RU2812894C2 - Method of quantitative and electrophoretic assessment of protein content in urine - Google Patents
Method of quantitative and electrophoretic assessment of protein content in urine Download PDFInfo
- Publication number
- RU2812894C2 RU2812894C2 RU2022109459A RU2022109459A RU2812894C2 RU 2812894 C2 RU2812894 C2 RU 2812894C2 RU 2022109459 A RU2022109459 A RU 2022109459A RU 2022109459 A RU2022109459 A RU 2022109459A RU 2812894 C2 RU2812894 C2 RU 2812894C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- sample
- mmol
- reagent
- protein concentration
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 title abstract description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 62
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 62
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 29
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 21
- KUQNCHZOCSYKOR-UHFFFAOYSA-N 1,1-dioxospiro[2,1$l^{6}-benzoxathiole-3,9'-xanthene]-3',4',5',6'-tetrol Chemical compound O1S(=O)(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C(O)=C1OC1=C(O)C(O)=CC=C21 KUQNCHZOCSYKOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 claims abstract description 9
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 7
- TVXXNOYZHKPKGW-UHFFFAOYSA-N sodium molybdate (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Mo]([O-])(=O)=O TVXXNOYZHKPKGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 235000015393 sodium molybdate Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 239000011684 sodium molybdate Substances 0.000 claims abstract description 6
- ZNCPFRVNHGOPAG-UHFFFAOYSA-L sodium oxalate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)C([O-])=O ZNCPFRVNHGOPAG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 5
- 229940039790 sodium oxalate Drugs 0.000 claims abstract description 5
- 229940074404 sodium succinate Drugs 0.000 claims abstract description 5
- ZDQYSKICYIVCPN-UHFFFAOYSA-L sodium succinate (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)CCC([O-])=O ZDQYSKICYIVCPN-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 11
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000004040 coloring Methods 0.000 claims 2
- 238000000424 optical density measurement Methods 0.000 claims 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 abstract description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 abstract description 15
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 8
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 abstract description 7
- 239000012496 blank sample Substances 0.000 abstract description 5
- 239000012482 calibration solution Substances 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 230000006872 improvement Effects 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 8
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 8
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 8
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 239000011546 protein dye Substances 0.000 description 3
- WXHLLJAMBQLULT-UHFFFAOYSA-N 2-[[6-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]-2-methylpyrimidin-4-yl]amino]-n-(2-methyl-6-sulfanylphenyl)-1,3-thiazole-5-carboxamide;hydrate Chemical compound O.C=1C(N2CCN(CCO)CC2)=NC(C)=NC=1NC(S1)=NC=C1C(=O)NC1=C(C)C=CC=C1S WXHLLJAMBQLULT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- -1 molybdate ions Chemical class 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- WQGWDDDVZFFDIG-UHFFFAOYSA-N pyrogallol Chemical compound OC1=CC=CC(O)=C1O WQGWDDDVZFFDIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012468 concentrated sample Substances 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005375 photometry Methods 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 201000001474 proteinuria Diseases 0.000 description 1
- 229940079877 pyrogallol Drugs 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 239000001044 red dye Substances 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 1
- 125000000472 sulfonyl group Chemical group *S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицины, может использоваться в клинико-диагностической практике с целью: концентрирование белка в моче, определение содержания белка в моче, способ пробоподготовки для электрофоретического разделения белков мочи, способ окрашивания полученных электрофореграмм.The invention relates to the field of medicine, can be used in clinical diagnostic practice for the following purposes: concentration of protein in urine, determination of protein content in urine, method of sample preparation for electrophoretic separation of urine proteins, method of staining the resulting electropherograms.
