RU2232993C1 - Method for assay of functional activity of human complement factor b - Google Patents
Method for assay of functional activity of human complement factor b Download PDFInfo
- Publication number
- RU2232993C1 RU2232993C1 RU2003110061/15A RU2003110061A RU2232993C1 RU 2232993 C1 RU2232993 C1 RU 2232993C1 RU 2003110061/15 A RU2003110061/15 A RU 2003110061/15A RU 2003110061 A RU2003110061 A RU 2003110061A RU 2232993 C1 RU2232993 C1 RU 2232993C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- factor
- activity
- functional activity
- assay
- complement
- Prior art date
Links
Abstract
Description
Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности факторов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.The invention relates to medical immunology, and in particular to methods for determining the functional activity of complement factors in human serum in the diagnosis of a number of diseases and in biological preparations.
Наиболее перспективным из современных методов определения белков сыворотки крови является метод иммуноферментного анализа благодаря своей чувствительности, избирательности и возможности автоматизации аналитического процесса. Однако имеющиеся на сегодня методы иммуноферментного анализа белков комплемента позволяют определять лишь их содержание как антигена. Тем не менее, наиболее информативным является оценка функциональной активности этих белков, которая и характеризует развитие патологического процесса. Что касается определения функциональной активности фактора В комплемента, то практически единственным является гемолитический метод [1] определения активности В, проявляющейся в активации системы по альтернативному пути, не отличающийся высокой степенью воспроизводимости и неохотно используемый клиницистами из-за трудностей, связанных с приготовлением гемолитической системы на основе эритроцитов кролика.The most promising of modern methods for determining serum proteins is enzyme immunoassay due to its sensitivity, selectivity and the ability to automate the analytical process. However, the methods available today for enzyme immunoassay of complement proteins allow only their content to be determined as antigen. Nevertheless, the most informative is the assessment of the functional activity of these proteins, which characterizes the development of the pathological process. As for the determination of the functional activity of complement factor B, the hemolytic method [1] for determining the activity of B, which manifests itself in the activation of the system along an alternative path, is not very reproducible and is reluctantly used by clinicians because of the difficulties associated with the preparation of the hemolytic system for erythrocyte-based rabbit.
Задачей заявленного изобретения является разработка способа, позволяющего определять функциональную активность фактора В альтернативного пути системы комплемента человека на основе иммуноферментного метода.The objective of the claimed invention is to develop a method that allows to determine the functional activity of the factor In an alternative way of the human complement system based on the enzyme immunoassay.
Поставленная задача достигается путем разработки способа определения, который предусматривает сорбцию в лунках микропланшета активатора альтернативного пути комплемента, выбранного из ряда: иммуноглобулин А, иммуноглобулин G, компонент С3, липополисахарид, затем внесение в лунки микропланшета раствора, содержащего реагент RB (сыворотки крови человека, лишенной активности фактора В), и анализируемой пробы, содержащей фактор В комплемента человека с неизвестной активностью, проведение инкубации в присутствии ионов Mg2+ и в отсутствие ионов Са2+ (в ходе которой происходит формирование С3-конвертазы (С3bВb) на сорбированном активаторе альтернативного пути в количествах, зависящих от концентрации функционально активного определяемого фактора В, а также активация этой конвертазой компонента С3 и ковалентное связывание последнего на сорбированном активаторе. Таким образом, количество связавшегося С3 зависит от количества С3-конвертазы, т.е. количества определяемого фактора В. Количество ковалентно связавшегося в результате активации компонента С3 определяют по продукту ферментативной реакции с помощью антител к С3-фракции иммуноглобулинов G, конъюгированных с ферментом. Тем самым достигается определение функциональной активности фактора В иммуноферментным методом, пригодным для стандартизации.The task is achieved by developing a determination method that provides for sorption in the wells of a microplate of an activator of an alternative complement pathway selected from the series: immunoglobulin A, immunoglobulin G, component C3, lipopolysaccharide, then introducing a solution containing RB reagent (human serum devoid of activity of factor B), and an analyzed sample containing factor B of a human complement with unknown activity, incubation in the presence of Mg 2+ ions and in the absence of ion in Ca 2+ (during which the formation of C3 convertase (C3bBb) takes place on the sorbed activator of the alternative pathway in amounts depending on the concentration of the functionally active determined factor B, as well as the activation of component C3 by this convertase and covalent binding of the latter on the sorbed activator. Thus , the amount of bound C3 depends on the amount of C3 convertase, i.e., the amount of determined factor B. The amount of component C3 covalently bound as a result of activation is determined by the product of the farm -commutative reaction by antibodies to C3 fraction of immunoglobulins G, conjugated with enzyme. Thus, the determination of the functional activity of factor B is achieved by an enzyme immunoassay suitable for standardization.
