RU2565454C1

RU2565454C1 - Method and set for functional activity enzyme-immunoassay of human complement factor h

Info

Publication number: RU2565454C1
Application number: RU2014140815/15A
Authority: RU
Inventors: Леонид Васильевич Козлов; Светлана Семеновна Андина; Александр Александрович Мишин
Priority date: 2014-10-09
Filing date: 2014-10-09
Publication date: 2015-10-20

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: anti-factor H IgG antibodies are sorbed in microarray wells; a sample containing functionally active factor H of interest is added to the microarray wells and incubated to enable immunochemical binding of factor H to the antibodies on the well surface; after the wells are washed, a preparation of component C3 is added into the microarray wells; after incubating once again and washing the wells, an amount of the component C3 bound to active molecules of factor H by means of anti-C3 antibodies conjugate with an enzyme, and a chromogenic substrate for this enzyme. Factor H activity is evaluated by the amount of the enzymatic reaction product.

EFFECT: group of inventions enables evaluating the functional activity of human complement factor H and possesses good result reproducibility.

1 dwg, 1 tbl, 2 ex

Description

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.The invention relates to medical immunology, and in particular to methods for determining the functional activity of complement components in human serum in the diagnosis of a number of diseases and in biological preparations.

Фактор Н принадлежит к белкам системы комплемента с концентрацией в сыворотке крови 400-800 мкг/мл. Функция его состоит в регуляции активации альтернативного пути комплемента. Отсутствие в плазме крови достаточной активности этого фактора приводит к нерегулируемой спонтанной активации комплемента с развитием воспаления и поражения собственных тканей организма. Заболевания, связанные с дефицитом активного фактора Н, включают поражения почек: атипичный гемолитикоуремический синдром [1], мембранопролиферативный гломерулонефрит [2], а также глаз - возрастная макулярная дегенерация [3]. Дефицит активности фактора Н может быть обусловлен либо пониженной продукцией активного белка, либо продукцией его мутантных форм [1-3]. Мутации затрагивают, как правило, участки молекулы фактора H, ответственные за связывание фрагмента C3b третьего компонента комплемента. Важным функциональным свойством фактора H является способность связываться с этим фрагментом, поскольку фактор Н является кофактором протеолитического расщепления C3b фактором I, которое необходимо для регуляции образования С5-конвертазы - основного фермента, ответственного за воспаление и лизис клеток. Таким образом, определение активности фактора Н (в частности, по его способности связывать C3b) необходимо для диагностики ряда тяжелых заболеваний и выявления их причины.Factor H belongs to the proteins of the complement system with a concentration in the blood serum of 400-800 mcg / ml. Its function is to regulate the activation of the alternative complement pathway. The lack of sufficient activity of this factor in the blood plasma leads to unregulated spontaneous activation of complement with the development of inflammation and damage to the body’s own tissues. Diseases associated with deficiency of active factor H include kidney damage: atypical hemolyticouremic syndrome [1], membrane proliferative glomerulonephritis [2], and eye - age-related macular degeneration [3]. Deficiency of factor H activity can be caused either by reduced production of the active protein, or by the production of its mutant forms [1-3]. Mutations usually affect the regions of the factor H molecule responsible for the binding of the C3b fragment of the third complement component. An important functional property of factor H is the ability to bind to this fragment, since factor H is a cofactor of the proteolytic cleavage of C3b by factor I, which is necessary for the regulation of the formation of C5 convertase, the main enzyme responsible for cell inflammation and lysis. Thus, the determination of the activity of factor H (in particular, by its ability to bind C3b) is necessary to diagnose a number of serious diseases and identify their causes.

Наиболее перспективным из современных методов определения белков сыворотки крови, а также их функциональной активности является метод иммуноферментного анализа благодаря своей чувствительности, избирательности и возможности автоматизации аналитического процесса. Для количественного определения содержания фактора Н в сыворотке крови имеются коммерческие ИФА системы. Однако определение функциональной активности фактора Н в литературе не описано.The most promising of modern methods for determining serum proteins, as well as their functional activity, is the enzyme-linked immunosorbent assay due to its sensitivity, selectivity and the ability to automate the analytical process. For quantitative determination of the content of factor H in blood serum, there are commercial ELISA systems. However, the determination of the functional activity of factor H is not described in the literature.

Задачей заявленного изобретения является разработка способа иммуноферментного определения функциональной активности фактора Н комплемента человека.The objective of the claimed invention is to develop a method of enzyme-linked immunosorbent assay for determining the functional activity of human complement factor H.

