RU2575621C1 - STRAIN-PRODUCER OF METHIONINE-FREE CRM197 BASED ON CELLS E. coli BL21 (DE3) - Google Patents
STRAIN-PRODUCER OF METHIONINE-FREE CRM197 BASED ON CELLS E. coli BL21 (DE3) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2575621C1 RU2575621C1 RU2015100909/10A RU2015100909A RU2575621C1 RU 2575621 C1 RU2575621 C1 RU 2575621C1 RU 2015100909/10 A RU2015100909/10 A RU 2015100909/10A RU 2015100909 A RU2015100909 A RU 2015100909A RU 2575621 C1 RU2575621 C1 RU 2575621C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- crm197
- coli
- cells
- expression
- Prior art date
Links
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 title claims abstract description 69
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 title claims abstract description 69
- 108010071134 CRM197 (non-toxic variant of diphtheria toxin) Proteins 0.000 title claims abstract description 59
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 title claims abstract description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 41
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 29
- 101710039852 METAP1 Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 101710012506 METAP2 Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 claims abstract description 16
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 60
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 60
- 229960005486 vaccines Drugs 0.000 abstract description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 11
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 4
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 56
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 52
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 23
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl β-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 13
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000002609 media Substances 0.000 description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 10
- 210000003000 Inclusion Bodies Anatomy 0.000 description 9
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 9
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108010033725 Recombinant Proteins Proteins 0.000 description 8
- 102000007312 Recombinant Proteins Human genes 0.000 description 8
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N edta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N Ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 6
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-Methionine Natural products CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 6
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 6
- 108091007172 antigens Proteins 0.000 description 6
- 102000038129 antigens Human genes 0.000 description 6
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 6
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 6
- 150000004676 glycans Polymers 0.000 description 6
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 6
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 6
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000001131 transforming Effects 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940041514 Candida albicans extract Drugs 0.000 description 5
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N D-Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 229960001031 Glucose Drugs 0.000 description 5
- GUBGYTABKSRVRQ-UUNJERMWSA-N Lactose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)O[C@@H]1CO)[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1 GUBGYTABKSRVRQ-UUNJERMWSA-N 0.000 description 5
- 230000000240 adjuvant Effects 0.000 description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 5
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 description 5
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 5
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 5
- 230000001717 pathogenic Effects 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N β-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 210000001322 Periplasm Anatomy 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 229960003983 diphtheria toxoid Drugs 0.000 description 4
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 4
- 244000052769 pathogens Species 0.000 description 4
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 4
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 3
- 206010013023 Diphtheria Diseases 0.000 description 3
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 3
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 3
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 3
- 229940052778 Neisseria meningitidis Drugs 0.000 description 3
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 description 3
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N PMSF Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 description 3
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 description 3
- LZCZIHQBSCVGRD-UHFFFAOYSA-N benzenecarboximidamide;hydron;chloride Chemical compound [Cl-].NC(=[NH2+])C1=CC=CC=C1 LZCZIHQBSCVGRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 229940045808 Haemophilus influenzae type b Drugs 0.000 description 2
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 2
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 2
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L MgCl2 Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000001744 T-Lymphocytes Anatomy 0.000 description 2
- 208000001877 Whooping Cough Diseases 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- KDFQYGBJUYYWDJ-UHFFFAOYSA-N azane;sodium Chemical compound N.[Na] KDFQYGBJUYYWDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial Effects 0.000 description 2
- 108010003152 bacteriophage T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 201000005702 pertussis Diseases 0.000 description 2
- FJYCIMTWDRJSQU-UHFFFAOYSA-N phenoxymethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)COC1=CC=CC=C1 FJYCIMTWDRJSQU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 1,4-dimercaptobutane-2,3-diol Chemical compound SCC(O)C(O)CS VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589291 Acinetobacter Species 0.000 description 1
- 241000606750 Actinobacillus Species 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N Ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000037197 Anion exchangers Human genes 0.000 description 1
- 108091006437 Anion exchangers Proteins 0.000 description 1
- 229940064005 Antibiotic throat preparations Drugs 0.000 description 1
- 229940083879 Antibiotics FOR TREATMENT OF HEMORRHOIDS AND ANAL FISSURES FOR TOPICAL USE Drugs 0.000 description 1
- 229940042052 Antibiotics for systemic use Drugs 0.000 description 1
- 229940042786 Antitubercular Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 241000287523 Ara Species 0.000 description 1
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 description 1
- 241000589562 Brucella Species 0.000 description 1
- 241000589876 Campylobacter Species 0.000 description 1
- 229940077731 Carbohydrate nutrients Drugs 0.000 description 1
- 210000002421 Cell Wall Anatomy 0.000 description 1
- 229940038705 Chlamydia trachomatis Drugs 0.000 description 1
- 241000606153 Chlamydia trachomatis Species 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 241000186227 Corynebacterium diphtheriae Species 0.000 description 1
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 description 1
- GZCGUPFRVQAUEE-KCDKBNATSA-N D-(+)-Galactose Natural products OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-KCDKBNATSA-N 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000033147 ERVK-25 Human genes 0.000 description 1
- 241000588914 Enterobacter Species 0.000 description 1
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 1
- 241001522878 Escherichia coli B Species 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 241000617590 Escherichia coli K1 Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 1
- 229960002989 Glutamic Acid Drugs 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 229940093922 Gynecological Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 241000589989 Helicobacter Species 0.000 description 1
- 229940037467 Helicobacter pylori Drugs 0.000 description 1
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 description 1
- 208000002672 Hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 241000724675 Hepatitis E virus Species 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 241000406221 Hypostomus robinii Species 0.000 description 1
- 102000009438 IgE Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010073816 IgE Receptors Proteins 0.000 description 1
- 210000000987 Immune System Anatomy 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108020004999 Messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000588621 Moraxella Species 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 description 1
- 208000009025 Nervous System Disease Diseases 0.000 description 1
- 206010029305 Neurological disorder Diseases 0.000 description 1
- 206010057852 Nicotine dependence Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 102100005352 PCSK9 Human genes 0.000 description 1
- 101700000651 PCSK9 Proteins 0.000 description 1
- 102100013547 PGRMC2 Human genes 0.000 description 1
- 101710006814 PGRMC2 Proteins 0.000 description 1
- 102100013781 PPP1R8 Human genes 0.000 description 1
- 241000606860 Pasteurella Species 0.000 description 1
- 108091005771 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000588769 Proteus <enterobacteria> Species 0.000 description 1
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 1
- 108090000589 Ribonuclease E Proteins 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 206010039447 Salmonellosis Diseases 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 description 1
- 229940076185 Staphylococcus aureus Drugs 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 241000191963 Staphylococcus epidermidis Species 0.000 description 1
- 229940031000 Streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 description 1
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 1
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 1
- 229940024982 Topical Antifungal Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 241000589886 Treponema Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 241000607734 Yersinia <bacteria> Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 231100000494 adverse effect Toxicity 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 125000000089 arabinosyl group Chemical class C1([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO1)* 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 description 1
- 230000037348 biosynthesis Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking Effects 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000001413 cellular Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000035071 co-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 229940001442 combination vaccines Drugs 0.000 description 1
- 238000005056 compaction Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000002380 cytological Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 101700047627 deoR Proteins 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic Effects 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002538 fungal Effects 0.000 description 1
- 101700037230 galU Proteins 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 1
- 101700046795 gtaB Proteins 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229940079866 intestinal antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000001320 lysogenic Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated Effects 0.000 description 1
- 201000009906 meningitis Diseases 0.000 description 1
- 229920002106 messenger RNA Polymers 0.000 description 1
- 230000000813 microbial Effects 0.000 description 1
- 230000003278 mimic Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 101700002291 ompT Proteins 0.000 description 1
- 229940005935 ophthalmologic Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920000023 polynucleotide Polymers 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000011546 protein dye Substances 0.000 description 1
- 230000030788 protein refolding Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 125000001453 quaternary ammonium group Chemical group 0.000 description 1
- 101700084252 recA1 Proteins 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 231100000486 side effect Toxicity 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000004215 spores Anatomy 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N α-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Изобретение относится к молекулярной биологии, биотехнологии, медицине и может быть использовано для повышения иммуногенности вакцин.The invention relates to molecular biology, biotechnology, medicine and can be used to increase the immunogenicity of vaccines.
В настоящее время наблюдается тенденция возрастания резистентности многих патогенов, вызывающих социально значимые бактериальные и грибковые заболевания, к действию антибиотиков, в связи с чем перспективным направлением борьбы с ними представляется предупреждение развития заболевания, за счет вакцинации. Действие многих разработанных и применяющихся вакцин основано на индуцировании иммунного ответа против полисахаридных антигенов, представленных на клеточной стенке патогена. Однако полисахарид - это антиген, не связанный с реакцией Т-клеток, потому вызывает лишь краткосрочный иммунитет без иммунной памяти; вакцины, содержащие только данные вещества, неэффективны, что показано у детей до 2 лет [Greenwood В M et al., Trans R Soc Trop Med Hyg, 1980, 74:756-760; международная заявка на изобретение WO 2010120921 A1, дата приоритета 16.04.2009]. Использование полисахаридов совместно с белком-адъювантом, преимущественно в одной конструкции, позволяет задействовать все звенья иммунитета, что в результате приводит к адекватному иммунному ответу, с формированием иммунологической памяти.Currently, there is a tendency to increase the resistance of many pathogens that cause socially significant bacterial and fungal diseases to the action of antibiotics, and therefore the prevention of the development of the disease through vaccination seems to be a promising direction in the fight against them. The action of many vaccines developed and used is based on the induction of an immune response against polysaccharide antigens present on the cell wall of the pathogen. However, a polysaccharide is an antigen that is not associated with the reaction of T cells, therefore it causes only short-term immunity without immune memory; vaccines containing only these substances are ineffective, as shown in children under 2 years of age [Greenwood, M et al., Trans R Soc Trop Med Hyg, 1980, 74: 756-760; international application for the invention WO 2010120921 A1, priority date 04.16.2009]. The use of polysaccharides in conjunction with an adjuvant protein, mainly in one design, allows all links of the immune system to be activated, which as a result leads to an adequate immune response, with the formation of immunological memory.
