных клеток, которые по существу отражают генетический состав, унаследованный при рождении, которая может быть получена из любой доступной для взятия образца части тела человека, например слизистую оболочку или фибробласты.As used herein, the term “constitutive tissue” means tissue composed of non-cancerous cells that essentially reflect the genetic makeup inherited at birth, which can be obtained from any part of the human body available for sampling, such as mucous membranes or fibroblasts.

Протокол теста, согласно настоящему изобретению, относится к количественному способу. В настоящей заявке, термин «количественный способ» означает способ, при применении которого получают данные о различной степени эффективности MMR, т.е. не тест с ответом «да» или «нет». Заявленный анализ функции MMR выявляет нарушения белков MMR по снижению эффективности репарации (см. Фигуру 4 в отношении MLH1 и MSH2). В настоящей заявке гены MMR или белки MMR означают любые гены или белки, участвующие в процессе MMR, например, выбранные из группы, состоящей из MLH1, MSH2, MSH6, MLH3, MSH3, PMS1, PMS2 и ЕХ01. В конкретном варианте воплощения, нарушения белков MMR MLH1, MSH2 и/или MSH6 выявляются способом или средствами согласно настоящему изобретению. Действительно, некоторая способность к исправлению ошибочно спаренных оснований сохраняется, например, в том случае, если имеется лишь один нормальный аллель гена MMR, что имеет место в любых нормальных клетках носителей мутации MMR в семьях с СП, или же в том случае, если ген MMR частично потерял активность. Для сравнения, в известных из уровня техники тестах, в которых используются раковые клетки, определяют, присутствует или отсутствует функция MMR, (т.е. присутствуют оба аллеля дикого типа) или (отсутствуют оба аллеля дикого типа), представляющие тесты MMR с ответом «да» или «нет».The test protocol of the present invention relates to a quantitative method. In the present application, the term "quantitative method" means a method, in the application of which data are obtained on various degrees of MMR efficiency, i.e. not a test with an answer of yes or no. The claimed analysis of the function of MMR reveals violations of the MMR proteins to reduce the efficiency of repair (see Figure 4 in relation to MLH1 and MSH2). In this application, MMR genes or MMR proteins mean any genes or proteins involved in the MMR process, for example, selected from the group consisting of MLH1, MSH2, MSH6, MLH3, MSH3, PMS1, PMS2 and EX01. In a particular embodiment, disorders of the MMR proteins MLH1, MSH2 and / or MSH6 are detected by the method or means of the present invention. Indeed, some ability to correct mistakenly paired bases is preserved, for example, if there is only one normal allele of the MMR gene, which occurs in any normal cells of carriers of the MMR mutation in families with SP, or if the MMR gene partially lost activity. In comparison, tests known in the art that use cancer cells determine whether MMR function is present or absent (i.e. both wild-type alleles are present) or (both wild-type alleles are absent) representing MMR tests with the answer “ Yes or no".

Репарация ошибочно спаренных оснований (MMR) ДНК происходит в ядре клетки, и в процессе репарации принимают участие только MMR белки ядра. С помощью способа согласно настоящему изобретению возможен анализ функциональности участвующих в MMR белков, которые направляются в ядро для осуществления репарационной активности in vivo, поскольку в этом способе в качестве исходного материала применяется ядерный экстракт. В отличие от этого при традиционной схеме анализ функции MMR применяется для исследования эффективности MMR мутантных белковых продуктов MMR, сконструированных in vitro. В этих испытаниях in vitro, тестируемые белки искусственно добавляют к ядерному экстракту, что не позволяет возможность изучать только белки, имеющиеся в ядрах в естественной ситуации. Таким образом, тест патогенности, согласно настоящему изобретению, отличается от функциональных тестов, известных из уровня техники, тем, что в нем раскрывается природная способность ядра к MMR. Таким образом, с помощью способа согласно настоящему изобретению, возможно обнаружить проблемы внутриядерной локализации MMR белков.Mismatched base repair (MMR) DNA repair occurs in the cell nucleus, and only MMR core proteins are involved in the repair process. Using the method according to the present invention, it is possible to analyze the functionality of the proteins participating in the MMR, which are sent to the nucleus for in vivo repair activity, since the nuclear extract is used as the starting material in this method. In contrast, in a traditional design, an MMR function analysis is used to study the MMR potency of mutant MMR protein products constructed in vitro. In these in vitro tests, the test proteins are artificially added to the nuclear extract, which makes it impossible to study only the proteins present in the nuclei in a natural situation. Thus, the pathogenicity test according to the present invention differs from functional tests known in the art in that it reveals the natural ability of the nucleus to MMR. Thus, using the method according to the present invention, it is possible to detect problems of intranuclear localization of MMR proteins.

В способах, известных из уровня техники, используются клеточные экстракты, например цитоплазматические экстракты (СЕ), а не ядерные экстракты. Тесты с использованием цитоплазматических экстрактов не дают правильной информации о количествах и долях MMR белков, которые в реальности способны осуществлять процесс репарации. Таким образом, тесты с цитоплазматическими экстрактами применимы лишь как тесты с ответом «да» или «нет», но не как количественное тестирование MMR.Methods known in the art use cell extracts, such as cytoplasmic extracts (CE), rather than nuclear extracts. Tests using cytoplasmic extracts do not provide the correct information on the amounts and fractions of MMR proteins that are actually capable of carrying out the repair process. Thus, tests with cytoplasmic extracts are applicable only as tests with the answer “yes” or “no”, but not as a quantitative testing of MMR.

При способах согласно настоящему изобретению, способность к MMR непосредственно выявляется в агарозном геле, без применения косвенных способов определения, таких как комплементационный анализ в E.coli, где выявление осуществляется по экспрессии гена lacZα.In the methods of the present invention, the ability to MMR is directly detected on an agarose gel, without the use of indirect determination methods, such as complementation analysis in E. coli, where detection is carried out by expression of the lacZα gene.

Одностадийный анализ согласно настоящему изобретению может необязательно включать стадии идентификации гена с генетическим или эпигенетическим дефектом, с которым связано нарушение MMR, или дополняться такими стадиями; однако эти стадии необязательны для постановки клинического диагноза. В отличие от традиционных тестов, способ согласно настоящему изобретению позволяет выявить лиц с повышенной предрасположенностью к раку, связанной с нарушенной MMR даже в том случае, если ни у одного из членов семьи еще не развился рак, если мутационные тесты не показывают выявляемых различий и в тех случаях, когда причиной является не генетическое а эпигенетическое (регуляторное) изменение.The one-step analysis according to the present invention may optionally include or be supplemented with stages of identification of a gene with a genetic or epigenetic defect associated with an MMR disorder; however, these stages are not necessary for making a clinical diagnosis. Unlike traditional tests, the method according to the present invention allows to identify individuals with an increased susceptibility to cancer associated with impaired MMR even if none of the family members has developed cancer, if mutation tests do not show any detectable differences in cases when the cause is not genetic but epigenetic (regulatory) change.

Основной принцип, а также различные варианты осуществления предлагаемого анализа показаны в виде схемы в Таблице 1, где Y обозначает экстракт ядерных белков с нарушенной MMR, X обозначает экстракт ядерных белков из тестируемого образца и Z обозначает экстракт ядерных белков с нормальной функцией, MMR применяемый в качестве положительного контроля.The basic principle, as well as various options for the implementation of the proposed analysis, are shown in the diagram in Table 1, where Y denotes an extract of nuclear proteins with impaired MMR, X denotes an extract of nuclear proteins from a test sample and Z denotes an extract of nuclear proteins with normal function, MMR used as positive control.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения экстракт ядерных белков тестируемого образца (X) получают из культуры нормальных клеток, например фибробластов, взятых у тестируемого пациента, и анализ функции MMR, согласно настоящему изобретению, выполняется в сосудах, содержащих Y (ядерный экстракт с дефектной функцией MMR), X и Z (ядерный экстракт с нормальной функцией MMR в качестве положительного контроля), соответственно. Реакция репарации превращает гетеродуплексы, устойчивые к расщеплению эндонуклеазами рестрикции в гомодуплексы, которые могут быть расщеплены. В случае, если образец X способен к MMR, субстратный гетеродуплекс будет, таким образом, расщеплен и линеаризован с получением трех фрагментов, при этом если X неспособен к MMR, при линеаризации образуется только один фрагмент. Таким же образом, Y даст только один фрагмент, в то время как Z даст три фрагмента. Этот вариант осуществления настоящего изобретения, +/- анализ MMR (+/- обозначает, что один из аллелей гена MMR является функциональным, а второй - дефектным), позволяет определить, обладает тестируемый пациент нарушенной/дефектной функцией MMR или нормальной функцией MMR.In one embodiment of the present invention, the nuclear protein extract of the test sample (X) is obtained from a culture of normal cells, for example fibroblasts, taken from a test patient, and the MMR function analysis of the present invention is performed in vessels containing Y (nuclear extract with defective MMR function ), X and Z (nuclear extract with normal MMR function as a positive control), respectively. The repair reaction converts heteroduplexes that are resistant to restriction endonuclease digestion into homoduplexes that can be cleaved. If sample X is capable of MMR, the substrate heteroduplex will thus be split and linearized to produce three fragments, while if X is not capable of MMR, only one fragment will be formed during linearization. In the same way, Y will give only one fragment, while Z will give three fragments. This embodiment of the present invention, +/- analysis of the MMR (+/- indicates that one of the alleles of the MMR gene is functional and the second is defective), allows you to determine whether the test patient has impaired / defective MMR function or normal MMR function.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения, ядерный экстракт образца (X) применятся для комплементации нормальной функции MMR в ядерном экстракте (Y), с образованием смеси X+Y. Дополненные тестируемые образцы (X+Y), а также положительный (Z) и отрицательный (Y) контроли, применяются затем при анализе функции MMR согласно настоящему изобретению для исследования способности к репарации ошибочно спаренных оснований. Эффективность репарации выражают количественно, измеряя эффективность расщепления, используя при этом в качестве уровня отсчета эффективность репарации нормального ядерного экстракта фибробластов (Z), что проиллюстрировано в Примере 8 и на Фиг. 4.In another embodiment of the present invention, a nuclear extract of the sample (X) is used to complement the normal function of the MMR in the nuclear extract (Y) to form an X + Y mixture. The supplemented test samples (X + Y), as well as the positive (Z) and negative (Y) controls, are then used in the analysis of the MMR function of the present invention to study the ability to repair mis-paired bases. The repair efficiency is quantified by measuring the cleavage efficiency, using the repair efficiency of a normal fibroblast nuclear extract (Z) as a reference level, as illustrated in Example 8 and FIG. four.

