RU2555335C9

RU2555335C9 - Medication for treatment of cardiovascular diseases

Info

Publication number: RU2555335C9
Application number: RU2014104145/15A
Authority: RU
Inventors: Кенес Тагаевич Еримбетов; Владимир Константинович Подгородниченко; Виктор Владимирович Хомиченок; Анна Яковлевна Гончарова; Рахимджан Ахметджанович Розиев; Алексей Викторович Клейменов
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью "Диборнол Девелопмент"
Priority date: 2014-02-06
Filing date: 2014-02-06
Publication date: 2016-09-10
Also published as: WO2015118488A1; RU2555335C1; EA201691465A1

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention represents a mixture of two structural isomers: 2,6-di(1,7,7-trimethylbicyclo[2.2.1]hept-2-yl)-4-methylphenol and its diastereomers, and 2-(1,7,7-trimethylbicyclo[2.2.1]hept-2-yl)-6-(2,2,1-trimethylbicyclo[2.2.1]hept-5-yl)-4-methylphenol, and their diastereomers with the ratio of the first and second structural isomers from 60:40 wt % to 95:5 wt %.

EFFECT: extension of the arsenal of means, possessing simultaneously haemorheological, anti-aggregate, anti-thrombogenic, retinoprotecting, endothelium-protecting, neuroprotecting, anti-arrhythmia and anti-ischemic activity, enhancing the cerebral blood flow.

4 dwg, 20 tbl, 6 ex

Description

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, и касается средств, обладающих гемореологической, антиагрегатной, антитромбогенной, ретинопротекторной, эндотелийпротекторной, нейропротекторной, противоаритмической и противоишемической активностью, а также увеличивающих мозговой кровоток.The invention relates to medicine, specifically to pharmacology, and relates to agents having hemorheological, antiplatelet, antithrombogenic, retinoprotective, endothelium protective, neuroprotective, antiarrhythmic and anti-ischemic activity, as well as increasing cerebral blood flow.

Известно средство, обладающее антирадикальной, гемореологической, антитромбоцитарной и антитромбогенной активностью [Патент №2347561, A61K 31/05, 2008].Known agent with antiradical, hemorheological, antiplatelet and antithrombogenic activity [Patent No. 2347561, A61K 31/05, 2008].

Известно средство, проявляющее противоишемические свойства [Патент №2499593, A61K 31/05, 2013].Known agent exhibiting anti-ischemic properties [Patent No. 2499593, A61K 31/05, 2013].

Известно средство, проявляющее противоаритмическую активность [Щетинин П.П. Противоаритмическая активность диборнола в условиях модели острой ишемии - реперфузии миокарда / Бюллетень сибирской медицины, 2003, том 12, №3, с. 153-156].Known agent exhibiting antiarrhythmic activity [Shchetinin P.P. Antiarrhythmic activity of dibornol under the conditions of the model of acute ischemia - myocardial reperfusion / Bulletin of Siberian Medicine, 2003, Volume 12, No. 3, p. 153-156].

Известно средство, обладающее нейропротекторной активностью [Патент №2406488, A61K 31/05, 2010].Known agent with neuroprotective activity [Patent No. 2406488, A61K 31/05, 2010].

Известно средство, обладающее ретинопротекторной активностью [Патент №2406487, A61K 31/05, 2010].Known agent having retinoprotective activity [Patent No. 2406487, A61K 31/05, 2010].

Известно средство, проявляющее эндотелийпротекторные свойства [Иванов И.С. Нейропротекторная и антитромбогенная активность 4-метил-2,6-диизоборнилфенола / Автореферат диссертации кандидата биологических наук, Томск, 2009, 24 с].A known agent exhibiting endothelium protective properties [Ivanov I.S. Neuroprotective and antithrombogenic activity of 4-methyl-2,6-diisobornylphenol / Abstract of the dissertation of the candidate of biological sciences, Tomsk, 2009, 24 pp.].

Известно средство, способное увеличивать мозговой кровоток [Патент №2351321, A61K 31/05, 2009].Known means that can increase cerebral blood flow [Patent No. 2351321, A61K 31/05, 2009].

Указанные средства представляют собой 4-метил-2,6-диизоборнилфенол.These agents are 4-methyl-2,6-diisobornylphenol.

Известно, что данное соединений представляет смесь структурных изомеров [Патент №2502719, С07С 39/17, 2013], однако не известно о соотношении данных изомеров в смеси, и влияние их соотношения на проявляемую ими фармакологическую активность.It is known that this compound is a mixture of structural isomers [Patent No. 2502719, C07C 39/17, 2013], but it is not known about the ratio of these isomers to the mixture and the effect of their ratio on the pharmacological activity they exhibit.

Задачей изобретения является расширение арсенала средств, обладающих одновременно гемореологической, антиагрегатной, антитромбогенной, ретинопротекторной, эндотелийпротекторной, нейропротекторной, противоаритмической и противоишемической активностью, увеличивающих мозговой кровоток. Также в задачу изобретения входило выявление фармакологической активности указанного средства, проявляющего указанные свойства.The objective of the invention is to expand the arsenal of drugs that have both hemorheological, antiaggregate, antithrombogenic, retinoprotective, endothelium protective, neuroprotective, antiarrhythmic and anti-ischemic activity that increase cerebral blood flow. Also the objective of the invention was to identify the pharmacological activity of the specified funds, showing these properties.

Поставленная задача достигается использованием смеси структурных изомеров 2,6-ди(1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ил)-4-метилфенола (изомер 1) и 2-(1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ил), 6-(2,2,1-триметилбицикло[2.2.1]гепт-5-ил)-4-метилфенола (изомер 2) в качестве лекарственного средства, обладающего гемореологическими, антиагрегатными, антитромбогенными, ретинопротекторными, эндотелийпротекторными, нейропротекторными, противоаритмическими и противоишемическими свойствами, увеличивающего мозговой кровоток с высокой степенью активности при следующем соотношении изомеров:The problem is achieved using a mixture of structural isomers of 2,6-di (1,7,7-trimethylbicyclo [2.2.1] hept-2-yl) -4-methylphenol (isomer 1) and 2- (1,7,7-trimethylbicyclo [2.2.1] hept-2-yl), 6- (2,2,1-trimethylbicyclo [2.2.1] hept-5-yl) -4-methylphenol (isomer 2) as a drug with hemorheological, antiplatelet agents antithrombogenic, retinoprotective, endothelium protective, neuroprotective, antiarrhythmic and anti-ischemic properties that increase cerebral blood flow with a high degree of activity in the following ratio of isomers:

от 60 до 95 мас.% для первого изомера и от 40 до 5 мас.% для второго изомера.from 60 to 95 wt.% for the first isomer and from 40 to 5 wt.% for the second isomer.

В литературе отсутствует информация по применению смеси структурных изомеров 2,6-ди(1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ил)-4-метилфенола и 2-(1,7,7-триметил-бицикло[2.2.1]гепт-2-ил), 6-(2,2,1-триметилбицикло[2.2.1]гепт-5-ил)-4-метилфенола с указанным соотношением изомеров как гемореологического, антиагрегатного, антитромбогенного, ретинопротекторного, эндотелийпротекторного, нейропротекторного, противоаритмического, противоишемического, увеличивающего мозговой кровоток средства при заболеваниях сердечно-сосудистой системы. В литературе описано применение только одного изомера - 2,6-ди(1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ил)-4-метилфенола, однако выделение его в чистом виде приводит к большим потерям в выходе и удорожанию препарата.There is no information in the literature on the use of a mixture of structural isomers of 2,6-di (1,7,7-trimethylbicyclo [2.2.1] hept-2-yl) -4-methylphenol and 2- (1,7,7-trimethyl-bicyclo [2.2.1] hept-2-yl), 6- (2,2,1-trimethylbicyclo [2.2.1] hept-5-yl) -4-methylphenol with the indicated ratio of isomers as hemorheological, antiplatelet, antithrombogenic, retinoprotective, endothelium protective, neuroprotective, antiarrhythmic, anti-ischemic, increasing cerebral blood flow drugs for diseases of the cardiovascular system. The literature describes the use of only one isomer - 2,6-di (1,7,7-trimethylbicyclo [2.2.1] hept-2-yl) -4-methylphenol, however, its isolation in pure form leads to large losses in yield and rise in price of the drug.

Новым в предлагаемом изобретении является то, что в качестве гемореологического, антиагрегатного, антитромбогенного, ретинопротекторного, эндотелийпротекторного, нейропротекторного, противоаритмического, противоишемического, увеличивающего мозговой кровоток средства используется смесь указанных диастереомеров 2,6-ди(1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ил)-4-метилфенола и 2-(1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ил), 6-(2,2,1-триметилбицикло[2.2.1]гепт-5-ил)-4-метилфенола с соотношением изомеров 60:40 мас.% + 95:5 мас.%, которое может применяться для лечения сердечно-сосудистых заболеваний. Данная смесь получается в результате подбора условий реакции алкилирования по Фриделю-Крафтсу пара-крезола камфеном и не требует дорогостоящих методов очистки. Соотношение изомеров рассчитывалось по спектрам ЯМР (Фиг. 1) и соотношению площадей пиков на ВЭЖХ (Фиг. 2 - 95:5 и Фиг. 3 - 60:40). Для анализа использовали жидкостной хроматограф «SURVEYOR LC», оснащенный УФ-детектором с фотодиодной матрицей (фирмы Thermo, США).New in the present invention is that as a hemorheological, antiaggregate, antithrombogenic, retinoprotective, endothelium protective, neuroprotective, antiarrhythmic, anti-ischemic, cerebral blood flow increasing agent, a mixture of these diastereomers of 2,6-di (1,7,7-trimethylbicyclo [2.2. 1] hept-2-yl) -4-methylphenol and 2- (1,7,7-trimethylbicyclo [2.2.1] hept-2-yl), 6- (2,2,1-trimethylbicyclo [2.2.1] hept-5-yl) -4-methylphenol with an isomer ratio of 60:40 wt.% + 95: 5 wt.%, which can be used to treat cardiac -sosudistyh diseases. This mixture is obtained by selecting the conditions for the Friedel-Crafts alkylation reaction of para-cresol with camphene and does not require expensive purification methods. The ratio of isomers was calculated by NMR spectra (Fig. 1) and the ratio of peak areas on HPLC (Fig. 2 - 95: 5 and Fig. 3 - 60:40). For analysis, a SURVEYOR LC liquid chromatograph equipped with a UV detector with a photodiode array (Thermo, USA) was used.