Белок CRM197 является производным дифтерийного токсина, отличающимся одной мутацией, а именно заменой глицина на глутаминовую кислоту в положении 52, что элиминирует его токсичность [Uchida Т., Pappenheimer A.M., Greany R. Diphtheria toxin and related proteins. I. Isolation and properties of mutant proteins serologically related to diphtheria toxin // J. Biol. Chem. 1973. Vol. 248, №11. P. 3838-3844]. Данный белок предпочтительно применяют в противоположность химически детоксицированному токсину дифтерии, в составе вакцин против различных патогенов. Так, в настоящее время ряд вакцин производится с использованием токсоида дифтерии CRM197 в качестве иммуногенного носителя [Lepow M.L. и др., J. Infectious Diseases 150 [1984] 402-406, RU 2331435, RU 2498994, RU 2498815, RU 2325184, RU 2495049, RU 2322451, RU 2422156, RU 2471497, RU 2454244, RU 2379052, RU 2378010, RU 2378008, RU 2419628, RU 2402347, RU 2521501, RU 2518291, RU 2508122, RU 2012107657, RU 2009149359, RU 2012107480, RU 2011151781, RU 2011143398, RU 2011142774, RU 2011142747, RU 2008145859, RU 2013101418, RU 2504398, RU 2381814, RU 2012151376, RU 2012153061, RU 2360699, RU 2493870, RU 2484846, RU 2362784, RU 2435609, RU 2105568, WO 9640239, UA 96934]. Известны и конъюгаты, содержащие CRM197 [RU 2253655, RU 2385737, RU 2361609, RU 2359696, RU 2336091, RU 2333007, RU 2331435, RU 2498994, RU 2498815, RU 2495049, RU 2322451, RU 2422156, RU 2471497, RU 2454244, RU 2379052, RU 2378010, RU 2378008, RU 2419628, RU 2402347, RU 2521501, RU 2518291, RU 2412944, RU 2508122, RU 2012116119, RU 2012107657, RU 2009149359, RU 2012107480, RU 2011151781, RU 2011143398, RU 2011142774, RU 2011142747, RU 2008145859, RU 2482878, RU 2013101418, RU 2504398, RU 2381814, RU 2012151376, RU 2012153061, RU 2360699, RU 2493870, RU 2484846, RU 2362784, RU 2435609, RU 2105568, WO 9640239, UA 96934].Protein CRM197 is a diphtheria toxin derivative that differs in one mutation, namely, the replacement of glycine with glutamic acid at position 52, which eliminates its toxicity [Uchida T., Pappenheimer A.M., Greany R. Diphtheria toxin and related proteins. I. Isolation and properties of mutant proteins serologically related to diphtheria toxin // J. Biol. Chem. 1973. Vol. 248, No. 11. P. 3838-3844]. This protein is preferably used in contrast to the chemically detoxified diphtheria toxin in vaccines against various pathogens. So, currently a number of vaccines are produced using diphtheria toxoid CRM197 as an immunogenic carrier [Lepow M.L. et al., J. Infectious Diseases 150 [1984] 402-406, RU 2331435, RU 2498994, RU 2498815, RU 2325184, RU 2495049, RU 2322451, RU 2422156, RU 2471497, RU 2454244, RU 2379052, RU 2378010, RU 2378008, RU 2419628, RU 2402347, RU 2521501, RU 2518291, RU 2508122, RU 2012107657, RU 2009149359, RU 2012107480, RU 2011151781, RU 2011143398, RU 2011142774, RU 2011142747, RU 2008145859, RU 2013101418, RU 2501898, 23818829, RU RU 2012151376, RU 2012153061, RU 2360699, RU 2493870, RU 2484846, RU 2362784, RU 2435609, RU 2105568, WO 9640239, UA 96934]. Conjugates are also known containing CRM197 [RU 2253655, RU 2385737, RU 2361609, RU 2359696, RU 2336091, RU 2333007, RU 2331435, RU 2498994, RU 2498815, RU 2495049, RU 2322451, RU 2422156, RU 2471497, RU 2454244, RU 2379052, RU 2378010, RU 2378008, RU 2419628, RU 2402347, RU 2521501, RU 2518291, RU 2412944, RU 2508122, RU 2012116119, RU 2012107657, RU 2009149359, RU 2012107480, RU 2011151781, RU 2011143398, RU 2011142774, RU 20111427774 RU 2008145859, RU 2482878, RU 2013101418, RU 2504398, RU 2381814, RU 2012151376, RU 2012153061, RU 2360699, RU 2493870, RU 2484846, RU 2362784, RU 2435609, RU 2105568, WO 9640239, UA 96934].
Вышеуказанные запатентованные в России изобретения и те, по которым планируется получить охрану в России, касаются инфекционных заболеваний, таких как менингит, вызванный Neisseria meningitidis группы A, B, C, W135 и Y, Е. coli K1-индуцированные заболевания, дифтерия, столбняк, коклюш, заболеваний, опосредованных PCSK9, Helicobacter pylori, вирусами полиомиелита, вирусом гепатита В, инфекций, вызываемых Chlamydia trachomatis, S. Pyogenes, Str. Pneumoniae, в том числе серотипов 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F и 23F, H. influenzae, в том числе типа B, стафилококками, в том числе Staphylococcus aureus, преимущественно штаммов типа 8 и 5, S. epidermidis, преимущественно штаммов серотипов I, II и III, инфекций, вызываемых грамотрицательными бактериями, в том числе Neisseria gonorrhoeae, аллергических и воспалительных реакций, вызываемых взаимодействиями C3-области IgE с высокоаффинным рецептором IgE, а также тау-ассоциированных неврологических расстройств, никотиновой зависимости. Вне России защищены либо планируют получить охрану в виде патентов на изобретение технические решения для профилактики инфекций, вызываемых Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, заболеваний, вызываемых вирусом гепатита E, вирусом гриппа и др. В основном, предложены технические решения в виде конъюгатов CRM197 с полисахаридами патогенов, причем представлены и структуры, содержащие два таких белка-носителя, конъюгированных с полисахаридом, каждый может быть конъюгирован с другим или таким же белком-носителем [RU 2004117775].The above inventions patented in Russia and those for which protection is planned to be obtained in Russia relate to infectious diseases, such as meningitis caused by Neisseria meningitidis groups A, B, C, W135 and Y, E. coli K1-induced diseases, diphtheria, tetanus, whooping cough, PCSK9-mediated diseases, Helicobacter pylori, poliomyelitis viruses, hepatitis B virus, infections caused by Chlamydia trachomatis, S. Pyogenes, Str. Pneumoniae, including
Известны и поливалентные вакцины, содержащие CRM197.Polyvalent vaccines containing CRM197 are also known.
Известна композиция вакцины, включающая анатоксин дифтерии, ′D′; анатоксин столбняка, T; клеточный антиген коклюша, ′wP′; поверхностный антиген вируса гепатита B, ′HbsAg′; капсулярный сахарид Haemophilus influenzae типа b (Hib), конъюгированный с белком-носителем, и по меньшей мере один капсулярный сахарид Neisseria meningitidis, конъюгированный с белком-носителем, где каждый из капсулярного сахарида Haemophilus influenzae типа b и капсулярного сахарида (сахаридов) Neisseria meningitidis является конъюгированным с белком-носителем в виде анатоксина столбняка [RU 2420315]. Известна мультивалентная иммуногенная композиция, включающая HBV компонент, дифтерийный анатоксин и один или несколько адъювантов, вариантом также являются конъюгаты данных компонентов [RU 2442825].A known vaccine composition comprising diphtheria toxoid, 'D'; tetanus toxoid, T; cellular pertussis antigen, ′ wP ′; hepatitis B surface antigen, 'HbsAg'; Haemophilus influenzae type b capsular saccharide (Hib) conjugated to a carrier protein, and at least one Neisseria meningitidis capsular saccharide conjugated to a carrier protein, where each of the Haemophilus influenzae type b capsular saccharide and Neisseria meningis saccharide (saccharides) Neisseria me conjugated to a carrier protein in the form of tetanus toxoid [RU 2420315]. Known multivalent immunogenic composition comprising an HBV component, diphtheria toxoid and one or more adjuvants, conjugates of these components are also an option [RU 2442825].
Известен способ получения комбинированной вакцины, которая содержит неионогенное поверхностно-активное вещество, поверхностный антиген (HBsAg) вируса гепатита В (HBV) и антиген C. diphtheriae - дифтерийный анатоксин, по которому осуществляют очистку и объединение HBsAg-компонента [RU 2444374]. Предложены и способы получения конъюгатов, с CRM197, за счет активированных функциональных групп на аминокислотных остатках носителя или, необязательно, через линкерную молекулу [WO 2005058940].There is a method of producing a combination vaccine that contains a nonionic surfactant, hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) (HBV) and C. diphtheriae antigen - diphtheria toxoid, which purifies and combines the HBsAg component [RU 2444374]. Methods for the preparation of conjugates with CRM197 are also proposed due to activated functional groups on the amino acid residues of the carrier or, optionally, through a linker molecule [WO 2005058940].
Классическим способом получения дифтерийного токсина и его нетоксичных производных является продукция в клетках Corynebacterium diphtheria линии PW8, инфицированных частицами β фага, геном которого несет мутантный ген tox, кодирующий дифтерийный токсин [RU 2394914, RU 94007083]. При этом необходимо выращивать культуру клеток в течение 36-48 часов для достижения максимальной концентрации дифтерийного токсина или его производных. Эти белки секретируются в культуральную среду, которая, наряду с целевым белком, содержит неспецифические примеси аминокислот, пептидов и белков. Целевой белок затем выделяют центрифугированием и последующей ультрафильтрацией, либо преципитацией, и далее очищают с использованием хроматографических методов. Однако для получения большего выхода целевого белка процесс ферментации требует большого количества лизогенных мутантов С. diphtheria и четко контролируемых условий роста (температура, перемешивание, аэрация, концентрация железа). Более того, используется патогенный организм, что требует особых условий производства.The classic way to obtain diphtheria toxin and its non-toxic derivatives is the production in cells of Corynebacterium diphtheria of the PW8 line infected with β phage particles whose genome carries the mutant tox gene encoding diphtheria toxin [RU 2394914, RU 94007083]. In this case, it is necessary to grow a cell culture for 36-48 hours to achieve the maximum concentration of diphtheria toxin or its derivatives. These proteins are secreted into the culture medium, which, along with the target protein, contains non-specific impurities of amino acids, peptides and proteins. The target protein is then isolated by centrifugation and subsequent ultrafiltration, or precipitation, and then purified using chromatographic methods. However, to obtain a higher yield of the target protein, the fermentation process requires a large number of C. diphtheria lysogenic mutants and well-controlled growth conditions (temperature, mixing, aeration, and iron concentration). Moreover, a pathogenic organism is used, which requires special production conditions.
Известен способ получения мутантного дифтерийного токсина CRM197 с использованием клеток Escherichia coli и гена, функционально связанного с промотором и хотя бы одной идеальной палиндромной операторной последовательностью, в векторе, преимущественно в периплазме [WO 2013178974].A known method for producing mutant diphtheria toxin CRM197 using Escherichia coli cells and a gene functionally linked to a promoter and at least one ideal palindromic operator sequence in a vector, mainly in periplasm [WO 2013178974].