Число включенных в анализ ядерных экстрактов с дефектом MMR (Y_n) может изменяться в зависимости от того, нужно ли выявить конкретный дефект(ы). В одном из предпочтительных вариантов осуществления способа, согласно настоящему изобретению, Υ₁ имеет дефицит MLH1, Υ₂ имеет дефицит MSH2/MSH6. Еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения Υ₃ имеет дефицит PMS2. Однако любой их указанных ядерных экстрактов с дефектом MMR (Υ_n) может быть исключен или добавлен в способ или применен в любой комбинации. Специалист в данной области техники способен сформировать тест-панель, подходящую для конкретной клинической ситуации.The number of nuclear extracts with a defect in MMR (Y _n ) included in the analysis may vary depending on whether specific defect (s) need to be identified. In one preferred embodiment of the method according to the present invention, Υ ₁ has a deficiency of MLH1, Υ ₂ has a deficiency of MSH2 / MSH6. In yet another embodiment of the present invention, No. ₃ has a deficiency of PMS2. However, any of these nuclear extracts with a defect of MMR (Υ _n ) can be excluded or added to the method or applied in any combination. A person skilled in the art is able to form a test panel suitable for a particular clinical situation.

Выполнение типичного диагностического анализа согласно настоящему изобретению подробно описано ниже.The implementation of a typical diagnostic analysis according to the present invention is described in detail below.

А. Образцы тканиA. Tissue samples

Тестируемый образец ткани может представлять собой любую нормальную ткань, удобную для взятия и обработки. В одном из конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения, выбранный образец ткани представляет собой образец кожи, полученный с помощью пункции или иссечения, любым способом, хорошо известным специалистам в области медицины.The tissue sample to be tested may be any normal tissue suitable for collection and processing. In one specific embodiment of the present invention, the selected tissue sample is a skin sample obtained by puncture or excision, by any method well known to specialists in the field of medicine.

Другие образцы ткани, которые могут применяться в способе согласно настоящему изобретению, включают образцы крови и мазки слизистых оболочек.Other tissue samples that can be used in the method according to the present invention include blood samples and smears of the mucous membranes.

Б. Размножение клеток образцаB. Reproduction of sample cells

Для исследования способности клеток к репарации ошибочно спаренных оснований (MMR), до экстракции ядерных белков необходимо нарастить достаточное количество клеток. Клетки выращивают в стандартных условиях клеточной культуры, подходящих для данного типа клеток и хорошо известных в данной области техники, затем собирают центрифугированием в мягких условиях.To study the ability of cells to repair mis-paired bases (MMR), a sufficient number of cells must be built up before nuclear protein extraction. Cells are grown under standard cell culture conditions suitable for a given cell type and well known in the art, then harvested by centrifugation under mild conditions.

В способе согласно изобретению может применяться любой тип клеток, полученный из клинического образца, взятого у пациента-человека, в том числе злокачественные клетки, полученные из опухоли. При этом предпочтительно использовать в тесте человеческие фибробласты. Еще один предпочтительный тип клеток представляет собой клетки, полученные из крови человека, например лимфоциты.In the method according to the invention, any type of cell obtained from a clinical sample taken from a human patient, including malignant cells obtained from a tumor, can be used. It is preferable to use human fibroblasts in the test. Another preferred cell type is cells derived from human blood, such as lymphocytes.

Наиболее предпочтительно, клетки, применяемые в тесте согласно настоящему изобретению представляют собой нормальные первичные клетки или трансформированные нормальные клетки.Most preferably, the cells used in the assay of the present invention are normal primary cells or transformed normal cells.

В. Экстракция ядерных белков из фибробластов человекаB. Extraction of nuclear proteins from human fibroblasts

MMR белки экстрагируют из ядер клеток. Клетки осаждают центрифугированием, подсчитывают и промывают солевым буфером для удаления остатков триписна. Клетки дополнительно промывают изотоническим раствором, затем осаждают центрифугированием и подвергают набуханию путем промывки гипотоническим раствором. Мембраны клеток разрушают тонкой иглой до тех пор, пока большая часть клеток не будет лизирована (что проверяется под микроскопом). После осаждения клеток, удаляют супернатант, содержащий цитоплазматическую фракцию. Ядерные белки экстрагируют из оставшейся ядерной фракции путем инкубации в холодном буфере для экстракции с солью, после чего оставшийся ядерные частицы отделяют центрифугированием, удалив полученную пеллету осадка. Экстрагированный образец ядерных белков затем подвергают диализу в присутствии ингибиторов протеиназ, затем очищают центрифугированием и хранят при -80°С. Содержание в образцах белка измеряют с помощью флоуориметра.MMR proteins are extracted from cell nuclei. Cells are pelleted by centrifugation, counted and washed with saline buffer to remove triscript residues. Cells are additionally washed with an isotonic solution, then precipitated by centrifugation and subjected to swelling by washing with a hypotonic solution. Cell membranes are destroyed with a thin needle until most of the cells are lysed (which is checked under a microscope). After cell precipitation, the supernatant containing the cytoplasmic fraction is removed. Nuclear proteins are extracted from the remaining nuclear fraction by incubation in cold extraction buffer with salt, after which the remaining nuclear particles are separated by centrifugation, removing the resulting pellet pellet. The extracted nuclear protein sample is then dialyzed in the presence of proteinase inhibitors, then purified by centrifugation and stored at -80 ° C. The protein content of the samples is measured using a flowmeter.

Г. Приготовление субстратаD. Preparation of the substrate

Кольцевой гетеродуплексный субстрат-плазмиду для применения при анализе Анализ функции MMR согласно настоящему изобретению получают путем ренатурации одноцепочечной ДНК (оцДНК) и денатурированной комплементарной плазмидной ДНК с одним негомологичным сайтом.Ring heteroduplex substrate plasmid for use in the analysis. An MMR function analysis of the present invention is obtained by renaturation of single-stranded DNA (ssDNA) and denatured complementary plasmid DNA with one non-homologous site.

оцДНК получают из плазмиды с помощью бактериальных клеток и коммерческого хелперного фага, с сильным отбором с антибиотиком. Клеточные остатки удаляют центрифугированием, затем собирают частицы фага путем осаждения и дополнительного центрифугирования. Бактериальные клетки также удаляют центрифугированием и оставшуюся ДНК бактериального происхождения удаляют ферментативной обработкой. После очистки образца, оцДНК очищают от капсидных белков фага ферменативно с помощью протеиназы.ssDNA is obtained from the plasmid using bacterial cells and a commercial helper phage, with strong selection with antibiotic. Cell debris is removed by centrifugation, then phage particles are collected by sedimentation and further centrifugation. Bacterial cells are also removed by centrifugation and the remaining DNA of bacterial origin is removed by enzymatic treatment. After purification of the sample, ssDNA is purified from the capsid proteins of the phage enzymatically using proteinase.

Двуцепочечную (дц) плазмидную матрицу, включающую ошибочно спаренные основания, амплифицируют и очищают из бактериальных клеток. Для получения 5′ разрыва, расположенного перед сайтом с ошибкой, применяется специфическая рестриктаза, которая линеаризует конструкцию, после чего образец осаждают и растворяют в соответствующем объеме буфера.A double-stranded (dc) plasmid matrix, including mistakenly paired bases, is amplified and purified from bacterial cells. To obtain a 5 ′ gap located in front of the site with an error, a specific restriction enzyme is used that linearizes the structure, after which the sample is precipitated and dissolved in an appropriate volume of buffer.

Для того чтобы получить включающий ошибку гетеродуплексный субстрат для анализа функции MMR согласно настоящему изобретению, оцДНК и описанную выше комплементарную ДНК денатурируют и повторно ренатруируют вместе. Чистоту конечного продукта, в том числе удаление солей и негибридизованной линейной дцДНК, а также негибридизованной оцДНК обеспечивают стадий отмывки с последующим осаждением этанолом. Концентрацию измеряют с помощью спектрофотометра и гель-электрофорезом, который также служит для проверки чистоты образца.In order to obtain an error-comprising heteroduplex substrate for the analysis of the MMR function of the present invention, the ssDNA and the complementary DNA described above are denatured and re-renated together. The purity of the final product, including the removal of salts and non-hybridized linear dsDNA, as well as non-hybridized ssDNA, is ensured by washing steps followed by ethanol precipitation. Concentration is measured using a spectrophotometer and gel electrophoresis, which also serves to verify the purity of the sample.

