RU2593361C1 - Spectrophotometric method of determination of protein in biological fluids - Google Patents
Spectrophotometric method of determination of protein in biological fluids Download PDFInfo
- Publication number
- RU2593361C1 RU2593361C1 RU2015106165/15A RU2015106165A RU2593361C1 RU 2593361 C1 RU2593361 C1 RU 2593361C1 RU 2015106165/15 A RU2015106165/15 A RU 2015106165/15A RU 2015106165 A RU2015106165 A RU 2015106165A RU 2593361 C1 RU2593361 C1 RU 2593361C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- sample
- reagent
- solution
- total protein
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биохимии и может быть использовано в лабораторной практике для определения содержания белка в биологических жидкостях (моче, спинномозговой жидкости, ликворе, сыворотке, плазме крови и т.д.).The invention relates to biochemistry and can be used in laboratory practice to determine the protein content in biological fluids (urine, cerebrospinal fluid, cerebrospinal fluid, serum, blood plasma, etc.).
На сегодняшний день самым распространенным и широко применяемым в клинической биохимии методом определения общего белка в биологических жидкостях является спектрофотометрический метод.To date, the most common and widely used method in clinical biochemistry for determining the total protein in biological fluids is the spectrophotometric method.
Известен и широко применим в клинико-биохимических исследованиях способ определения концентрации белка в биологическом материале, в основе которого лежит реакция взаимодействия ионов меди с пептидными связями в молекуле белка в присутствии сильного основания (биуретовый метод). [Dilena В.А., Penberthy L.A., Fraser C.G. Clin. Chem. 1983. V. 29. P. 553-557], [Marshall Т., Williams K.M. Clin. Chem. 2000. V. 46. P. 392-398]. Интенсивность окраски образующегося комплекса зависит от концентрации белка и может быть оценена как с помощью анализаторов (автоматических и полуавтоматических), так и обычных фотометров. Метод характеризуется высокой аналитической надежностью, специфичностью и позволяет определять белок в широком диапазоне концентраций. Однако способ не обладает чувствительностью при определении минимальных количеств белка.Known and widely applicable in clinical and biochemical studies, a method for determining the concentration of protein in biological material, which is based on the reaction of the interaction of copper ions with peptide bonds in the protein molecule in the presence of a strong base (biuret method). [Dilena B.A., Penberthy L.A., Fraser C.G. Clin. Chem. 1983. V. 29. P. 553-557], [Marshall T., Williams K.M. Clin. Chem. 2000. V. 46. P. 392-398]. The color intensity of the resulting complex depends on the protein concentration and can be estimated using analyzers (automatic and semi-automatic), as well as conventional photometers. The method is characterized by high analytical reliability, specificity and allows the determination of protein in a wide range of concentrations. However, the method does not have sensitivity in determining the minimum amounts of protein.
Известен метод Лоури [Альтшулер Б.Ю., Раков С.С., Ткачев Г.А. Вопросы медицинской химии. 2001. №4. С. 426-438], сочетающий биуретовую реакцию и реакцию Фолина на аминокислоты, тирозин и триптофан в составе белковой молекулы. Он обладает более высокой чувствительностью по сравнению с биуретовым методом, однако возможно неспецифическое взаимодействие реактива Фолина с небелковыми компонентами (чаще всего со свободными ароматическими аминокислотами и многими другими соединениями, содержащими фенольную группу), способными оказывать влияние на данную реакцию и искажать результаты исследования.The well-known method of Lowry [Altshuler B.Yu., Rakov S.S., Tkachev G.A. Questions of medical chemistry. 2001. No4. S. 426-438], combining biuret reaction and Folin's reaction to amino acids, tyrosine and tryptophan in the protein molecule. It has a higher sensitivity compared to the biuret method, however, non-specific interaction of the Folin reagent with non-protein components (most often with free aromatic amino acids and many other compounds containing a phenolic group) is possible, which can influence this reaction and distort the results of the study.