Известен способ получения CRM197 с использованием клеток Escherichia coli и гена, его кодирующего, при котором синтезируется гибридный белок, в котором CRM197-фрагмент связан с гетерологичной сигнальной последовательностью для доставки в периплазму и содержит сайт разрезания между этими двумя фрагментами, при этом собственный сигнал для транспорта в периплазму может быть удален, причем гетерологичная последовательность функционально связана с промотором из araBAD promoter (PBAD), lac promoter, 1-rhamnose - индуцибельный rhaP BAD promoter, T7 RNA polymerase promoter, trc и tac promoter, lambda phage promoter p L, anhydro tetracycline-inducible tetA promoter/operator, клонирована в высококопийный экспрессионный вектор, из pEC415, pBR322, pBAD, серии pET, серии pUC, pACT3, pEXT22, pEXT20, серии pBLUESCRIPT, серии pGEM, хотя бы 50% продуцируемого белка растворима, индукция экспрессии происходит от 20°C до 37°C, N-конец экспрессируемого белка представлен на 50-100% последовательностями ADDV, GADDV, либо MGADDV, у того же количества белка имеется дисульфидная связь между Cys186 и Cys201 [WO 2014102265].A known method for producing CRM197 using Escherichia coli cells and a gene coding for it, in which a hybrid protein is synthesized in which a CRM197 fragment is linked to a heterologous signal sequence for delivery to the periplasm and contains a cut site between these two fragments, with its own signal for transport can be removed in the periplasm, the heterologous sequence being functionally linked to the promoter from araBAD promoter (PBAD), lac promoter, 1-rhamnose - inducible rhaP BAD promoter, T7 RNA polymerase promoter, trc and tac promoter, lambda phage promoter p L, anhydro tetracycline-inducible tetA promoter / operator, cloned into a high copy expression vector from pEC415, pBR322, pBAD, pET series, pUC series, pACT3, pEXT22, pEXT20, pBLUESCRIPT series, pGEM series, at least 50% soluble protein , expression induction occurs from 20 ° C to 37 ° C, the N-terminus of the expressed protein is represented by 50-100% ADDV, GADDV, or MGADDV sequences, the same amount of protein has a disulfide bond between Cys186 and Cys201 [WO 2014102265].
Известна экспрессионная система, в том числе для получения белка CRM197, в которой ген, кодирующий белок CRM197, на 5′ конце содержит сигнальную последовательность для направления в периплазматическое пространство бактерии, возможно, гетерологичную, на 3′ конце содержит последовательность, кодирующую, по меньшей мере, один B- или T-клеточный эпитоп, клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из E. coli, Acinetobacter, Actinobacillus, Bordetella, бруцелл, бактерии Campylobacter, Цианобактерии, Enterobacter, Erwinia, Franciscella, Helicobacter, Hemophilus, Klebsiella, Legionella, Moraxella, Neisseria, Pasteurella, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigella, Treponema, Vibrio, и Yersinia [WO 2011042516]. Также предложен способ получения данного белка в ферментере, по которому на разных стадиях различается температура(первая стадия - 20-40°C, вторая стадия - 20-28°C) и pH (первый этап - 6,0-7,0 или 7,0, второй этап - 6.5, 6.5-10.0, 7,0-8,0, 6.5-9,0 или 7,0-8,5), pH поддерживают с использованием буфера из группы, состоящей из фосфатного буфера, трис-буфера и гистидинового буфера, в концентрации 10-200 мМ, 50-100 мМ, 10-50 мМ, 100-200 мМ или 50-150 мМ, фосфатного буфера - 80-100 мМ, увеличение pH на второй стадии достигается путем добавления гидроксида натрия или аммиака, причем затем pH поддерживают между 6.5-10.0, 7,0-8,0, 9,0 6.5- или 7,0-8,5 путем добавления гидроксида натрия или аммиака, также различается скорость подачи субстрата, экспрессия индуцируется на второй стадии добавлением ИПТГ до конечной концентрации от 0,1 до 10 мМ.An expression system is known, including for producing the CRM197 protein, in which the gene encoding the CRM197 protein at the 5 ′ end contains a signal sequence for directing bacteria, possibly heterologous, to the periplasmic space, at the 3 ′ end contains a sequence encoding at least , one B- or T-cell epitope, the host cell is selected from the group consisting of E. coli, Acinetobacter, Actinobacillus, Bordetella, Brucella, Campylobacter, Cyanobacteria, Enterobacter, Erwinia, Franciscella, Helicobacter, Hemophilella, Klebs Moraxella, Neisseria, Pasteurella, Proteus, Salmonella, Serratia, Sh igella, Treponema, Vibrio, and Yersinia [WO 2011042516]. A method for producing this protein in a fermenter is also proposed, according to which the temperature (the first stage is 20-40 ° C, the second stage is 20-28 ° C) and the pH (the first stage is 6.0-7.0 or 7) are different at different stages. , 0, the second stage - 6.5, 6.5-10.0, 7.0-8.0, 6.5-9.0 or 7.0-8.5), the pH is maintained using a buffer from the group consisting of a phosphate buffer, tris- buffer and histidine buffer, at a concentration of 10-200 mm, 50-100 mm, 10-50 mm, 100-200 mm or 50-150 mm, phosphate buffer - 80-100 mm, an increase in pH in the second stage is achieved by adding sodium hydroxide or ammonia, and then the pH is maintained m between 6.5-10.0, 7.0-8.0, 9.0 6.5- or 7.0-8.5 by adding sodium hydroxide or ammonia, the substrate feed rate also differs, expression is induced in the second stage by the addition of IPTG to a final concentration of 0.1 to 10 mM.
Однако выделение белка из телец включения является более простым, менее трудоемким и позволяет получить больший выход белка из 1 л культуры клеток.However, the isolation of protein from inclusion bodies is simpler, less time consuming and allows to obtain a greater yield of protein from 1 l of cell culture.
Известен способ получения белка CRM197, слитого с тагом, с использованием клеток Escherichia coli [WO 2010150230]. В тексте описания указано, что использовали плазмидную ДНК pET9a и штамм E. coli BL21AI TM и BL21 (DE3). Также авторы указывают как возможные для использования векторы pET3a, pET3b, pET3c, pET5a, pET5b, pET5c, pET9b, pET9c, pET12a, pET12b, pET12c, pET17b (Novagen), pRSETA, B and C (Invitrogen) и pTYB1, pTYB2, рТУВ3 и pTYB4 (New England Biolabs), все векторы, которые имеют сильный промотор T7; штаммы E. coli, содержащие копию гена, кодирующего Т7 РНК-полимеразу, в том числе BL21StarTM(DE3), BL21-Gold(DE3), BL21(DE3)pLys, производные штамма ER2566, ER2566, ER2833, ER3011, ER3012, BL21 Al TM BL21(DE3), C41(DE3), C43(DE3) и все модифицированные штаммы Е. coli В - BLR(DE3), B834(DE3 TunerTM(DE3) или все модифицированные штаммы Е. coli K-12, HMS174(DE3), AD494(DE3), OrigamiTM(DE3), NovaBlue(DE3), RosettaTM(DE3). Предложена полинуклеотидная последовательность, кодирующая CRM197, оптимизированная для экспрессии в клетках Е. coli, которая может быть соединена с последовательностью, кодирующей любой таг.A known method of producing protein CRM197, fused with a tag using Escherichia coli cells [WO 2010150230]. The description text indicates that the plasmid DNA pET9a and the E. coli strain BL21AI TM and BL21 (DE3) were used. The authors also indicate how vectors pET3a, pET3b, pET3c, pET5a, pET5b, pET5c, pET9b, pET9c, pET12a, pET12b, pET12c, pET17b (Novagen), pRSETA, B and C (Invitrogen) and pTYB1, pTYB3, p pTYB4 (New England Biolabs), all vectors that have a strong T7 promoter; E. coli strains containing a copy of the gene encoding T7 RNA polymerase, including BL21StarTM (DE3), BL21-Gold (DE3), BL21 (DE3) pLys, derivatives of strain ER2566, ER2566, ER2833, ER3011, ER3012, BL21 Al TM BL21 (DE3), C41 (DE3), C43 (DE3) and all modified E. coli B strains - BLR (DE3), B834 (DE3 TunerTM (DE3) or all modified E. coli strains K-12, HMS174 (DE3 ), AD494 (DE3), OrigamiTM (DE3), NovaBlue (DE3), RosettaTM (DE3) A polynucleotide sequence encoding CRM197 is optimized for expression in E. coli cells, which can be connected to a sequence encoding any tag.
Однако целесообразно использование продуцента, который обеспечивает высокий уровень синтеза CRM197, не слитого с какой-либо последовательностью, для уменьшения количества работы с белком и увеличения вероятности прохождения препаратом доклинических и клинических исследований.However, it is advisable to use a producer that provides a high level of synthesis of CRM197, not fused to any sequence, to reduce the amount of protein work and increase the likelihood of preclinical and clinical studies.
Известен способ получения мутантного дифтерийного токсина CRM197 с использованием клеток Escherichia coli, включающий стадии получения телец включения, рефолдинг, разделение и концентрирование ультрафильтрацией раствора для рефолдинга, замену среды на Tris-HCl буфер, концентрирование раствора для рефолдинга, очистки с использованием анионообменной хроматографии, причем для хроматографии используют уравновешивающий буфер (Tris-HCl или фосфатный буфер 10 ммоль/л-1 моль/л, pH 6.0-11.0), добавление NaCl (10 ммоль/л-1 моль/л), элюирование белка в режиме вымывания, либо прерывистым элюционным градиентом [CN 101265288]. Для хроматографии используют агарозу или полистирол, с четвертичной аммониевой группой, DEAE-Sepharose FF, Q-Sepharose FF, SOURCE30-Q or Q-Big-Beds, причем может быть использована диэлектрическая среда с DEAE - Sepharose FF. В данном патенте не описан используемый штамм E. coli, в этом отношении приведена ссылка на документ CN 200610042194.7, однако такой номер не существует.A known method for producing mutant diphtheria toxin CRM197 using Escherichia coli cells, which includes the steps of producing inclusion bodies, refolding, separation and concentration by ultrafiltration of a refolding solution, replacing the medium with Tris-HCl buffer, concentrating the refolding solution, purification using anion exchange chromatography, and for chromatography uses a balancing buffer (Tris-HCl or phosphate buffer 10 mmol / l-1 mol / l, pH 6.0-11.0), the addition of NaCl (10 mmol / l-1 mol / l), elution of the protein in washing mode, or reryvistym elution gradient [CN 101265288]. For chromatography, agarose or polystyrene with a quaternary ammonium group, DEAE-Sepharose FF, Q-Sepharose FF, SOURCE30-Q or Q-Big-Beds is used, and a dielectric medium with DEAE - Sepharose FF can be used. The E. coli strain used is not described in this patent, reference is made to CN 200610042194.7 in this regard, however, such a number does not exist.