Д. Анализ функции MMR согласно настоящему изобретениюD. Analysis of the function of MMR according to the present invention

Как указано выше анализ функции MMR согласно настоящему изобретению может применяться не только для определения того, дефектна или нет функция MMR в тестируемом образце, но позволяет также различать способность к MMR ядерных белков, выделенных из клеток с дефектной функцией MMR, и ядерных белков, выделенных из клеток с утраченной функией MMR. Для выявления гена, с которых связан дефект MMR, полученные из образцов ядерные экстракты (X) применяются для дополнения ядерных экстрактов с дефицитом MLH1 (Y₁) и MSH2/MSH6 (Υ₂).As indicated above, the analysis of the MMR function according to the present invention can be used not only to determine whether the MMR function is defective or not in the test sample, but also allows you to distinguish between the MMR ability of nuclear proteins isolated from cells with defective MMR function and nuclear proteins isolated from cells with a lost function of MMR. To identify the gene with the associated MMR defect, nuclear extracts (X) obtained from the samples are used to supplement nuclear extracts with deficiency of MLH1 (Y ₁ ) and MSH2 / MSH6 (Υ ₂ ).

Анализ функции MMR согласно настоящему изобретению выполняется путем смешивания 50-500 мкг, предпочтительно приблизительно 50-200 мкг, более предпочтительно приблизительно 75-100 мкг, экстракта ядерных белков с избыточным количеством субстрата - кольцевой (гетеродуплексной), плазмиды; при этом в случае комплементации хорошо известной клеточной линии с дефицитом MMR для выявления гена, вызывающего недостаточность функции MMR, общее количество двух используемых при анализе субстратов не должно превышать 200 мкг. Реакция репарации активируется в присутствии MMR буфера, обеспечивающего оптимальные концентрации солей, и в то же время обеспечивающего присутствие АТФ и дезоксирибонуклеотидов. Реакция репарации завершается ферментативно, затем белки удаляются из образца с помощью экстракции фенолом/хлороформом/изоамиловым спиртом.An analysis of the MMR function of the present invention is performed by mixing 50-500 μg, preferably about 50-200 μg, more preferably about 75-100 μg, of an extract of nuclear proteins with an excessive amount of substrate — a ring (heteroduplex) plasmid; in the case of complementation of the well-known cell line with MMR deficiency to identify the gene that causes the lack of MMR function, the total number of two substrates used in the analysis should not exceed 200 μg. The repair reaction is activated in the presence of an MMR buffer that provides optimal salt concentrations and at the same time ensures the presence of ATP and deoxyribonucleotides. The repair reaction is completed enzymatically, then the proteins are removed from the sample by extraction with phenol / chloroform / isoamyl alcohol.

После осаждения образец подвергают двойному расщеплению, при этом, если репарация прошла успешно, гетеродуплексная ДНК-субстрат расщепляется на два фрагмента меньшего размера. Эти два фрагмента меньшего размера выявляют с помощью электрофореза в агарозном геле. Поскольку ДНК-субстрат добавляют в избытке, во всех случаях на геле виден также линеаризованный продукт полной длины. В его отсутствии виден только этот полноразмернаый фрагмент линеаризованной ДНК плазмиды.After deposition, the sample is subjected to double cleavage, and if the repair is successful, the heteroduplex DNA substrate is split into two smaller fragments. These two smaller fragments are detected by agarose gel electrophoresis. Since the DNA substrate is added in excess, in all cases a linearized full length product is also visible on the gel. In its absence, only this full-sized fragment of the linearized plasmid DNA is visible.

Еще одна задача настоящего изобретения состоит в создании набора, включающего необходимые реагенты для способа, согласно настоящему изобретению. Набор, согласно настоящему изобретению, включает стандартные реагенты, например необходимый гетеродуплексный(-ые) ДНК субстрат(ы), включающие ошибочно спаренные нуклеотилы; по меньшей мере один, но предпочтительно два, ядерных экстракта утраченной функцией MMR; и ядерный экстракт с нормальной функцией MMR в качестве положительного контроля. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения, указанные ядерные экстракты с дефектной функцией MMR получены из линий клеток с дефицитом MLH1 и MSH2/MSH6, соответственно. А именно, такие, указанные ядерные экстракты с утраченной функцией MMR получены из клеток НСТ116 и LoVo.Another objective of the present invention is to provide a kit comprising the necessary reagents for the method according to the present invention. The kit according to the present invention includes standard reagents, for example, the required heteroduplex (s) DNA substrate (s), including erroneously paired nucleotyls; at least one, but preferably two, nuclear extracts of lost MMR function; and a nuclear extract with normal MMR function as a positive control. In specific embodiments of the present invention, said MMR defective nuclear extracts are derived from MLH1 and MSH2 / MSH6 deficient cell lines, respectively. Namely, such indicated nuclear extracts with lost MMR function were obtained from HCT116 and LoVo cells.

Входящие в набор, согласно настоящему изобретению, реагенты должны быть выбраны согласно основным принципом, раскрытым в Таблице 1. В одном из вариантов осуществления изобретения, первый ядерный экстракт (Y1) имеет дефицит MLH1, а второй ядерный экстракт (Y2) имеет дефицит MSH2/MSH6. В случае, если тестируемый образец не обеспечивает комплементацию указанного первого ядерного экстракта, однако обеспечивает комплементацию указанного второго ядерного экстракта, тестируемый образец демонстрирует дефицит MLH1. В случае, если тестируемый образец обеспечивает комплементацию указанного первого ядерного экстракта, однако не обеспечивает комплементацию указанного второго ядерного экстракта, тестируемый образец демонстрирует дефицит MSH2 или MSH6.The reagents included in the kit according to the present invention should be selected according to the basic principle disclosed in Table 1. In one embodiment, the first nuclear extract (Y1) has a deficiency of MLH1, and the second nuclear extract (Y2) has a deficiency of MSH2 / MSH6 . In the event that the test sample does not complement the first nuclear extract, but does complement the second nuclear extract, the test sample exhibits MLH1 deficiency. If the test sample provides complementation of the specified first nuclear extract, but does not complement the specified second nuclear extract, the test sample shows a deficiency of MSH2 or MSH6.

Набор, согласно настоящему изобретению, может необязательно дополнительно включать ядерные экстракты с дефицитом MMR, которые позволяют специфически различать дефекты генов MSH2 и MSH6. Такие ядерные экстракты могут быть получены из линий клеток, например дефектных по MSH6 HCT-15/DLD-1 (АТСС CCL-225/221).The kit of the present invention may optionally additionally include MMR deficient nuclear extracts that specifically distinguish between defects in the MSH2 and MSH6 genes. Such nuclear extracts can be obtained from cell lines, for example MSH6 defective HCT-15 / DLD-1 (ATCC CCL-225/221).

Набор, согласно настоящему изобретению, может необязательно включать также дополнительные реагенты, необходимые для анализа функции MMR, например, необходимые буферы и нуклеотиды.The kit according to the present invention may optionally also include additional reagents necessary for analysis of the MMR function, for example, the necessary buffers and nucleotides.

Один пример набора, согласно настоящему изобретению, приведен в примерах ниже.One example of a kit according to the present invention is shown in the examples below.

ПРИМЕРЫEXAMPLES

Следующие примеры приведены для дополнительной иллюстрации вариантов осуществления настоящего изобретению, однако они предназначены для ограничения объема притязаний. Для специалиста в данной области техники очевидно, что по мере развития технологии, изобретательский замысел может осуществляться различными способами. Таким образом, изобретение и варианты его осуществления не ограничены приведенными здесь примерами, но могут меняться в пределах объема притязаний.The following examples are provided to further illustrate embodiments of the present invention, however, they are intended to limit the scope of claims. For a person skilled in the art it is obvious that as the technology develops, the inventive concept can be implemented in various ways. Thus, the invention and its embodiments are not limited to the examples given here, but may vary within the scope of the claims.