Разделение смеси диастереоизомеров проводили на колонке Hypercarb, 100×2.1 мм, размер частиц 5 мкм (Thermo, США). Подвижная фаза - ацетонитрил + 0.1% муравьиной кислоты, режим элюирования - изократический, скорость потока - 600 мкл/мин (Фиг. 2) или элюент ацетонитрил + Н₂О + 0.1% муравьиной кислоты, режим элюирования - градиентный, скорость потока - 300 мкл/мин (Фиг. 3). Структура 2,6-ди(1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ил)-4-метилфенола была подтверждена рентгеноструктурным анализом (Фиг. 4).Separation of the mixture of diastereoisomers was carried out on a Hypercarb column, 100 × 2.1 mm, particle size 5 μm (Thermo, USA). The mobile phase is acetonitrile + 0.1% formic acid, the elution mode is isocratic, the flow rate is 600 μl / min (Fig. 2) or the acetonitrile + H ₂ O + 0.1% formic acid eluent, the elution mode is gradient, the flow rate is 300 μl / min (Fig. 3). The structure of 2,6-di (1,7,7-trimethylbicyclo [2.2.1] hept-2-yl) -4-methylphenol was confirmed by X-ray diffraction analysis (Fig. 4).

Для специалиста эти свойства явным образом не вытекают из уровня техники.For a specialist, these properties are not explicitly derived from the prior art.

Таким образом, предметом исследования явились следующие соединения.Thus, the following compounds were the subject of study.

Соединение 1 - 4-метил-2,6-диизоборнилфенол.Compound 1 - 4-methyl-2,6-diisobornylphenol.

Соединение 2 - смесь структурных изомеров и их диастереомеров: 2,6-ди(1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ил)-4-метилфенола и 2-(1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ил), 6-(2,2,1-триметилбицикло[2.2.1]гепт-5-ил)-4-метилфенола с соотношением изомеров от 60% до 95 мас.% для первого изомера и от 40% до 5 мас.% для второго изомера.Compound 2 is a mixture of structural isomers and their diastereomers: 2,6-di (1,7,7-trimethylbicyclo [2.2.1] hept-2-yl) -4-methylphenol and 2- (1,7,7-trimethylbicyclo [ 2.2.1] hept-2-yl), 6- (2,2,1-trimethylbicyclo [2.2.1] hept-5-yl) -4-methylphenol with an isomer ratio of 60% to 95% by weight for the first isomer and from 40% to 5 wt.% for the second isomer.

Эффективность соединения 2 по сравнению с контролем и соединением 1 продемонстрирована в модельных экспериментах на крысах линии Wistar при внутрижелудочном введении в дозе 100 мг/кг.The effectiveness of compound 2 compared with control and compound 1 was demonstrated in model experiments on Wistar rats with intragastric administration at a dose of 100 mg / kg.

Во всех примерах статистическая обработка результатов была осуществлена с помощью пакетов программ "BioStat" для Windows с применением t-критерия Стьюдента и критерия χ². Для оценки достоверности различий при сравнении средних величин использовали непараметрический критерий Манна-Уитни.In all examples, the statistical processing of the results was carried out using the BioStat software packages for Windows using the Student t-test and χ ² criterion. To assess the significance of differences when comparing average values, the nonparametric Mann-Whitney test was used.

Сущность изобретения поясняется примерами конкретного выполнения.The invention is illustrated by examples of specific performance.

Пример 1. Эксперименты проведены на 90 крысах-самках линии Wistar массой 190-210 г. Крысы были разделены на 3 группы по 30 животных в каждой. На модели тотальной транзиторной ишемии головного мозга по методу W.A. Pulsinelli, J.B. Brierley [1979] оценивались нейропротекторные эффекты. Для этого за 1 сутки до моделирования ишемии у наркотизированных крыс (тиопенталом-натрия 60 мг/кг, внутрибрюшинно) на уровне первого шейного позвонка производилось термокоагуляция обеих вертебральных артерий. Через 24 ч под эфирным наркозом на обе сонные артерии накладывались окклюдеры на 30 мин. Состоятельность модели оценивалось по побледнению видимой части сосудистой оболочки глаза, расширению зрачков, развитию гипервентиляции. Реперфузия проводилась снятием окклюдеров. Крысам контрольной группы вводилось внутрижелудочно 1 мл 1% крахмального геля, животным опытных групп - соединения 1 и 2 в дозе 100 мг/кг в 1 мл крахмального геля один раз в сутки в течение 7 суток. Первое введение осуществлялось через 1 ч после создания модели ишемии, последнее введение - за 1 ч до забора крови. В первые 2-5 ч после воспроизведения модели тотальной транзиторной ишемии головного мозга у крыс наблюдались наиболее тяжелые симптомы повреждения центральной нервной системы в виде арефлексии, судорог, спастического паралича конечностей, тонического напряжения мышц туловища, бокового положения. Оценку функционального состояния высшей нервной деятельности на 1-е, 4-е, 5-е и 7-е сутки после создания модели тотальной транзиторной ишемией головного мозга проводили по шкале Stroke-index [McGraw СР., 1977] по следующим показателям: спонтанная двигательная активность (нормальная, повышенная или сниженная, отсутствие), расстройства походки (скованность, шаткость, замедленность движений, нарушение ориентации), рефлексы отдергивания хвоста, обеих передних и задних лап, реакция на звук, тремор, судороги, тонус мышц туловища и конечностей (нормальный, повышенный, отсутствие), признаки птоза (отсутствие, односторонний, двусторонний). Каждый показатель оценивали в баллах: О баллов - норма; 1 балл - умеренно выраженные изменения; 2 балла - резко выраженные изменения. Неврологический дефицит животного оценивали суммой баллов по всем показателям. Кроме того, в каждой группе крыс определяли долю животных с тяжелыми неврологическими расстройствами (6 баллов и более), с нарушениями средней тяжести (3-5 баллов) и с легкими изменениями (до 2 баллов). Выживаемость животных регистрировали на 1-е, 4-и, 5-е и 7-е сутки после тотальной транзиторной ишемии головного мозга. По завершению экспериментов проводилась эвтаназия животных.Example 1. The experiments were performed on 90 female Wistar rats weighing 190-210 g. Rats were divided into 3 groups of 30 animals each. On the model of total transient cerebral ischemia according to the method of W.A. Pulsinelli, J.B. Brierley [1979] evaluated neuroprotective effects. For this, 1 day before the modeling of ischemia in anesthetized rats (thiopental sodium 60 mg / kg, ip), thermocoagulation of both vertebral arteries was performed at the level of the first cervical vertebra. 24 hours later, under ether anesthesia, occluders were applied to both carotid arteries for 30 minutes. The consistency of the model was assessed by blanching of the visible part of the choroid, expansion of the pupils, and development of hyperventilation. Reperfusion was carried out by the removal of occluders. 1 ml of 1% starch gel was administered intragastrically to rats of the control group, and compounds 1 and 2 at a dose of 100 mg / kg in 1 ml of starch gel were administered intragastrically once a day for 7 days. The first injection was carried out 1 hour after the creation of a model of ischemia, the last injection - 1 hour before blood sampling. In the first 2-5 hours after reproducing the model of total transient cerebral ischemia in rats, the most severe symptoms of damage to the central nervous system in the form of areflexia, seizures, spastic paralysis of the limbs, tonic tension of the muscles of the trunk, lateral position were observed. The functional state of higher nervous activity was assessed on the 1st, 4th, 5th and 7th days after the creation of the model with total transient cerebral ischemia using the Stroke-index scale [McGraw CP., 1977] according to the following indicators: spontaneous motor activity (normal, increased or decreased, absence), gait disorders (stiffness, unsteadiness, slow movement, disorientation), tail jerks, reflexes of the tail, both front and hind legs, reaction to sound, tremor, cramps, muscle tone of the trunk and extremities (normal Povy enny, lack of it), the symptoms of ptosis (no, one-sided, two-sided). Each indicator was evaluated in points: About points - the norm; 1 point - moderate changes; 2 points - pronounced changes. The neurological deficit of the animal was evaluated by the total score for all indicators. In addition, in each group of rats, the proportion of animals with severe neurological disorders (6 points or more), with moderate impairment (3-5 points) and with mild changes (up to 2 points) was determined. Animal survival was recorded on the 1st, 4th, 5th and 7th day after total transient cerebral ischemia. At the end of the experiments, animal euthanasia was performed.

Результаты исследований показывают, что в контроле в течение первых суток после тотальной транзиторной ишемии головного мозга погибло 30% крыс. В то же время у леченных животных соединениями 1 и 2, в первые сутки соответственно погибло 15 и 11% крыс, что было приблизительно в 2 раза ниже контрольного показателя (табл. 1). Несмотря на то, что средний балл неврологического дефицита у вышивших крыс всех групп достоверно не различался (табл. 2), отмечена отчетливая тенденция к уменьшению под влиянием соединений 1 и 2 количества животных с тяжелыми неврологическими нарушениями и соответствующее достоверное увеличение количества животных со средней степенью неврологического дефицита (табл. 2). При лечении соединением 2 отмечалось достоверное снижение уровня смертности крыс и неврологических нарушений по сравнению как с контролем, так и при применении соединения 1.Research results show that 30% of the rats died in the control during the first days after total transient cerebral ischemia. At the same time, in treated animals with compounds 1 and 2, on the first day, respectively, 15 and 11% of rats died, which was approximately 2 times lower than the control value (Table 1). Despite the fact that the average score of neurological deficit in embryo rats of all groups did not differ significantly (Table 2), there was a clear tendency to decrease under the influence of compounds 1 and 2 the number of animals with severe neurological impairment and a corresponding significant increase in the number of animals with an average degree of neurological deficit (table. 2). In the treatment with compound 2, there was a significant decrease in the mortality rate of rats and neurological impairment compared with both the control and the use of compound 1.