Известен способ получения мутантного дифтерийного токсина CRM197 с использованием клеток Escherichia coli, включающий стадии получения телец включения, денатурацию, центрифугирование, диализ супернатанта, помещение в буферную проточную систему и рефолдинг при перемешивании при 4°C, осаждение белка сульфатом аммония (от 20% до 40%), центрифугрование, концентрирование ультрафильтрацией с использованием ионообменной хроматографии, разделение с иерархическим использованием молекулярных сит [CN 103266125]. Используют ген, кодирующий CRM197, кодонно оптимизированный. В описании изобретения указано, что использовали клетки E. coli DH5α, а также плазмидную ДНК pBAD-DEST49, затем клетки E. coli BL21. Использование штамма E. coli, в котором возможна контролируемая экспрессия целевого белка, является более предпочтительным.A known method for producing mutant diphtheria toxin CRM197 using Escherichia coli cells, including the steps of producing inclusion bodies, denaturation, centrifugation, dialysis of the supernatant, placement in a buffer flow system and refolding with stirring at 4 ° C, precipitation of protein with ammonium sulfate (from 20% to 40 %), centrifugation, concentration by ultrafiltration using ion exchange chromatography, separation with hierarchical use of molecular sieves [CN 103266125]. A gene encoding CRM197, codon optimized, is used. The description of the invention indicates that E. coli DH5α cells were used, as well as pBAD-DEST49 plasmid DNA, then E. coli BL21 cells. The use of an E. coli strain in which controlled expression of the target protein is possible is more preferred.
Известен способ получения CRM197 с использованием клеток Escherichia coli, в тельцах включения, который характеризуется следующими шагами: (1) клонирование гена, кодирующего CRM197 (дизайн последовательности CRM197 и ДНК-последовательностей праймеров; с учетом синтетической рекомбинантной плазмиды); (2) создание рекомбинантной экспрессионной плазмиды (разрезание последовательностей ДНК, кодирующих CRM197 и векторную ДНК (вектора серии PET, PACYC PMBP), очистка и лигирование, трансформация, скрининг и идентификация); (3) трансформация клеток E. coli (E. coli BL21(DE3), JM109(DE3), OrigmaB(DE3) или Rosseta(DE3)) полученным экспрессионным вектором, скрининг (индукция экспрессии целевого белка, анализ белка-мишени электрофорезом в полиакриламидном геле ДСН-ПААГ; секвенирование ДНК); (4) очистка CRM197 (извлечение телец включения, отмывка, рефолдинг, очистка на анионообменнике на колонке (Q или DEAE) и гель-фильтрация белка, анализ очищенного белка с использованием ДСН-ПААГ [CN 100999548]. Описанное в данном патенте на изобретение техническое решение является наиболее близким аналогом предлагаемого изобретения - прототипом.A known method for producing CRM197 using Escherichia coli cells in inclusion bodies, which is characterized by the following steps: (1) cloning a gene encoding CRM197 (CRM197 sequence design and primer DNA sequences; taking into account a synthetic recombinant plasmid); (2) creation of a recombinant expression plasmid (cutting DNA sequences encoding CRM197 and vector DNA (PET, PACYC PMBP series vectors), purification and ligation, transformation, screening and identification); (3) transformation of E. coli cells (E. coli BL21 (DE3), JM109 (DE3), OrigmaB (DE3) or Rosseta (DE3)) with the obtained expression vector, screening (induction of target protein expression, analysis of the target protein by polyacrylamide electrophoresis) SDS-PAGE gel; DNA sequencing); (4) purification of CRM197 (inclusion body inclusion, washing, refolding, purification on an anion exchanger on a column (Q or DEAE) and protein gel filtration, analysis of purified protein using SDS-PAGE [CN 100999548]. Technical description described in this patent for the invention the solution is the closest analogue of the invention is the prototype.
Однако показано, что рекомбинантные белки, получаемые с использованием экспрессионных систем, в том числе бактериальных, которые сохраняют N-концевой метионин, в некоторых случаях отличаются от таковых, синтезируемых в клетке-хозяине, что может приводить к негативным последствиям при применении таких белков, включая индукцию формирования нежелательных антител. Использование метионинаминопептидазы для модификации рекомбинантного белка позволяет осуществить способ недорогой генерации терапевтических белков, имеющих структуру, имитирующую таковую местных белков клетки-хозяина, которые используются для борьбы с причинами различных заболеваний [Sandman et al., Biotechnology (NY) 13:504-6 (1995), US 6638750 (B1)]. Так, известен способ получения безметионинового интерферона альфа с использованием вектора, кодирующего метиониновую аминопептидазу и ген интерферона альфа человека, в клетках E. coli BL21 [CN 102367441 (B)]. Использование такой конструкции позволяет получить белок с уменьшенной иммуногенностью и уменьшить количество побочных реакций при использовании у человека.However, it has been shown that recombinant proteins obtained using expression systems, including bacterial ones, that retain the N-terminal methionine, in some cases differ from those synthesized in the host cell, which can lead to negative consequences when using such proteins, including inducing the formation of unwanted antibodies. The use of methionine aminopeptidases to modify a recombinant protein allows a method of inexpensively generating therapeutic proteins having a structure that mimics that of the local proteins of the host cell, which are used to combat the causes of various diseases [Sandman et al., Biotechnology (NY) 13: 504-6 (1995 ), US 6,638,750 (B1)]. Thus, there is a known method for producing methionine-free interferon alpha using a vector encoding methionine aminopeptidase and the human interferon alpha gene in E. coli BL21 cells [CN 102367441 (B)]. Using this design allows you to get a protein with reduced immunogenicity and reduce the number of adverse reactions when used in humans.
Авторами настоящего изобретения впервые для CRM197, для белка-адъюванта, предложено использование подхода, при котором в процессе его синтеза в клетках E. coli отщепляется N-концевой метионин.The authors of the present invention for the first time for CRM197, for an adjuvant protein, proposed the use of an approach in which, during its synthesis, the N-terminal methionine is cleaved in E. coli cells.
Технический результат выражается в увеличении эффективности вакцинации. Данный технический результат достигается тем, что формируются более специфичные антитела к вводимой конструкции, к полисахариду, за счет того, что уменьшается формирование антител на данный специфичный для экспрессии в клетках E. coli элемент, что позволит акцентировать внимание на конструкции целиком.The technical result is expressed in increasing the effectiveness of vaccination. This technical result is achieved by the formation of more specific antibodies to the introduced construct, to the polysaccharide, due to the fact that the formation of antibodies to this element specific for expression in E. coli cells is reduced, which will allow focusing on the whole construct.
Технический результат также выражается в увеличении эффективности вакцинации разными вакцинами, содержащими одинаковый адъювант. Данный технический результат достигается тем, что конструкция не подвергается блокированию и быстрой элиминации, индуцируется ответ на всю конструкцию, благодаря тому, что уменьшается вероятность специфического ответа на N-концевой метионин конструкции, полученной в клетках E. coli, в результате появляется возможность использования данного адъюванта в различных вакцинах, вводимых одному пациенту.The technical result is also expressed in increasing the efficiency of vaccination with different vaccines containing the same adjuvant. This technical result is achieved by the fact that the construct does not undergo blocking and rapid elimination, the response to the whole construct is induced, due to the fact that the probability of a specific response to the N-terminal methionine of the construct obtained in E. coli cells is reduced, as a result, it becomes possible to use this adjuvant in various vaccines given to one patient.
Технический результат также выражается в увеличении безопасности вводимой вакцины за счет уменьшения побочных эффектов, связанных с N-концевым метионином CRM197.The technical result is also expressed in increasing the safety of the administered vaccine by reducing the side effects associated with the N-terminal methionine CRM197.
Сущность изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION
Предложен штамм-продуцент CRM197 на основе клеток Escherichia coli BL21(DE3), содержащих плазмидную ДНК pETDuet-1, с которой одновременно синтезируются белок CRM197 и метиониновая аминопептидаза E. coli, гены, кодирующие данные белки, кодонно оптимизированы для экспрессии в клетках Е. coli, в 7 результате, синтезируемый CRM197 - безметиониновый. Использование данного штамма позволяет получить более безопасный компонент вакцины - безметиониновый CRM197, при этом не требуются дополнительные стадии работы с белком, для отделения метионина, дезактивации фермента и дополнительной очистки белка, поскольку отделение происходит внутри клетки, фермент также работает внутри клетки. При этом метиониновая аминопептидаза синтезируется в растворимом виде, за счет того, что использовали видоспецифичный фермент, а также за счет кодонной оптимизации, в результате является активным ферментом, способным к котрансляционной модификации синтезируемого CRM197, при этом CRM197 переходит в нерастворимую форму (в тельца включения), в результате стоит задача выделения белка исключительно из нерастворимой фракции - из телец включения, что облегчает очистку белка.A CRM197 producer strain based on Escherichia coli BL21 (DE3) cells containing plasmid DNA pETDuet-1 is proposed, with which the CRM197 protein and E. coli methionine aminopeptidase are simultaneously synthesized, the genes encoding these proteins are codonically optimized for expression in E. coli cells , in result 7, the synthesized CRM197 is methionine-free. Using this strain allows you to get a safer component of the vaccine - methionine-free CRM197, while it does not require additional stages of work with the protein to separate methionine, deactivate the enzyme and additional protein purification, since the separation occurs inside the cell, the enzyme also works inside the cell. In this case, methionine aminopeptidase is synthesized in a soluble form, due to the use of a species-specific enzyme, as well as due to codon optimization, as a result, it is an active enzyme capable of cotranslational modification of the synthesized CRM197, while CRM197 goes into an insoluble form (into inclusion bodies) As a result, the task is to isolate the protein exclusively from the insoluble fraction - from inclusion bodies, which facilitates protein purification.
Результаты исследований проиллюстрированы примерами 1-3 и фиг. 1.The research results are illustrated by examples 1-3 and FIG. one.
Краткое описание чертежей.A brief description of the drawings.
Фиг. 1. Электрофореграмма результатов индукции экпрессии гена crm197 с использованием 0,5 мМ ИПТГ, а также очистки белка CRM197, 12,5% ПААГ, 0,1% ДДС-Na. 1 - маркер молекулярного веса, 2 - лизат клеток штамма-продуцента до индукции, 3 - лизат клеток штамма-продуцента после индукции экспрессии гена 0,5 мМ ИПТГ, 4 - препарат рекомбинантного белка CRM197, полученный после проведения гидрофобной хроматографии, 5 - высокоочищенный препарат рекомбинантного белка CRM197, полученный после проведения гель-фильтрации.FIG. 1. Electrophoregram of the results of the induction of expression of the gene crm197 using 0.5 mm IPTG, as well as purification of the protein CRM197, 12.5% SDS page, 0.1% DDS-Na. 1 — molecular weight marker, 2 — producer cell strain lysate prior to induction, 3 — producer strain cell lysate after induction of 0.5 mM IPTG gene expression, 4 — CRM197 recombinant protein preparation obtained after hydrophobic chromatography, 5 — highly purified preparation recombinant protein CRM197 obtained after gel filtration.