Поставленная задача достигается путем разработки иммуноферментного способа и набора для иммуноферментного определения функциональной активности фактора Н комплемента человека, который предусматривает: сорбцию в лунках микропанели IgG антител к фактору Н, внесение в лунки микропанели образцов проб, содержащих определяемый функционально активный фактор H, проведение инкубации, во время которой происходит иммунохимическое связывание фактора Н с антителами на поверхности лунок, затем после промывки лунок внесение в лунки микропанели препарата компонента С3 [4], неизбежно содержащего фрагмент C3b, а также «C3b-подобный» белок - С3(H₂O) [5, 6], образующиеся в результате спонтанной инактивации компонента С3, и после очередной промывки лунок определение количества связавшегося компонента C3b с активными молекулами фактора H на поверхности лунок с помощью конъюгата антител против С3 с ферментом и хромогенного субстрата для этого фермента. Метод основан на способности функционально активного фактора Н связываться с C3b или С3(H₂O) [6].The problem is achieved by developing an enzyme-linked immunosorbent assay and a kit for the enzyme-linked immunosorbent assay for determining the functional activity of human complement factor H, which includes: sorption of IgG antibodies to factor H in the micropanel, introducing samples of samples containing a functionally determined factor H determined into the micropanel, incubation during during which the immunochemical binding of factor H to antibodies on the surface of the wells occurs, then after washing the wells, the micropanels are added to the wells Paratov C3 component [4], inevitably containing C3b fragment, and «C3b-like" protein - C3 (H ₂ O) [5, 6], resulting from spontaneous inactivation of the C3 component, and after another washing the wells determining the amount of bound component C3b with active factor H molecules on the surface of the wells using an anti-C3 antibody conjugate with an enzyme and a chromogenic substrate for this enzyme. The method is based on the ability of functionally active factor H to bind to C3b or C3 (H ₂ O) [6].

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка иммуноферментного способа и набора для определения функциональной активности фактора Н, позволяющих при сравнении с результатами количественного определения содержания фактора Н в тех же образцах диагностировать наличие мутантных форм этого белка с измененной функциональной активностью.The technical result of the claimed invention is the development of an enzyme-linked immunosorbent assay and kit for determining the functional activity of factor H, allowing, when compared with the results of quantitative determination of the content of factor H in the same samples, to diagnose the presence of mutant forms of this protein with altered functional activity.

Пример 1. Способ иммуноферментного определения функциональной активности фактора Н комплемента человека.Example 1. An enzyme-linked immunosorbent assay for determining the functional activity of human complement factor H.

IgG-антитела к фактору Н в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, рН 9,5, с конечной концентрацией 15-50 мкг/мл, вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонного полистиролового 96-луночного планшета. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4°С. Три раза отмывают планшет фосфатным буферным раствором, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl, (ЗФР) по 250 мкл в каждую лунку, затем планшет осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В каждую лунку планшета вносят по 100 мкл раствора, содержащего определяемый фактор Н в подходящем разведении в ЗФР. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, трехкратной отмывки фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,15 M NaCl и 0,05% Твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл препарата компонента С3 человека, в концентрации 50 мкг/мл в ЗФР. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, трехкратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата антител против С3 с пероксидазой. По окончании инкубации в течение 1 ч при 37°С удаляют содержимое лунок и промывают пять раз по 200 мкл буфером ЗФР-Твин. Вносят в каждую лунку по 100 мкл субстратного буфера (3,3′,5,5′-тетраметилбензидин в 15 мл цитратно-фосфатного буфера, рН 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 15-30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 450 нм. Количество активного фактора Н рассчитывают по стандартной кривой (рис. 1). На рис.1 представлено определение функциональной активности фактора H комплемента человека методом иммуноферментного анализа.IgG antibodies to factor H in 0.05 M sodium carbonate buffer, pH 9.5, with a final concentration of 15-50 μg / ml, contribute 100 μl of solution to each well of a flat-bottomed polystyrene 96-well plate. Close the lid and leave overnight at 4 ° C. Three times the tablet is washed with phosphate buffered saline, pH 7.4, containing 0.15 M NaCl (PBS), 250 μl per well, then the tablet is dried by shaking the remaining liquid. 100 μl of a solution containing the determined factor H in a suitable dilution in PBS is added to each well of the plate. After incubation in a thermostat for 1 h at 37 ° C, washing three times with phosphate buffer, pH 7.4, containing 0.15 M NaCl and 0.05% Tween-20, and draining the plate, 100 μl of the component preparation are added to each well C3 person, at a concentration of 50 μg / ml in PBS. After incubation in a thermostat for 1 h at 37 ° C, three times washing with a detergent and draining the plate, 100 μl of a conjugate of antibodies against C3 with peroxidase are introduced into each well. After incubation for 1 h at 37 ° C, the contents of the wells are removed and washed five times with 200 μl of PBS-Tween buffer. Pipette 100 μl of substrate buffer into each well (3.3 ′, 5.5′-tetramethylbenzidine in 15 ml of citrate-phosphate buffer, pH 5.0, and 50 μl of 3% hydrogen peroxide). After 15-30 minutes of incubation in the dark, the reaction is stopped by adding 50 μl of 14% sulfuric acid to each well. The results of the reaction are taken into account using a spectrophotometer with a vertical beam by measuring light absorption at 450 nm. The amount of active factor H is calculated according to a standard curve (Fig. 1). Figure 1 shows the determination of the functional activity of human complement factor H by enzyme-linked immunosorbent assay.