Наибольшее распространение определения белка в моче получил метод с сульфосалициловой кислотой (ССК). Метод основан на помутнении пробы с образованием хлопьевидных преципитатов вследствие денатурации белков в кислой среде [Kingsbury F.B., Clark C.P., Williams G., Post A.L. // J. Lab. Clin. Med. – 1926. – Vol. 11. – P.981-989]. Процедура определения белка состоит в добавлении к пробе ССК, с последующей инкубацией 5 минут, после чего концентрацию белка определяют по интенсивности помутнения на фотоэлектроколориметре против холостой пробы, расчеты проводят с помощью калибровочного графика, построенного по стандартным растворам альбумина. Однако определение белка с ССК более специфично к альбумину и в присутствии глобулинов общее содержание белка получается заниженным. Кроме того, несмотря на простоту выполнения анализа, доступность реактива и экономичность, метод имеет ряд существенных недостатков: плохо поддается стандартизации; существенное различие в составе калибратора (альбумин) и проб приводит к заниженным результатам; малая чувствительность метода (недостаточно для диагностики микропротеинурии); малая степень разведения пробы в реагенте 1/3 приводит к сильному влиянию в реакционной смеси интерферирующих веществ.The most widely used method for determining protein in urine is the sulfosalicylic acid (SSA) method. The method is based on the turbidity of the sample with the formation of flocculent precipitates due to the denaturation of proteins in an acidic environment [Kingsbury F.B., Clark C.P., Williams G., Post A.L. // J. Lab. Clin. Med. – 1926. – Vol. 11. – P.981-989]. The protein determination procedure consists of adding SSC to the sample, followed by incubation for 5 minutes, after which the protein concentration is determined by the intensity of turbidity on a photoelectrocolorimeter against a blank sample, calculations are carried out using a calibration graph constructed using standard albumin solutions. However, the determination of protein with CCK is more specific to albumin, and in the presence of globulins, the total protein content is underestimated. In addition, despite the ease of analysis, availability of the reagent and cost-effectiveness, the method has a number of significant disadvantages: it is difficult to standardize; a significant difference in the composition of the calibrator (albumin) and samples leads to underestimated results; low sensitivity of the method (not enough to diagnose microproteinuria); a small degree of dilution of the sample in the reagent 1/3 leads to a strong influence of interfering substances in the reaction mixture.
Наиболее чувствительными и точными являются колориметрические методы определения общего белка мочи, основанные на специфических цветных реакциях белков, в частности методы, основанные на связывании белка с органическими красителям. Наиболее широко применяемые методы с кумасси бриллиантовым голубым и пирогаллолово-красным (ПГК).The most sensitive and accurate are colorimetric methods for determining total urine protein, based on specific color reactions of proteins, in particular methods based on protein binding to organic dyes. The most widely used methods are Coomassie Brilliant Blue and Pyrogallol Red (PGR).
Способ количественного определения содержания белка, основанный на связывании белков красителем Coomassie Briliant Blue G-250 [Bradford M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem, 1976. V. 72. P. 248 – 254.]. В кислой среде сульфонильные группы анионной формы красителя соединяются с белком, максимум поглощения свободной формы красителя при 495 нм, после связывания с белком при 595. Комплекс белок-краситель образуется в течение 2 минут и сохраняет стабильность около 1 часа, Изменение окраски регистрируют фотометрически при длине волны 595 нм через 2-3 минуты после реакции, расчеты проводят с помощью калибровочного графика, построенного по стандартным растворам альбумина. Метод простой, быстрый и недорогой, чувствительность составляет 5 – 15 мг/л, но линейная область определения белка приблизительно 500 мг/л. Краситель нечувствителен к большинству компонентов буферных смесей, но подвержен влиянию детергентов: додецилсульфат натрия, тритон X-100. Помимо этого, результат анализа может искажать неоднородная способность красителя связывать белки: связывание происходит преимущественно с аминокислотными остатками аргинина и в меньшей степени гистидина, триптофана, тирозина, лизина и фенилаланина.A method for the quantitative determination of protein content based on the binding of proteins with the dye Coomassie Briliant Blue G-250 [Bradford M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem, 1976. V. 72. P. 248 – 254.]. In an acidic environment, the sulfonyl groups of the anionic form of the dye combine with the protein, the absorption maximum of the free form of the dye is at 495 nm, after binding to the protein at 595. The protein-dye complex is formed within 2 minutes and remains stable for about 1 hour. The color change is recorded photometrically at length waves 595 nm 2-3 minutes after the reaction, calculations are carried out using a calibration graph constructed using standard albumin solutions. The method is simple, fast and inexpensive, the sensitivity is 5 – 15 mg/l, but the linear range of protein detection is approximately 500 mg/l. The dye is insensitive to most components of buffer mixtures, but is susceptible to the influence of detergents: sodium dodecyl sulfate, Triton X-100. In addition, the analysis result can be distorted by the heterogeneous ability of the dye to bind proteins: binding occurs predominantly with the amino acid residues of arginine and to a lesser extent histidine, tryptophan, tyrosine, lysine and phenylalanine.