Известны спектрофотометрические способы определения белка в биологических жидкостях, основанные на связывании протеина с органическими красителями, обеспечивающими лучшую воспроизводимость результатов. В качестве красителей могут использоваться: кумасси бриллиантовый синий (Coumassie Brilliant Blue) [Bradford M.M. Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254], бромфеноловый синий [патент РФ №2250465, МПК7 G01N 33/52, опубл. 20.04.2005], бромкрезоловый зеленый [Инструкция по применению набора реагентов для определения содержания альбумина в сыворотке и плазме крови человека. АЛЬБУМИН ФС. Утверждена Приказом Росздравнадзора от 15 апреля 2009 г. №3004 - Пр/09 РУ № ФСР 2009/04712 от 06.02.2009 г.], пирогаллоловый красный [Инструкция по применению набора реагентов для количественного определения общего белка в моче и СМЖ с пирогаллоловым красным. ОБЩИЙ БЕЛОК ПГК ФС. «Диакон-ДС». Утверждена приказом Росздравнадзора от 20.06.2010 г. №6830-Пр/10 РУ № ФСР 2007/01435 от 07.05.2010]. В результате реакции молекул белка с органическим красителем образуется окрашенное соединение, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации белка в пробе.Known spectrophotometric methods for determining protein in biological fluids, based on the binding of protein to organic dyes, providing better reproducibility of the results. As dyes can be used: Coomassie brilliant blue (Coumassie Brilliant Blue) [Bradford MM Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254], bromophenol blue [RF patent No. 2250465, IPC 7 G01N 33/52, publ. 04/20/2005], bromocresol green [Instructions for use of a set of reagents for determining the content of albumin in human serum and plasma. ALBUMIN FS. Approved by the Order of Roszdravnadzor dated April 15, 2009 No. 3004 - Pr / 09 RU No. ФСР 2009/04712 dated February 6, 2009], pyrogallol red [Instructions for use of the reagent kit for the quantitative determination of total protein in urine and CSF with pyrogallol red. TOTAL PROTEIN PGK FS. "Deacon-DS". Approved by order of Roszdravnadzor dated 06/20/2010 No. 6830-Pr / 10 RU No. ФСР 2007/01435 dated 05/07/2010]. As a result of the reaction of protein molecules with an organic dye, a colored compound is formed, the color intensity of which is proportional to the concentration of protein in the sample.
Недостатками этих методов является неодинаковая чувствительность каждого из красителей к различным белкам, что приводит к заметному искажению результатов при использовании калибраторов различного состава и появлению дополнительных ошибок при определении общего белка в биологических жидкостях. Наличие лекарственных препаратов в исследуемых биологических жидкостях оказывает влияние на оптическую плотность растворов, кроме того, сорбция красителей на стенках кювет ограничивает применение методов в лабораторной практике для рутинных анализов.The disadvantages of these methods are the uneven sensitivity of each dye to different proteins, which leads to a noticeable distortion of the results when using calibrators of different compositions and the appearance of additional errors in determining the total protein in biological fluids. The presence of drugs in the studied biological fluids affects the optical density of the solutions; in addition, the sorption of dyes on the walls of the cuvette limits the use of methods in laboratory practice for routine analyzes.
Наиболее близким к заявляемому техническому решению является способ количественного определения белка в биологических жидкостях [патент РФ №2268476, МПК7 G01N 33/68, опубл. 20.01.2006]. Для определения концентрации белка в биологической жидкости указанным способом осуществляют:Closest to the claimed technical solution is a method for the quantitative determination of protein in biological fluids [RF patent No. 2268476, IPC 7 G01N 33/68, publ. January 20, 2006]. To determine the concentration of protein in a biological fluid in the specified way carry out:
- смешивание образца биологической жидкости с реактивом-комплексообразователем,- mixing a sample of biological fluid with a reagent complexing agent,
- инкубацию пробы в течение 10 мин при комнатной температуре,- incubation of the sample for 10 min at room temperature,
- измерение оптической плотности пробы фотометрически при длинах волн в диапазоне 600-700 нм,- measurement of the optical density of the sample photometrically at wavelengths in the range of 600-700 nm,
- определение концентрации белка стандартным образом.- determination of protein concentration in a standard way.
При этом используют реактив-комплексообразователь, содержащий в качестве органического красителя пирогаллоловый красный, молибдат натрия, янтарную кислоту, ацетат натрия, низкоатомный спирт и стабилизатор, воду при следующих соотношениях компонентов (в масс. %): молибдат натрия - (0.6-1.6)×10-3; пирогаллоловый красный - (1.0-2.0)×10-3; янтарная кислота - 0.4-0.7; ацетат натрия - 0.04-0.10; низкоатомный спирт - 8.0-16.0; стабилизатор - 0.03-1.0; вода - остальное.In this case, a complexing agent containing pyrogallol red, sodium molybdate, succinic acid, sodium acetate, low alcohol alcohol and a stabilizer, water is used as an organic dye, in the following ratios of the components (in mass%): sodium molybdate - (0.6-1.6) × 10 -3 ; pyrogallol red - (1.0-2.0) × 10 -3 ; succinic acid - 0.4-0.7; sodium acetate - 0.04-0.10; low alcohol alcohol - 8.0-16.0; stabilizer - 0.03-1.0; water is the rest.
Реактив-комплексообразователь в качестве низкоатомного спирта может содержать этанол, метанол или другой, а в качестве стабилизатора - любой неионогенный ПАВ.The reagent complexing agent may contain ethanol, methanol, or another as a low-alcohol alcohol, and any nonionic surfactant as a stabilizer.