Пример 1. Культивирование фибробластов, полученных у тестируемого пациентаExample 1. Cultivation of fibroblasts obtained from a test patient

Фибробласты выращиваются в Модифицированной по Дульбекко среде Игла (Invitrogen, САТ# 31966-021) при 37°С в инкубаторе с 5% CO₂. Культуральная среда дополняется 10% фетальной бычьей сывороткой (Invitrogen, САТ# 10106-169), 2х средой с заменимыми аминокислотами (Invitrogen, САТ# 10370-070) и 2% раствором пенициллин-стрептомицин (Invitrogen, САТ# 15070-063). Клетки пересеиваются с помощью трипсина, 0,25% ЭДТА (Invitrogen, САТ# 25200-072) в соотношении 1:2-1:6 при достижении сливающегося на 80-90% слоя клеток. Для сохранения подавления экспрессии в производных клеточных линиях FB-M1 или производных клеточных линиях FB-SH13 с дефицитом MSH2, к культуральной среде добавляются 150 мкг/мл гидромицина В (Invitrogen, САТ# 10687-010). Клетки выращиваются в обработанных культуральных флаконах Т175 с крышкой с фильтром (NUNC, CAT# 145-178883) до получения 5×10⁸-10⁹ для экстракции ядерных белков.Fibroblasts are grown in the Dulbecco Modified Eagle Medium (Invitrogen, CAT # 31966-021) at 37 ° C in an incubator with 5% CO ₂ . The culture medium is supplemented with 10% fetal bovine serum (Invitrogen, CAT # 10106-169), 2 media with interchangeable amino acids (Invitrogen, CAT # 10370-070) and 2% penicillin-streptomycin solution (Invitrogen, CAT # 15070-063). Cells are seeded with trypsin, 0.25% EDTA (Invitrogen, CAT # 25200-072) in a ratio of 1: 2-1: 6 when a cell layer merges into 80-90%. To maintain suppression of expression in derived FB-M1 cell lines or derived FH-SH13 cell lines with MSH2 deficiency, 150 μg / ml of hydromycin B are added to the culture medium (Invitrogen, CAT # 10687-010). Cells are grown in treated T175 culture vials with a filter cap (NUNC, CAT # 145-178883) to obtain 5 × 10 ⁸ -10 ⁹ for nuclear protein extraction.

Пример 2. Линии клеток и ядерные экстрактыExample 2. Cell lines and nuclear extracts

Адгезивные линии раковых клеток человека HeLa, LoVo и НСТ116 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) культивируются согласно указаниям производителя. Клетки HeLa (АТСС CCL-2) представляют собой эпителиальные клетки с нормальный функцией MMR, полученные из шейки матки женщины; клетки НСТ116 (АТСС CCL-247) и LoVo (АТСС CCL-229) представляют собой эпителиальные клетки, с дефектной MMR, полученные из толстой кишки мужчины. В клетки НСТ116 не включают MLH1, а в клетках LoVo ген MSH2 инактивирован, что приводит к дефициту белков MSH2, MSH3 и MSH6. Была показана связь отсутствия MSH2 с протеолитическим разложением его белков-партнеров MSH3 и MSH6.Adhesive human cancer cell lines HeLa, LoVo and HCT116 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) are cultured according to the manufacturer's instructions. HeLa cells (ATCC CCL-2) are epithelial cells with normal MMR function, obtained from the cervix of a woman; HCT116 (ATCC CCL-247) and LoVo cells (ATCC CCL-229) are epithelial cells with defective MMR obtained from the large intestine of a man. MLH1 is not included in HCT116 cells, and the MSH2 gene is inactivated in LoVo cells, which leads to a deficiency of MSH2, MSH3 and MSH6 proteins. The association of the absence of MSH2 with the proteolytic degradation of its partner proteins MSH3 and MSH6 was shown.

Клетки HeLa выращиваются в среде DMEM, с добавлением 2% L-глутамина, 10% фосфатно-солевого буфера и 5% пенициллина-стрептомицина. LoVo cells выращивают в среде F12 (или F12:DMEM) (Invitrogen, САТ# 31765-027/31331-028) с добавлением 2% L-глутамина, 10-20% фосфатно-солевого буфера и 5% пенициллина-стрептомицина; клетки НСТ116 выращивают в среде McCoys 5А (Invitrogen, САТ# 22330-021) с добавлением 2% L-глутамина, 10-20% фосфатно-солевого буфера и 5% пенициллина-стрептомицина.HeLa cells are grown in DMEM supplemented with 2% L-glutamine, 10% phosphate buffered saline and 5% penicillin-streptomycin. LoVo cells are grown in F12 (or F12: DMEM) medium (Invitrogen, CAT # 31765-027 / 31331-028) supplemented with 2% L-glutamine, 10-20% phosphate-buffered saline and 5% penicillin-streptomycin; HCT116 cells were grown in McCoys 5A medium (Invitrogen, CAT # 22330-021) supplemented with 2% L-glutamine, 10-20% phosphate-buffered saline and 5% penicillin-streptomycin.

Линию клеток FB-M1 получили, как описано в публикации McDaid et al, BJC, 101: 441-451, 2009. Вкратце, были сконструированы перекрывающиеся олигонуклеотиды, продуцирующие короткую интерферирующую РНК (киРНК) направленную на MLH1 в сайте AACTGTTCTACCAGATACTCA и лигированы с коммерческим вектором кшРНК Silencer™ (Ambion САТ# АМ7209). Конструкцию затем проверили секвенированием, после чего линеаризовали и поместили 1 мкг ДНК 1×10⁷ клеток с помощью электропорации. Немедленно после этого добавляли обогащенную сывороткой среду и клетки были высеяны на чашки (в количестве) 5×10⁵ с последующей гигромициновой селекцией (150 мкг/мкл) в течение 10-14 дней. Клетки FB-SH13 получали сходным образом с помощью перекрывающихся олигонуклеотидов, дающих киРНК, направленную на MSH2 в сайте TCTGCAGAGTGTTGTGCTT в векторе pSilencer™ кшРНК.The FB-M1 cell line was obtained as described in McDaid et al, BJC, 101: 441-451, 2009. Briefly, overlapping oligonucleotides were constructed that produce short interfering RNA (siRNA) directed to MLH1 at the AACTGTTCTACCAGATACTCA site and ligated with the commercial vector Silencer ™ cshRNA (Ambion CAT # AM7209). The construct was then checked by sequencing, after which linearized and placed 1 μg of DNA 1 × 10 ⁷ cells using electroporation. Immediately after this, serum-enriched medium was added and the cells were plated on plates (in an amount) of 5 × 10 ⁵ followed by hygromycin selection (150 μg / μl) for 10-14 days. FB-SH13 cells were similarly prepared using overlapping oligonucleotides giving siRNA directed to MSH2 at the TCTGCAGAGTGTTGTGCTT site in the pSilencer ™ cshRNA vector.

Таким же образом, линии фибробластов с мутациями других генов MMR, например с подавлением экспресии MSH6 могут быть приготовлены с кшРНК вектором pSilencer™ 4.1 - CMV Hygro (Cat# АМ5777). Ядерные экстракты фибробластов получали согласно следующему протоколу (Lahue et al, Science, 245: 160-164, 1989):In the same way, fibroblast lines with mutations of other MMR genes, for example, with suppression of MSH6 expression, can be prepared with kshRNA by pSilencer ™ 4.1 vector - CMV Hygro (Cat # AM5777). Fibroblast nuclear extracts were prepared according to the following protocol (Lahue et al, Science, 245: 160-164, 1989):

1. Собрать 5×10⁸-10⁹ клеток в лог-фазе с помощью трипсина.1. Collect 5 × 10 ⁸ -10 ⁹ cells in the log phase using trypsin.

2. Подсчитать клети.2. Count the stands.

3. Центрифугировать при 500×g в течение 10 мин при +4°С.3. Centrifuge at 500 × g for 10 min at + 4 ° C.

4. Ресуспендировать пеллетты клеток в 20-30 мл холодного 1 × изотонического буфера (20 мМ Hepes рН 7,5, 5 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl, 250 мМ сахарозы, 0,2 мМ ФМСФ, 1 × полная смесь ингибиторов протеаз без ЭДТА- (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany), 0,25 мкг/мл апротинина, 0,7 мкг/мл пепстатина, 0,5 мкг/мл леупептина, 1 мМ ДТТ) и центрифугировать так же, как на предыдущей стадии.4. Resuspend cell pellets in 20-30 ml of cold 1 × isotonic buffer (20 mM Hepes pH 7.5, 5 mM KCl, 1.5 mM MgCl, 250 mM sucrose, 0.2 mM PMSF, 1 × complete mixture of protease inhibitors without EDTA- (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany), 0.25 μg / ml aprotinin, 0.7 μg / ml pepstatin, 0.5 μg / ml leupeptin, 1 mM DTT) and centrifuged as in the previous step .

5. Оценить объем сконцентрированных клеток и ресуспендировать в 20-30 мл холодного 1 × гипотонического буфера (изотонического буфера без сахарозы) и немедленно центрифугировать как указано ниже.5. Assess the volume of concentrated cells and resuspend in 20-30 ml of cold 1 × hypotonic buffer (isotonic buffer without sucrose) and immediately centrifuge as follows.

6. Удалить супернатант и ресуспендировать пеллету в 1 × холодном гипотоническом буфере для получения плотности 1-2×10⁸ клеток/мл. Объем сконцентрированных клеток вычесть из объема ресуспендирования.6. Remove the supernatant and resuspend the pellet in 1 × cold hypotonic buffer to obtain a density of 1-2 × 10 ⁸ cells / ml. The volume of concentrated cells is subtracted from the volume of resuspension.

7. Разрушить клетки с помощью шприца, медленно втянув их в шприц с тонкой иглой и затем вытолкнув их из шприца одним резким движением. Разрушение клеток следует продолжать до того, как будут лизированы 80-90% клеток, что контролируется под микроскопом (50 мкл 0,4% трипанового синего в фосфатно-солевом буфере с 45 мкл фосфатно-солевого буфера и 5 мкл клеток).7. Destroy the cells with a syringe by slowly pulling them into the syringe with a thin needle and then pushing them out of the syringe in one sharp movement. Cell destruction should be continued until 80-90% of the cells are lysed, which is monitored under a microscope (50 μl of 0.4% trypan blue in phosphate-buffered saline with 45 μl of phosphate-saline buffer and 5 μl of cells).