Способ количественного определения содержания белка, основанный на связывании комплекса красителя пирогаллоловый красный и ионов молибдата с молекулами белка в кислой среде [Watanabe N., Kamei S., Ohkubo A., Yamanaka M., Ohsawa S., Makino K., Tokuda K. Urina Protein as Measured with a Pyrogallol Red-Molybdate Complex, Manually and in a Hitachi 726 Automated Analyzer // Clin. Chem., 1986. V. 32 (8). P. 1551 – 1544.]. В кислой среде пирогаллоловый красный и молибдат натрия образуют комплекс с максимум поглощения при 460 нм, при взаимодействии комплекса с белками максимум поглощения смещается на 598 нм. Время необходимое для образования комплекса 10 минут, окраска остается стабильной в течение 1 часа. Изменение окраски регистрируют фотометрически при длине волны 600 нм через 10 минут после реакции, расчеты проводят с помощью калибровочного графика, построенного по стандартным растворам альбумина. Метод прост и удобен для ручного выполнения, также возможна автоматизация. Чувствительность метода составляет 30 – 40 мг/л, линейная область измерения от 0,05 до 2 г/л. Кроме того, сродство ПГК практически одинаково ко всем белкам. Образующиеся комплексы белок – краситель нечувствительны к большинству интерферирующих веществ. Помимо этого, в зависимости от используемой методики соотношение проба реагент варьирует от 1/10 до 1/50, что также уменьшает влияние присутствующих веществ в моче. A method for quantitative determination of protein content based on the binding of a complex of pyrogallol red dye and molybdate ions with protein molecules in an acidic environment [Watanabe N., Kamei S., Ohkubo A., Yamanaka M., Ohsawa S., Makino K., Tokuda K. Urina Protein as Measured with a Pyrogallol Red-Molybdate Complex, Manually and in a Hitachi 726 Automated Analyzer // Clin. Chem., 1986. V. 32 (8). P. 1551 – 1544.]. In an acidic environment, pyrogallol red and sodium molybdate form a complex with an absorption maximum at 460 nm; when the complex interacts with proteins, the absorption maximum shifts to 598 nm. The time required for the formation of the complex is 10 minutes, the color remains stable for 1 hour. The color change is recorded photometrically at a wavelength of 600 nm 10 minutes after the reaction; calculations are carried out using a calibration graph constructed using standard albumin solutions. The method is simple and convenient for manual execution; automation is also possible. The sensitivity of the method is 30 – 40 mg/l, the linear measurement range is from 0.05 to 2 g/l. In addition, the affinity of PGA for all proteins is almost the same. The resulting protein-dye complexes are insensitive to most interfering substances. In addition, depending on the technique used, the sample-reagent ratio varies from 1/10 to 1/50, which also reduces the influence of substances present in the urine.