Техническим результатом заявленного изобретения является разработка упрощенного способа определения функциональной активности фактора В комплемента человека, обладающего хорошей воспроизводимостью результатов и отсутствием необходимости использования таких плохо сохраняемых и трудно стандартизуемых компонентов, какими являются эритроциты.The technical result of the claimed invention is the development of a simplified method for determining the functional activity of factor B of a human complement, with good reproducibility of the results and the absence of the need to use such poorly stored and difficult to standardize components, such as red blood cells.
Пример 1. Определение функциональной активности препарата фактора В. Растворяют активатор альтернативного пути комплемента - иммунохимически чистый IgA в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, рН 9,5, в концентрациях 10-100 мкг/мл и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонного полистиролового 96-луночного планшета. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4°С. Три раза отмывают планшет вероналовым буферным раствором, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl, 10 мМ этиленгликоль-бис(β-аминоэтиловый эфир)-N,N,N’,N’- тетрауксусную кислоту и 5 мМ MgCl2 (Mg-EGTA), заливая по 150 мкл в каждую лунку, затем планшет осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В лунки планшета ряда вносят по 100 мкл раствора Mg-EGTA, содержащего 10 мкл реагента RB (RB - сыворотка человека, лишенная фактора В с сохранением активностей остальных компонентов и факторов комплемента, получаемая, например, прогреванием ее в течение 30 мин при 50°С) и анализируемую пробу, содержащую фактор В с неизвестной активностью. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, двукратной отмывки фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против компонента С3 человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, двукратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера (10 мг ортофенилендиамина в 25 мл цитратно-фосфатного буфера, рН 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотомегра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 492 нм. Функциональную активность препарата фактора В рассчитывают по стандартной кривой. Этим методом проведено определение активности фактора В в образцах с известным содержанием фактора В. Полученные результаты приведены в таблице.Example 1. Determination of the functional activity of the preparation of factor B. Dissolve the activator of the alternative complement pathway - immunochemically pure IgA in 0.05 M sodium carbonate buffer, pH 9.5, at concentrations of 10-100 μg / ml and add 100 μl of solution to each well flat-bottomed polystyrene 96-well plate. Close the lid and leave overnight at 4 ° C. The tablet is washed three times with Veronal buffer solution, pH 7.4, containing 0.15 M NaCl, 10 mM ethylene glycol bis (β-aminoethyl ether) -N, N, N ', N'-tetraacetic acid and 5 mM MgCl 2 ( Mg-EGTA), pouring 150 μl into each well, then the plate is dried by shaking out the remaining liquid. 100 μl of a Mg-EGTA solution containing 10 μl of RB reagent (RB is human serum devoid of factor B while maintaining the activities of other components and complement factors, obtained, for example, by heating it for 30 minutes at 50 ° C, is added to the wells of a row tablet). ) and an assayed sample containing factor B with unknown activity. After incubation in a thermostat for 1 h at 37 ° C, twice washing with phosphate buffer, pH 7.4, containing 0.15 M NaCl and 0.05% tween-20, and draining the plate, 100 μl of peroxidase conjugate are added to each well with antibodies against component C3 person in the same buffer in a selected dilution. After incubating in a thermostat for 1 h at 37 ° C, washing twice with detergent, and draining the plate, 100 μl of substrate buffer (10 mg of orthophenylenediamine in 25 ml of citrate-phosphate buffer, pH 5.0, and 50 μl 3 % hydrogen peroxide). After 30 minutes of incubation in the dark, the reaction is stopped by adding 50 μl of 14% sulfuric acid to each well. The reaction results are taken into account using a spectrophotomegre with a vertical beam by measuring light absorption at 492 nm. The functional activity of the drug factor B is calculated according to a standard curve. This method was used to determine the activity of factor B in samples with a known content of factor B. The results are shown in the table.
Пример 2. Определение функциональной активности препарата фактора В проводят аналогично примеру 1, но в качестве активатора альтернативного пути используют иммуноглобулин G. Полученные результаты приведены в таблице.Example 2. Determination of the functional activity of the preparation of factor B is carried out analogously to example 1, but immunoglobulin G is used as an alternative pathway activator. The results are shown in the table.
Пример 3. Определение функциональной активности препарата фактора В проводят аналогично примеру 1, но в качестве активатора альтернативного пути используют препарат компонента С3 морской свинки. Полученные результаты приведены в таблице.Example 3. Determination of the functional activity of the preparation of factor B is carried out analogously to example 1, but as an activator of the alternative pathway, the preparation of component C3 of guinea pig is used. The results are shown in the table.
Пример 4. Определение функциональной активности препарата фактора В проводят аналогично примеру 1, но в качестве активатора альтернативного пути используют липополисахарид (ЛПС - препарат клеточной стенки бактерий, пирогенал). Полученные результаты приведены в таблице.Example 4. Determination of the functional activity of the preparation of factor B is carried out analogously to example 1, but as an activator of the alternative pathway, use a lipopolysaccharide (LPS - preparation of the bacterial cell wall, pyrogenal). The results are shown in the table.