Смешивание биологической жидкости с реактивом-комплексообразователем ведут в соотношении 1:(10-50).Mixing biological fluid with a reagent-complexing agent is carried out in a ratio of 1: (10-50).
Недостатком прототипа является различие в чувствительности пирогаллолового красного к альбумину и белкам глобулинового ряда, что приводит к ошибкам в случае определения общего белка в биологических жидкостях при использовании калибраторов разного состава, а также возможность использования указанного способа для определения содержания общего белка только в моче и спинномозговой жидкости.The disadvantage of the prototype is the difference in the sensitivity of pyrogallol red to albumin and proteins of the globulin series, which leads to errors in the determination of total protein in biological fluids using calibrators of different compositions, as well as the possibility of using this method to determine the total protein content only in urine and cerebrospinal fluid .
Техническим результатом заявляемого технического решения является минимизация погрешности в определении общего белка в биологических жидкостях разного вида.The technical result of the proposed technical solution is to minimize the error in determining the total protein in biological fluids of various kinds.
Для достижения технического результата предлагается смешивать образец биологической жидкости с раствором реагента, содержащим следующие компоненты: бромпирогаллоловый красный, молибдат натрия оксалат натрия, янтарную кислоту и воду. Концентрации компонентов в растворе реагента (масс. %):To achieve a technical result, it is proposed to mix a sample of biological fluid with a reagent solution containing the following components: bromopyrogallol red, sodium molybdate, sodium oxalate, succinic acid and water. The concentration of the components in the reagent solution (wt.%):
бромпирогаллоловый красный - (1.5-4.0)×10-3;bromopyrogallol red - (1.5-4.0) × 10 -3 ;
молибдат натрия - (0.5-1.5)×10-3;sodium molybdate - (0.5-1.5) × 10 -3 ;
оксалат натрия - 0.01-0.03;sodium oxalate - 0.01-0.03;
янтарная кислота - 0.4-0.7;succinic acid - 0.4-0.7;
вода - остальное.water is the rest.
Смешивают образец биологической жидкости и раствор реагента в соотношении 1:(5-200) соответственно и измеряют оптическую плотность пробы при длине волны в диапазоне 580-620 нм относительно холостой пробы, а затем определяют концентрацию белка методом градуировочного графика или методом одного эталона.A sample of biological fluid and a reagent solution are mixed in a ratio of 1: (5-200), respectively, and the optical density of the sample is measured at a wavelength in the range of 580-620 nm relative to the blank sample, and then the protein concentration is determined by the calibration curve or by one standard method.
Если проводят анализ биологических жидкостей с высоким содержанием белка, например плазма или сыворотка крови, ее следует разбавлять физиологическим раствором.If biological fluids with a high protein content, such as plasma or blood serum, are analyzed, it should be diluted with saline.
Предлагаемое техническое решение имеет с прототипом следующие общие признаки:The proposed technical solution has the following common features with the prototype:
- смешивание биологической жидкости с реактивом - комплексообразователем ведут в соотношении 1:(10-50) соответственно;- mixing the biological fluid with the reagent - complexing agents is carried out in a ratio of 1: (10-50), respectively;
- выдерживание при комнатной температуре;- keeping at room temperature;
- измерение оптической плотности пробы проводят фотометрически при длинах волн в более узком диапазоне;- measurement of optical density of the sample is carried out photometrically at wavelengths in a narrower range;
- раствор реагента содержит органический краситель, молибдат натрия, янтарную кислоту, ацетат натрия, взятых в концентрациях (масс. %):- the reagent solution contains an organic dye, sodium molybdate, succinic acid, sodium acetate, taken in concentrations (wt.%):
органический краситель - (1.0-2.0)×10-3;organic dye - (1.0-2.0) × 10 -3;
молибдат натрия - (0.6-1.6)×10-3;sodium molybdate - (0.6-1.6) × 10 -3;
ацетат натрия 0.04-0.10;sodium acetate 0.04-0.10;
янтарная кислота 0.4-0.7;succinic acid 0.4-0.7;
вода - остальное.water is the rest.
Оксалат натрия и ацетат натрия предназначены для создания постоянного значения рН раствора реагента и поддержания буферной емкости, т.е. являются эквивалентами.Sodium oxalate and sodium acetate are designed to create a constant pH value of the reagent solution and maintain a buffer capacity, i.e. are equivalents.
Отличительными признаками являются:Distinctive features are:
- в состав раствора реагента входит в качестве органического красителя бромпирогаллоловый красный с содержанием (1.5-4.0)×10-3 масс. %;- the composition of the reagent solution includes bromopyrogallol red as an organic dye with a content of (1.5-4.0) × 10 -3 mass. %;
- в состав раствора реагента входит оксалат натрия с содержанием 0.01-0.03 масс. %, взятый в меньшем количестве;- the composition of the reagent solution includes sodium oxalate with a content of 0.01-0.03 mass. % taken in smaller quantities;
- инкубирование можно не проводить;- incubation can not be carried out;
- смешивание образца биологической жидкости и раствора реагента проводят в соотношении 1:(5-200), т.е. в более широком диапазоне.- mixing a sample of biological fluid and a reagent solution is carried out in a ratio of 1: (5-200), i.e. in a wider range.