На основе протокола количественного определения содержания белка с красителем пирогаллоловым красным был разработан протокол [Caldwell R.B., Lattemann C.T. Simple and Reliable Method To Precipitate Proteins from Bacterial Culture Supernatant // Applied and environmental microbiology, 2004. V. 70. №.1. P. 610 – 612] концентрирования белка. Способ включает смешивание раствора реагента с белком с последующей инкубацией в течение ночи при +4˚С. После осадок центрифугируют при 10000 g в течение 1 часа, отделяют от супернатанта, промывают осадок 1 мл ацетона и удаляют ацетон выпариванием. Based on the protocol for the quantitative determination of protein content with the dye pyrogallol red, a protocol was developed [Caldwell R.B., Lattemann C.T. Simple and Reliable Method To Precipitate Proteins from Bacterial Culture Supernatant // Applied and environmental microbiology, 2004. V. 70. No. 1. P. 610 – 612] protein concentration. The method involves mixing a reagent solution with protein, followed by incubation overnight at +4˚C. Afterwards, the precipitate is centrifuged at 10,000 g for 1 hour, separated from the supernatant, the precipitate is washed with 1 ml of acetone and the acetone is removed by evaporation.
Наиболее близким к изобретению является способ количественного определения белка в биологических жидкостях (моче и спинномозговой жидкости) с применением коммерческого набора «Белок PGR» производства компании «Абрис+». Способ включает смешивание раствора реагента с образцом биологической жидкости в соотношении 50:1, инкубацию пробы с перемешиванием в течение 10 минут, измерение оптической плотности против холостой пробы при длине волны 600 нм и определение концентрации белка по стандартной формуле относительно калибровочного раствора альбумина. В составе набора пирогаллоловый красный – 0,6 ммоль/л, молибдат натрия – 1,6 ммоль/л, сукцинат натрия – 50 ммоль/л, в результате взаимодействия белковых молекул с пирогаллоловым красным в кислой среде в присутствии ионов молибдата образуется окрашенный комплекс, имеющий максимум поглощения при длине волны 613 нм.The closest to the invention is a method for the quantitative determination of protein in biological fluids (urine and cerebrospinal fluid) using the commercial kit “PGR Protein” produced by the Abris+ company. The method includes mixing a reagent solution with a biological fluid sample in a ratio of 50:1, incubating the sample with stirring for 10 minutes, measuring the optical density against a blank sample at a wavelength of 600 nm and determining the protein concentration using a standard formula relative to an albumin calibration solution. The set contains pyrogallol red - 0.6 mmol/l, sodium molybdate - 1.6 mmol/l, sodium succinate - 50 mmol/l, as a result of the interaction of protein molecules with pyrogallol red in an acidic environment in the presence of molybdate ions, a colored complex is formed, having an absorption maximum at a wavelength of 613 nm.
Однако коммерческих наборов с протоколом для одномоментного применения, как в качестве способа определения концентрации белка, так и способа концентрирования, а также с возможностью использования в качестве красителя электрофореграмм, не было найдено.However, no commercial kits with a protocol for one-time use, both as a method for determining protein concentration and a concentration method, as well as with the possibility of using electropherograms as a dye, have been found.
Техническим результатом изобретения является улучшение аналитических характеристик, чувствительность способа составляет 0,05 г/л, область линейности до 2 г/л, коэффициент вариации менее 10%, выход белка при концентрировании до 56-79%. The technical result of the invention is the improvement of analytical characteristics, the sensitivity of the method is 0.05 g/l, the linearity range is up to 2 g/l, the coefficient of variation is less than 10%, the protein yield upon concentration is up to 56-79%.