Пример 1. Создание штамма-продуцента безметионинового белка CRM197 на основе клеток Escherichia coli.Example 1. The creation of a producer strain of methionine-free protein CRM197 based on Escherichia coli cells.
1.1. Создание нуклеотидной последовательности, кодирующей белок CRM197, и нуклеотидной последовательности, кодирующей метионинаминопептидазу E. coli. Использовали транслированный по нуклеотидной последовательности NCBI Reference Sequence: NC_012971.2 белок метионинаминопептидазу E. coli BL21(DE3), аминокислотную последовательность которого переводили в нуклеотидную с одновременной кодонной оптимизацией для экспрессии в клетках E. coli с использованием программы на сайте molbiol.ru и добавлением сайтов рестрикции Nco I и Hind III, а также стоп-кодона.1.1. Creation of a nucleotide sequence encoding a CRM197 protein and a nucleotide sequence encoding E. coli methionine aminopeptidase. We used the E. coli BL21 (DE3) methionine aminopeptidase protein translated according to the nucleotide sequence of the NCBI Reference Sequence: NC_012971.2, the amino acid sequence of which was converted to the nucleotide sequence with simultaneous codon optimization for expression in E. coli cells using the program on the site molbiol.ru and adding sites restriction of Nco I and Hind III, as well as a stop codon.
Использовали транслированный по нуклеотидной последовательности NCBI PRF: 224021 белок CRM197, аминокислотную последовательность которого переводили в нуклеотидную с одновременной кодонной оптимизацией для экспрессии в клетках E. coli с использованием программы на сайте molbiol.ru и добавлением сайтов рестрикции Nde I и Avr II, а также старт- и стоп-кодона.We used the CRM197 protein translated by the NCBI PRF: 224021 nucleotide sequence, the amino acid sequence of which was converted to the nucleotide sequence with simultaneous codon optimization for expression in E. coli cells using the program on the site molbiol.ru and adding restriction sites Nde I and Avr II, as well as the start - and a stop codon.
Рассчитанные нуклеотидные последовательности синтезировали химическим методом с помощью синтезатора ДНК ASM-800 (БИОССЕТ, Россия).The calculated nucleotide sequences were synthesized by a chemical method using an ASM-800 DNA synthesizer (BIOSSET, Russia).
1.2. Создание плазмидной ДНК, кодирующей белки CRM197 и метионинаминопептидазу E. coli.1.2. Creation of plasmid DNA encoding CRM197 proteins and E. coli methionine aminopeptidase.
Полученные гены клонировали в плазмиде pETDuet-1 для последующей экспрессии. Для этого проводили реакцию рестрикции, а затем лигирования генов и вектора pETDuet-1, последовательно для каждого гена, с использованием соответствующего буфера и лигазы, при +20°C в течение 2 часов.The resulting genes were cloned into the plasmid pETDuet-1 for subsequent expression. For this, a restriction reaction was performed, followed by ligation of the genes and the pETDuet-1 vector, sequentially for each gene, using the appropriate buffer and ligase, at + 20 ° C for 2 hours.
Смесь прогревали при +95°C в течение 10 мин и очищали от солей диализом на нитроцелюлозных фильтрах с диаметром пор 0,025 мкм (Millipore, США). Диализ проводили против раствора, содержащего 0,5 мМ ЭДТА в 10% глицерине, в течение 10 мин.The mixture was heated at + 95 ° C for 10 min and purified from salts by dialysis on nitrocellulose filters with a pore diameter of 0.025 μm (Millipore, USA). Dialysis was performed against a solution containing 0.5 mM EDTA in 10% glycerol for 10 minutes.
1.3. Создание штамма Е. coli для амплификации полученной плазмидной ДНК.1.3. Creation of E. coli strain for amplification of the obtained plasmid DNA.
Полученной плазмидой трансформировали клетки Е. coli штамма DH10B/R (Gibko BRL, США) с генотипом F-mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80dlacZΔM 15 ΔlacX74 deoR recA1 endA1 araD139 Δ(ara, leu)769 galU galKλ-rpsL nupG методом электропорации.The obtained plasmid was used to transform E. coli cells of strain DH10B / R (Gibko BRL, USA) with the genotype F-mcrA Δ (mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80dlacZΔM 15 ΔlacX74 deoR recA1 endA1 araD139 Δ (ara, leu) 769 galU galGLU gal electroporation.
После трансформации клетки инкубировали в SOC-среде (2% бакто-триптон, 0.5% дрожжевой экстракт, 10 мМ NaCl, 2.5 мМ KCl, 10 мМ MgCl2, 10 мМ MgSO4, 20 мМ глюкоза) в течение 40 мин при +37°C.After transformation, cells were incubated in SOC-medium (2% Bacto-tryptone, 0.5% yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 10 mM MgSO 4, 20 mM glucose) for 40 minutes at + 37 ° C.
Проводили скрининг клеток E. coli на наличие плазмид на селективной среде, содержащей LB-arap, 50 мкг/мл ампициллина. Выросшие на селективной среде колонии клеток E. coli проверяли на наличие вставки таргетных генов.E. coli cells were screened for plasmids in a selective medium containing LB-arap, 50 μg / ml ampicillin. Colonies of E. coli cells grown on selective medium were checked for the presence of an insertion of targeted genes.
Из выросших клонов выделяли плазмидную ДНК с использованием набора Wizard Minipreps DNA Purification System (Promega, США). Очищенную плазмидную ДНК проверяли с помощью секвенирования с использованием стандартных праймеров для секвенирования для используемой плазмидной ДНК. В ходе работы были отобраны клоны, содержащие требуемые фрагменты ДНК в составе плазмиды, - штамм E. coli для амплификации плазмидной ДНК, содержащей таргетные гены, - из которого такие плазмиды были выделены для дальнейшего создания штамма-продуцента.Plasmid DNA was isolated from grown clones using the Wizard Minipreps DNA Purification System kit (Promega, United States). The purified plasmid DNA was checked by sequencing using standard sequencing primers for the plasmid DNA used. In the course of the work, clones containing the required DNA fragments in the plasmid were selected — an E. coli strain for amplification of plasmid DNA containing targeted genes — from which such plasmids were isolated to further create a producer strain.
1.4. Создание штамма-продуцента безметионинового белка CRM197 на основе клеток Escherichia coli BL21 (DE3).1.4. Creation of a producer strain of CRM197 bezmethionine-free protein based on Escherichia coli BL21 cells (DE3).
Для экспрессии генов, кодирующих белки метионинаминопептидазу и CRM197, с полученной плазмиды использовали клетки E. coli штамма BL21 (DE3) (Invitrogen, USA), с генотипом F-ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm rne 131 (DE3), содержащие в геноме λDe3 лизоген и мутацию rne131. Мутированный ген rne (rne131) кодирует усеченную форму РНКазы Е, что уменьшает внутриклеточное разрушение мРНК, приводя к увеличению ее ферментативной стабильности. lon- и ompT-мутации по генам протеаз позволяют получать непротеолизированные рекомбинантные белки в больших количествах.For the expression of genes encoding the methionine aminopeptidase and CRM197 proteins from the obtained plasmid, E. coli cells of strain BL21 (DE3) (Invitrogen, USA), with the genotype F-ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm rne 131 (DE3) containing in the λDe3 genome is lysogen and the rne131 mutation. The mutated rne gene (rne131) encodes a truncated form of RNase E, which reduces the intracellular destruction of mRNA, leading to an increase in its enzymatic stability. lon- and ompT mutations by protease genes allow to obtain non-proteolyzed recombinant proteins in large quantities.
Подготавливали вышеуказанные клетки Е. coli следующим образом. Инкубировали клетки при +37°С в течение ночи в 5 мл L-бульона, содержащего 1% триптон, 1% дрожжевой экстракт и 1% натрий хлористый. Разводили культуру свежим L-бульоном в 50-100 раз и выращивали на качалке при +37°С до оптической плотности 0,2-0,3 при длине волны 590 нм. При достижении оптической плотности более 0,3 культуру разводили свежим L-бульоном до оптической плотности 0,1 и растили 30 мин. Переносили 100 мл культуры в стерильную центрифужную пробирку и осаждали клетки при +4°С на 5000 g в течение 10 мин. Супернатант сливали, клетки ресуспендировали в деионизованной воде в исходном объеме с последующим центрифугированием. Процедуру отмывки повторяли трижды. После отмывки осадок клеток ресуспендировали в малом объеме деионизованной воды и центрифугировали 30 сек. при 5000 об/мин. на микроцентрифуге.The above E. coli cells were prepared as follows. Cells were incubated at + 37 ° C overnight in 5 ml of L-broth containing 1% tryptone, 1% yeast extract and 1% sodium chloride. The culture was bred with fresh L-broth 50-100 times and grown on a shaker at + 37 ° C to an optical density of 0.2-0.3 at a wavelength of 590 nm. Upon reaching an optical density of more than 0.3, the culture was diluted with fresh L-broth to an optical density of 0.1 and grown for 30 minutes. Transferred 100 ml of culture to a sterile centrifuge tube and pelleted cells at + 4 ° C at 5000 g for 10 min. The supernatant was drained, the cells were resuspended in deionized water in the initial volume, followed by centrifugation. The washing procedure was repeated three times. After washing, the cell pellet was resuspended in a small volume of deionized water and centrifuged for 30 sec. at 5000 rpm in a microcentrifuge.
Трансформацию компетентных клеток осуществляли методом электропорации. Для этого 1 мкл плазмидной ДНК добавляли к 12 мкл компетентных клеток, перемешивали и проводили электропорацию с использованием электропоратора MicroPulser (BioRad) в стерильных ячейках при электрическом импульсе напряженностью 10 кВ/см длительностью 4 мсек.Transformation of competent cells was carried out by electroporation. For this, 1 μl of plasmid DNA was added to 12 μl of competent cells, mixed and electroporated using a MicroPulser electroporator (BioRad) in sterile cells with an electric pulse of 10 kV / cm for 4 ms.
После трансформации клетки инкубировали в SOC-среде (2% бакто-триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 10 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 10 мМ MgCl2, 10 мМ MgSO4, 20 мМ глюкоза) в течение 40 мин. при +37°С. 10-100 мкл клеточной суспензии высевали на селективную LB-среду (Gibko BRL, США), содержащую ампициллин (50 мкг/мл), для отбора клонов, содержащих плазмиды (штаммов-продуцентов).After transformation, the cells were incubated in SOC medium (2% bacto-tryptone, 0.5% yeast extract, 10 mm NaCl, 2.5 mm KCl, 10 mm MgCl 2 , 10 mm MgSO 4 , 20 mm glucose) for 40 min . at + 37 ° C. 10-100 μl of the cell suspension were plated on selective LB medium (Gibko BRL, USA) containing ampicillin (50 μg / ml) to select clones containing plasmids (producer strains).