8. Центрифугировать разрушенные клетки при 3000 g в течение 10 мин при +4°С и удалить супернатант.8. Centrifuge the destroyed cells at 3000 g for 10 min at + 4 ° C and remove the supernatant.

9. Оценить объем ядерной пеллеты и добавить 1/3-1/5 буфера для холодной экстракции (25 мМ Hepes рН 7,5, 10% сахарозы, 1 мМ ФМСФ, 0,5 мМ ДТТ, 1 мкг /мл леупептина) от объема пеллеты. Ресуспендировать пеллету тщательным пипетированием.9. Assess the volume of nuclear pellets and add 1 / 3-1 / 5 cold extraction buffer (25 mM Hepes pH 7.5, 10% sucrose, 1 mM PMSF, 0.5 mM DTT, 1 μg / ml leupeptin) by volume pellets. Resuspend the pellet by thorough pipetting.

10. измерить новый объем и добавить NaCl до конечной концентрации 0,155 M при помешивании.10. Measure a new volume and add NaCl to a final concentration of 0.155 M with stirring.

11. Перемешивать смесь вращением в течение 60 мин при температуре 4°С.11. Stir the mixture by rotation for 60 min at a temperature of 4 ° C.

12. Центрифугировать при 14500×g в течение 20 мин при температуре 2°С.12. Centrifuge at 14500 × g for 20 min at a temperature of 2 ° C.

13. Провести диализ образца 2 раза по 50 мин в кассете 3,500 MWCO в одном литре холодного буфера для диализа (25 мМ Hepes рН 7,5, 50 мМ KCl, 0.1 мМ ЭДТА рН 8, 10% сахарозы, 1 мМ ФМСФ, 2 мМ ДТТ, 1 мкг /мл леупептина). Заменить буфер после первых 50 минут.13. Dialyze the sample 2 times for 50 min in a 3,500 MWCO cassette in one liter of cold dialysis buffer (25 mM Hepes pH 7.5, 50 mM KCl, 0.1 mM EDTA pH 8, 10% sucrose, 1 mM PMSF, 2 mM DTT, 1 μg / ml leupeptin). Replace buffer after first 50 minutes.

14. Осветлить экстракт центрифугированием при 20000×g в течение 15 мин при температуре 2°С.14. Lighten the extract by centrifugation at 20,000 × g for 15 min at a temperature of 2 ° C.

15. Мгновенно заморозить ядерные белки в жидком азоте и хранить при -80°С.15. Instantly freeze nuclear proteins in liquid nitrogen and store at -80 ° C.

Пример 3. Вестерн-блотExample 3. Western blot

Уровень экспрессии белков в ядерных экстрактах ядерные экстракты (ЯЭ) исследовали с помощью вестерн-блота 50 мг ЯЭ и 0,1-5 мкл общего белкового экстракта дикого типа с помощью СДС-электрофореза в полиакриламидном геле. Белки наносили на цепроцеллюлозную мембрану (Amersham Hypond™, PVDF, Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden), которую затем инкубировали с моноклональными антителами против MSH2 (Calbio-chem, San Diego, СА, USA, MSH2-AM, NA-26, 0,2 мг/мл), против MSH3 (BD Transduction Laboratories, Lexington, KY, USA, M94120, 250 мг/мл), против MSH6 (BD Transduction Laboratories, клон 44, 0,02 мг/мл), против PMS2 (Cal-biochem/ОпсодеЯЭ Research, San Diego, CA, USA, Ab-1, 0,2 мг/мл) и против MLH1 (BD Biosciences/Pharmingen, San Diego, CA, USA, клон 168-15, 0,5 мг/мл). В качестве (загрузочного) контроля использовали повсеместно экспрессируемый α-тубулин для оценки уровня MMR белка в экстрактах (анти-α-тубулин; Sigma, Louis, МО, USA, DM1A, 0,2 мг/мл).The level of protein expression in nuclear extracts of nuclear extracts (NJ) was studied using a Western blot of 50 mg of NJ and 0.1-5 μl of the total wild-type protein extract using SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Proteins were applied to a chain-cellulose membrane (Amersham Hypond ™, PVDF, Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden), which was then incubated with monoclonal antibodies against MSH2 (Calbio-chem, San Diego, CA, USA, MSH2-AM, NA-26, 0 , 2 mg / ml), against MSH3 (BD Transduction Laboratories, Lexington, KY, USA, M94120, 250 mg / ml), against MSH6 (BD Transduction Laboratories, clone 44, 0.02 mg / ml), against PMS2 (Cal -biochem / OptodeaE Research, San Diego, CA, USA, Ab-1, 0.2 mg / ml) and against MLH1 (BD Biosciences / Pharmingen, San Diego, CA, USA, clone 168-15, 0.5 mg / ml). The universally expressed α-tubulin was used as a (loading) control to assess the level of MMR protein in extracts (anti-α-tubulin; Sigma, Louis, MO, USA, DM1A, 0.2 mg / ml).

Пример 4. Получение гетеродимерных белковых комплексов дикого типа.Example 4. Obtaining heterodimeric protein complexes of the wild type.

Клетки насекомого Spodoptera frugiperda (Sf9) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) трансфецировали бакмидной ДНК, несущих фрагменты «ДНК MSH2, MSH3, MSH6, PMS2 или MLH1 дикого типа, после чего клетки повторно инфицировали для получения большего выхода рекомбинантных бакуловирусов (Nystrom-Lahti et al, 2002). Эти рекомбинантные бакуловирусы дикого типа применялись для коинфицирования клеток Sf9 для продукции белков, образующих анализируемые гетеродимерные комплексы: MutLa (MLH1 + PMS2), MutSa (MSH2 + MSH6) и MutSp (MSH2 + MSH3). Эти гетеродимерные комплексы экстрагировали в виде общего экстракта белка (ОЭ) в течение 50 часов (MutLa) или 72 часов (MutSa и MutS(3)) путем лизирования клеток и осаждения центрифугированием.Spodoptera frugiperda (Sf9) insect cells (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) were transfected with bacmid DNA carrying wild-type MSH2, MSH3, MSH6, PMS2 or MLH1 DNA fragments, after which the cells were re-infected to obtain a higher yield of recombinant baculoviruses (Nystrom- Lahti et al, 2002). These recombinant wild-type baculoviruses were used to co-infect Sf9 cells for the production of proteins forming the heterodimer complexes under analysis: MutLa (MLH1 + PMS2), MutSa (MSH2 + MSH6) and MutSp (MSH2 + MSH3). These heterodimeric complexes were extracted as total protein extract (OE) for 50 hours (MutLa) or 72 hours (MutSa and MutS (3)) by cell lysis and centrifugation.

Пример 5. Получение субстрата.Example 5. Obtaining a substrate.

Получение гетеродуплексных молекул. Гетеродуплексная молекула ДНК представляет собой кольцевую молекулу длиной 3192 bp с одноцепочечным разрывом длиной 445 bp, расположенного перед сайтом с ошибочно спаренными нуклеотидами. Эта молекула включает полный сайт рестрикции BglW. Молекулу получают ренатурацией одноцепочечной ДНК из плазмиды pGEM-IDL40 (Фигура 6) вместе с несущей ошибку плазмидой на основе той же конструкции (pGEM-IDL GT, для 5′GT субстрата или pGEM-IDL-39 для 54DL1 субстрата).Obtaining heteroduplex molecules. A heteroduplex DNA molecule is a 3192 bp ring molecule with a 445 bp single stranded gap located in front of a site with erroneously paired nucleotides. This molecule includes the complete BglW restriction site. The molecule is obtained by renaturation of single-stranded DNA from the plasmid pGEM-IDL40 (Figure 6) together with an error-prone plasmid based on the same construct (pGEM-IDL GT, for 5′GT substrate or pGEM-IDL-39 for 54DL1 substrate).

Одноцепочечная ДНК (оцДНК) была приготовлена путем инфицирования трансформированных pGEM IDL40 бактериальных клеток XL1-blue бактериофагом M13K07 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA), реплицируюшего антисмысловую цепь, которую затем можно экстрагировать из клетки. Последовательности нижней (-) цепи, ампилифицируемой фагом М13, показана как SEQ ID NO: 1, с обозначенным сайтом рестрикции BglW.Single-stranded DNA (ssDNA) was prepared by infection of transformed pGEM IDL40 bacterial cells with XL1-blue bacteriophage M13K07 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA), which replicates the antisense strand, which can then be extracted from the cell. The sequences of the lower (-) chain amplified by the M13 phage are shown as SEQ ID NO: 1, with the designated BglW restriction site.

Были получены две различные гетеродуплексные конструкции; с ошибочно спаренными G-T (5′GT) и одиночным нуклеотидом 54DL1. Направленный сайт-специфический мутагенез выполнен в pGEM-IDL40 согласно указаниям производителя (Quik-Change® Site-directed mutagenesis, Stratagene, La Jolla, CA, USA) для получения содержащих ошибки плазмид pGEM IDLGT и pGEM IDL39.Two different heteroduplex designs were obtained; with erroneously paired G-T (5′GT) and a single nucleotide 54DL1. Directed site-specific mutagenesis was performed in pGEM-IDL40 according to the manufacturer's instructions (Quik-Change® Site-directed mutagenesis, Stratagene, La Jolla, CA, USA) to obtain error-prone plasmids pGEM IDLGT and pGEM IDL39.