Сущность предложенного способа состоит в том, что для определения концентрации белка указанным способом, включающим смешивание образца с реактивом-комплексообразователем, инкубацию пробы в течение 10 минут при комнатной температуре, измерение оптической плотности пробы фотометрически при длине волны 600 нм, определение концентрации белка стандартным образом, используют реагент (PRMM) следующего состава: пирогаллоловый красный (0,05 ммоль/л), молибдат натрия (0,16 ммоль/л), сукцинат натрия (50 ммоль/л), оксалат натрия (1 ммоль/л), 20% (vol/vol) метанол в воде. Концентрирование белка в пробе достигается путем последующей инкубации при +4˚С в течение суток, после центрифугируют при 12000 об/мин 11 минут и отбирают супернатант. The essence of the proposed method is that to determine the protein concentration using the specified method, including mixing the sample with a complexing reagent, incubating the sample for 10 minutes at room temperature, measuring the optical density of the sample photometrically at a wavelength of 600 nm, determining the protein concentration in a standard manner, use a reagent (PRMM) of the following composition: pyrogallol red (0.05 mmol/l), sodium molybdate (0.16 mmol/l), sodium succinate (50 mmol/l), sodium oxalate (1 mmol/l), 20% (vol/vol) methanol in water. Concentration of the protein in the sample is achieved by subsequent incubation at +4˚C for 24 hours, after which it is centrifuged at 12,000 rpm for 11 minutes and the supernatant is collected.
Смешивание биологической жидкости с реактивом-комплексообразователем ведут в соотношении 1:9, при этом измерение оптической плотности проводят при одной длине волны 600 нм. Выбранное соотношение проба-реагент является компромиссным решением и для измерения концентрации белка, и для последующего концентрирования. The biological fluid is mixed with the complexing reagent in a ratio of 1:9, and the optical density is measured at one wavelength of 600 nm. The selected sample-to-reagent ratio is a compromise for both protein concentration measurement and subsequent concentration.
Реактив-комплексообразователь, кроме молибдата натрия и пирогаллолового красного включает метанол в качестве низкоатомного спирта. Это позволяет стабилизировать раствор реактива во время приготовления и при дальнейшем хранении. Кроме того, введение именно метанола повышает количественный выход белка при концентрировании.The complexing reagent, in addition to sodium molybdate and pyrogallol red, includes methanol as a low-atomic alcohol. This allows you to stabilize the reagent solution during preparation and during further storage. In addition, the introduction of methanol increases the quantitative yield of protein during concentration.
Введение в реактив-комплексообразователь янтарной кислоты позволяет повысить его буферную емкость.The introduction of succinic acid into the complexing reagent makes it possible to increase its buffer capacity.
Введение в реактив-комплексообразователь оксалата натрия позволяет уменьшить влияние интерферирующих факторов при определении концентрации белка в моче. The introduction of sodium oxalate into the complexing reagent makes it possible to reduce the influence of interfering factors when determining the protein concentration in the urine.
Реактив-комплексообразователь готовят следующим образом: приготоавливают раствор окрашенного реагента – пирогаллолового красного в присутствии молибдата натрия, сукцината натрия и оксалата натрия растворением соответсвующих сухих навесок в дистиллированной воде, после чего добавляют метанол и доводят водой до нужного объема. Раствор для разведения готовят аналогичным образом без добавления пирогаллолового красного. Рабочий реактив готовят смешиванием необходимого объема в соотношении 1:1 окрашенного раствора и раствора для разведения. The complexing reagent is prepared as follows: a solution of the colored reagent - pyrogallol red - is prepared in the presence of sodium molybdate, sodium succinate and sodium oxalate by dissolving the appropriate dry samples in distilled water, after which methanol is added and adjusted with water to the required volume. The dilution solution is prepared in the same way without adding pyrogallol red. The working reagent is prepared by mixing the required volume in a 1:1 ratio of the colored solution and the dilution solution.
Возможность практического применения заявленного способа иллюстрируется следующими примерами.The possibility of practical application of the claimed method is illustrated by the following examples.