Полученная после трансформации компетентных клеток штаммов Е. coli плазмида обеспечивала высокий уровень биосинтеза рекомбинантных белков, закодированных в ней.The plasmid obtained after the transformation of competent cells of E. coli strains provided a high level of biosynthesis of recombinant proteins encoded in it.
Пример 2. Получение безметионинового CRM197 в клетках штамма-продуцента E. coli 2.1. при индукции синтеза белков 0.2% лактозой по методу ШтудиераExample 2. Obtaining bezmethionine-free CRM197 in the cells of the producer strain of E. coli 2.1. upon induction of protein synthesis by 0.2% lactose according to the Stuyder method
Для культивирования полученного штамма-продуцента использовали стандартную агаризованную LB-среду, содержащую ампициллин в концентрации 50 мкг/мл и глюкозу в концентрации 1% для блокирования неспецифической экспрессии.To cultivate the obtained producer strain, a standard agarized LB medium containing ampicillin at a concentration of 50 μg / ml and glucose at a concentration of 1% was used to block non-specific expression.
Индукцию экспрессии проводили при достижении культурой клеток оптической плотности 0.6-0.8 оптических единиц при длине волны 600 нм.Expression induction was carried out when the cell culture reached an optical density of 0.6-0.8 optical units at a wavelength of 600 nm.
Для автоиндукции экспрессии по методу Штудиера использовали среду PYP-5052, состоящую из 1% пептона (Gibco, США), 0.5% дрожжевого экстракта (Gibco, США), 50 мМ Na2HPO4, 50 мМ K2HPO4, 25 мМ (NH4)2SO4, 2 мМ MgSO4, 0.5% глицерола, 0.05% глюкозы и 0.2% лактозы, в качестве индуктора использовали 0.2% лактозу [Studier FW. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr Purif. 2005 May; 41(1):207-34].For autoinduction of expression according to the Stuyder method, PYP-5052 medium was used, consisting of 1% peptone (Gibco, USA), 0.5% yeast extract (Gibco, USA), 50 mM Na 2 HPO 4 , 50 mM K 2 HPO 4 , 25 mM ( NH 4 ) 2 SO 4 , 2 mM MgSO 4 , 0.5% glycerol, 0.05% glucose and 0.2% lactose; 0.2% lactose was used as an inductor [Studier FW. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr Purif. 2005 May; 41 (1): 207-34].
В среду PYP-5052, содержащую ампициллин в концентрации 50 мкг/мл, инокулировали единичную колонию штамма-продуцента. Ферментацию проводили при +37°C в термостатированном шейкере роторного типа при 250 об. мин. в течение 20 часов до отсутствия существенного изменения ОП600 за 1 час. Отбирали аликвоту на анализ экспрессии генов, кодирующих белки CRM197 и метиониновую аминопептидазу, методом электрофореза в ПААГ, а оставшуюся биомассу осаждали центрифугированием при 9000 g.On Wednesday, PYP-5052, containing ampicillin at a concentration of 50 μg / ml, was inoculated with a single colony of the producer strain. Fermentation was carried out at + 37 ° C in a thermostatically controlled rotary type shaker at 250 vol. min within 20 hours until there is no significant change in OD 600 for 1 hour. An aliquot was taken to analyze the expression of genes encoding the CRM197 proteins and methionine aminopeptidase by PAGE, and the remaining biomass was precipitated by centrifugation at 9000 g.
Клетки ресуспендировали в лизирующем буфере, содержащем 20 мМ трис-HCl pH 7,5, 5 мМ ЭДТА и 1 мМ феноксиметилсульфонилфторид, из расчета на 1 г клеток 5-7 мл буфера. Суспензию клеток обрабатывали ультразвуком 7 раз по 30 сек с интервалом в 30 сек (частота ультразвука составляет 22 кГц), отбирали пробу на анализ SDS-PAGE (PolyAcrylamide Gel Electrophoresis with Sodium dodecyl sulfate). Полученный препарат содержал около 5% метиониновой аминопептидазы и около 25% белка CRM197 от общего количества белков E. coli.Cells were resuspended in lysis buffer containing 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 5 mM EDTA and 1 mM phenoxymethylsulfonyl fluoride, based on 1 g of cells 5-7 ml of buffer. The cell suspension was sonicated 7 times for 30 seconds with an interval of 30 seconds (ultrasound frequency is 22 kHz), a sample was taken for analysis by SDS-PAGE (PolyAcrylamide Gel Electrophoresis with Sodium dodecyl sulfate). The resulting preparation contained about 5% methionine aminopeptidase and about 25% CRM197 protein from the total amount of E. coli proteins.
Лизат центрифугировали 10 мин. при +4°C, 5000 g. Отбирали пробу надосадочной жидкости (супернатанта) и осадка для анализа локализации белков и оценки их растворимости, с использованием SDS-PAGE. Анализ показал наличие белка массой около 29-30 кДа в супернатанте, что соответствует рассчитанной массе метионинаминопептидазы (29,3 кДа), и, таким образом, продемонстрировал растворимость полученного белка. Осадок содержал белок массой около 58-59 кДа, что соответствует рассчитанной массе CRM197 (58,5 кДа), таким образом, анализ продемонстрировал нерастворимость полученного белка.The lysate was centrifuged for 10 minutes. at + 4 ° C, 5000 g. A sample of the supernatant (supernatant) and sediment were taken to analyze the localization of proteins and assess their solubility using SDS-PAGE. The analysis showed the presence of a protein with a mass of about 29-30 kDa in the supernatant, which corresponds to the calculated mass of methionine aminopeptidase (29.3 kDa), and thus demonstrated the solubility of the obtained protein. The precipitate contained a protein weighing about 58-59 kDa, which corresponds to the calculated mass of CRM197 (58.5 kDa), thus, the analysis demonstrated the insolubility of the obtained protein.
Супернатант сливали, к осадку добавляли раствор 1 M мочевины из расчета 10 мл на 1 г клеток, интенсивно перемешивали. Повторяли центрифугирование. Супернатант сливали, осадок ресуспендировали в растворе 2 М мочевины того же объема. Повторяли центрифугирование, сливали супернатант, осадок (тельца включения) использовали для выделения белка CRM197.The supernatant was poured, a solution of 1 M urea was added to the pellet at the rate of 10 ml per 1 g of cells, and intensively mixed. Centrifugation was repeated. The supernatant was drained, the precipitate was resuspended in a solution of 2 M urea of the same volume. Centrifugation was repeated, the supernatant was poured off, the pellet (inclusion bodies) was used to isolate the CRM197 protein.
2.2. При индукции синтеза белков ИПТГ.2.2. By inducing the synthesis of IPTG proteins.
Индукцию экспрессии генов с использованием ИПТГ осуществляли следующим образом. Инкубировали клетки единичной колонии штамма-продуцента при +37°C в термостатированном шейкере роторного типа при 250 об./мин. в течение ночи в LB среде (1% триптон, 1% дрожжевой экстракт и 1% натрий хлористый), содержащей ампициллин в концентрации 50 мкг/мл. Разводили культуру свежей LB средой в 50 раз и выращивали в термостатированном шейкере роторного типа при 250 об./мин. +37°C до достижения культурой клеток оптической плотности 0.6-0.8 оптических единиц при длине волны 600 нм. После этого осуществляли индукцию экспрессии рекомбинантных генов добавлением ИПТГ к культуре до конечной концентрации 0,1 мМ. 0,5 мМ или 1 мМ. Индукцию проводили в течение 18 часов для определения оптимальной концентрации индуктора для получения высокого уровня экспрессии таргетных генов, после чего отбирали пробу для анализа с использованием SDS-PAGE, клетки концентрировали с помощью центрифугирования.Induction of gene expression using IPTG was carried out as follows. The cells of a single colony of the producer strain were incubated at + 37 ° C in a temperature-controlled rotary-type shaker at 250 rpm. overnight in LB medium (1% tryptone, 1% yeast extract and 1% sodium chloride) containing ampicillin at a concentration of 50 μg / ml. The culture was diluted 50 times with fresh LB medium and grown in a thermostatic rotary type shaker at 250 rpm. + 37 ° C until the cell culture reaches an optical density of 0.6-0.8 optical units at a wavelength of 600 nm. After this, the expression of recombinant genes was induced by adding IPTG to the culture to a final concentration of 0.1 mM. 0.5 mm or 1 mm. Induction was carried out for 18 hours to determine the optimal concentration of the inducer to obtain a high level of expression of target genes, after which a sample was taken for analysis using SDS-PAGE, the cells were concentrated by centrifugation.
Клетки ресуспендировали в лизирующем буфере, содержащем 20 мМ трис-HCl pH 7,5, 5 мМ ЭДТА и 1 мМ феноксиметилсульфонилфторид, из расчета на 1 г клеток 5-7 мл буфера. Суспензию клеток обрабатывали ультразвуком 7 раз по 30 сек с интервалом в 30 сек (частота ультразвука составляет 22 кГц), отбирали пробу на анализ SDS-PAGE. Полученный препарат содержал в случае индукции 0,1 мМ ИПТГ около 2% метиониновой аминопептидазы и около 18% белка CRM197 от общего количества белков E. coli, при индукции 0,5 мМ ИПТГ - около 5% метиониновой аминопептидазы и около 27% белка CRM197 от общего количества белков E. coli, при индукции 1 мМ ИПТГ около 3% метиониновой аминопептидазы и около 20% белка CRM197 от общего количества белков E. coli.Cells were resuspended in lysis buffer containing 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 5 mM EDTA and 1 mM phenoxymethylsulfonyl fluoride, based on 1 g of cells 5-7 ml of buffer. The cell suspension was treated with ultrasound 7 times for 30 seconds with an interval of 30 seconds (ultrasound frequency is 22 kHz), a sample was taken for analysis by SDS-PAGE. The resulting preparation contained, in the case of induction of 0.1 mM IPTG, about 2% methionine aminopeptidase and about 18% CRM197 protein of the total E. coli proteins, with the induction of 0.5 mM IPTG, about 5% methionine aminopeptidase and about 27% CRM197 from the total number of E. coli proteins, with the induction of 1 mM IPTG, about 3% methionine aminopeptidase and about 20% CRM197 protein of the total number of E. coli proteins.