В контроле смертность крыс к четвертым суткам после тотальной транзиторной ишемии головного мозга достигала максимальных значений (45%), в течение последующего периода наблюдения летальность не увеличивалась. В опытных группах гибель животных к этому сроку была существенно ниже и не изменялась к 5-7-м суткам (табл. 1). Структура тяжести неврологических расстройств была сходной у выживших животных, получавших соединение 1 и контроля к 4-м суткам. У крыс, леченных соединением 2, было отмечено улучшение неврологических расстройств (табл. 2). Начиная с 4-х суток, у животных контрольной группы происходило снижение тяжести неврологической симптоматики. Однако восстановление неврологического статуса у крыс, леченных соединениями 1 и 2, происходило более высокими темпами. Так, к 5-м суткам средний балл неврологического дефицита в группах леченных соединениями 1 и 2 был соответственно в 1,6 и 2 раза ниже контроля, а к 7 суткам сохранялась тенденция к полному восстановлению функции центральной нервной системы.In the control, mortality of rats reached the maximum values (45%) by the fourth day after total transient cerebral ischemia (45%); during the subsequent observation period, mortality did not increase. In the experimental groups, the death of animals by this time was significantly lower and did not change by the 5-7th day (Table 1). The severity structure of neurological disorders was similar in surviving animals treated with compound 1 and control by day 4. In rats treated with compound 2, an improvement in neurological disorders was noted (Table 2). Starting from the 4th day, in the animals of the control group there was a decrease in the severity of neurological symptoms. However, the restoration of neurological status in rats treated with compounds 1 and 2 occurred at a faster pace. So, by the 5th day the average score of neurological deficit in the groups treated with compounds 1 and 2 was 1.6 and 2 times lower than the control, respectively, and by the 7th day the tendency to complete restoration of central nervous system function continued.

Таким образом, применение соединения 2 в терапии ишемического повреждения головного мозга в наибольшей степени по сравнению с соединением 1 снижает гибель животных и ускоряет восстановление неврологического статуса у вышивших животных.Thus, the use of compound 2 in the treatment of ischemic brain damage to the greatest extent compared with compound 1 reduces the death of animals and accelerates the restoration of neurological status in embroidered animals.

Пример 2. Исследование эндотелийпротекторной активности соединений 1 и 2 было проведено на моделях патологических состояний (неполной ишемии головного мозга и сахарного диабета).Example 2. A study of the endothelial protective activity of compounds 1 and 2 was carried out on models of pathological conditions (incomplete cerebral ischemia and diabetes mellitus).

Модель неполной ишемии головного мозга у наркотизированных (эфирный наркоз) крыс-самок линии Wistar воспроизводился путем полной окклюзии левой сонной артерии и ограничения кровотока по правой сонной артерии на 50% от исходного под контролем электромагнитного флоуметра. У ложнооперированных животных проводилось аналогичное оперативное вмешательство, но без перевязки сосудов. Раны были обработаны антисептиками и на них наложены швы.The model of incomplete cerebral ischemia in anesthetized (ether anesthesia) Wistar female rats was reproduced by complete occlusion of the left carotid artery and restriction of blood flow through the right carotid artery to 50% of the initial one under the control of an electromagnetic flowmeter. False-operated animals underwent a similar surgical intervention, but without vascular ligation. The wounds were treated with antiseptics and sutured.

Для оценки эндотелиальной дисфункции исследовалась эндотелийзависимая и эндотелийнезависимая реакция сосудов у крыс. Для этого у наркотизированных животных непрерывно регистрировалось системное артериальное давление (САД). Для измерения САД животным в правую сонную артерию имплантировали катетер, заполненной смесью физиологического раствора и гепарина. Эндотелийзависимую вазодилатация регистрировалась при болюсном внутривенном введении ацетилхолина (5 мкг/кг), эндотелийнезависимую вазодилатацию - при болюсном внутривенном введении нитропруссида натрия (30 мкг/кг). Ацетилхолин и нитропруссид натрия вводились в бедренную вену. Функциональное состояние эндотелия оценивалось с использованием коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД), рассчитываемого как отношение площадей под кривыми снижения артериального давления в ответ на внутривенное введение натрия нитропруссида и в ответ на внутривенное введение ацетилхолина [Тюренков И.Ю., Воронов А.В., 2008].To assess endothelial dysfunction, the endothelium-dependent and endothelium-independent vascular response in rats was studied. For this, anesthetized animals were continuously recorded systemic blood pressure (SBP). To measure SBP, a catheter filled with a mixture of saline and heparin was implanted into the right carotid artery. Endothelium-dependent vasodilation was recorded with bolus intravenous administration of acetylcholine (5 μg / kg), endothelium-independent vasodilation was recorded with bolus intravenous administration of sodium nitroprusside (30 μg / kg). Acetylcholine and sodium nitroprusside were injected into the femoral vein. The functional state of the endothelium was evaluated using the coefficient of endothelial dysfunction (QED), calculated as the ratio of the areas under the blood pressure reduction curves in response to the intravenous administration of sodium nitroprusside and in response to the intravenous administration of acetylcholine [Tyurenkov I.Yu., Voronov AV, 2008 ].

Эксперименты с воспроизведением модели неполной ишемии головного мозга проведены на крысах-самках линии Wistar массой 260-280 г. Были сформированы 5 групп животных по 10 в каждой. Группы крыс: интактная, контрольная, ложнооперированная и леченные соединением 1 и соединением 2. Животным контрольных, ложнооперированных и интактных групп вводился внутрижелудочно 1 мл крахмальной гели. Крысам, леченным соединениями 1 и 2, вводились препараты в дозе 100 мг/кг. Крахмальная гель и суспензия соединений 1 и 2 в крахмальном геле вводились животным один раз в сутки в течение 5 суток. Первое введение осуществлялось через 1 ч после создания модели неполной ишемии головного мозга. На 5-е сутки через 1 ч после последнего введения соединений 1 и 2 или крахмальной гели крысы были наркотизированы (тиопенталом-натрия 60 мг/кг, внутрибрюшинно) и проведена оценка функции эндотелия.Experiments with the reproduction of a model of incomplete cerebral ischemia were carried out on female Wistar rats weighing 260-280 g. 5 groups of animals were formed, 10 each. Rat groups: intact, control, pseudo-operated and treated with compound 1 and compound 2. Animals of the control, pseudo-operated and intact groups were administered intragastrically 1 ml of starch gel. Rats treated with compounds 1 and 2 were administered drugs at a dose of 100 mg / kg. The starch gel and a suspension of compounds 1 and 2 in the starch gel were administered to animals once a day for 5 days. The first injection was carried out 1 hour after the creation of a model of incomplete cerebral ischemia. On the 5th day, 1 hour after the last injection of compounds 1 and 2 or starch gel, the rats were anesthetized (thiopental sodium 60 mg / kg, intraperitoneally) and the endothelial function was evaluated.

Результаты проведенных исследований свидетельствуют, что в группе ложнооперированных крыс изменений эндотелийнезависимой и эндотелийзависимой вазодилатации по сравнению с интактными животными не выявлено, КЭД составил 2,1±0,2 (табл. 3). Следовательно, все наблюдаемые изменения в контроле и группах, леченных соединениями 1 и 2, не связаны с влиянием оперативного вмешательства. У ишемизированных крыс контрольной группы КЭД составил 3,4±0,4, что на 60% превышало значение в группе ложнооперированных крыс (табл. 3). Таким образом, неполная ишемия головного мозга у крыс сопровождалось эндотелиальной дисфункцией. Описанные изменения функции эндотелия с преимущественным нарушением эндотелийзависимой вазодилатации согласуются с данными о формировании эндотелиальной дисфункции при ишемическом и реперфузионном повреждении тканей головного мозга крыс. В группе крыс с ишемией головного мозга, леченных соединением 2, КЭД составил 1,9±0,2, что достоверно отличалось от контроля и группы, получавших соединение 1 и было аналогично ложнооперированным животным.The results of the studies indicate that in the group of false-operated rats, changes in endothelium-independent and endothelium-dependent vasodilation as compared with intact animals were not detected, QED was 2.1 ± 0.2 (Table 3). Therefore, all observed changes in the control and groups treated with compounds 1 and 2 are not associated with the influence of surgical intervention. In ischemic rats of the control group, the QED was 3.4 ± 0.4, which is 60% higher than the value in the group of false-operated rats (Table 3). Thus, incomplete cerebral ischemia in rats was accompanied by endothelial dysfunction. The described changes in endothelial function with a predominant violation of endothelium-dependent vasodilation are consistent with data on the formation of endothelial dysfunction in ischemic and reperfusion damage to rat brain tissue. In the group of rats with cerebral ischemia treated with Compound 2, the QED was 1.9 ± 0.2, which was significantly different from the control and the group treated with Compound 1 and was similar to false-operated animals.

Таким образом, при курсовом внутрижелудочном введении соединение 2 по сравнению с соединением 1 проявляет более высокую эндотелийпротекторную активность в условиях модели неполной ишемии головного мозга у крыс.Thus, in the course of intragastric administration, compound 2 exhibits higher endothelial protective activity compared to compound 1 under the conditions of the model of incomplete cerebral ischemia in rats.

Для создания модели сахарного диабета крысам-самкам линии Wistar однократно внутрибрюшинно вводился стрептозотоцин в дозе 60 мг/кг в цитратном буфере. В эксперимент отбирались животные с уровнем глюкозы в крови от 19 до 26 ммоль/л. Уровень глюкозы в цельной крови измерялся с помощью глюкометра (Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.).To create a model of diabetes mellitus, female rats of the Wistar strain were once intraperitoneally injected with streptozotocin at a dose of 60 mg / kg in citrate buffer. Animals with a blood glucose level of 19 to 26 mmol / L were selected for the experiment. Whole blood glucose levels were measured using a glucometer (Guidelines for preclinical studies of drugs. Part One. - M.: Grif and K, 2012. - 944 p.).

Оценка эндотелиальной дисфункции проведена в соответствии с методикой, изложенной в предыдущем разделе.Evaluation of endothelial dysfunction was carried out in accordance with the methodology described in the previous section.

Эксперименты с воспроизведением модели сахарного диабета проведены на крысах-самках линии Wistar массой 240-260 г. У 30 животных воспроизводилась модель сахарного диабета и через 1 месяц после инъекции стрептозотоцина были отобраны крысы в группы леченные соединением 1, соединением 2 и контроля с близким уровнем глюкозы в крови, находящимся в пределах от 19 до 26 ммоль/л. В течение последующего месяца ежедневно внутрижелудочно животным контрольной и интактной групп вводился крахмальный гель, крысам опытных групп - соединения 1 и 2 в дозе 100 мг/кг в крахмальном геле. Через 1 ч после последнего введения соединений 1 и 2 крысы были наркотизированы (тиопенталом-натрия 60 мг/кг, внутрибрюшинно) и проведена оценка функции эндотелия.Experiments with the reproduction of a model of diabetes mellitus were carried out on female Wistar rats weighing 240-260 g. In 30 animals, a diabetes mellitus model was reproduced and 1 month after injection of streptozotocin, rats were selected in the groups treated with compound 1, compound 2 and control with a similar glucose level in blood, ranging from 19 to 26 mmol / l. Over the next month, starch gel was administered intragastrically to animals of the control and intact groups, and compounds 1 and 2 were administered to the rats of the experimental groups at a dose of 100 mg / kg in starch gel. 1 h after the last administration of compounds 1 and 2, the rats were anesthetized (thiopental sodium 60 mg / kg, ip) and the endothelial function was evaluated.