Пример 1. Нормальное значения содержания общего белка в моче варьирует в диапазоне 10 – 140 мг/л [Tiez N.W. Clinical guide to laboratory tests // W.B. Saunders Company, 1986, p.87]. При диагностике микропротеинурии и протеинурии при различных почечных заболеваниях количественно определяют концентрацию общего белка в моче. Процедура определения следующая: в пробирку вносят 100 мкл образца мочи пациента и 900 мкл реактива. Проба инкубируется в течение 10 минут при комнатной температуре (+18…+25˚С). Далее проводится измерение фотометрическим способом на измерительном приборе в кювете с оптическим путем 1 см и при длине волны 600 нм против холостой пробы. В качестве холостой пробы используют раствор, состоящий из 100 мкл воды и 900 мкл реагента. Аналогичным образом проводят анализ стандартного водного раствора альбумина с концентрацией 1 г/л (калибровочный раствор). По полученным значения оптических плотностей для исследуемого образца (ОПоб) и калибровочного раствора альбумина (ОПкл) рассчитывают концентрацию С, г/л, белка в моче по формуле:Example 1. Normal values for total protein in urine vary in the range of 10 – 140 mg/l [Tiez N.W. Clinical guide to laboratory tests // W.B. Saunders Company, 1986, p.87]. When diagnosing microproteinuria and proteinuria in various renal diseases, the concentration of total protein in the urine is quantified. The determination procedure is as follows: 100 μl of the patient’s urine sample and 900 μl of the reagent are added to the test tube. The sample is incubated for 10 minutes at room temperature (+18...+25˚С). Next, a photometric measurement is carried out on a measuring device in a cuvette with an optical path of 1 cm and at a wavelength of 600 nm against a blank sample. A solution consisting of 100 μl of water and 900 μl of reagent is used as a blank sample. Analyze a standard aqueous solution of albumin with a concentration of 1 g/l (calibration solution) in a similar manner. Based on the obtained optical densities for the test sample (ODob) and the albumin calibration solution (OPcl), the concentration C, g/l, of protein in urine is calculated using the formula:
С = Cкл х (ОПоб/ОПкл), где Скл = 1 г/л.C = Ccl x (OPob/OPcl), where Ccl = 1 g/l.
В случае, если расчетная величина концентрации белка превышает 2 г/л, необходимо развести образец мочи пациента водой и провести анализ повторно, а полученный результат умножить на степень разведения. If the calculated protein concentration exceeds 2 g/l, it is necessary to dilute the patient's urine sample with water and repeat the analysis, and multiply the result obtained by the degree of dilution.
Пример 2. Исследование белкового спектра мочи часто требует концентрирования белка в образце. Процедура концентрирования с PRMM следующая: в пробирку вносят 100 мкл образца мочи пациента и 900 мкл реактива, проба инкубируется в течение суток при +4˚С. После проводят центрифугирование при 12000 об/мин в течение 11 минут и отбирают супернатант, полученные осадки используются для электрофоретического разделения. При количественной оценке выход белка составил 56-79%, такой выход белка сопоставим с выходом достигаемым другими методами [Afkarian M., Bhasin M., Dillon S.T., Guerrero M.C., Nelson R.G., Knowler W.C., Thadhani R., Libermann T.A. (2010) Mol. Cell Proteomics, 9(10), 2195–2204. DOI:10.1074/mcp.M110.000992].Example 2: Testing the protein spectrum of urine often requires concentrating the protein in the sample. The concentration procedure with PRMM is as follows: 100 μl of the patient’s urine sample and 900 μl of the reagent are added to the test tube, the sample is incubated for 24 hours at +4˚C. Afterwards, centrifugation is carried out at 12,000 rpm for 11 minutes and the supernatant is collected, the resulting sediments are used for electrophoretic separation. When quantified, the protein yield was 56-79%, this protein yield is comparable to the yield achieved by other methods [Afkarian M., Bhasin M., Dillon S.T., Guerrero M.C., Nelson R.G., Knowler W.C., Thadhani R., Libermann T.A. (2010) Mol. Cell Proteomics, 9(10), 2195–2204. DOI:10.1074/mcp.M110.000992].