Пример 2. Набор для иммуноферментного определения функциональной активности фактора H.Example 2. A kit for enzyme immunoassay to determine the functional activity of factor H.

Набор содержит плоскодонную микропанель с сорбированными антителами к фактору Н, препарат компонента С3 комплемента человека, конъюгат фермента с антителами к компоненту С3 комплемента человека, субстратный буфер и стандарт с известной активностью фактора H человека. Данный набор используется в соответствии с примером 1.The kit contains a flat-bottomed micropanel with adsorbed antibodies to factor H, a preparation of the human complement component C3, an enzyme conjugate with antibodies to the human complement component C3, a substrate buffer and a standard with known human factor H activity. This kit is used in accordance with example 1.

Из приведенных на рисунке результатов следует, что измеряемая оптическая плотность линейно зависит от концентрации активного фактора Н с коэффициентом корреляции R²=0,99, что позволяет достоверно определять функциональную активность фактора H заявленным способом в концентрациях от 5 нг/мл с использованием описанного набора.From the results shown in the figure, it follows that the measured optical density linearly depends on the concentration of active factor H with a correlation coefficient of R ² = 0.99, which allows one to reliably determine the functional activity of factor H by the claimed method in concentrations from 5 ng / ml using the described set.

Кроме того, для проверки адекватности метода было проведено сравнение активностей фактора Н в сыворотках крови 6 пациентов, у четырех из которых генетическими исследованиями были выявлены мутации фактора Н, и в пуле 10 сывороток здоровых доноров крови. Определение количественного содержания фактора Н во всех исследованных сыворотках было проведено с использованием коммерческой тест-системы («Фактор Н системы комплемента, кат. номер HK342-01» - Набор реагентов для количественного определения фактора Н системы комплемента методом иммуноферментного анализа, БИОХИММАК, Москва). Во всех сыворотках количество фактора Н было примерно одинаково и составляло 790±180 мкг/мл.In addition, to test the adequacy of the method, a comparison was made of the activity of factor H in the blood serum of 6 patients, four of which genetic mutations of factor H were detected by genetic studies, and in a pool of 10 sera of healthy blood donors. The quantitative content of factor H in all investigated sera was determined using a commercial test system (“Factor H of the complement system, cat. No. HK342-01” - Reagent kit for the quantitative determination of factor H of the complement system by enzyme-linked immunosorbent assay, BIOCHIMMAK, Moscow). In all sera, the amount of factor H was approximately the same and amounted to 790 ± 180 μg / ml.

Результаты определений приведены в таблице 1. Как следует из данных таблицы, низкая активность фактора Н была обнаружена только в сыворотках крови, содержащих мутантный фактор Н.The results of the determinations are shown in table 1. As follows from the table, a low activity of factor H was detected only in blood serum containing mutant factor N.

Таблица 1. Определение активности фактора Н в сыворотках крови пациентов.Table 1. Determination of the activity of factor H in the blood serum of patients.

ЛИТЕРАТУРАLITERATURE

1. Westra D., Vernon K.A., Volokhina E.B., Pickering M.C., van de Kar N.C., van den Heuvel L.P. Atypical hemolytic uremic syndrome and genetic aberrations in the complement factor H-related 5 gene // J. Hum. Genet. 2012. V. 57. P. 459-464.1. Westra D., Vernon K.A., Volokhina E.B., Pickering M.C., van de Kar N.C., van den Heuvel L.P. Atypical hemolytic uremic syndrome and genetic aberrations in the complement factor H-related 5 gene // J. Hum. Genet. 2012. V. 57. P. 459-464.