Результаты исследований показали, что у крыс контрольной группы была выявлена эндотелиальная дисфункция. Об этом свидетельствовало достоверное увеличение КЭД в 1,5 раза по сравнению с интактными животными. Описанные изменения в контрольной группе животных согласуются с данными о наличии эндотелиальной дисфункции у больных сахарным диабетом и у животных с моделями данного заболевания. У животных, леченных соединением 2, КЭД был достоверно значимо в 1,6 и 1,2 соответственно ниже, чем в контроле и при применении соединения 1 в терапии сахарного диабета.The research results showed that endothelial dysfunction was detected in rats of the control group. This was evidenced by a significant increase in QED by 1.5 times in comparison with intact animals. The described changes in the control group of animals are consistent with data on the presence of endothelial dysfunction in patients with diabetes mellitus and in animals with models of this disease. In animals treated with compound 2, QED was significantly significantly 1.6 and 1.2 lower, respectively, than in the control and when using compound 1 in the treatment of diabetes mellitus.

Таким образом, при курсовом внутрижелудочном введении соединение 2 по сравнению с соединением 1 проявляет более высокую эндотелийпротекторную активность при сахарном диабете у крыс.Thus, with a course of intragastric administration, compound 2 exhibits higher endothelial protective activity in diabetes mellitus in rats compared to compound 1.

Пример 3. На модели диабетической ретинопатии оценивались ретинопротекторные эффекты соединений 1 и 2. Эксперименты проведены на 40 крысах-самках линии Wistar массой 220-250 г. Модель диабетической ретинопатии у крыс воспроизводилась путем однократного внутрибрюшинного введения стрептозотоцина в дозе 60 мг/кг массы тела. Уровень гипергликемии (свыше 18 ммоль/л), потеря массы тела, выраженность полиурии и полидипсии являлись критериями тяжести сахарного диабета. Через 30 суток после введения стрептозотоцина крысы были разделены на 3 группы. Крысам опытных групп с концентрацией глюкозы 21,8±2,5 (соединение 1) и 22,0±1,9 (соединение 2) ммоль/л ежедневно в течение 30 суток вводились внутрижелудочно соединения 1 и 2 в дозе 100 мг/кг массы тела, в виде суспензии в 1 мл крахмальной гели. Животным контрольной группы с концентрацией глюкозы 22,3±2,2 ммоль/л вводился такое же количество крахмальной гели по той же схеме. Группа интактных животных, находившихся в аналогичных условиях. Центральные отделы сетчаток крыс являлись материалом исследования, которые были отпрепарированы (через 60 суток после начала инъекции стрептозотоцина) сразу после эвтаназии эфирным наркозом животных. Центральные участки задней стенки глаза были фиксированы в 2,5% растворе глютаральдегида на 0,2 М какодилатном буфере (рН 7,4), после фиксированы в 2% растворе четырехокиси осмия и залиты в смесь смол эпон-аралдит. Полутонкие срезы были окрашены толуидиновым синим, ультратонкие контрастированы уранилацетатом и цитратом свинца, просмотрены и сфотографированы в электронном микроскопе. На полутонких срезах производен подсчет нейросенсорных клеток с пикнозом ядра на 1000 клеток с каждой сетчатки, гиперхромных и пикноморфных ассоциативных нейронов и радиальных глиоцитов, ганглионарных нейронов с тотальным, очаговым хроматолизом и пикноморфных на 200 клеток с каждой сетчатки. С использованием окулярной измерительной сетки Автандилова были высчитаны численная плотность ядер в наружном ядерном слое на площади 900 мкм², удельная площадь сосудов со стазом, сладжем и тромбозом, глионейрональный индекс.Example 3. On the model of diabetic retinopathy, the retinoprotective effects of compounds 1 and 2 were evaluated. The experiments were performed on 40 female Wistar rats weighing 220-250 g. The model of diabetic retinopathy in rats was reproduced by a single intraperitoneal administration of streptozotocin at a dose of 60 mg / kg body weight. The level of hyperglycemia (over 18 mmol / l), weight loss, the severity of polyuria and polydipsia were the criteria for the severity of diabetes. 30 days after the administration of streptozotocin, rats were divided into 3 groups. Compounds 1 and 2 were administered intragastrically to rats of experimental groups with a glucose concentration of 21.8 ± 2.5 (compound 1) and 22.0 ± 1.9 (compound 2) mmol / l daily for 30 days at a dose of 100 mg / kg body, in the form of a suspension in 1 ml of starch gel. Animals of the control group with a glucose concentration of 22.3 ± 2.2 mmol / L were injected with the same amount of starch gel according to the same scheme. A group of intact animals in similar conditions. The central sections of the rat retinas were the material of the study, which were prepared (60 days after the start of streptozotocin injection) immediately after euthanasia by ether anesthesia of animals. The central parts of the posterior wall of the eye were fixed in a 2.5% glutaraldehyde solution in 0.2 M cacodylate buffer (pH 7.4), after which they were fixed in a 2% solution of osmium tetroxide and poured into a mixture of epon-araldite resins. Semi-thin sections were stained with toluidine blue, ultra-thin sections were contrasted with uranyl acetate and lead citrate, viewed and photographed using an electron microscope. Semi-thin sections counted neurosensory cells with pycnosis of the nucleus per 1000 cells from each retina, hyperchromic and pycnomorphic associative neurons and radial gliocytes, ganglionic neurons with total, focal chromatolysis and pycnomorphic 200 cells from each retina. Using Avtandilov’s ocular measuring grid, the numerical density of the nuclei in the outer nuclear layer on an area of 900 μm ² , the specific area of the vessels with stasis, sludge and thrombosis, and the gleoneuronal index were calculated.

Результаты проведенных исследований свидетельствуют, что после развития стрептозотоцинового диабета в сетчатках животных отмечаются морфологические признаки дегенерации всех структурных компонентов сетчатки. Деструктивные изменения нейросенсорных клеток выражаются в появлении перикарионов различного размера, деформации ядер, между которыми разрастаются гипертрофированные склеральные отростки радиальной глии. Наблюдается смещение одиночных ядер нейросенсорных клеток в фотосенсорный и наружный сетчатый слои. Количественный анализ показал трехкратное увеличение процента нейросенсорных клеток с пикнозом ядра, характеризующихся повышением осмиофилии ядра и цитоплазмы, и снижение в 1,56 раз плотности распределения ядер нейросенсорных клеток в наружный ядерный слой по отношению к интактному контролю (табл. 5). Изменения ассоциативных нейронов носят реактивный характер. При стрептозотоциновом диабете у крыс контрольной группы наблюдалось увеличение процента гиперхромных нейронов по сравнению с интактным контролем (табл. 6). Дегенерации мультиполярных нейронов при длительной гипергликемии на фоне стрептозотоцинового диабета характеризуются в основном различной степени выраженности хроматолизом. В контрольной группе в первую очередь отмечены хроматолитические изменения ганглионарных нейронов (табл. 7): повышение уровня нейронов с очаговым и тотальным хроматолизом в 6-7 раз по отношению к интактному контролю, при этом количество пикноморфных нейронов возрастает в 3,8 раза. При длительной гипергликемии у крыс контрольной группы были выявлены деструктивные процессы в радиальных глиоцитах, что выражалось повышением электронной плотности цитоплазмы и ядра. Количество пикноморфных радиальных глиоцитов относительно значений интактного контроля увеличивается, что сопровождается снижением глионейронального индекса (табл. 8). В контрольной группе отмечались выраженные расстройства микроваскуляризации, характеризующиеся достоверным увеличением по сравнению с интактным контролем удельной площади хориоидальных сосудов со сладжем и стазом форменных элементов (табл. 9).The results of the studies indicate that after the development of streptozotocin diabetes in the retinas of animals, morphological signs of degeneration of all structural components of the retina are noted. Destructive changes in neurosensory cells are expressed in the appearance of pericarions of various sizes, nuclear deformations, between which hypertrophied scleral processes of radial glia grow. A shift of single nuclei of neurosensory cells to the photosensory and external reticular layers is observed. Quantitative analysis showed a three-fold increase in the percentage of neurosensory cells with pycnosis of the nucleus, characterized by an increase in osmiophilia of the nucleus and cytoplasm, and a 1.56-fold decrease in the density distribution of the nuclei of neurosensory cells in the outer nuclear layer relative to the intact control (Table 5). Changes in associative neurons are reactive in nature. In streptozotocin diabetes, in rats of the control group, an increase in the percentage of hyperchromic neurons was observed compared with the intact control (Table 6). Degeneration of multipolar neurons with prolonged hyperglycemia in the presence of streptozotocin diabetes is characterized mainly by varying degrees of chromatolysis. In the control group, chromatolytic changes in ganglionic neurons were first noted (Table 7): an increase in the level of neurons with focal and total chromatolysis by 6–7 times with respect to the intact control, while the number of pycnomorphic neurons increased by 3.8 times. With prolonged hyperglycemia in rats of the control group, destructive processes in radial gliocytes were revealed, which was expressed by an increase in the electron density of the cytoplasm and nucleus. The number of pycnomorphic radial gliocytes relative to the values of intact control increases, which is accompanied by a decrease in the glyoneuronal index (Table 8). In the control group, pronounced microvascularization disorders were noted, characterized by a significant increase compared with the intact control of the specific area of choroid vessels with sludge and stasis of shaped elements (Table 9).