Пример 3. Электрофорез белков мочи с окраской электрофоретических пластинок PRMM. Определение белка и концентрирование проводят, как описано в примерах 1-2. Электрофорез проводят по Лэммли на 4-20% гелях Mini-PROTEAN TGX Precast Gels BioRad. После электрофоретического разделения проводят: фиксацию белков в электрофоретической пластине; окраску, помещая электрофоретическую пластину в рабочий раствор реактива на сутки; отмывку от избытка краски; сканирование. Качественная оценка электрофореграмм показывает, что интенсивность фракций при окраске PRMM несколько уступает Кумасси R-250. Однако фоновое окрашивание при использовании PRMM практически отсутствует (фиг. 1). Количественная оценка зависимости площади полосы на электрофореграмме от количества нанесенного белка (фиг. 2) показала, что для Кумасси эта зависимость носит выраженный экспоненциальный характер. В то же время, при окраске PRMM – зависимость линейна (R2=0,98). А преимущество Кумасси по коэффициенту чувствительности (наклон прямой при линейной аппроксимации) выражено только при малых количествах белка (7905 у.е./мкг до 1 мкг на дорожку, фиг. 2). При больших количествах белка на дорожку – коэффициенты чувствительности для обоих методов окрашивания примерно равны.Example 3. Electrophoresis of urine proteins with staining of PRMM electrophoretic plates. Protein determination and concentration are carried out as described in examples 1-2. Electrophoresis is carried out according to Laemmli on 4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gels BioRad. After electrophoretic separation, the following is carried out: fixation of proteins in an electrophoretic plate; staining by placing the electrophoretic plate in the working reagent solution for a day; cleaning from excess paint; scanning. A qualitative assessment of electropherograms shows that the intensity of the fractions when stained with PRMM is somewhat inferior to Coomassie R-250. However, there is virtually no background staining using PRMM (Fig. 1). A quantitative assessment of the dependence of the band area on the electropherogram on the amount of applied protein (Fig. 2) showed that for Coomassie this dependence is of a pronounced exponential nature. At the same time, when stained with PRMM, the dependence is linear (R 2 =0.98). And the advantage of Coomassie in terms of sensitivity coefficient (slope of the straight line with linear approximation) is expressed only at small amounts of protein (7905 a.u./μg to 1 μg per lane, Fig. 2). At large amounts of protein per lane, the sensitivity coefficients for both staining methods are approximately equal.
Таким образом, преимуществами предложенного изобретения в сравнении с известными решениями являются: Thus, the advantages of the proposed invention in comparison with known solutions are:
1) возможность более широкого практического применения реактива благодаря улучшенным аналитическим характеристикам, чувствительность способа составляет 0,05 г/л, область линейности до 2 г/л, коэффициент вариации составляет менее 10%;1) the possibility of wider practical use of the reagent due to improved analytical characteristics, the sensitivity of the method is 0.05 g/l, the linearity range is up to 2 g/l, the coefficient of variation is less than 10%;
2) возможность концентрирования белка перед электрофоретическим разделением благодаря модификации состава компонентов;2) the possibility of concentrating the protein before electrophoretic separation due to modification of the composition of the components;
3) возможность применения реактива в качестве окраски гелей после электрофореза.3) the possibility of using the reagent as a stain for gels after electrophoresis.
Краткое описание чертежей.Brief description of the drawings.
Фиг 1. Результаты ДСН-ПААГ электрофореза сконцентрированных проб: окрашивание PRMM и Кумасси R-250.Figure 1. Results of SDS-PAGE electrophoresis of concentrated samples: PRMM and Coomassie R-250 staining.
Фиг. 2. Зависимость площади пика на электрофореграмме от количества белка, нанесенного на дорожку при окрашивании Кумасси R-250 и реагентом PRMM.Fig. 2. Dependence of the peak area on the electropherogram on the amount of protein applied to the track when stained with Coomassie R-250 and PRMM reagent.