На фиг. 1 изображены спектры поглощения растворов комплекса бромпирогаллолового красного с молибденом (VI) (БПГК - Mo(VI)) - I и комплекса бромпирогаллолового красного с молибденом (VI) в присутствии белка - II с максимумом поглощения при длине волны 600 нм; на фиг. 2 - спектры поглощения растворов реагента с разной концентрацией общего белка: при 0.003 г/л - график 1; при 0.006 г/л - график 2; при 0.012 г/л - график 3; при 0.015 г/л - график 4; при 0.018 г/л - график 5; при 0.021 г/л - график 6; при 0.024 г/л - график 7; при 0.030 г/л - график 8; при 0.036 г/л - график 9; на фиг. 3 - графики зависимости оптической плотности раствора, содержащего БПГК - Mo(VI) и альбумин с концентрацией 0.002 г/л, при фиксированном значении рН и температуре 25°C от времени инкубации; на фиг. 4 - зависимость оптической плотности растворов с постоянной концентрацией альбумина 0.002 г/л от кислотности среды; на фиг. 5 - представлены градуировочные зависимости оптической плотности растворов от концентрации белка: общий белок - график а; альбумин - график б.In FIG. Figure 1 shows the absorption spectra of solutions of the complex of bromopyrogallol red with molybdenum (VI) (BPHC - Mo (VI)) - I and the complex of bromopyrogallol red with molybdenum (VI) in the presence of protein II with an absorption maximum at a wavelength of 600 nm; in FIG. 2 - absorption spectra of reagent solutions with different concentrations of total protein: at 0.003 g / l - graph 1; at 0.006 g / l - graph 2; at 0.012 g / l - graph 3; at 0.015 g / l - graph 4; at 0.018 g / l - graph 5; at 0.021 g / l - graph 6; at 0.024 g / l - graph 7; at 0.030 g / l - graph 8; at 0.036 g / l - graph 9; in FIG. 3 - graphs of the dependence of the optical density of a solution containing BPHC - Mo (VI) and albumin with a concentration of 0.002 g / l, at a fixed pH value and a temperature of 25 ° C on incubation time; in FIG. 4 - dependence of the optical density of solutions with a constant albumin concentration of 0.002 g / l on the acidity of the medium; in FIG. 5 - calibration dependences of the optical density of solutions on protein concentration are presented: total protein - graph a; albumin schedule b.
При осуществлении способа в результате смешения раствора реагента с раствором белка образуется трехкомпонентный комплекс БПГК - Mo(VI) - белок (фигура 1). Спектр поглощения раствора реагента имеет характерный вид с двумя максимумами поглощения - I (фиг. 1). При введении в систему молекул белка происходит образование трехкомпонентного соединения, и спектр поглощения сдвигается в область 580-620 нм - II (фиг. 1), максимум поглощения трехкомпонентного комплекса БПГК - Mo(VI) - белок наблюдается при длине волны 600 нм. При увеличении концентрации молекул белка в растворе происходит пропорциональное увеличение оптической плотности при длине волны 600 нм (фигура 2). Поскольку раствор реагента также поглощает при длине волны 600 нм, то в качестве холостой пробы следует использовать раствор, приготовленный смешиванием соответствующего объема раствора реагента и объема физиологического раствора, равного объему пробы (см. графики 1-9).When implementing the method, as a result of mixing the reagent solution with the protein solution, a three-component complex of BPHC - Mo (VI) - protein is formed (figure 1). The absorption spectrum of the reagent solution has a characteristic form with two absorption maxima - I (Fig. 1). When protein molecules are introduced into the system, a three-component compound is formed, and the absorption spectrum shifts to the region of 580-620 nm - II (Fig. 1), the absorption maximum of the three-component complex BPHC - Mo (VI) - protein is observed at a wavelength of 600 nm. With an increase in the concentration of protein molecules in the solution, a proportional increase in the optical density occurs at a wavelength of 600 nm (figure 2). Since the reagent solution also absorbs at a wavelength of 600 nm, a solution prepared by mixing the appropriate volume of the reagent solution and the volume of physiological saline equal to the volume of the sample should be used as a blank sample (see graphs 1-9).