Лечение соединением 2 более эффективно предотвращает деструкцию нейросенсорных клеток, что выражается в снижении процента пикнотичных ядер нейронов до значений интактного контроля и повышении количества рядов ядер относительно контрольной группы и группы крыс, леченных соединением 1 (табл. 5). Вместе с тем плотность распределения ядер нейросенсорных клеток в наружном ядерном слое остается сниженным, что связано, вероятно, пролиферативно-прогрессивной реакцией радиальной глии в виде пролиферации и гипертрофии склеральных отростков. Введение соединения 2 в отличие от соединения 1 способствовало полной сохранности нейронов внутреннего ядерного слоя от повреждающего действия стойкой длительной гипергликемии, что выражалось в отсутствии достоверных различий по всем показателям деструкции ассоциативных нейронов крыс леченных соединением 2 и интактной групп (табл. 6). Внутрижелудочное введение соединения 2 оказывало положительное влияние на состояние ганглионарных нейронов сетчатки, причем процент нейронов с тотальным и очаговым хроматолизом снижалось относительно значений контрольной группы и группы животных леченных соединением 1, оставаясь при этом все же достоверно выше значений интактного контроля (табл. 7). Также при введении крысам соединения 2 отмечалось полное восстановление всех показателей деструкции радиальных глиоцитов (табл. 8). Так, процент пикноморфных радиальных глиоцитов снижался при этом глионейрональный индекс возрастал по отношению как к контрольным значениям, так и значениям группы крыс леченных соединением 1. При введении животным соединения 2 отмечалось значительное улучшение гемодинамики, что выражалось в достоверном снижении удельной площади сосудов со стазом, сладжем и тромбозом по сравнению с аналогичными показателями крыс контроля и леченных соединением 1 (табл. 9).Compound 2 treatment more effectively prevents the destruction of neurosensory cells, which is reflected in a decrease in the percentage of pyknotic nuclei of neurons to intact control values and an increase in the number of rows of nuclei relative to the control group and the group of rats treated with compound 1 (Table 5). At the same time, the density distribution of the nuclei of neurosensory cells in the outer nuclear layer remains reduced, which is probably due to the proliferative-progressive reaction of radial glia in the form of proliferation and hypertrophy of scleral processes. The introduction of compound 2, unlike compound 1, contributed to the complete preservation of neurons of the inner nuclear layer from the damaging effects of persistent prolonged hyperglycemia, which was expressed in the absence of significant differences in all indicators of destruction of associative rat neurons treated with compound 2 and the intact group (Table 6). Intragastric administration of compound 2 had a positive effect on the state of retinal ganglion neurons, and the percentage of neurons with total and focal chromatolysis decreased relative to the values of the control group and the group of animals treated with compound 1, while remaining significantly higher than the values of intact control (Table 7). Also, when rats were administered with compound 2, complete restoration of all indicators of the destruction of radial gliocytes was noted (Table 8). Thus, the percentage of pycnomorphic radial gliocytes decreased while the gloneuronal index increased in relation to both the control values and the values of the group of rats treated with compound 1. When animals were administered with compound 2, a significant improvement in hemodynamics was observed, which was expressed in a significant decrease in the specific area of vessels with stasis, sludge and thrombosis compared with the same indicators of control rats and treated with compound 1 (table. 9).

Таким образом, курсовое лечение соединением 2 в дозе 100 мг/кг по сравнению с соединением 1 в течение 30 суток крысам с диабетической ретинопатией, развившейся на фоне стрептозотоцинового диабета, оказывало более выраженный ретинопротекторный эффект, приводя к снижению выраженности деструкции всех структурных компонентов сетчатки. Соединение 2 в отличие от соединения 1 обладает достоверно более высокой ретинопротекторной активностью.Thus, a course of treatment with compound 2 at a dose of 100 mg / kg compared with compound 1 for 30 days in rats with diabetic retinopathy that developed against streptozotocin diabetes had a more pronounced retinoprotective effect, leading to a decrease in the severity of destruction of all structural components of the retina. Compound 2, unlike compound 1, has a significantly higher retinoprotective activity.

Пример 4. Влияние соединений 1 и 2 при однократном парентеральном и трехкратном внутрижелудочном введении крысам на мозговой кровоток исследовалось путем регистрации в сонной артерии скорости тока крови с помощью электромагнитного расходомера.Example 4. The effect of compounds 1 and 2 with a single parenteral and triple intragastric administration to rats on cerebral blood flow was studied by recording the velocity of blood flow in the carotid artery using an electromagnetic flow meter.

Эксперименты по изучению влияния однократного парентерального введения соединений 1 и 2 на динамику мозгового кровотока (МК) и системного артериального давления (САД) проведены на 26 крысах-самцах линии Wistar массой 340-360 г. Были сформированы 3 группы животных. Животным контрольной группы (n=8) подкожно был введен 1 мл кремофора. Крысам опытных групп (n=18) подкожно были введены соединения 1 и 2 в дозе 100 мг/кг в виде раствора в 1 мл кремофора.Experiments to study the effect of a single parenteral administration of compounds 1 and 2 on the dynamics of cerebral blood flow (MK) and systemic blood pressure (CAD) were performed on 26 male Wistar rats weighing 340-360 g. 3 groups of animals were formed. Animals of the control group (n = 8) were injected subcutaneously with 1 ml of cremophor. Compounds 1 and 2 were administered subcutaneously to rats of the experimental groups (n = 18) at a dose of 100 mg / kg as a solution in 1 ml of cremophor.

У наркотизированных крыс (тиопенталом-натрия 60 мг/кг, внутрибрюшинно) были отпрепарированы правая бедренная артерия и имплантирован катетер для измерения системного артериального давления. Левая общая сонная артерия была отпрепарирована и перевязана наружная сонная артерия. На общую сонную артерию был наложен манжеточный датчик, и регистрировалась величина мозгового кровотока с помощью электромагнитного расходомера крови.In anesthetized rats (thiopental sodium 60 mg / kg, intraperitoneally), the right femoral artery was dissected and a catheter was implanted to measure systemic blood pressure. The left common carotid artery was dissected and the external carotid artery was ligated. A cuff sensor was placed on the common carotid artery, and cerebral blood flow was recorded using an electromagnetic blood flow meter.

Эксперименты по изучению влияния трехкратного внутрижелудочного введения соединений 1 и 2 на мозговой кровоток был проведен на 18 крысах-самцах линии Wistar массой 250-280 г. Были сформированы 3 группы животных. Крысам контрольной группы (n=6) вводился внутрижелудочно ежедневно однократно в течение 3 суток эквиобъемное количество крахмальной гели. Животным опытных групп внутрижелудочно ежедневно однократно в течение 3 суток были введены соединения 1 (n=6) и 2 (n=6) в дозе 100 мг/кг в крахмальном геле. На 3-и сутки эксперимента через 1 ч после последнего введения были проведены измерения мозгового кровотока у крыс.Experiments to study the effect of triple intragastric administration of compounds 1 and 2 on cerebral blood flow were carried out on 18 male Wistar rats weighing 250-280 g. 3 groups of animals were formed. The rats of the control group (n = 6) were injected intragastrically once daily for 3 days with an equivalent volume of starch gel. Compounds 1 (n = 6) and 2 (n = 6) were administered intragastrically to the animals of the experimental groups once daily for 3 days at a dose of 100 mg / kg in starch gel. On the 3rd day of the experiment, 1 hour after the last injection, measurements of cerebral blood flow in rats were performed.

Результаты проведенных исследований свидетельствуют, что в контроле при однократном парентеральном (подкожном) введении кремафора крысам уровень МК в течение 1 ч был стабильным, в последующие 30 мин измерения выявлена незначительная тенденция к снижению мозгового кровотока. При этом отмечена тенденция к снижению САД в течение проведения измерения, что, очевидно, связано с условиями опыта (наличие операционной травмы и использование наркоза) (табл. 10). При внутрижелудочном трехдневном введении крахмального геля у животных контрольной группы значение мозгового кровотока составляло 5,9±0,5 мл/мин (табл. 11).The results of the studies indicate that in the control with a single parenteral (subcutaneous) administration of cremaphore to rats, the MK level for 1 h was stable, in the next 30 minutes of measurement, there was a slight tendency to a decrease in cerebral blood flow. At the same time, there was a tendency towards a decrease in the SBP during the measurement, which is obviously related to the experimental conditions (the presence of surgical trauma and the use of anesthesia) (Table 10). With a three-day intragastric administration of starch gel in animals of the control group, the value of cerebral blood flow was 5.9 ± 0.5 ml / min (Table 11).

Подкожное введение масляного раствора соединений 1 и 2 крысам способствовало, начиная с 5 мин измерения и до конца наблюдения значимому повышению МК. В период с 45 до 90 мин эксперимента значения МК у крыс, леченных соединением 2, достоверно были выше величин этого показателя в группах контроля и леченных соединением 1. При этом по уровню САД в течение всего периода наблюдения достоверных различий между группами животных не выявлено (табл. 10).Subcutaneous administration of an oil solution of compounds 1 and 2 to rats contributed, from the 5th minute of measurement to the end of the observation, a significant increase in MK. In the period from 45 to 90 min of the experiment, the MK values in rats treated with compound 2 were significantly higher than the values of this indicator in the control groups and treated with compound 1. Moreover, no significant differences between the groups of animals were revealed by the level of SBP during the entire observation period (table . 10).

При курсовом внутрижелудочном введении крысам соединения 2 в дозе 100 мг/кг значение мозгового кровотока составляло 8,9±0,4 мл/мин, что было, соответственно, на 47 и 22% выше, чем показатель контрольной группы и животных леченных соединением 1 (табл. 11).In the course of intragastric administration to rats of compound 2 at a dose of 100 mg / kg, the value of cerebral blood flow was 8.9 ± 0.4 ml / min, which was, respectively, 47 and 22% higher than the indices of the control group and animals treated with compound 1 ( table 11).

Таким образом, подкожное введение масляного раствора соединения 2 в дозе 100 мг/кг повышает более значимо по сравнению с контролем и животными леченными соединением 1 мозговой кровоток, не вызывая снижение системного артериального давления. Трехкратное внутрижелудочное введение соединения 2 в дозе 100 мг/кг вызывает значимое увеличение мозгового кровотока и по выраженности эффекта превосходит соединение 1. Предлагаемое изобретение расширяет арсенал средств, способных увеличивать мозговой кровоток.Thus, subcutaneous administration of an oil solution of compound 2 at a dose of 100 mg / kg increases cerebral blood flow more significantly compared to the control and animals treated with compound 1, without causing a decrease in systemic blood pressure. Three intragastric administration of compound 2 at a dose of 100 mg / kg causes a significant increase in cerebral blood flow and in terms of severity of effect exceeds compound 1. The present invention expands the arsenal of agents that can increase cerebral blood flow.

Пример 5. Исследование гемореологической, антитробоцитарной и антитромбогенной активностей соединений 1 и 2 было проведено на моделях гипервязкости крови ех vivo, внутрисосудистого тромбоза у крыс.Example 5. The study of hemorheological, antitrobocytic and antithrombogenic activities of compounds 1 and 2 was carried out on ex vivo blood hyperviscosity models, intravascular thrombosis in rats.