Лизат центрифугировали 10 мин. При +4°C, 5000 g. Отбирали пробу надосадочной жидкости (супернатанта) и осадка для анализа локализации белков и оценки их растворимости, с использованием SDS-PAGE. Анализ проб после индукции ИПТГ во всех исследуемых концентрациях показал наличие белка массой около 29-30 кДа в супернатанте, что соответствует рассчитанной массе метионинаминопептидазы (29,3 кДа), и, таким образом, продемонстрировал растворимость полученного белка. Осадок содержал белок массой около 58-59 кДа, что соответствует рассчитанной массе CRM197 (58,5 кДа), таким образом, анализ продемонстрировал нерастворимость полученного белка.The lysate was centrifuged for 10 minutes. At + 4 ° C, 5000 g. A sample of the supernatant (supernatant) and sediment were taken to analyze the localization of proteins and assess their solubility using SDS-PAGE. Analysis of the samples after IPTG induction in all studied concentrations showed the presence of a protein with a mass of about 29-30 kDa in the supernatant, which corresponds to the calculated mass of methionine aminopeptidase (29.3 kDa), and thus demonstrated the solubility of the obtained protein. The precipitate contained a protein weighing about 58-59 kDa, which corresponds to the calculated mass of CRM197 (58.5 kDa), thus, the analysis demonstrated the insolubility of the obtained protein.
Таким образом, наблюдали экспрессию генов, кодирующих белок CRM197 и метионинаминопептидазу, при всех вариантах индукции, а именно - с использованием 0,1 мМ, 0,5 мМ и 1 мМ ИПТГ, и 0,2% лактозы. При всех исследованных вариантах индукции белок CRM197 получали в нерастворимой фракции (тельцах включения), метионинаминопептидазу - в растворимой фракции, что облегчает выделение и очистку белка CRM197. Подобран оптимальный протокол индукции экспрессии генов, кодирующих рекомбинантные белки CRM197 и метиониновую аминопептидазу, - индукция 0,5 мМ ИПТГ при 37°C в течение ночи. Данный способ является оптимальным по выходу белков и затратам на его осуществление (Фиг. 1).Thus, the expression of genes encoding the CRM197 protein and methionine aminopeptidase was observed for all induction variants, namely, using 0.1 mM, 0.5 mM and 1 mM IPTG, and 0.2% lactose. For all investigated induction variants, the CRM197 protein was obtained in the insoluble fraction (inclusion bodies), the methionine aminopeptidase was obtained in the soluble fraction, which facilitates the isolation and purification of the CRM197 protein. The optimal protocol for inducing the expression of genes encoding the recombinant CRM197 proteins and methionine aminopeptidase was chosen — induction of 0.5 mM IPTG at 37 ° C overnight. This method is optimal in terms of protein yield and the cost of its implementation (Fig. 1).
Пример 3. Очистка рекомбинантного белка CRM197.Example 3. Purification of the recombinant protein CRM197.
Осуществляли очистку белка CRM197, полученного с использованием индукции 0,5 мМ ИПТГ. Биомассу, полученную из 1 л жидкой культуры клеток штамма-продуцента после индукции экпрессии гена crm197 (4 г), ресуспендировали на ледяной бане, добавляя 3 мл на 1 г биомассы охлажденного ресуспендирующего буфера (40 мМ Tris-HCl, pH 8,0; 1 мМ ЭДТА; 1 мМ дитиотреитол - ДТТ) и разрушали 5 циклами соникации. Фрагменты клеток осаждали центрифугированием при 15000 g в течение 40 мин. Для осветления лизата к супернатанту добавляли по каплям 10%-ный Тритон Х-100 до 0,1%, перемешивали, оставляли на 30 мин при 4° и затем центрифугировали при 25000 g 30 мин [DeWalt B.W. et al. Compaction agent clarification of microbial lysates // Protein Expr. Purif. 2003. Vol. 28, №2. P. 220-223].Purification of the CRM197 protein obtained using the induction of 0.5 mM IPTG was performed. The biomass obtained from 1 L of the liquid culture of the producer strain cells after induction of expression of the crm197 gene (4 g) was resuspended in an ice bath by adding 3 ml per 1 g of biomass of chilled resuspending buffer (40 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA; 1 mM dithiothreitol — DTT) and were disrupted by 5 sonication cycles. Cell fragments were precipitated by centrifugation at 15,000 g for 40 minutes. To clarify the lysate, 10% Triton X-100 was added dropwise to the supernatant to 0.1%, stirred, left for 30 min at 4 ° and then centrifuged at 25000 g for 30 min [DeWalt B.W. et al. Compaction agent clarification of microbial lysates // Protein Expr. Purif. 2003. Vol. 28, No. 2. P. 220-223].
К 40 мл осветленного клеточного лизата добавляли буфер для нанесения (50 мМ Tris-HCl, 1 мМ ЭДТА, 2 мМ ДТТ, 0.2 M бензамидин-HCl, 0.2 мМ PMSF, pH 7.5), после чего наносили на колонку HiPrep 16/10 Q XL (GE Healthcare, Швеция), уравновешенную буфером для нанесения, и промывали 50 мл того же буфера при скорости 10 мл/мин. Элюцию белков, связавшихся с носителем, проводили градиентом NaCl (0% В в 5 CV, 30% В в 5 CV, 100% В в 5 CV) до 10 M NaCl. Оптический профиль элюции определяли по поглощению при 280 нм на спектрофотометре. Фракции (5 мл каждая), содержащие белок CRM197, объединяли и наносили на колонку SOURCE 15ISO (GE Healthcare, Швеция), уравновешенную буфером для нанесения (1.6 M (NH4)2SO4, 10% глицерин, 50 мМ Tris-HCl, 1 мМ ЭДТА, 2 мМ ДТТ, 0.2 мМ бензамидин-HCl, 0.2 мМ PMSF, pH 7.5). После промывания колонки 50 мл того же буфера белок элюировали буфером для элюции (50 мМ Tris-HCl, 10% глицерин, 1 мМ ЭДТА, 2 мМ ДТТ, 0.2 мМ бензамидин-HCl, 0.2 мМ PMSF, pH 7.5) при скорости 5 мл/мин. Для элюции использовали градиент - 0-16% В в 4 CV, 16-24% В в 8 CV, 24-35% В в 4 CV, 100% В в 4 CV. Объем каждой фракции составил 5 мл.Application buffer (50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 2 mM DTT, 0.2 M benzamidine-HCl, 0.2 mM PMSF, pH 7.5) was added to 40 ml of clarified cell lysate, and then applied to a HiPrep 16/10 Q XL column (GE Healthcare, Sweden) equilibrated with application buffer and washed with 50 ml of the same buffer at a rate of 10 ml / min. Elution of carrier-bound proteins was performed using a NaCl gradient (0% B in 5 CV, 30% B in 5 CV, 100% B in 5 CV) to 10 M NaCl. The optical elution profile was determined by absorbance at 280 nm on a spectrophotometer. Fractions (5 ml each) containing CRM197 protein were pooled and applied onto a SOURCE 15ISO column (GE Healthcare, Sweden) equilibrated with application buffer (1.6 M (NH4) 2SO4, 10% glycerol, 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA , 2 mM DTT, 0.2 mM benzamidine-HCl, 0.2 mM PMSF, pH 7.5). After washing the column with 50 ml of the same buffer, the protein was eluted with elution buffer (50 mM Tris-HCl, 10% glycerol, 1 mM EDTA, 2 mM DTT, 0.2 mM benzamidine-HCl, 0.2 mM PMSF, pH 7.5) at a rate of 5 ml / min For elution, a gradient of 0-16% B in 4 CV, 16-24% B in 8 CV, 24-35% B in 4 CV, 100% B in 4 CV was used. The volume of each fraction was 5 ml.
Для доочистки белка CRM197, а также перевода в нативные условия использовали гель-фильтрацию. Данный метод не только позволяет разделять молекулы по их размеру, но и обеспечивает формирование правильной пространственной структуры рекомбинантных белков [Li M., Su Z.-G., Janson J.-C. In vitro protein refolding by chromatographic procedures // Protein Expr. Purif. 2004. Vol. 33, №1. p. 1-10].For purification of the CRM197 protein, as well as conversion to native conditions, gel filtration was used. This method not only allows you to separate the molecules according to their size, but also ensures the formation of the correct spatial structure of recombinant proteins [Li M., Su Z.-G., Janson J.-C. In vitro protein refolding by chromatographic procedures // Protein Expr. Purif. 2004. Vol. 33, No. 1. p. 1-10].
Хроматографию проводили на гель-фильтрационной колонке XK26/60 с сорбентом Superdex S-100, при скорости элюции 1,3 мл/мин, элюент - 0,01 M натрий фосфатный буфер, pH 7,2-7,4. Результаты анализировали с помощью электрофореза в 12,5%-ном полиакриламидном геле в денатурирующих условиях по Леммли [Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. Vol. 227, №5259. P. 680-685], гели окрашивали Кумасси G-250. Концентрацию белка определяли по методу Бредфорд [Bradford М.М. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. Vol. 72. P. 248-254].Chromatography was performed on an XK26 / 60 gel filtration column with a Superdex S-100 sorbent at an elution rate of 1.3 ml / min, eluent 0.01 M sodium phosphate buffer, pH 7.2-7.4. The results were analyzed by electrophoresis in a 12.5% polyacrylamide gel under denaturing conditions according to Lemmli [Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. Vol. 227, No. 5259. P. 680-685], the gels stained Coomassie G-250. Protein concentration was determined by the method of Bradford [Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. Vol. 72. P. 248-254].
В результате был получен препарат белка CRM197 с чистотой 97%, выход белка составил 0,3 г из 1 литра жидкой культуры штамма-продуцента (Фиг. 1).As a result, a protein preparation CRM197 with a purity of 97% was obtained, the protein yield was 0.3 g from 1 liter of the liquid culture of the producer strain (Fig. 1).
Пример 4. Свойства полученного штамма-продуцента белка CRM197.Example 4. Properties of the obtained strain producing protein CRM197.
Культуральные свойстваCultural properties
Грамотрицательные прямые палочки, размером 1,1-1,5-2,0-3,0 мкм, одиночные, спор и капсул не образуют. Каталазоположительные. Оксидазоотрицательные. Факультативные анаэробы. Интервал pH 5-7. Катализируют D-глюкозу и некоторые другие углеводы с образованием кислоты и газа, не сбраживают лактозу, арабинозу и галактозу. Реакция Фогес-Проскауэра отрицательная, не образуют H2S, но гидролизуют мочевину.Gram-negative straight rods, 1.1-1.5-2.0-3.0 microns in size, single, do not form spores and capsules. Catalopositive. Oxidase-negative. Optional anaerobes. PH range 5-7. Catalyze D-glucose and some other carbohydrates with the formation of acid and gas, do not ferment lactose, arabinose and galactose. The Voges-Proskauer reaction is negative, they do not form H 2 S, but they hydrolyze urea.