Концентрация БПГК и молибдата натрия в растворе реагента не должна быть меньше 1.5×10-3 и 0.6×10-3 масс. % соответственно, т.к. при меньших концентрациях этих компонентов сокращается диапазон линейности градуировочного графика. Использование концентраций, больших 4.0×10-3 и 1.6×10-3 масс. % соответственно, приводит к излишнему расходу реактивов.The concentration of BPHC and sodium molybdate in the reagent solution should not be less than 1.5 × 10 -3 and 0.6 × 10 -3 mass. % respectively, because at lower concentrations of these components, the linearity range of the calibration curve is reduced. The use of concentrations of large 4.0 × 10 -3 and 1.6 × 10 -3 mass. %, respectively, leads to excessive consumption of reagents.
Исследование времени формирования аналитического сигнала проводили путем измерения оптической плотности раствора, содержащего комплекс БПГК - Mo(VI) и альбумин с концентрацией 0.002 г/л, при фиксированном значении рН 2.5 и температуре 25°C через равные промежутки времени на спектрофотометре (UV-1800 «Shimadzu», Япония) в режиме «Кинетика». Полученные результаты, представленные на фигуре 3, показывают, что оптическая плотность растворов в пределах погрешности ее измерения остается постоянной в течение не менее 60 минут, что позволяет исключить обязательное инкубирование проб.The study of the formation time of the analytical signal was carried out by measuring the optical density of a solution containing a complex of BPHC - Mo (VI) and albumin with a concentration of 0.002 g / l, at a fixed pH of 2.5 and a temperature of 25 ° C at regular intervals on a spectrophotometer (UV-1800 " Shimadzu ", Japan) in the" Kinetics "mode. The results obtained, presented in figure 3, show that the optical density of the solutions within the measurement error remains constant for at least 60 minutes, which eliminates the mandatory incubation of samples.
Для выбора оптимальной кислотности среды для проведения реакции между молекулами белка и реагентом готовили серию растворов с постоянной концентрацией альбумина и различной кислотностью среды и измеряли оптические плотности полученных растворов. Значение кислотности среды определяли с помощью рН-метра-иономера «Эксперт - 001». Кислотность варьировали в диапазоне значений 1.5-4.5 ед. рН добавлением разных количеств едкого натра или хлороводородной кислоты к исходному раствору в присутствии сукцинатного буфера. Эксперимент проводили для растворов с постоянной концентрацией альбумина 0.002 г/л при длине волны 600 нм. В соответствии с полученными данными был построен график зависимости оптической плотности растворов от кислотности (фигура 4) для раствора реагента с составом (масс. %): бромпирогаллоловый красный 3.5×10-3, молибдат натрия 1.0×10-3; янтарная кислота 0.6; оксалат натрия 0.01. Оптимальное значение кислотности среды для проведения реакции между комплексом БПГК-Mo(VI) и раствором белка предлагаем создавать введением янтарной кислоты с концентрацией 0.4-0.7 масс. %; и оксалатом натрия 0.01-0.03 масс. %. Введение оксалат ионов в состав раствора реагента способствует устранению их влияния при анализе белка в биологических жидкостях. Совместное присутствие оксалата натрия и янтарной кислоты способствует созданию требуемой буферной емкости раствора реагента, позволяющей сохранять оптимальное значение кислотности среды в пределах от 2.2 до 3.5 ед. рН даже при добавлении большого объема пробы. Меньшее содержание компонентов не обеспечивает достаточную буферную емкость реагента, а большее содержание приводит к неоправданно завышенному расходу реактивов.To select the optimal acidity of the medium for carrying out the reaction between the protein molecules and the reagent, a series of solutions with a constant concentration of albumin and a different acidity of the medium was prepared and the optical densities of the resulting solutions were measured. The acidity of the medium was determined using an Expert-001 pH meter. Acidity varied in the range of 1.5–4.5 units. pH by adding various amounts of sodium hydroxide or hydrochloric acid to the initial solution in the presence of succinate buffer. The experiment was carried out for solutions with a constant albumin concentration of 0.002 g / l at a wavelength of 600 nm. In accordance with the data obtained, a graph was constructed of the dependence of the optical density of solutions on acidity (Figure 4) for a reagent solution with the composition (wt.%): Bromopyrogallol red 3.5 × 10 -3 , sodium molybdate 1.0 × 10 -3 ; succinic acid 0.6; sodium oxalate 0.01. We suggest creating the optimum acidity of the medium for carrying out the reaction between the BPHC-Mo (VI) complex and the protein solution by introducing succinic acid with a concentration of 0.4-0.7 mass. %; and sodium oxalate 0.01-0.03 mass. % The introduction of oxalate ions into the composition of the reagent solution helps to eliminate their influence in the analysis of protein in biological fluids. The combined presence of sodium oxalate and succinic acid contributes to the creation of the required buffer capacity of the reagent solution, which allows maintaining the optimal value of the acidity of the medium in the range from 2.2 to 3.5 units. pH even when a large sample volume is added. A lower content of the components does not provide a sufficient buffer capacity of the reagent, and a higher content leads to unreasonably high reagent consumption.