Субстрат 5′GT получен путем ренатурации оцДНК с содержащей ошибочно спаренные основания GEM-IDLGT. Эта плазмида длиной 3192bp (pGEM-IDLGT) для линейной дцДНК содержит неполный сайт рестрикции BglW (GGATCT). Верхняя (+) цепь, комплементарная оцДНК полученной из IDL40, за исключением G, замещающего А, который был бы комплементарным в сайте BglW. Последовательности pGEM-IDLGT обозначена как SEQ ID NO: 2, где аннотирован неполный сайт рестрикции BglW.The 5′GT substrate was obtained by renaturation of ssDNA containing mistakenly paired GEM-IDLGT bases. This 3192bp plasmid (pGEM-IDLGT) for linear dsDNA contains an incomplete BglW restriction site (GGATCT). Upper (+) chain complementary to ssDNA derived from IDL40, with the exception of G, substituting A, which would be complementary to the BglW site. The pGEM-IDLGT sequences are designated as SEQ ID NO: 2, where the incomplete BglW restriction site is annotated.

Субстрат 54DL1 был получен путем ренатурации оцДНК с содержащей ошибку pGEM-IDL1. Эта плазмида длиной 3191 bp (pGEM-IDL39) линейной дцДНК включает неполный сайт рестрикции BglW (-GATCT). Верхняя (+) цепь комплементарна оцДНК, полученной из IDL40, за исключением делеции А в сайте BglW. Для получения 5′ разрыва кольцевой субстрат линеаризовали BamII или DraIII до повторной ренатурации. Последовательность pGEM-IDL39 показана как SEQ ID NO: 3, где обозначен неполный сайт рестрикции BglW.Substrate 54DL1 was obtained by renaturation of ssDNA containing the error pGEM-IDL1. This 3191 bp plasmid (pGEM-IDL39) of linear dsDNA includes an incomplete BglW restriction site (-GATCT). The upper (+) chain is complementary to the ssDNA derived from IDL40, with the exception of deletion A at the BglW site. To obtain a 5 ′ rupture, the ring substrate was linearized with BamII or DraIII prior to repeated renaturation. The sequence of pGEM-IDL39 is shown as SEQ ID NO: 3, where an incomplete BglW restriction site is indicated.

Пример 6. Анализ функции MMR согласно настоящему изобретениюExample 6. Analysis of the function of MMR according to the present invention

Настоящее изобретение представляет собой модификации ранее описанного анализа функции MMR in vitro (Nystrom-Lahti et al, 2002), позволяющая непосредственного проанализировать способность ядерного экстракта к MMR. Кроме того, комплементация может применяться для определения дефектного гена MMR в образце путем комплементации экстракта с определенным дефектом MMR так, как это описано в Таблице 1. Реакции репарации стандартизована так, что в них используются 75-100 мкг ЯЭ. Избыточное количество гетеродуплексного ДНК-субстрат (5′GT или 54DL1) составляет 100 нг. Реакция репарации выполняется в объеме 20 мкл со следующими реагентами:The present invention is a modification of the previously described in vitro MMR function analysis (Nystrom-Lahti et al, 2002), allowing direct analysis of the ability of a nuclear extract to MMR. In addition, complementation can be used to identify a defective MMR gene in a sample by complementing an extract with a specific defect in MMR as described in Table 1. The repair reactions are standardized to use 75-100 μg of IE. An excess of heteroduplex DNA substrate (5′GT or 54DL1) is 100 ng. The repair reaction is carried out in a volume of 20 μl with the following reagents:

- 100 нг гетеродуплексного субстрата- 100 ng heteroduplex substrate

- 75-100 мкг ядерного экстракта- 75-100 mcg of nuclear extract

- 2 мкл of 10х буфера MMR (200 мМ Трис-HCl с рН 7,6, 400 мМ KCl, 50 мМ MgCl₂, 10 мМ глутатиона, 500 мкг/мл БСА, 1 мМ каждого дНТФ, 15 мМ АТФ)- 2 μl of 10 × MMR buffers (200 mM Tris-HCl with pH 7.6, 400 mM KCl, 50 mM MgCl ₂ , 10 mM glutathione, 500 μg / ml BSA, 1 mM each dNTP, 15 mM ATP)

- KCl до получения конечной концентрации 110 мМ- KCl to obtain a final concentration of 110 mm

- добавить Н₂О до 20 мкл.- add H ₂ O to 20 μl.

Поскольку реакция должна проводиться в общем объеме 20 мкл и с конечной концентрацией KCl 110 мМ, следует учитывать содержание KCl в ядерном экстракте (2 мкл 10х MMR буфера доводит содержание KCL в реакционной смеси до 40 мМ). Содержание KCl в ядерный экстракт принимается за 75 мМ/мкл.Since the reaction should be carried out in a total volume of 20 μl and with a final KCl concentration of 110 mM, the KCl content in the nuclear extract should be taken into account (2 μl of 10x MMR buffer brings the KCL content in the reaction mixture to 40 mM). The content of KCl in the nuclear extract is taken as 75 mm / μl.

Типичный протокол анализа функции MMR, согласно настоящему изобретению:A typical MMR function analysis protocol according to the present invention:

1. Смешать пипетированием компоненты реакция репарации на льду и инкубировать в течение 30 мин при температуре 37°С.1. Pipetting the components of the reaction of repair on ice and incubating for 30 min at a temperature of 37 ° C.

2. Остановить реакцию, добавив 30 мкл СТОП-раствора (42 мМ ЭДТА, 1,2% СДС, 50,4 мкг/мл протеиназы К). Инкубировать при 37°С в течение 20 мин.2. Stop the reaction by adding 30 μl of STOP solution (42 mm EDTA, 1.2% SDS, 50.4 μg / ml proteinase K). Incubate at 37 ° C for 20 minutes.

3. Добавить 1 объем (50 мкл) ТЭ буфера с рН 8,0.3. Add 1 volume (50 μl) of TE buffer with pH 8.0.

4. Добавить 1 объем смеси фенол-хлороформ-изоамиловый спирт (25:24:1) и встряхивать на вортексе в течение 10 с. Центрифугировать на максимальной скорости в течение 10 мин при комнатной температуре.4. Add 1 volume of the phenol-chloroform-isoamyl alcohol mixture (25: 24: 1) and shake vortex for 10 s. Centrifuge at maximum speed for 10 min at room temperature.

5. Перенести верхнюю фазу (приблизительно 90 мл) в новую пробирку и добавить равный объем хлороформа. Встряхивать на вортексе в течение 10 с и центрифугировать на максимальной скорости в течение 10 мин при комнатной температуре.5. Transfer the upper phase (approximately 90 ml) to a new tube and add an equal volume of chloroform. Shake vortex for 10 s and centrifuge at maximum speed for 10 min at room temperature.

6. Перенести 85 мл верхней фазы в новую пробирку для осаждения этиловым спиртом.6. Transfer 85 ml of the upper phase to a new tube for ethanol precipitation.

7. Добавить NaCl до получения конечной концентрации 150 мМ, а затем 2,5 объема холодного абсолютного этилового спирта. Инкубировать при -20°С в течение 30 минут.7. Add NaCl to obtain a final concentration of 150 mM, and then 2.5 volumes of cold absolute ethyl alcohol. Incubate at -20 ° C for 30 minutes.

8. Получить пеллету ДНК центрифугированием образца на максимальной скорости в течение 30 минут при +4°С.8. Obtain the DNA pellet by centrifuging the sample at maximum speed for 30 minutes at + 4 ° C.

9. Промыть пеллету 150 мкл 70% этанола, центрифугировать на максимальной скорости в течение 10 минут, высушить и ресуспендировать пеллету в 6 мкл дистиллированной деминерализованной H₂O.9. Wash the pellet with 150 μl of 70% ethanol, centrifuge at maximum speed for 10 minutes, dry and resuspend the pellet in 6 μl of distilled demineralized H ₂ O.

10. Добавить 4 мкл свежеприготовленной 10 × смеси для расщепления (2,5 мкл FastDigest® BglW (Fermentas, САТ# FD0083), 2,5 мкл FastDigest® Eco31I (Fermentas, САТ# FD0293), 10 мкл FastDigest® Буфер и 25 мкл ddH20) и инкубировать при 37°С в течение 10 минут.10. Add 4 μl of a freshly prepared 10 × digestion mixture (2.5 μl FastDigest® BglW (Fermentas, CAT # FD0083), 2.5 μl FastDigest® Eco31I (Fermentas, CAT # FD0293), 10 μl FastDigest® Buffer and 25 μl ddH20) and incubated at 37 ° C for 10 minutes.

11. Добавить РНКазу А до концентрации 40 мкг/мл и инкубировать при 37°С в течение 10 минут.11. Add RNase A to a concentration of 40 μg / ml and incubate at 37 ° C for 10 minutes.

12. Загрузить образцы на 1,0% агарозный гель, приготовленный на 1х ТАЕ, с тем чтобы определить, произошла ли репарация.12. Download samples on a 1.0% agarose gel prepared on 1x TAE to determine if repair has occurred.

