Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах. The invention relates to medical immunology, and in particular to methods for determining the functional activity of complement components in human serum in the diagnosis of a number of diseases and in biological preparations.
Наиболее перспективным из современных методов определения белков сыворотки крови является метод иммуноферментного анализа благодаря своей чувствительности, избирательности и возможности автоматизации аналитического процесса. Однако имеющиеся на сегодня методы иммуноферментного анализа белков комплемента позволяют определять лишь их содержание как антигена. Тем не менее наиболее информативным является оценка функциональной активности этих белков, которая и характеризует развитие патологического процесса. Что касается определения функциональной активности компонентов комплемента, то практически единственным является гемолитический метод [1], не отличающийся высокой степенью воспроизводимости и неохотно используемый клиницистами из-за трудностей, связанных с приготовлением гемолитической системы на основе эритроцитов барана. The most promising of modern methods for the determination of blood serum proteins is the enzyme-linked immunosorbent assay due to its sensitivity, selectivity and the ability to automate the analytical process. However, currently available methods of enzyme immunoassay of complement proteins allow only their content to be determined as antigen. Nevertheless, the most informative is the assessment of the functional activity of these proteins, which characterizes the development of the pathological process. As for the determination of the functional activity of complement components, the hemolytic method [1], which is not distinguished by a high degree of reproducibility and is reluctantly used by clinicians, is practically the only one because of the difficulties associated with the preparation of a hemolytic system based on sheep erythrocytes.
Нами разработан способ, позволяющий определять функциональную активность компонента С3 системы комплемента человека на основе иммуноферментного метода. Преимуществами предложенного метода являются простота определения, хорошая воспроизводимость результатов и отсутствие необходимости использования таких плохо сохраняемых и плохо стандартизуемых компонентов, какими являются эритроциты. We have developed a method that allows us to determine the functional activity of the component C3 of the human complement system based on the enzyme immunoassay. The advantages of the proposed method are the simplicity of determination, good reproducibility of the results, and the absence of the need to use such poorly stored and poorly standardized components as red blood cells.
Способ осуществляется следующим образом: проводят сорбцию в лунках микропанели иммуноглобулина G, затем в лунки вносят сыворотку морской свинки и буферный раствор, содержащий ионы Са2+ и Ni2+, и проводят инкубацию для формирования на поверхности лунок стабильной С3-конвертазы классического пути комплемента, после чего, вылив содержимое в лунки, вносят растворы, в которых определяют активность компонента С3, и проводят инкубацию, во время которой происходит ковалентное связывание С3 с С3-конвертазой с превращением последней в С5-конвертазу. Количество ковалентно связавшегося в результате активации компонента С3 определяют по продукту ферментативной реакции с помощью антител к С3-фракции иммуноглобулинов G, ковалентно связанных с ферментом. Способ основан на способности функционально активного компонента С3 образовывать С5-конвертазу классического пути при взаимодействии с С3-конвертазой.The method is as follows: sorption of the immunoglobulin G micropanel in the wells is carried out, then guinea pig serum and a buffer solution containing Ca 2+ and Ni 2+ ions are added to the wells and incubated to form a stable C3 convertase of the classical complement pathway on the surface of the wells, after which, after pouring the contents into the wells, solutions are added in which the activity of the C3 component is determined and incubation is carried out during which the C3 is covalently coupled to the C3 convertase to convert the latter to a C5 convertase. The amount of component C3 covalently bound as a result of activation is determined by the product of the enzymatic reaction using antibodies to the C3 fraction of immunoglobulins G covalently linked to the enzyme. The method is based on the ability of the functionally active component C3 to form the classic pathway C5-convertase when interacting with the C3-convertase.
Пример. Определение функциональной активности препарата С3. Растворяют иммунохимически чистый IgG в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, рН 9,5, в концентрациях белка 10-100 мкг/мл и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонного полистиролового 96-луночного планшета. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4oС. Два раза отмывают планшет вероналовым буферным раствором, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl, 0,15 мМ Са2+ (VBS-Ca2+), по 150 мкл в каждую лунку, затем планшет осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В лунки планшета ряда вносят 75 мкл VBS-Ca2+, 15 мкл 0,1М нитрата никеля (II) и 10 мкл сыворотки морской свинки. После инкубации в термостате в течение 30 мин при 37oС, двукратной отмывки VBS, содержащим 5 мМ ЭДТА, (VBS-E) и осушения планшета в лунки планшета каждого ряда вносят по 100 мкл раствора, содержащего С3 в растворе VBS-E в виде прогрессивных двукратных разведений.Example. Determination of the functional activity of the drug C3. Immunochemically pure IgG is dissolved in 0.05 M sodium carbonate buffer, pH 9.5, at protein concentrations of 10-100 μg / ml, and 100 μl of the solution is added to each well of a flat-bottomed polystyrene 96-well plate. Close the lid and leave overnight at 4 o C. Two times the tablet is washed with Veronal buffer solution, pH 7.4, containing 0.15 M NaCl, 0.15 mm Ca 2+ (VBS-Ca 2+ ), 150 μl each each well, then the plate is drained by shaking out the remaining liquid. 75 μl of VBS-Ca 2+ , 15 μl of 0.1 M nickel (II) nitrate and 10 μl of guinea pig serum are added to the wells of a row plate. After incubation in a thermostat for 30 minutes at 37 ° C, washing twice with VBS containing 5 mM EDTA (VBS-E) and drying the plate, 100 μl of a solution containing C3 in VBS-E solution in the form of progressive double dilutions.
После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37oС, двукратной отмывки фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,15 М NCl и 0,05% твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против компонента С3 человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37oС, двукратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера (10 мг ортофенилендиамина в 25 мл цитратно-фосфатного буфера, рН 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 492 нм. Функциональную активность препарата С3 рассчитывают по стандартной кривой. Этим методом проведено определение активности С3 в 5 образцах сыворотки крови человека и стандартным гемолитическим методом [1] . Полученные результаты (в мг/мл активного компонента С3) представлены в таблице.After incubation in a thermostat for 1 h at 37 ° C, washing twice with phosphate buffer, pH 7.4, containing 0.15 M NCl and 0.05% tween-20, and draining the plate, 100 μl of peroxidase conjugate are added to each well with antibodies against the component C3 person in the same buffer in a selected dilution. After incubation in a thermostat for 1 h at 37 ° C, twice washing with detergent and draining the plate, 100 μl of substrate buffer (10 mg of orthophenylenediamine in 25 ml of citrate-phosphate buffer, pH 5.0, and 50 μl 3 % hydrogen peroxide). After 30 minutes of incubation in the dark, the reaction is stopped by adding 50 μl of 14% sulfuric acid to each well. The results of the reaction are taken into account using a spectrophotometer with a vertical beam by measuring light absorption at 492 nm. The functional activity of the drug C3 is calculated according to a standard curve. This method determined the activity of C3 in 5 samples of human serum and the standard hemolytic method [1]. The results obtained (in mg / ml of the active component C3) are presented in the table.
ЛИТЕРАТУРА
1. Козлов Л.В., Крылова Ю.И., Чих В.П., Молчанова Н.Н. Модифицированные методы определения функциональной активности факторов комплемента С2, С3, С4 и С5. Биоорганическая химия. 1982. Т. 8. 5. С. 652-659.LITERATURE
1. Kozlov L.V., Krylova Yu.I., Chikh V.P., Molchanova N.N. Modified methods for determining the functional activity of complement factors C2, C3, C4 and C5. Bioorganic chemistry. 1982.V. 8. 5.P. 652-659.