С целью оптимизации состава раствора реагента к буферному раствору, содержащему БПГК - Mo(VI), янтарную кислоту и оксалат натрия, добавляли этиловый спирт 8.0-16.0 масс. % и поверхностно-активные вещества 0.03-1.00 масс. %. Как указано в прототипе, добавление этилового спирта в указанных количествах позволяет стабилизировать раствор реактива во времени, а добавление детергентов позволяет предотвратить выпадение осадка. Экспериментально установлено, что добавление детергентов в раствор реагента приводит к уменьшению срока хранения раствора, а добавление этилового спирта не влияет на устойчивость раствора реагента.In order to optimize the composition of the reagent solution, ethyl alcohol 8.0-16.0 wt. Was added to the buffer solution containing BPHC - Mo (VI), succinic acid and sodium oxalate. % and surfactants 0.03-1.00 mass. % As indicated in the prototype, the addition of ethyl alcohol in the indicated amounts allows the solution of the reagent to be stabilized over time, and the addition of detergents helps to prevent precipitation. It was experimentally established that the addition of detergents to the reagent solution leads to a decrease in the shelf life of the solution, and the addition of ethyl alcohol does not affect the stability of the reagent solution.
Исследовали диапазон линейности зависимости оптической плотности растворов от концентрации и предел обнаружения белка при использовании растворов реагента различного состава. Результаты эксперимента представлены в таблице 1.We investigated the linearity range of the dependence of the optical density of solutions on the concentration and the detection limit of the protein when using reagent solutions of various compositions. The results of the experiment are presented in table 1.
Полученные данные свидетельствуют о том, что введение в состав раствора реагента этанола и (или) детергентов не приводит к увеличению чувствительности и расширению диапазона определяемых содержаний белка. Применение более простого по составу раствора реагента, включающего только БПГК - Mo(VI), янтарную кислоту, оксалат натрия и воду, позволяет расширить диапазон линейности градуировочного графика, диапазон определяемых содержаний общего белка, а также уменьшить предел его обнаружения и экономить реактивы.The data obtained indicate that the introduction of ethanol and (or) detergents into the composition of the reagent solution does not increase the sensitivity and expand the range of the determined protein contents. The use of a simpler reagent solution in composition, including only BPHC - Mo (VI), succinic acid, sodium oxalate and water, allows you to expand the linearity range of the calibration graph, the range of determined total protein contents, as well as reduce its detection limit and save reagents.
Для построения градуировочного графика в пробирки вносят раствор реагента и соответствующий объем стандартного раствора белка. Растворы перемешивают и измеряют оптическую плотность в кювете с толщиной слоя 1 см относительно холостой пробы на спектрофотометре при длине волны 600 нм. Холостая проба готовится добавлением к реагенту соответствующего объема физиологического раствора.To build a calibration graph, a reagent solution and the corresponding volume of a standard protein solution are added to the tubes. The solutions are mixed and the absorbance is measured in a cuvette with a layer thickness of 1 cm relative to a blank sample on a spectrophotometer at a wavelength of 600 nm. A blank sample is prepared by adding an appropriate volume of saline to the reagent.
Градуировочные зависимости оптической плотности от концентрации альбумина и общего белка при их содержании в растворе до 2 г/л представлены на фигуре 5.Calibration dependences of the optical density on the concentration of albumin and total protein when their content in the solution is up to 2 g / l are presented in figure 5.
Предел обнаружения рассчитывали по общепринятой формуле:The detection limit was calculated by the generally accepted formula:
где S - стандартное отклонение фонового значения,where S is the standard deviation of the background value,
tgα - тангенс угла наклона градуировочной кривой.tgα is the slope of the calibration curve.
Как видно из фигуры 5, градуировочные зависимости оптической плотности растворов от концентрации белка, построенные при использовании разных калибраторов - стандартного раствора альбумина и стандартного раствора общего белка - имеют одинаковый тангенс угла наклона. Значение предела обнаружения в обоих случаях составило 0.01 г/л, что говорит о практически одинаковой чувствительности реагента к белкам различной природы.As can be seen from figure 5, the calibration dependences of the optical density of the solutions on the protein concentration, constructed using different calibrators - a standard albumin solution and a standard solution of total protein - have the same slope. The detection limit in both cases was 0.01 g / l, which indicates almost the same sensitivity of the reagent to proteins of various nature.
Таким образом, введение в состав раствора реагента бромпирогаллолового красного позволяет минимизировать или исключить ошибку, которая возникает в обычной практике при определении общего белка в случае использования в качестве калибратора стандартного раствора альбумина.Thus, the introduction of bromopyrogallol red reagent into the solution makes it possible to minimize or eliminate the error that occurs in ordinary practice when determining the total protein in the case of using a standard albumin solution as a calibrator.