2. Wong E.K., Anderson H.E., Herbert A.P., Challis R.C., Brown P., Reis G.S., Tellez J.O., Strain L., Fluck N., Humphrey A., Macleod A., Richards A., Ahlert D., Santibanez-Koref M., Barlow P.N., Marchbank K.J., Harris C.L., Goodship Т.Н., Kavanagh D. Characterization of a Factor H Mutation That Perturbs the Alternative Pathway of Complement in a Family with Membranoproliferative GN // J. Am. Soc. Nephrol. 2014. Apr 10. [Epub ahead of print].2. Wong EK, Anderson HE, Herbert AP, Challis RC, Brown P., Reis GS, Tellez JO, Strain L., Fluck N., Humphrey A., Macleod A., Richards A., Ahlert D., Santibanez- Koref M., Barlow PN, Marchbank KJ, Harris CL, Goodship T.N., Kavanagh D. Characterization of a Factor H Mutation That Perturbs the Alternative Pathway of Complement in a Family with Membranoproliferative GN // J. Am. Soc. Nephrol. 2014. Apr 10. [Epub ahead of print].

3. Hoffman J.D., Cooke Bailey J.N., D'Aoust L.N., Cade W., Ayala-Haedo J., Fuzzell M.D., Laux R.A., Adams L., Reinhart-Mercer L., Caywood L., Whitehead-Gay P., Agarwal A., Wang G., Scott W.K., Pericak-Vance M., Haines J.L. Rare Complement Factor H Variant Associated with Age-related Macular Degeneration in the Amish // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2014. Jun 6. pii: IOVS-13-13684. doi: 10.1167 / iovs. 13-13684. [Epub ahead of print].3. Hoffman JD, Cooke Bailey JN, D'Aoust LN, Cade W., Ayala-Haedo J., Fuzzell MD, Laux RA, Adams L., Reinhart-Mercer L., Caywood L., Whitehead-Gay P., Agarwal A., Wang G., Scott WK, Pericak-Vance M., Haines JL Rare Complement Factor H Variant Associated with Age-related Macular Degeneration in the Amish // Invest. Ophthalmol. Vis Sci. 2014. Jun 6. pii: IOVS-13-13684. doi: 10.1167 / iovs. 13-13684. [Epub ahead of print].

4. Козлов Л.В., Дьяков В.Л., Мишин А.А., Гузова В.А., Баталова Т.Н., Лысакова С.В. Способ получения компонента С3 комплемента человека. Патент РФ №2144365. 20.01.2000. Бюл. №2.4. Kozlov L.V., Dyakov V.L., Mishin A.A., Guzova V.A., Batalova T.N., Lysakova S.V. The method of obtaining component C3 of human complement. RF patent No. 2144365. 01/20/2000. Bull. No. 2.

5. Andersson J., Ekdahl K.N., Larsson R., Nilsson U.R., Nilsson В. С3 Adsorbed to a Polymer Surface Can Form an Initiating Alternative Pathway // J. Immunology. 2002. V. 168. P. 5786-5791.5. Andersson J., Ekdahl K.N., Larsson R., Nilsson U.R., Nilsson B. C3 Adsorbed to a Polymer Surface Can Form an Initiating Alternative Pathway // J. Immunology. 2002. V. 168. P. 5786-5791.

6. Oran A.E., Isenman D.E. Identification of residues within the 727-767 segment of human complement component C3 important for its interaction with factor H and with complement receptor 1 (CR1, CD35) // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 5120-5130.6. Oran A.E., Isenman D.E. Identification of residues within the 727-767 segment of human complement component C3 important for its interaction with factor H and with complement receptor 1 (CR1, CD35) // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 5120-5130.

Claims

1. An enzyme-linked immunosorbent assay for determining the functional activity of human complement factor H, characterized in that sorbed IgG antibodies to factor H in the micropanel wells, then an assayed sample containing factor H with unknown activity is introduced into the wells, incubation is carried out, during which factor H binds with IgG antibodies sorbed in the wells of the micropanel, the contents of the wells are poured, and then the preparation of component C3 of the person is introduced into them and, after incubation and washing, the amount of bound C3 is determined using the conjugate an enzyme with antibodies to component C3 and a substrate buffer for this enzyme, after which factor H activity is calculated by the amount of the resulting enzymatic reaction product.

2. A kit for enzyme-linked immunosorbent assay for determining the functional activity of factor H of a human complement associated with antibodies to it adsorbed in the wells of a micropanel, characterized in that it contains a flat-bottomed micropanel with adsorbed antibodies to factor H, a preparation of human component C3, an enzyme conjugate with antibodies to component C3 human, substrate buffer and standard for calculating the activity of factor N.