Эксперименты по изучению гемореологических свойств соединений 1 и 2 были проведены на 20 крысах-самцах линии Wistar массой 270-290 г. Крысы были рандомизированы на 4 группы по 5 животных в каждой. Крысам контрольной группы вводился крахмальный гель, животные опытных групп - пентоксифиллин (400 мг/кг) или соединения 1 и 2 (100 мг/кг). Препараты и эквиобъемное количество крахмальной гели (2 мл) вводили внутрижелудочно через зонд за один час до забора крови.Experiments to study the hemorheological properties of compounds 1 and 2 were carried out on 20 male Wistar rats weighing 270-290 g. Rats were randomized into 4 groups of 5 animals each. The rats of the control group were injected with starch gel, the animals of the experimental groups - pentoxifylline (400 mg / kg) or compounds 1 and 2 (100 mg / kg). The preparations and the equivolume amount of starch gel (2 ml) were administered intragastrically through a probe one hour before blood sampling.

Значения вязкости крови и агрегации эритроцитов оценивалось в пробах крови сразу после взятия и через 1 ч после инкубации крови при температуре 20,0±0,4°C. Кровь забиралось из общей сонной артерии под эфирным наркозом. В качестве антикоагулянта был использован 3,8% раствор цитрата натрия в соотношении с кровью 1:9. Вязкость крови была измерена на ротационном вискозиметре в диапазоне скоростей сдвига от 5 до 300 с^-1 до и после инкубации образцов при температуре 20,0±0,4°C в течение 60 мин.Blood viscosity and erythrocyte aggregation were evaluated in blood samples immediately after collection and 1 h after blood incubation at a temperature of 20.0 ± 0.4 ° C. Blood was drawn from the common carotid artery under ether anesthesia. As an anticoagulant, a 3.8% solution of sodium citrate was used in a ratio of 1: 9 with blood. Blood viscosity was measured on a rotational viscometer in the range of shear rates from 5 to 300 s ^-1 before and after incubation of the samples at a temperature of 20.0 ± 0.4 ° C for 60 min.

В этой же серии экспериментов спонтанная агрегация эритроцитов исследовалось с помощью силлектометрического метода. Критерием агрегационной активности эритроцитов являлся полупериод агрегации Т_1/2 - время, за которое величина фотометрического сигнала снижается в два раза.In the same series of experiments, spontaneous aggregation of erythrocytes was studied using the sillectometric method. The criterion for the aggregation activity of erythrocytes was the half-period of aggregation T _1/2 - the time during which the value of the photometric signal is reduced by half.

Исходные значения вязкости крови животных контрольной группы при скоростях сдвига от 5 до 300 с^-1 находились в диапазоне от 8,3±0,1 до 4,5±0,1 мПа с. Инкубирование данных образцов крови в течение 60 мин при температуре 20,0±0,4°C приводило к значимому (на 16-31%) повышению вязкости крови. Пентоксифиллин вызывал достоверное по сравнению с контролем понижение вязкости крови на низких скоростях сдвига до инкубации. После инкубации отмечалось повышение вязкости крови во всем исследуемом диапазоне скоростей сдвига, однако значения этого показателя были достоверно ниже по сравнению со значениями в контрольной группе. Следовательно, внутрижелудочное введение пентоксифиллина крысам улучшало исходные гемореологические показатели на низких скоростях сдвига и замедляло развитие «гипервязкости» крови в условиях in vitro. Соединение 2 по сравнению с контролем и соединением 1 оказывал выраженное влияние на вязкость крови. У животных, леченных соединением 2 по сравнению с контролем и группой животных с введением соединения 1, сразу после взятия крови выявлено достоверное снижение вязкости крови как на низких скоростях сдвига, так и после инкубации на высоких скоростях сдвига (табл. 12).The initial values of the blood viscosity of animals of the control group at shear rates from 5 to 300 s ^-1 were in the range from 8.3 ± 0.1 to 4.5 ± 0.1 mPa s. Incubation of these blood samples for 60 min at a temperature of 20.0 ± 0.4 ° C led to a significant (16-31%) increase in blood viscosity. Pentoxifylline caused a significant decrease in blood viscosity compared to control at low shear rates before incubation. After incubation, an increase in blood viscosity was observed in the entire studied range of shear rates, however, the values of this indicator were significantly lower compared to the values in the control group. Consequently, intragastric administration of pentoxifylline to rats improved the initial hemorheological parameters at low shear rates and slowed the development of “hyperviscosity” in blood in vitro. Compound 2 compared with control and compound 1 had a pronounced effect on blood viscosity. In animals treated with compound 2 compared with the control and the group of animals with the introduction of compound 1, immediately after blood collection, a significant decrease in blood viscosity was revealed both at low shear rates and after incubation at high shear rates (Table 12).

Исходные значения агрегации эритроцитов между группами существенно не отличались. Инкубация крови крыс контрольной группы приводила к возрастанию агрегации эритроцитов на 37%. Введение пентоксифиллина предотвращало ускорение агрегации эритроцитов при инкубации. Внутрижелудочное введение крысам соединения 2 замедляло агрегацию эритроцитов при инкубации крови, что выразилось в достоверном повышении полупериода агрегации эритроцитов по сравнению с контролем и соединением 1 на 55% и 22% соответственно (табл. 13).The initial values of red blood cell aggregation between groups did not differ significantly. Incubation of the blood of rats in the control group led to an increase in red blood cell aggregation by 37%. The introduction of pentoxifylline prevented the acceleration of red blood cell aggregation during incubation. The intragastric administration of compound 2 to rats slowed down the aggregation of red blood cells during blood incubation, which resulted in a significant increase in the half-life of erythrocyte aggregation compared to control and compound 1 by 55% and 22%, respectively (Table 13).

Таким образом, соединение 2 способно ограничивать развитие гипервязкости крови и повышение агрегации эритроцитов ex vivo. Эффект соединения 2 по выраженности выше, чем эффект соединения 1 и сопоставим с пентоксифиллином.Thus, compound 2 is able to limit the development of blood hyperviscosity and increase ex vivo red blood cell aggregation. The effect of compound 2 is more pronounced than the effect of compound 1 and is comparable to pentoxifylline.

Эксперименты по изучению антитромбоцитарной активности соединений 1 и 2 были проведены 20 крысах-самцах линии Wistar массой 300-320 г, которые Крысы были разделены на 4 группы (по 5 особей в каждой). За час до взятия крови животным опытных групп вводился пентоксифиллин (400 мг/кг) или соединения 1 и 2 (100 мг/кг). Крысам контрольной группы вводился эквиобъемные количества крахмальной гели. Кровь была взята из общей сонной артерии под эфирным наркозом. В качестве антикоагулянта был использован 3,8% раствор цитрата натрия в соотношении с кровью 1:9. Агрегация тромбоцитов определялась нефелометрическим методом. По стандартному методу были получены богатая (БТП) и бедная (БеТП) тромбоцитами плазма и подсчитывалось число тромбоцитов. После определения числа тромбоцитов в БТП была проведена стандартизация числа тромбоцитов, для чего БТП разводилось необходимым количеством БеТП до 400±27 тыс.тромбоцитов в 1 мм³ в пробе. Для оценки антитромбоцитарного эффекта сосудистой стенки были использованы БТП и БеТП интактных крыс-доноров. Агрегация тромбоцитов оценивалось в стандартизованной плазме на приборе, агрегатограммы регистрировали с помощью самописца. После добавления индуктора агрегации регистрировалось изменение уровня оптической плотности БТП. В качестве критерия агрегационной активности тромбоцитов был использован показатель степени агрегации (в %), характеризуемый изменением оптической плотности БТП после добавления в кювету индуктора агрегации. При этом за 100% принимали величину оптической плотности БеТП, а за 0% - величину оптической плотности БТП. В качестве индуктора агрегации использовали АДФ в конечной концентрации 4·10^-6 М.Experiments to study the antiplatelet activity of compounds 1 and 2 were carried out on 20 male Wistar rats weighing 300-320 g, which Rats were divided into 4 groups (5 animals each). An hour before blood collection, the animals of the experimental groups were injected with pentoxifylline (400 mg / kg) or compounds 1 and 2 (100 mg / kg). Equivolume amounts of starch gel were administered to rats of the control group. Blood was taken from the common carotid artery under ether anesthesia. As an anticoagulant, a 3.8% solution of sodium citrate was used in a ratio of 1: 9 with blood. Platelet aggregation was determined by the nephelometric method. By the standard method, rich (BTP) and poor (BeTP) platelets were obtained, and platelet counts were calculated. After determining the platelet count in BTP, platelet count was standardized, for which BTP was diluted with the required amount of BeTP to 400 ± 27 thousand platelets in 1 mm ³ in the sample. To evaluate the antiplatelet effect of the vascular wall, BTP and BeTP of intact donor rats were used. Platelet aggregation was evaluated in a standardized plasma on the instrument, aggregatograms were recorded using a recorder. After the addition of the aggregation inducer, a change in the optical density level of BTP was recorded. An indicator of the degree of aggregation (in%), characterized by a change in the optical density of BTP after adding an aggregation inducer to the cuvette, was used as a criterion for platelet aggregation activity. At the same time, the optical density of BeTP was taken as 100%, and the optical density of BTP was taken as 0%. ADP in a final concentration of 4 · 10 ^-6 M was used as an aggregation inducer.

Результаты проведенных исследований показали, что у животных контрольной группы амплитуда агрегации тромбоцитов, индуцированная АДФ в конечной концентрации 4·10^-6 М, составила 29±2%. Амплитуда АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов после введения пентоксифиллина была достоверно ниже аналогичного показателя в контрольной группе. После введения соединения 2 амплитуда агрегации тромбоцитов также была значимо достоверно ниже показателей в контрольной группе и группе с введением соединения 1 (табл. 14).The results of the studies showed that in animals of the control group the amplitude of platelet aggregation induced by ADP at a final concentration of 4 · 10 ^-6 M was 29 ± 2%. The amplitude of ADP-induced platelet aggregation after administration of pentoxifylline was significantly lower than that in the control group. After administration of compound 2, the amplitude of platelet aggregation was also significantly significantly lower than in the control group and the group with the introduction of compound 1 (table. 14).