Процент репарации определяют с помощью ПО Image-Pro® 4,0 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA).The percentage of repair is determined using Image-Pro® 4.0 software (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA).

В качестве положительного контроля используют ЯЭ клеток HeLa с нормальной функцией MMR, при этом ЯЭ без комплементации (с утраченной функцией MMR) применяется в качестве отрицательного контроля. Субстраты линеаризуют с помощью рестрикции Eco31I рестриктазой. Поскольку реакция репарации превращает GT гетеродуплекс в AT гомодуплекс или заполняет 1 или 2-нуклеотидные петлевые структуры, восстанавливая сайт рестрикции BglW, эффективность репарации может быть измерена по эффективности двойного расщепления.As a positive control, HeLa cell NERs with normal MMR function are used, while non-complimentary NRs (with lost MMR function) are used as a negative control. Substrates are linearized by restriction with Eco31I restriction enzyme. Since the repair reaction converts the GT heteroduplex into an AT homoduplex or fills the 1 or 2 nucleotide loop structures, restoring the BglW restriction site, the repair efficiency can be measured by the double cleavage efficiency.

Пример 7. Фибробласты, применяемые при анализе функции MMR согласно настоящему изобретениюExample 7. Fibroblasts used in the analysis of MMR function according to the present invention

Этот пример предназначен для того, чтобы показать, что анализ функции MMR может применяться к нормальной ткани, например фибробластам. Ядерный экстракт фибробластов дикого типа (FB-WT), приготовленный согласно примеру 2, ядерный экстракт клеток HeLa с нормальной функцией MMR и отрицательный контроль (MOCK), не содержащий никаких белков, были подвергнуты анализу функции MMR согласно настоящему изобретению так, как это описано в примере 3.This example is intended to show that MMR function analysis can be applied to normal tissue, such as fibroblasts. Wild type fibroblast nuclear extract (FB-WT) prepared according to Example 2, normal HeRa cell extract with normal MMR function and negative control (MOCK) containing no proteins were analyzed for MMR function according to the present invention as described in example 3.

После того, как прошла реакция репарации, двойное расщепление ДНК субстрата дает одну полосу большего размера, длиной приблизительно 3000 bp в случае, если не прошла репарация, и два дополнительных меньших фрагмента (приблизительно 1800 и 1300 bp) если репарация произошла. Поскольку субстрат ДНК всегда добавляется в избыточном количестве, даже экстрактах с нормальной функцией MMR помимо двух фрагментов, полученных при двойном расщеплении, сохраняется линеаризованный субстрат.After the repair reaction has taken place, double digestion of the substrate DNA gives one larger band, approximately 3000 bp in length if the repair has failed, and two additional smaller fragments (approximately 1800 and 1300 bp) if the repair has occurred. Since the DNA substrate is always added in excess, even extracts with normal MMR function, in addition to the two fragments obtained by double cleavage, the linearized substrate is retained.

Результаты анализа приведены на Фигуре 2, где показано, что на дорожке 1, (клетки MOCK) имеется только одна полоса, соответствующая фрагменту большой длины (= отсутствие репарации), но на дорожках 2 и 3 (ядерные экстракты FB-WT и HeLa, соответственно), видны две дополнительные полосы фрагментов меньшего размера, которые указывают на прошедшую реакцию репарации.The analysis results are shown in Figure 2, which shows that on track 1, (MOCK cells) there is only one band corresponding to a fragment of long length (= no repair), but on tracks 2 and 3 (nuclear extracts FB-WT and HeLa, respectively ), two additional bands of smaller fragments are visible, which indicate a past repair reaction.

Таким образом, это пример без сомнения показывает, что ядерные экстракты из нормальных фибробластов обладают способностью к MMR, сравнимой с таковой экстрактов клеточных линий (HeLa) с нормальной функцией MMR, что можно подтвердить с помощью анализа согласно настоящему изобретению.Thus, this example no doubt shows that nuclear extracts from normal fibroblasts have an MMR ability comparable to that of cell line extracts (HeLa) with normal MMR function, which can be confirmed by analysis according to the present invention.

Пример 8. Человеческие фибробласты с частично подавленной экспрессией генов MMR демонстрируют сниженную способность к MMR в анализе функции MMR, согласно настоящему изобретениюExample 8. Human fibroblasts with partially suppressed expression of MMR genes demonstrate reduced ability to MMR in the analysis of the function of MMR according to the present invention

Этот пример показывает, что человеческие фибробласты клеточных линий FB-M1 и FB-SH13 (раскрытые в примере 2), в которых частично подавлена экспрессия гена MLH1 или гена MSH2, соответственно, с помощью технологии РНК шпилек (кшРНК), обладают ясно выраженной сниженной способностью к MMR.This example shows that human fibroblasts of cell lines FB-M1 and FB-SH13 (disclosed in Example 2), in which expression of the MLH1 gene or the MSH2 gene is partially suppressed, respectively, using hairpin RNA (kshRNA) technology, have a pronounced reduced ability to MMR.

Во-первых, был выполнен вестерн-блот с равными количествами ядерных экстрактов из фибробластов дикого типа (FB-WT) и клеток FB-M1 или FB-WT и клеток FB-SH13. В результате (Фигура 3) видно, что количество белка MLH1 было определенно снижено в клетках FB-M1 в сравнении FB-WT, так же как и уровень MSH2 в клетках FB-SH13, α-использовали в качестве контроля загрузки.First, a Western blot was performed with equal amounts of nuclear extracts from wild-type fibroblasts (FB-WT) and FB-M1 or FB-WT cells and FB-SH13 cells. As a result (Figure 3), it can be seen that the amount of MLH1 protein was definitely reduced in FB-M1 cells compared to FB-WT, as well as the level of MSH2 in FB-SH13 cells, α-was used as a load control.

Во вторых, был выполнен анализ функции анализ функции MMR так, как описано в примере 6, с применением тех же ядерных экстрактов в тех же количествах:Secondly, an analysis of the function was performed, analysis of the MMR function as described in example 6, using the same nuclear extracts in the same quantities:

MOCK - не содержащий ядерного экстракта отрицательный контроль анализа;MOCK - no nuclear extract negative control analysis;

FB-WT - ядерный экстракт человеческого фибробласта дикого типа (положительный контроль); иFB-WT - wild type human fibroblast nuclear extract (positive control); and

FB-M1 - ядерный экстракт из человеческих фибробластов с частично подавленной экспрессией MLH1;FB-M1 - nuclear extract from human fibroblasts with partially suppressed expression of MLH1;

илиor

FB-SH13 - ядерный экстракт из человеческих фибробластов с частично подавленной экспрессией MSH2.FB-SH13 is a nuclear extract from human fibroblasts with partially suppressed MSH2 expression.

Результат анализа показывает, что сниженная концентрация одного из ключевых белков MMR связана с дефектным механизмом MMR. Результат показан на Фиг. 4 и ясно демонстрирует, что анализ функции MMR, согласно настоящему изобретению, определенно выявляет дефекты MLH1 и MSH2 в ядерном экстракте человеческого фибробласта дикого типа как снижение эффективности репарации. Кроме того, способность к MMR может быть дифференциально восстановлена в неспособном к MMR ядерном экстракте при совместном анализе с ядерным экстрактом дикого типа, или ядерным экстрактом с частично подавленной функцией MMR, что показано на Фиг. 5 (в данном случае НСТ116 с FB-WT или FB-M1) и описано в тесте в Таблице 1 и на стр. 13-14.The result of the analysis shows that a reduced concentration of one of the key MMR proteins is associated with a defective MMR mechanism. The result is shown in FIG. 4 and clearly demonstrates that an analysis of the MMR function of the present invention definitely reveals defects in MLH1 and MSH2 in a wild-type human fibroblast nuclear extract as a decrease in repair efficiency. Furthermore, the MMR ability can be differentially restored in an MMR unable nuclear extract when combined with a wild-type nuclear extract, or a nuclear extract with a partially suppressed MMR function, as shown in FIG. 5 (in this case HCT116 with FB-WT or FB-M1) and is described in the test in Table 1 and on pages 13-14.

Эффективность репарации при анализе функции MMRe согласно настоящему изобретению определяется как процент репарированной ДНК от всего субстрата ДНК в составе реакции. Недостаток ключевых белков MMR в различной степени снижает эффективность репарации, в том время как отсутствие MMR белков снижает эффективность репарации до неопределяемых уровней.The repair efficiency in the analysis of the MMRe function according to the present invention is defined as the percentage of repaired DNA from the total DNA substrate in the reaction. The lack of key MMR proteins reduces the repair efficiency to varying degrees, while the lack of MMR proteins reduces the repair efficiency to undetectable levels.

Пример 9. Набор для применения при диагностическом анализе дефектов MMRExample 9. Kit for use in the diagnostic analysis of defects in MMR

Набор согласно настоящему изобретению предпочтительно имеет форму сосудов с готовой смесью всех реагентов для выполнения анализа функции MMR. В него необходимо добавить только ядерный экстракт тестируемого образца. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения в набор входят отдельные сосуды для тестирования различных вариантов нарушения MMR.The kit of the present invention preferably is in the form of vessels with a ready-made mixture of all reagents for performing an MMR function analysis. Only the nuclear extract of the test sample must be added to it. In one of the embodiments of the present invention, the kit includes separate vessels for testing various variants of violation of MMR.