ЛитератураLiterature
1. Козлов Л.В., Соляков Л.С. Возможность участия зимогенных форм факторов В и D в активации альтернативного пути системы комплемента./Биоорганическая химия, 1982, т. 8, №3, с.342-348.1. Kozlov L.V., Solyakov L.S. The possibility of the participation of the zymogenic forms of factors B and D in the activation of the alternative pathway of the complement system. / Bioorganic Chemistry, 1982, v. 8, No. 3, p. 342-348.
Claims (1)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2003110061/15A RU2232993C1 (en) | 2003-04-09 | 2003-04-09 | Method for assay of functional activity of human complement factor b |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2003110061/15A RU2232993C1 (en) | 2003-04-09 | 2003-04-09 | Method for assay of functional activity of human complement factor b |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2232993C1 true RU2232993C1 (en) | 2004-07-20 |
RU2003110061A RU2003110061A (en) | 2004-10-20 |
Family
ID=33414278
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2003110061/15A RU2232993C1 (en) | 2003-04-09 | 2003-04-09 | Method for assay of functional activity of human complement factor b |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2232993C1 (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2550946C1 (en) * | 2013-11-06 | 2015-05-20 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Method of determining functional activity of human complement factor b |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2464567C1 (en) * | 2011-06-17 | 2012-10-20 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Method and kit for quantitative immunoassay of human complement c1 inhibitor |
-
2003
- 2003-04-09 RU RU2003110061/15A patent/RU2232993C1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
NIEMANN M.A. et al. The principal site of glycation of human complement factor B, Biochem J. - 1991, Mar. 1, 274(Pt2), p.473-480. * |
КОЗЛОВ Л.В. и др. Возможность участия зимогенных форм факторов В и D в активации альтернативного пути системы комплемента. Биоорганическая химия. - 1982, т.8, № 3, с.342-348. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2550946C1 (en) * | 2013-11-06 | 2015-05-20 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Method of determining functional activity of human complement factor b |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JPH0684970B2 (en) | Method of detecting occult blood in feces | |
US4804625A (en) | Assay procedures | |
RU2232991C1 (en) | Method for assay of functional activity of human complement factor d | |
RU2417375C2 (en) | Method and set for immune-enzyme assay of functional activity of human complement component c3 | |
CN102841206A (en) | Troponin-T determination kit | |
RU2380707C1 (en) | Method and set for immunoenzyme assay of functional activity of component c3 of human complement by alternative pathway of activation | |
RU2232992C1 (en) | Method for assay of functional activity of human complement component c3 by alternative pathway of activation | |
RU2232993C1 (en) | Method for assay of functional activity of human complement factor b | |
CN101446586A (en) | Immunological assay reagents and assay method | |
RU2195662C1 (en) | Method of determining functional activity of human complement c1 inhibitor | |
RU2376605C1 (en) | Method and set for immune-enzyme detection of functuinal activity of factor d of human complement | |
RU2405042C1 (en) | Method and kit for immune-enzyme assay of functional activity of human complement component c2 | |
RU2376606C1 (en) | Method and set for immune-enzyme detection of functional activity of component c4 of human complement | |
RU2374650C1 (en) | Method and kit for immune-enzyme assay of functional activity of human complement factor b | |
RU2195664C2 (en) | Method of determining functional activity of c3 component of human complement | |
RU2506594C1 (en) | Method and kit for immune-enzyme assay of functional activity of human complement component c3 | |
RU2195670C1 (en) | Method of assay of functional activity of component c2 in human complement | |
RU2251697C1 (en) | Method for detecting functional activity of human complement c3 component according to classical way of activation | |
RU2149406C1 (en) | Method for determining functional activity of human c4 complement component | |
RU2425383C1 (en) | METHOD AND KIT FOR IMMUNE-ENZYME FUNCTIONAL ACTIVITY ASSAY ON C1r2s2 SUBCOMPONENTS OF FIRST COMPONENT OF HUMAN COMPLEMENT | |
RU2235329C1 (en) | METHOD FOR DETERMINATION OF FUNCTIONAL ACTIVITY OF C1r2s2 SUBCOMPONENTS OF THE FIRST HUMAN COMPLEMENT COMPONENT | |
RU2413224C1 (en) | METHOD AND SET FOR ELISA DETERMINATION OF FUNCTIONAL ACTIVITY OF HUMAN COMPLEMENT COMPONENT C1q | |
RU2253118C1 (en) | Determination of functional activity of human complement c4 component | |
RU2162601C1 (en) | Method of assay of functional activity of component c4 of human complement | |
RU2251698C1 (en) | METHOD FOR DETECTING FUNCTIONAL ACTIVITY OF SUBCOMPONENTS C1r2s2 OF THE FIRST COMPONENT OF HUMAN COMPLEMENT |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20050410 |