Таким образом, соединение 2 по сравнению с соединением 1 обладает выраженным влиянием на сосудисто-тромбоцитарный гемостаз. Антитромбогенная активность соединения 2 может быть обусловлена как антитромбоцитарными, так и эндотелийпротекторными свойствами.Thus, compound 2 in comparison with compound 1 has a pronounced effect on vascular platelet hemostasis. The antithrombogenic activity of compound 2 can be due to both antiplatelet and endothelial protective properties.

Опыты по исследованию антитромбогенной активности соединений 1 и 2 были проведены на 24 крысах-самцах линии Wistar массой 260-280 г. Были сформированы 4 группы по 6 животных в каждой. Животным контрольной группы вводился крахмальный гель. Крысам опытных групп соответственно вводились пентоксифиллин (400 мг/кг), соединения 1 и 2 (100 мг/кг). Соединения и эквиобъемное количество крахмальной гели (2 мл) вводились внутрижелудочно через зонд 1 раз в день в течение 5 суток. На 5-е сутки эксперимента, через 1 ч после последнего введения животные были наркотизированы (тиопентал натрия в дозе 60 мг/кг, внутрибрюшинно), выделена левая общая сонная артерия и воспроизведена модель внутрисосудистого тромбоза. На отпрепарированную сонную артерию были наложены манжеточные датчики, и регистрировалась величина кровотока по сосуду с помощью электромагнитного расходомера крови. Далее под сонную артерию была подложена полоски фильтровальной бумаги и полиэтиленовой пленки. На эту артерию сверху накладывалась полоска фильтровальной бумаги, на которую была нанесена 1 капля 10% раствора FeCl₂. Измерения величины кровотока в артерии проводились от момента нанесения хлорида железа на левую сонную артерию до полной остановки кровотока в ней (время образования тромба). Расчет снижения кровотока относительно исходной величины кровотока был выражен в процентах. Масса тромба оценивалась гравиметрическим методом.Experiments to study the antithrombogenic activity of compounds 1 and 2 were carried out on 24 male Wistar rats weighing 260-280 g. 4 groups of 6 animals each were formed. The animals in the control group were injected with starch gel. Pentoxifylline (400 mg / kg), compounds 1 and 2 (100 mg / kg) were respectively administered to rats of the experimental groups. Compounds and the equivolume amount of starch gel (2 ml) were administered intragastrically through a probe 1 time per day for 5 days. On the 5th day of the experiment, 1 hour after the last injection, the animals were anesthetized (sodium thiopental at a dose of 60 mg / kg, intraperitoneally), the left common carotid artery was isolated, and the model of intravascular thrombosis was reproduced. Cuff sensors were placed on the prepared carotid artery, and the blood flow through the vessel was recorded using an electromagnetic blood flow meter. Then under the carotid artery was placed strips of filter paper and plastic film. A strip of filter paper was superimposed on this artery from above, on which 1 drop of a 10% solution of FeCl ₂ was applied. Measurements of the amount of blood flow in the artery were carried out from the moment of application of iron chloride on the left carotid artery to a complete stop of blood flow in it (thrombus formation time). The calculation of the decrease in blood flow relative to the initial value of blood flow was expressed as a percentage. The mass of the thrombus was estimated by gravimetric method.

У животных контрольной группы после воздействия на сосудистую стенку раствором FeCl₂ происходило полное прекращение кровотока по сосуду. Среднее время полной остановки кровотока до нуля составило 22±1 мин. Масса тромба, определяемая через сутки после аппликации хлорида железа, составила 1,40±0,1 мг (табл. 15). При курсовом внутрижелудочном введении крысам пентоксифиллина зарегистрировано снижение кровотока на 28% от исходного значения к 90-й мин эксперимента. На следующие сутки в просвете сонных артерий у крыс этой группы тромбов не обнаружено. Применение пентоксифиллина уменьшает тромбообразование в зоне стеноза. Курсовое внутрижелудочное введение животным соединения 2 предотвращало прекращение кровотока после аппликации раствором FeCl₂. К 90-й мин эксперимента у крыс, леченных соединением 2, было отмечено снижение кровотока на 9%. Введение соединения 2 полностью препятствовало тромбообразованию в сонной артерии на следующие сутки после аппликации раствором FeCl₂. По антитромбогенной активности соединение 2 существенно превосходило соединение 1.In animals of the control group after exposure to the vascular wall with a solution of FeCl ₂ there was a complete cessation of blood flow through the vessel. The average time to completely stop blood flow to zero was 22 ± 1 min. The mass of the thrombus, determined one day after the application of iron chloride, was 1.40 ± 0.1 mg (Table 15). During the course of intragastric administration of pentoxifylline to rats, a decrease in blood flow by 28% from the initial value was recorded by the 90th minute of the experiment. The next day in the lumen of the carotid arteries in rats of this group of blood clots was not found. The use of pentoxifylline reduces thrombus formation in the stenosis zone. The course intragastric administration of compound 2 to animals prevented the cessation of blood flow after application with a solution of FeCl ₂ . By the 90th minute of the experiment, rats treated with compound 2 showed a decrease in blood flow by 9%. The introduction of compound 2 completely prevented thrombosis in the carotid artery the next day after application with a solution of FeCl ₂ . In terms of antithrombogenic activity, compound 2 significantly exceeded compound 1.

Таким образом, соединение 2 по сравнению с соединением 1 обладает выраженной антитромбогенной активностью.Thus, compound 2 in comparison with compound 1 has a pronounced antithrombogenic activity.

Пример 6. Изучение противоишемической и противоаритмической активности соединений 1 и 2 выполнено согласно Руководству по проведению доклинических исследований лекарственных средств (Часть первая. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.) на модели ишемии и реперфузии миокарда у крыс, которая рекомендована для воспроизведения ишемии и аритмий желудочкового типа.Example 6. The study of anti-ischemic and anti-arrhythmic activity of compounds 1 and 2 was performed according to the Guidelines for preclinical studies of drugs (Part One. - M .: Grif and K, 2012. - 944 p.) On rat myocardial ischemia and reperfusion model, which Recommended for the reproduction of ischemia and ventricular arrhythmias.

Эксперименты проведены на 66 крысах-самцах линии Wistar массой 260-280 г. Крысы были рандомизированы в 3 группы. Крысам опытных групп соответственно вводились соединения 1 и 2 в дозе 100 мг/кг в виде суспензии на 1% крахмальном геле (2 мл) внутрижелудочно через зонд 1 раз в день в течение 3 суток до и 3 суток после создания модели. Животным контрольной группы вводилось эквиобъемное количество крахмального геля по аналогичной схеме.The experiments were performed on 66 Wistar male rats weighing 260-280 g. Rats were randomized into 3 groups. Compounds 1 and 2, respectively, were administered to rats of the experimental groups at a dose of 100 mg / kg in the form of a suspension on a 1% starch gel (2 ml) intragastrically through a probe 1 time per day for 3 days before and 3 days after model creation. The animals of the control group were injected with an equivalent volume of starch gel according to a similar scheme.

Соединения 1 и 2 были исследованы с помощью электрокардиографического (ЭКГ) и морфологического методов. Для воспроизведения модели животные были наркотизированы тиопенталом натрия (60 мг/кг, внутрибрюшинно), интубированы и подключены к аппарату искусственной вентиляции легких. После проведения торако- и перикардотомии была проведена окклюзия левой коронарной артерии на уровне нижнего края auricula sinistra без нарушения топографии сердца в грудной клетке по методу Когана [Коган А.Х. Хирургический метод моделирования коронароокклюзионного инфаркта и аневризма сердца у крыс // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 1979. №3. с. 79-81]. Длительность окклюзии левой коронарной артерии составляла 20 мин, после чего лигатуру развязывалась и осуществлялась постишемическая реперфузия. В течение периода ишемии и 10 мин реперфузии проводилось мониторирование ЭКГ во II стандартном отведении с помощью компьютерного электрокардиографа. Верификацию правильности наложения лигатуры и адекватность модели отслеживалось по степени изменения высоты ST-сегмента на ЭКГ. У ложнооперированных животных проводилось аналогичное оперативное вмешательство без наложения лигатур на левую коронарную артерию.Compounds 1 and 2 were investigated using electrocardiographic (ECG) and morphological methods. To reproduce the model, the animals were anesthetized with sodium thiopental (60 mg / kg, intraperitoneally), intubated, and connected to a ventilator. After thoraco- and pericardotomy, occlusion of the left coronary artery was performed at the level of the lower edge of auricula sinistra without disturbing the topography of the heart in the chest by the method of Kogan [Kogan A.Kh. The surgical method for modeling coronary occlusion infarction and heart aneurysm in rats // Pathological physiology and experimental therapy. 1979. No. 3. from. 79-81]. The duration of occlusion of the left coronary artery was 20 minutes, after which the ligature was untied and postischemic reperfusion was carried out. During the period of ischemia and 10 minutes of reperfusion, ECG was monitored in standard II lead using a computer electrocardiograph. Verification of the correctness of the ligature and the adequacy of the model was monitored by the degree of change in the height of the ST segment on the ECG. False-operated animals underwent a similar surgical intervention without ligature on the left coronary artery.

На 3-и сутки после реперфузии крысы были вновь наркотизированы тиопенталом натрия (60 мг/кг, внутрибрюшинно), интубированы и подключены к аппарату искусственной вентиляции легких и наложена лигатура. Для выявления зоны гипоперфузии в бедренную вену болюсно вводился 0,2 мл 5% раствора красителя patent blue violet, и в течение последующих 20-30 с извлекалось сердце. Участки миокарда с сохраненной перфузией окрашивались в зеленый цвет, неперфузируемые оставались неокрашенными.On the 3rd day after reperfusion, the rats were again anesthetized with sodium thiopental (60 mg / kg, intraperitoneally), intubated and connected to a ventilator, and ligature was applied. To identify the hypoperfusion zone, 0.2 ml of a 5% patent blue violet dye solution was bolus injected into the femoral vein, and the heart was removed over the next 20-30 seconds. Parts of the myocardium with preserved perfusion were stained green, non-perfused remained unpainted.