В этом примере описан набор для определения того, имеется или нет у тестируемого человека синдром Линча, путем определения того, имеется ли у указанного человека дефект в гене MLH1 или в любом из генов MSH2 или MSH6, без разделения последних. Такой набор включает, по меньшей мере, пять отдельных сосудов.This example describes a kit for determining whether or not a test person has Lynch syndrome by determining whether the person has a defect in the MLH1 gene or in any of the MSH2 or MSH6 genes, without separating the latter. Such a kit includes at least five separate vessels.

В указанные сосуды входят следующие реагенты:The following reagents are included in these vessels:

- Гетеродуплексный субстрат- Heteroduplex substrate

- Ядерный экстракт (НСТ116, LoVo или FB-WT)- Nuclear extract (HCT116, LoVo or FB-WT)

- 10Х буфер ММК (200 мМ Трис-HCl рН 7,6, 400 мМ KCl, 50 мМ MgCl₂, 10 мМ глутатион, 500 мкг/мл БСА, 1 мМ каждого из дНТФ, 15 мМ АТФ).- 10X MMC buffer (200 mM Tris-HCl pH 7.6, 400 mM KCl, 50 mM MgCl ₂ , 10 mM glutathione, 500 μg / ml BSA, 1 mM each of dNTP, 15 mM ATP).

Помимо этого необходим СТОП-раствор для анализа функции ММР (42 мМ ЭДТА, 1,2% СДС, 50.4 мкг/мл протеиназы K), который также может входить в указанный набор.In addition, a STOP solution is required to analyze the MMP function (42 mM EDTA, 1.2% SDS, 50.4 μg / ml proteinase K), which can also be included in this kit.

Дополнительно, указанный набор может необязательно включать реагенты, необходимые для осветления образца (ТЕ буфер, фенол/хлороформ/изоамиловый спирт и хлороформ), для его осаждения (NaCl и этиловый спирт) и для выявления репарации (РНКаза А и рестриктазы BglW и Eco31I с буфер и загрузочный краситель).Additionally, the kit may optionally include reagents necessary to brighten the sample (TE buffer, phenol / chloroform / isoamyl alcohol and chloroform), to precipitate it (NaCl and ethyl alcohol) and to detect repair (RNase A and BglW and Eco31I restriction enzymes with buffer and loading dye).

Дополнительные компоненты указанного набора включают реагенты, необходимые для культивирования клеток, из которых должны быть экстрагированы ядерные белки, а также реагенты, необходимые экстракции из таких клеток ядерных белков (см. пример 2).Additional components of this kit include reagents necessary for the cultivation of cells from which nuclear proteins are to be extracted, as well as reagents necessary for extraction of nuclear proteins from such cells (see Example 2).

Набор, согласно настоящему изобретению, не ограничен никакой конкретной формой или типом сосудов. Для набора подходят любые типы сосудов, подходящие для манипуляций и инкубаций, описанных в примере 6, например пробирки eppenodorf®.The kit of the present invention is not limited to any particular vessel shape or type. Any vessel types suitable for manipulation and incubation described in Example 6 are suitable for the kit, for example eppenodorf® tubes.

Claims

1. A quantitative method for determining in humans a hereditarily impaired function of the repair of mismatched DNA bases (+/-), where this method includes
a) obtaining primary cells from normal constitutive tissue of a specified person,
b) culturing said primary cells under culture conditions suitable for culturing fibroblasts,
C) obtaining an extract of nuclear proteins from these cultured primary fibroblasts of the specified person,
d) obtaining extracts of nuclear proteins with the normal function of the repair of mismatched bases + / + and the defective function of the repair of mismatched bases - / - from cell lines as positive and negative controls, respectively,
d) mixing in separate vessels the extract of nuclear proteins of primary fibroblasts obtained in stage c) and the extract of nuclear proteins with the normal function of repairing the wrongly paired bases of the proteins and the extract of nuclear proteins with the defective function of repairing the wrongly paired bases obtained in stage d), with at least one heteroduplex DNA substrate, including erroneously paired bases;
f) performing an analysis of the repair of mistakenly paired bases of the primary fibroblast nuclear protein extract and control nuclear protein extracts with the indicated DNA substrate, and
g) quantitative determination of the ability of the extract of nuclear proteins of primary fibroblasts to repair the specified DNA substrate molecules,
and, thus, determining whether a person has a hereditarily impaired repair function of the mismatched DNA bases +/-.

2. The method of claim 1, wherein said substrate is obtained from a plasmid having the sequence of SEQ ID NO: 1.

3. The method of claim 2, wherein said substrate further comprises a nucleic acid sequence selected from the group consisting of the sequences SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3.

4. The method of claim 1, wherein said nuclear protein extract with a defective mismatch repair function is obtained from a cell line selected from the group consisting of HCT116 and LoVo cells.

5. The method according to claim 4, in which the total amount of nuclear protein extract per vessel is in the range of 50-500 μg, preferably 50-200 μg, more preferably 75-100 μg.

6. A quantitative method for identifying a repair gene for mistakenly paired bases with a hereditarily defective function (+/-), where this method includes
a) obtaining primary cells from a sample of normal constitutive tissue of the specified person,
b) culturing said primary cells under culture conditions suitable for culturing fibroblasts,
C) obtaining an extract of nuclear proteins from these cultured primary fibroblasts of the specified person,
d) obtaining extracts of nuclear proteins with the normal function of the repair of mismatched bases + / + and a defective function of the repair of mismatched bases - / - from cell lines as a positive and negative control, respectively, and the subsequent mixing of at least one extract of nuclear proteins with a defective repair function mistakenly paired bases obtained in stage g), with the specified extract obtained in stage c),
d) mixing in a separate vessel at least one extract of nuclear proteins with a defective function of the repair of paired bases obtained in stage g), and the specified extract of nuclear proteins of primary fibroblasts obtained in stage c), with at least one heteroduplex DNA substrate including mistakenly paired bases, and further includes
f) analysis of the repair of mistakenly paired bases with an extract of nuclear proteins of primary fibroblasts and control extracts of nuclear proteins with the specified DNA substrate,
g) quantitative determination of the ability of the extract of nuclear proteins of primary fibroblasts to repair the specified DNA substrate molecules,
h) complementation of a nuclear protein extract with a defective function of the repair of mismatched bases obtained in stage g), the specified extract of primary fibroblasts obtained in stage c) and the identification of a defective gene by determining whether a complementary nuclear protein extract is capable of repairing the specified DNA substrate.

7. The method of claim 6, wherein said substrate is obtained from a plasmid having the sequence of SEQ ID NO: 1.

8. The method of claim 7, wherein said substrate further comprises a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3.

9. The method of claim 6, wherein said extract of nuclear proteins with a defective base pair repair function is obtained from a cell line selected from the group consisting of HCT116 and LoVo cells.

10. The method according to p. 9, in which the total amount of the extract of nuclear proteins per vessel is in the range of 50-500 μg, preferably 50-200 μg, more preferably 75-100 μg.

11. A method for the diagnosis of Lynch syndrome in humans by identifying a gene for the repair of mismatched DNA bases with a hereditarily impaired function of repairing mismatched DNA bases using the method according to any one of claims. 6-10, in which primary fibroblasts are obtained from a clinical sample taken from non-cancerous constitutive human tissue.

12. The method according to p. 11, where the gene for repair of mismatched DNA bases is selected from the group consisting of MLH1, MSH2, MSH6, MLH3, MSH3, PMS1, PMS2 and EX01.

13. The use of the kit in the method according to any one of paragraphs. 1-12, in which each vessel includes at least one heteroduplex DNA substrate, including erroneously paired bases, and one nuclear protein extract with a defective paired base repair function or a nuclear protein extract with a normal paired base repair function as a positive control .

14. The use of the kit of claim 13, wherein said extracts of nuclear proteins with a defective mismatch function are derived from cell lines with a malfunction of the mismatch function in any of the (genes) MLH1, MSH2, MSH6 or PMS2.

15. The use of a kit according to claim 14, comprising at least two extracts of nuclear proteins with a defective function of the repair of mistakenly paired bases.

16. The use of the kit according to claim 15, wherein said extracts of nuclear proteins with a defective mismatch function are derived from cell lines with a malfunction of the mismatch function in the (genes) MLH1 and MSH2 / MSH6, respectively.

17. The use of a kit according to claim 16, wherein said extracts of nuclear proteins with a defective mismatch repair function are obtained from HCT116 and LoVo cells, respectively.

18. The use of the kit according to claim 17, which also includes additional reagents necessary to perform the analysis of the repair function of mistakenly paired bases.

19. The use of the kit according to claim 18, which additionally includes a 10x mis-paired base repair buffer, which includes 200 mM Tris-HCl pH 7.6, 400 mM KCl, 50 mM MgCl2.10 mM glutathione, BSA 500 Mg / ml, 1 mM each dNTP and 15 mM ATP; and STOP solution for the analysis of MMR, consisting of 42 mm EDTA, 1.2% SDS, 50.4 μg / ml proteinase K.

20. The use of a kit according to claim 18, comprising reagents for clarifying the sample, for example, TE buffer, phenol / chloroform / isoamyl alcohol and chloroform; for precipitation of the specified sample, for example NaCl and ethyl alcohol; and to detect repair, for example RNase A and BglWu restriction enzyme Eco31 l with buffer and loading paint.