Ростовые характеристики Клетки растут в интервале температур от 8°C до 43°C, интервал для культивирования - 28-38°C, оптимум роста при 37°C.Growth characteristics Cells grow in the temperature range from 8 ° C to 43 ° C, the interval for cultivation is 28-38 ° C, the optimum growth is at 37 ° C.
Описание визуальных и цитологических наблюдений при стандартных условиях культивированияDescription of visual and cytological observations under standard culture conditions
Клетки хорошо растут на простых питательных средах, содержащих и не содержащих ампициллин. На агаризованной среде - колонии гладкие, круглые, слабо выпуклые, с ровным краем. В жидких средах образуют равномерную светорассеивающую суспензию, при хранении без перемешивания оседают на дно.Cells grow well on simple nutrient media containing and not containing ampicillin. On an agar medium, colonies are smooth, round, slightly convex, with a smooth edge. A uniform light-scattering suspension is formed in liquid media; when stored without stirring, they settle to the bottom.
Claims (1)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2575621C1 true RU2575621C1 (en) | 2016-02-20 |
Family
ID=
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2672816C2 (en) * | 2017-02-06 | 2018-11-19 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов" Федерального медико-биологического агентства | METHOD OF PRODUCING NON-METHIONINE RECEPTOR ANTAGONIST INTERLEUKIN-36 STRAIN BACTERIA ESCHERICHIA COLI BL21 [DE3] - PRODUCER NON-METHIONINE RECEPTOR ANTAGONIST INTERLEUKIN-36 (VARIANTS), METHOD OF THEIR PREPARATION, AND PLASMID VECTOR pBAD15A pET15A AND DNA SEQUENCE FOR THEIR PREPARATION |
| RU2733440C2 (en) * | 2018-06-04 | 2020-10-01 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) | Method of producing a methionine-gamma-lyase enzyme, an antitumor drug fdf mgl based on said enzyme and use of said agent for tumor growth inhibition (versions) |
| RU2803949C1 (en) * | 2019-09-03 | 2023-09-22 | Дженофокус Ко., Лтд. | Method for crm197 protein expression |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001087982A2 (en) * | 2000-05-18 | 2001-11-22 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Immunotoxin fusion proteins and means for expression thereof |
| CN100999548A (en) * | 2006-01-10 | 2007-07-18 | 海南天源康泽医药科技有限公司 | Diphtheria toxin muton CRM197 and its preparation process |
| WO2010150230A1 (en) * | 2009-06-25 | 2010-12-29 | Consorzio Interuniversitario Per Lo Sviluppo Dei Sistemi A Grande Interfase Csgi | Bacterial expression of an artificial gene for the production of crm197 and its derivatives |
| RU2531234C2 (en) * | 2009-06-22 | 2014-10-20 | ВАЙЕТ ЭлЭлСи | POLYSACCHARIDE-PROTEIN CONJUGATE POLYSACCHARIDE-PROTEIN FOR INDUCING IMMUNE RESPONSE AND PROTECTION AGAINST Staphylococcus aureus INFECTION, METHODS OF CONJUGATE OBTAINING (VERSIONS), CONJUGATE-CONTAINING COMPOSITION AND METHODS OF INDUCING IMMUNE RESPONSE AND PREVENTION OF Staphylococcus aureus INFECTION |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001087982A2 (en) * | 2000-05-18 | 2001-11-22 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Immunotoxin fusion proteins and means for expression thereof |
| CN100999548A (en) * | 2006-01-10 | 2007-07-18 | 海南天源康泽医药科技有限公司 | Diphtheria toxin muton CRM197 and its preparation process |
| RU2531234C2 (en) * | 2009-06-22 | 2014-10-20 | ВАЙЕТ ЭлЭлСи | POLYSACCHARIDE-PROTEIN CONJUGATE POLYSACCHARIDE-PROTEIN FOR INDUCING IMMUNE RESPONSE AND PROTECTION AGAINST Staphylococcus aureus INFECTION, METHODS OF CONJUGATE OBTAINING (VERSIONS), CONJUGATE-CONTAINING COMPOSITION AND METHODS OF INDUCING IMMUNE RESPONSE AND PREVENTION OF Staphylococcus aureus INFECTION |
| WO2010150230A1 (en) * | 2009-06-25 | 2010-12-29 | Consorzio Interuniversitario Per Lo Sviluppo Dei Sistemi A Grande Interfase Csgi | Bacterial expression of an artificial gene for the production of crm197 and its derivatives |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2672816C2 (en) * | 2017-02-06 | 2018-11-19 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов" Федерального медико-биологического агентства | METHOD OF PRODUCING NON-METHIONINE RECEPTOR ANTAGONIST INTERLEUKIN-36 STRAIN BACTERIA ESCHERICHIA COLI BL21 [DE3] - PRODUCER NON-METHIONINE RECEPTOR ANTAGONIST INTERLEUKIN-36 (VARIANTS), METHOD OF THEIR PREPARATION, AND PLASMID VECTOR pBAD15A pET15A AND DNA SEQUENCE FOR THEIR PREPARATION |
| RU2672816C9 (en) * | 2017-02-06 | 2019-01-11 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов" Федерального медико-биологического агентства | THE METHOD OF PRODUCTION OF INTERLEUKIN-36 RECEPTOR ANTAGONIST WITH CLEAVED N-TERMINAL METHIONINE, ESCHERICHIA COLI BL21[DE3] STRAIN PRODUCING INTERLEUKIN-36 RECEPTOR ANTAGONIST WITH CLEAVED N-TERMINAL METHIONINE (VARIANTS), METHOD OF THEIR CONSTRUCTION, PLASMID VECTORS pBAD15A AND pET15A AND DNA SEQUENCE FOR THEIR CONSTRUCTION |
| RU2733440C2 (en) * | 2018-06-04 | 2020-10-01 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) | Method of producing a methionine-gamma-lyase enzyme, an antitumor drug fdf mgl based on said enzyme and use of said agent for tumor growth inhibition (versions) |
| RU2803949C1 (en) * | 2019-09-03 | 2023-09-22 | Дженофокус Ко., Лтд. | Method for crm197 protein expression |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7042305B2 (en) | Codon-optimized polynucleotide for high-level expression of CRM197 | |
| WO2015188240A1 (en) | Escherichia coli t7 expression vector, vectors for the co-expression and co-purification of recombinant peptides in/with carrier proteins, use of expression vectors for obtaining complexes with multiple antigens and immunomodulators | |
| JP2012531198A (en) | Bacterial expression of artificial genes for production of CRM197 and its derivatives | |
| CN110845587B (en) | Site-directed mutagenesis carrier protein and application thereof in preparation of vaccine | |
| CN106939042B (en) | Porcine alpha interferon and application thereof | |
| RU2575621C1 (en) | STRAIN-PRODUCER OF METHIONINE-FREE CRM197 BASED ON CELLS E. coli BL21 (DE3) | |
| CN114699521B (en) | Immunity adjuvant based on metallothionein family and application thereof | |
| CN108671227B (en) | Broad-spectrum multi-subunit vaccine for preventing streptococcus suis infection | |
| CN111019927B (en) | Recombinant plasmid for expressing TEV protein, recombinant engineering bacterium and method for preparing and purifying TEV protein | |
| KR102078714B1 (en) | Recovery and purification method of bioactive crm197 proteins from inclusion bodies including crm197 | |
| WO2005108563A2 (en) | Peptidoglycan-hydrolyzing protein encoded by bacteriophage n4 | |
| KR101658081B1 (en) | Method for Preparing Recombinant Protein Using CysQ as a Fusion Expression Partner | |
| RU2453599C1 (en) | NUCLEIC ACID CODING FUNCTIONALLY ACTIVE RECOMBINANT IgAL PROTEASE NEISSERIA MENINGITIDIS OF SEROGROUP B, RECOMBINANT PLASMID DNA CONTAINING NUCLEOTIDE SEQUENCE CODING ACTIVE IgAL PROTEASE, PRODUCER STRAIN CONTAINING PLASMID DNA PRODUCING MATURE FORM OF IgAL PROTEASE, RECOMBINANT Ig PROTEASE NEISSERIA MENINGITIDIS OF SEROGROUP B, METHOD FOR PRODUCING MATURE FORM IgAL PROTEASE SHOWING IMMUNOGENIC AND PROTECTIVE PROPERTIES | |
| RU2539026C1 (en) | RECOMBINANT PLASMID pESAT6-CFP10-DBD, RECOMBINANT STRAIN Escherichia coli M15 [pREP4, pESAT6-CFP10-DBD], METHOD FOR PREPARING, IMMOBILISING, CONCENTRATING AND PURIFYING RECOMBINANT PROTEIN ESAT6-CFP10-DBD ON DEXTRAN, RECOMBINANT PROTEIN ESAT6-CFP10-DBD AND IMMUNOGENIC COMPOSITION CONTAINING PROTEIN ESAT6-CFP10-DBD | |
| RU2590701C2 (en) | Antigenic composition and therapeutic application thereof for preventing and treating oncological diseases, recombinant plasmid dna, providing synthesis of hybrid protein, as well as method of producing protein | |
| TWI541350B (en) | A Method for Highly Efficient Expression of Recombinant Protein from Engineering Bacteria and Its Application | |
| RU2143492C1 (en) | Recombinant plasmid encoding fused protein as precursor of human insulin (variants), strain of bacterium escherichia coli - producer of fused protein as precursor of human insulin (variants), method of human insulin preparing | |
| RU2636346C1 (en) | Method for obtaining of recombinant exoprotein of a pseudomonas aeruginosa | |
| RU2520737C1 (en) | METHOD OF PRODUCTION OF IMMUNOGENIC COMPOSITION BASED ON FUSION PROTEIN pESAT6-DBD AND DEXTRAN, RECOMBINANT PLASMID pESAT6-DBD, STRAIN OF Escherichia coli, CHIMERIC PROTEIN ESAT6-DBD AND THEIR APPLICATION | |
| AU2001256032B2 (en) | Co-expression of recombinant proteins | |
| KR20230063207A (en) | Manufacturing method of viral structural protein | |
| RU2520078C1 (en) | METHOD FOR OBTAINING IMMUNOGENIC COMPOSITION BASED ON Ag85A-DBD HYBRID PROTEIN AND DEXTRANE; pAg85A-DBD RECOMBINANT PLASMIDE; Escherichia coli [pREP4, pAg85A-DBD] STRAIN; Ag85A-DBD CHIMERIC PROTEIN | |
| BR0017015A2 (en) | modified staphylococcal toxin, coding gene, expression vector, cell and polypeptide production, toxin separation and purification, and vaccine production methods | |
| KR101694965B1 (en) | Peptide tag with improved affinity toward 2B8 antibody and use thereof | |
| KR20160092791A (en) | Peptide tag with improved affinity toward 3H7 antibody and use thereof |