Проверку правильности определения общего белка в реальных объектах - образцах сыворотки крови и мочи. В первом случае результаты анализа сравнивали с данными, полученными независимым биуретовым методом. Для проб мочи использовали метод стандартных добавок. Содержание общего белка определяли по градуировочному графику и методом одного эталона. Данные эксперимента представлены в таблицах 2-3.Verification of the correct determination of the total protein in real objects - samples of blood serum and urine. In the first case, the results of the analysis were compared with data obtained by an independent biuret method. For urine samples, the standard supplementation method was used. The total protein content was determined by the calibration curve and the method of one standard. The experimental data are presented in tables 2-3.
Таким образом, по сравнению с используемыми на практике способами определения общего белка в биологических жидкостях, предлагаемый способ характеризуется более широким диапазоном определяемых концентраций и большей чувствительностью.Thus, in comparison with the methods used in practice for determining the total protein in biological fluids, the proposed method is characterized by a wider range of detectable concentrations and greater sensitivity.
Возможность варьирования кратности разведения анализируемых проб, а также высокая чувствительность предлагаемого способа и больший диапазон линейности позволяет проводить анализ как объектов с заведомо низким содержанием белка (моча, спинномозговая жидкость, ликвор), так и объектов, где содержание общего белка высоко (сыворотка и плазма крови). Отсутствие необходимости инкубирования проб позволяет сократить время анализа.The possibility of varying the dilution ratio of the analyzed samples, as well as the high sensitivity of the proposed method and a larger linearity range, allows analysis of objects with obviously low protein content (urine, cerebrospinal fluid, cerebrospinal fluid), and objects where the total protein content is high (serum and blood plasma) ) The absence of the need for sample incubation reduces the analysis time.
Одинаковая чувствительность бромпирогаллолового красного в составе предлагаемого реагента к белкам различной природы позволяет минимизировать погрешности в определении общего белка в биологических жидкостях, так как природа и состав калибратора при использовании указанного красителя не оказывает влияние на результаты определения общего белка.The identical sensitivity of bromopyrogallol red in the composition of the proposed reagent to proteins of various nature allows one to minimize errors in determining the total protein in biological fluids, since the nature and composition of the calibrator using this dye does not affect the results of determining the total protein.
Получаемый технический результат обеспечивается отличительными признаками заявляемого способа, т.е. он обладает изобретательским уровнем, новизной и может найти широкое практическое применение для количественного определения общего белка в биологических жидкостях при массовых клинико-диагностических исследованиях.The resulting technical result is provided by the hallmarks of the proposed method, i.e. it has an inventive step, novelty and can find wide practical application for the quantitative determination of total protein in biological fluids in mass clinical diagnostic studies.
Claims (3)
бромпирогаллоловый красный - (1.5-4.0)×10-3,
молибдат натрия - (0.5-1.5)×10-3,
оксалат натрия - 0.01-0.03,
янтарная кислота - 0.4-0.7,
вода - остальное,
соотношение образца биологической жидкости с раствором реагента берут 1:(5-200) соответственно, измеряют оптическую плотность пробы при длине волны в диапазоне 580-620 нм относительно холостой пробы, приготовленной путем добавления к реагенту соответствующего объема физиологического раствора, определение концентрации общего белка осуществляют методом градуировочного графика или методом одного эталона.1. Spectrophotometric method for determining the total protein in biological fluids, including mixing a sample of biological fluid with a reagent solution taken in a certain ratio, keeping at room temperature, measuring the optical density of the sample at wavelengths in a certain range, determining the concentration of the total protein, while the reagent solution contains an organic dye, sodium molybdate, sodium salt, succinic acid and water, characterized in that in the reagent solution as an organic dye bromopyrogallol red, and sodium oxalate as the sodium salt, the components were taken in concentrations (wt.%):
bromopyrogallol red - (1.5-4.0) × 10 -3 ,
sodium molybdate - (0.5-1.5) × 10 -3 ,
sodium oxalate - 0.01-0.03,
succinic acid - 0.4-0.7,
water - the rest
the ratio of the sample of the biological fluid with the reagent solution is taken 1: (5-200), respectively, the optical density of the sample is measured at a wavelength in the range of 580-620 nm relative to the blank sample prepared by adding an appropriate volume of physiological solution to the reagent, the concentration of the total protein is determined by the method calibration graph or by one standard method.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015106165/15A RU2593361C1 (en) | 2015-02-24 | 2015-02-24 | Spectrophotometric method of determination of protein in biological fluids |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015106165/15A RU2593361C1 (en) | 2015-02-24 | 2015-02-24 | Spectrophotometric method of determination of protein in biological fluids |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2593361C1 true RU2593361C1 (en) | 2016-08-10 |