Claims (5)
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2022109459A RU2022109459A (en) | 2023-10-09 |
| RU2812894C2 true RU2812894C2 (en) | 2024-02-05 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2268476C2 (en) * | 2004-03-30 | 2006-01-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Эйлитон" (ООО "Эйлитон") | Method for quantitative detecting protein in biological liquids |
| RU2593361C1 (en) * | 2015-02-24 | 2016-08-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Кубанский государственный университет" (ФГБОУ ВПО "КубГУ") | Spectrophotometric method of determination of protein in biological fluids |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2268476C2 (en) * | 2004-03-30 | 2006-01-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Эйлитон" (ООО "Эйлитон") | Method for quantitative detecting protein in biological liquids |
| RU2593361C1 (en) * | 2015-02-24 | 2016-08-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Кубанский государственный университет" (ФГБОУ ВПО "КубГУ") | Spectrophotometric method of determination of protein in biological fluids |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Еремина А. И., Никитина С. А. АНАЛИЗ ЭФФЕКТИВНОСТИ ОКРАСКИ СЫВОРОТОЧНЫХ БЕЛКОВ В АГАРОЗНОМ ГЕЛЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ACID VIOLET И ПИРОГОЛЛОЛОВОГО КРАСНОГО //Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины. - 2015. - С. 57-58. Marshall T., Williams K. M. Extent of aminoglycoside interference in the pyrogallol red-molybdate protein assay depends on the concentration of sodium oxalate in the dye reagent //Clinical chemistry, 2004, 50(5), p. 934-935. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| McElderry et al. | Six methods for urinary protein compared. | |
| US4302536A (en) | Colorimetric immunoassay process | |
| Schosinsky et al. | Simple spectrophotometric determination of urinary albumin by dye-binding with use of bromphenol blue. | |
| DE60024448D1 (en) | SYSTEM FOR ELECTROCHEMICAL QUANTITATIVE ANALYSIS OF ANALYZES IN A SOLID PHASE | |
| Pokhrel et al. | Selection of appropriate protein assay method for a paper microfluidics platform | |
| Xu et al. | Simultaneous determination of urinary creatinine, calcium and other inorganic cations by capillary zone electrophoresis with indirect ultraviolet detection | |
| NIshi et al. | Three turbidimetric methods for determining total protein compared. | |
| Tas et al. | Protein staining methods in quantitative cytochemistry | |
| CN114487420A (en) | Creatine kinase isoenzyme detection kit | |
| RU2812894C2 (en) | Method of quantitative and electrophoretic assessment of protein content in urine | |
| Pesce et al. | Method for measuring the concentration of urinary proteins according to their molecular size category. | |
| CN112379091A (en) | Creatine kinase isoenzyme CK-MB detection kit resistant to heparin interference | |
| Gentry et al. | Determination of serum albumin in domestic animals using the immediate bromcresol green reaction | |
| US3649198A (en) | Diagnostic method for the determination of uric acid in blood | |
| Kuo | Derivative spectroscopic determination of paraquat in serum. | |
| CN112485447B (en) | Kit for determining complement C1q | |
| JPH0414310B2 (en) | ||
| CN109799352B (en) | Chemiluminescent reagent and application thereof in immunoassay | |
| SU1367838A3 (en) | Versions of method of determining tistreptolizene antibodies in blood | |
| Robertson | Optimizing determination of plasma albumin by the bromcresol green dye-binding method. | |
| Indika et al. | Optimization of Automated Dimethylmethylene Blue Assay for Quantification of Pediatric Urine Samples | |
| Stone et al. | Validation of an enzymatic total magnesium determination based on activation of modified isocitrate dehydrogenase | |
| RU2268476C2 (en) | Method for quantitative detecting protein in biological liquids | |
| Gustafsson | Urinary albumin determination by the immediate bromcresol green method | |
| Ijpma et al. | Evaluation of the Du Pont aca ammonia procedure. |