Срезы сердца были приготовлены на замораживающем микротоме. Часть срезов оставлялись в нативном виде для оценки зоны гипоперфузии. Другая часть срезов окрашивалась нитросиним тетразолием (НСТ) с целью выявления в ткани дегидрогеназной активности. Срезы были заключены в глицериново-желатиновый гель и сканированы. Размер зон гипоперфузии и изменения дегидрогеназной активности оценивалось с применением программы Adobe Photoshop. За зону инфаркта принимались зоны с резким снижением дегидрогеназной активности. Для этого на срезах миокарда выделялись участки, суммарная интенсивность окраски которых была снижена в 2,5 раза и более относительно интактных областей миокарда, что отражало топографию снижения в той же степени дегидрогеназной активности [Коган А.Х. Хирургический метод моделирования коронароокклюзионного инфаркта и аневризма сердца у крыс // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 1979. №3. с. 79-81].Heart sections were prepared on a freezing microtome. Some sections were left in their native form to assess the hypoperfusion zone. Another part of the sections was stained with nitro-blue tetrazolium (HCT) in order to detect dehydrogenase activity in the tissue. Slices were enclosed in a glycerol-gelatin gel and scanned. The size of hypoperfusion zones and changes in dehydrogenase activity was evaluated using the Adobe Photoshop program. Zones with a sharp decrease in dehydrogenase activity were taken as a heart attack zone. For this purpose, sections were identified on the myocardial sections, the total color intensity of which was reduced by 2.5 times or more relative to the intact regions of the myocardium, which reflected the topography of the decrease in the same degree of dehydrogenase activity [Kogan A.Kh. The surgical method for modeling coronary occlusion infarction and heart aneurysm in rats // Pathological physiology and experimental therapy. 1979. No. 3. from. 79-81].

Результаты исследований свидетельствуют, что в контрольной группе в течение первых часов после восстановления кровоснабжения миокарда левого желудочка погибло 11 животных из 22 (50%). У животных, леченных соединением 2, в период реперфузии из 22 животных погибло 1. Смертность в группе крыс леченных соединением 2 составила 4%, что достоверно отличалось от показателя в контроле и группе животных, получавших внутрижелудочно соединение 1 (табл. 16).The research results indicate that in the control group during the first hours after the restoration of blood supply to the left ventricular myocardium, 11 animals out of 22 died (50%). In animals treated with compound 2, out of 22 animals died during reperfusion 1. Mortality in the group of rats treated with compound 2 was 4%, which was significantly different from the control and the group of animals treated with intragastric compound 1 (Table 16).

У крыс контрольной группы к первым суткам и в течение последующих 3 суток после возобновления перфузии миокарда левого желудочка на ЭКГ отмечалось появление патологического зубца Q, свидетельствующего о наличии некротических изменений в миокарде, и снижение амплитуды зубца Т относительно исходных значений. После восстановления кровоснабжения миокарда в течение периода реперфузии у крыс контрольной группы сохранялось существенное снижение амплитуды зубца R относительно исходных значений, характеризующее нарушение процесса деполяризации желудочков вследствие выключения части миокарда из процессов возбуждения. В группе крыс с введением соединения 2 по сравнению с контролем и группой животных леченных соединением 1 в течение 1-3 суток после реперфузии миокарда отмечено достоверное снижение амплитуды зубца Q на ЭКГ после эпизода ишемии/реперфузии. В течение периода реперфузии к третьим суткам в группе крыс, леченных соединением 2 было выявлено отчетливое достоверное повышение амплитуды зубцов R и Т относительно контроля и группы животных с введением соединения 1 (табл. 17).In the rats of the control group, the appearance of a pathological Q wave, indicating the presence of necrotic changes in the myocardium, and a decrease in the amplitude of the T wave relative to the initial values were observed on the ECG in the first days and during the next 3 days after the resumption of perfusion of the left ventricular myocardium. After restoration of myocardial blood supply during the reperfusion period in rats of the control group, a significant decrease in the amplitude of the R wave relative to the initial values was observed, which characterizes the violation of the process of ventricular depolarization due to the shutdown of part of the myocardium from the excitation processes. In the rat group with the introduction of compound 2 compared with the control and the group of animals treated with compound 1 within 1-3 days after myocardial reperfusion, there was a significant decrease in the amplitude of the Q wave on the ECG after an episode of ischemia / reperfusion. During the reperfusion period by the third day in the group of rats treated with compound 2, a distinct significant increase in the amplitude of the R and T waves was revealed relative to the control and the group of animals with the introduction of compound 1 (Table 17).

Как видно из таблицы 19 по размеру зоны гипоперфузии от общей площади поперечных срезов миокард исследуемые группы существенно не отличались. У животных, леченных соединением 2, по сравнению с контролем и группой крыс с введением соединения 1 отмечено достоверное уменьшение зоны резко сниженной дегидрогеназной активности от общей площади миокарда и от площади зоны гипоперфузии. Следовательно, лечебно-профилактическое введение соединения 2 в дозе 100 мг/кг снижает смертность животных после эпизода ишемии/реперфузии и значимо уменьшало зону инфаркта как от общей площади миокарда, так и от площади гипоперфузии по сравнению с аналогичными показателями контрольной группы и группы животных леченных соединением 1 (табл. 18).As can be seen from table 19, the size of the hypoperfusion zone did not differ significantly from the total area of the transverse sections of the myocardium. In animals treated with compound 2, compared with the control and the group of rats with the introduction of compound 1, a significant decrease in the zone of sharply reduced dehydrogenase activity from the total area of the myocardium and from the area of the hypoperfusion zone was noted. Therefore, the therapeutic and prophylactic administration of compound 2 at a dose of 100 mg / kg reduces the mortality of animals after an episode of ischemia / reperfusion and significantly reduced the infarction area both from the total myocardial area and from the area of hypoperfusion compared to the same indices of the control group and the group of animals treated with the compound 1 (tab. 18).

У животных контрольной и опытных групп в ишемический и реперфузионный периоды в разных соотношениях отмечались все виды желудочковых аритмий высоких градаций по Lown: политопная желудочковая экстрасистолия, желудочковые тахикардии, фибрилляции желудочков. У контрольных крыс в ишемический период основную долю в нарушениях ритма сердца составили желудочковые фибрилляции (50%) и желудочковая тахикардия (27%) (табл. 20). Смертность в контрольной группе крыс составила 50% (табл. 16). Основной причиной гибели животных явились фатальные аритмии, в частности фибрилляции левого желудочка с последующей остановкой сердца.In animals of the control and experimental groups in ischemic and reperfusion periods in all ratios, all types of ventricular arrhythmias of high gradations according to Lown were noted: polytopic ventricular extrasystole, ventricular tachycardia, ventricular fibrillation. In control rats during the ischemic period, the main share in cardiac arrhythmias was ventricular fibrillation (50%) and ventricular tachycardia (27%) (Table 20). Mortality in the control group of rats was 50% (table. 16). Fatal arrhythmias, in particular left ventricular fibrillation followed by cardiac arrest, were the main cause of animal death.

У животных опытных групп профилактическое введение соединений 1 и 2 во время эпизода ишемии существенно не изменяло структуру ритма сердца в сравнении с частотой и характером аритмий у животных контроля (табл. 19). Существенные различия в количестве и тяжести аритмий у крыс исследуемых групп были выявлены в реперфузионный период. В группе животных, леченных соединением 2, по сравнению с контролем и группой с введением соединения 1 значительно (в 6 раза и 1,7 раза соответственно) увеличилось число животных без желудочковых аритмий и достоверно снизилось количество крыс с фатальными желудочковыми фибрилляциями (табл. 20). Снижение патологических изменений ритма сердца и уменьшение числа крыс с наиболее тяжелым видом аритмии - желудочковыми фибрилляциями - проявились уменьшением летальности животных, защищенных соединением 2 в перефузионный период.In animals of the experimental groups, the prophylactic administration of compounds 1 and 2 during an episode of ischemia did not significantly change the structure of the heart rhythm in comparison with the frequency and nature of arrhythmias in control animals (Table 19). Significant differences in the number and severity of arrhythmias in rats of the studied groups were revealed during the reperfusion period. In the group of animals treated with compound 2, compared with the control and the group administered with compound 1, the number of animals without ventricular arrhythmias significantly (6 times and 1.7 times, respectively) and the number of rats with fatal ventricular fibrillation significantly decreased (Table 20) . A decrease in pathological changes in the heart rhythm and a decrease in the number of rats with the most severe type of arrhythmia, ventricular fibrillation, were manifested by a decrease in the lethality of animals protected by compound 2 during the perfusion period.

Соединение 2 в дозе 100 мг/кг массы тела, в отличие от контроля и соединения 1 при его лечебно-профилактическом введении в условиях модели ишемии и реперфузии миокарда статистически значимо снижал частоту возникновения и тяжесть аритмий, уменьшал смертность животных, обусловленную фатальными аритмиями.Compound 2 at a dose of 100 mg / kg of body weight, in contrast to control and compound 1, when it was administered under the conditions of a model of myocardial ischemia and reperfusion, statistically significantly reduced the incidence and severity of arrhythmias, and reduced animal mortality due to fatal arrhythmias.

Таким образом, значимое уменьшение зоны инфаркта миокарда, снижение частоты и тяжести аритмии и смертности животных, защищенных соединением 2, обусловлено его противоишемическим и противоаритмическим действиями.Thus, a significant decrease in the zone of myocardial infarction, a decrease in the frequency and severity of arrhythmias and mortality in animals protected by compound 2, is due to its anti-ischemic and anti-arrhythmic actions.

Предлагаемое изобретение расширяет арсенал средств, обладающих одновременно гемореологической, антиагрегатной, антитромбогенной, ретинопротекторной, эндотелийпротекторной, нейропротекторной, противоаритмической и противоишемической активностью, увеличивающих мозговой кровоток.The present invention expands the arsenal of agents that have both hemorheological, antiaggregate, antithrombogenic, retinoprotective, endothelium protective, neuroprotective, antiarrhythmic and anti-ischemic activity that increase cerebral blood flow.

Claims

An agent for the treatment of cardiovascular diseases, which is a mixture of 2,6-di (1,7,7-trimethylbicyclo [2.2.1] hept-2-yl) -4-methylphenol and its diastereomers, and 2- (1.7 , 7-trimethylbicyclo [2.2.1] hept-2-yl) -6- (2,2,1-trimethylbicyclo [2.2.1] hept-5-yl) -4-methylphenol and its diastereomers with a ratio of 2.6- di (1,7,7-trimethylbicyclo [2.2.1] hept-2-yl) -4-methylphenol and 2- (1,7,7-trimethylbicyclo [2.2.1] hept-2-yl) -6- ( 2,2,1-trimethylbicyclo [2.2.1] hept-5-yl) -4-methylphenol from 60 to 95 wt.% For the first isomer and from 40 to 5 wt.% For the second isomer.