Family
ID=56613135
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015106165/15A RU2593361C1 (en) | 2015-02-24 | 2015-02-24 | Spectrophotometric method of determination of protein in biological fluids |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2593361C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108801961A (en) * | 2018-05-22 | 2018-11-13 | 山东农业工程学院 | A kind of detection method of biotin |
| RU2807912C1 (en) * | 2022-12-20 | 2023-11-21 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Ивановский государственный химико-технологический университет" | 5-[4'-(1'',3''-benzoxazol-2''-yl)phenyl]-10,15,20-tris(4'-sulfophenyl)porphine as fluorescent sensor for detection and quantification of albumina content |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2268476C2 (en) * | 2004-03-30 | 2006-01-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Эйлитон" (ООО "Эйлитон") | Method for quantitative detecting protein in biological liquids |
-
2015
- 2015-02-24 RU RU2015106165/15A patent/RU2593361C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2268476C2 (en) * | 2004-03-30 | 2006-01-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Эйлитон" (ООО "Эйлитон") | Method for quantitative detecting protein in biological liquids |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Watanabe N, Kamei S, Ohkubo A, et al. Urinary protein as measurement with a pyrogallol red-molybdate complexe manually and in Hitachi 726 automated analyzer. Clin Chem 1986 ; 32 : 1551-4. * |
| Ларичева Е. С., Андреев Ю. Н., Ребякова Е. Н., Козлов А. В. Способен ли метод определения белка в моче пирогаллоловым красным претендовать на роль основного? "Лабораторная диагностика", 2009, с. 24-31. Мамедова А.М. Аналитические аспекты использования цветометрических характеристик пирогаллолового красного и бромпирогаллолового красного и их комплексов с ионами металлов. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук. Москва, 2005. * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108801961A (en) * | 2018-05-22 | 2018-11-13 | 山东农业工程学院 | A kind of detection method of biotin |
| CN108801961B (en) * | 2018-05-22 | 2020-07-10 | 山东农业工程学院 | Biotin detection method |
| RU2812894C2 (en) * | 2022-04-08 | 2024-02-05 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Волгоградский государственный медицинский университет "Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method of quantitative and electrophoretic assessment of protein content in urine |
| RU2807912C1 (en) * | 2022-12-20 | 2023-11-21 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Ивановский государственный химико-технологический университет" | 5-[4'-(1'',3''-benzoxazol-2''-yl)phenyl]-10,15,20-tris(4'-sulfophenyl)porphine as fluorescent sensor for detection and quantification of albumina content |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Walters et al. | An ultramicromethod for the determination of conjugated and total bilirubin in serum or plasma | |
| JP4697809B2 (en) | Method for stabilizing leuco dyes | |
| EP1903327B1 (en) | Cuvette | |
| CN101680876A (en) | Whole blood assay | |
| EP4062179B1 (en) | Fluorimetric analytical method for the determination of creatinine in clinically significant biological samples and a fluorimetric reagent for use in this method | |
| EP0097472B1 (en) | Method of determining calcium in a fluid sample | |
| RU2593361C1 (en) | Spectrophotometric method of determination of protein in biological fluids | |
| US20210208152A1 (en) | Reagent composition for measuring glycated albumin and method for measuring glycated albumin using same | |
| US11220704B2 (en) | Method for measuring HbA1c | |
| JP5274590B2 (en) | Method for stabilizing leuco dyes | |
| CN101477059B (en) | Method for rapidly detecting inorganic phosphorus in water solution | |
| ES2977287T3 (en) | Calibrators and controls for determining the percentage of glycosylated hemoglobin in a liquid test sample from a patient | |
| JP5055507B2 (en) | Method and reagent for measuring protein in sample | |
| JP2010189662A (en) | Method for stabilizing leuco pigment | |
| Wilson et al. | The automated measurement of ascorbic acid in serum and urine | |
| RU2268476C2 (en) | Method for quantitative detecting protein in biological liquids | |
| US20170089910A1 (en) | Methods and compositions for assaying blood levels of legumain | |
| RU2300771C2 (en) | Method for determination of hemoglobin in biological fluids | |
| JPH0335166A (en) | Method and reagent for preventing turbidity | |
| CZ30895U1 (en) | A reaction mixture for the quantitative determination of creatinine in a sample of human urine, serum or plasma | |
| Brescia et al. | Multi-volume analysis of nucleic acids using the EPOCH™ spectrophotometer system | |
| RU2097762C1 (en) | Reagent kit for determination of primary aromatic amines in solutions and biological fluids | |
| Suzuki | Color reaction of aromatic aldehyde with serum protein and its application to the determination of serum total globulin concentration | |
| RU2163019C2 (en) | Method for qualitative and quantitative determination of protein in biological fluids | |
| EP3397971B1 (en) | Method for determining the quantity of an hba1c in a blood sample |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20210225 |