RU2547598C1 - METHOD OF GENOTYPING STRAINS Mycobacterium tuberculosis - Google Patents
METHOD OF GENOTYPING STRAINS Mycobacterium tuberculosis Download PDFInfo
- Publication number
- RU2547598C1 RU2547598C1 RU2013155216/10A RU2013155216A RU2547598C1 RU 2547598 C1 RU2547598 C1 RU 2547598C1 RU 2013155216/10 A RU2013155216/10 A RU 2013155216/10A RU 2013155216 A RU2013155216 A RU 2013155216A RU 2547598 C1 RU2547598 C1 RU 2547598C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- oligonucleotides
- genotype
- sequencing
- polymorphism
- case
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/35—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Mycobacteriaceae (F)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION
Изобретение относится к медицине, фтизиатрии и медицинской микробиологии и может быть использовано для идентификации клинически значимых штаммов Mycobacterium tuberculosis, в том числе с множественной и широкой лекарственной устойчивостью, а также с измененной вирулентностью при работе с пациентами.The invention relates to medicine, phthisiology and medical microbiology and can be used to identify clinically significant strains of Mycobacterium tuberculosis, including those with multiple and wide drug resistance, as well as altered virulence when working with patients.
Уровень техникиState of the art
Начиная с 90-х годов прошлого века, в мире наблюдается резкий рост заболеваемости туберкулезом. По данным ВОЗ, на 2011 г. отмечено 8.7 млн. новых случаев заболевания. В структуре смертности от инфекционных и паразитарных заболеваний в России доля умерших от туберкулеза составляет 70%.Since the 90s of the last century, a sharp increase in the incidence of tuberculosis has been observed in the world. According to the WHO, in 2011 there were 8.7 million new cases of the disease. In the structure of mortality from infectious and parasitic diseases in Russia, the proportion of deaths from tuberculosis is 70%.
Согласно современной классификации, возбудитель туберкулеза М.tuberculosis подразделяется на несколько генотипов, основными из которых являются следующие (Рис.1):According to modern classification, the tuberculosis pathogen M. tuberculosis is divided into several genotypes, the main of which are the following (Fig. 1):
Генотип Beijing. К данному генотипу относятся штаммы кластеров R220 (типичный представитель М.tuberculosis R1207) и R86 (М.tuberculosis X122), происходящие из Западной Африки, штаммы CCDC5079; CCDC5180 и штаммы широко распространившегося по всему миру кластера W. Являются наиболее часто встречающимся генотипом в мире [Ioerger Т.R. et al. The non-clonality of drug resistance in Beijing genotype isolates of Mycobacterium tuberculosis from the Western Cape of South Africa. BMC Genomics. 2010. 11:670].Genotype of Beijing. This genotype includes strains of clusters R220 (a typical representative of M. tuberculosis R1207) and R86 (M. tuberculosis X122), originating from West Africa, strains CCDC5079; CCDC5180 and strains of the W cluster widely spread around the world. They are the most common genotype in the world [Ioerger T.R. et al. The non-clonality of drug resistance in Beijing genotype isolates of Mycobacterium tuberculosis from the Western Cape of South Africa. BMC Genomics. 2010.11: 670].
Генотип EAI. Данная группа штаммов широко распространена в Юго-Восточной Азии, островах Тихого Океана, в США (Сан-Франциско). [Brudey K. Mycobacterium tuberculosis complex genetic diversity: mining the fourth international spoligotyping database (SpolDB4) for classification, population genetics and epidemiology. BMC Microbiol. 2006. 6(6):23].EAI genotype. This group of strains is widespread in Southeast Asia, the islands of the Pacific Ocean, and in the USA (San Francisco). [Brudey K. Mycobacterium tuberculosis complex genetic diversity: mining the fourth international spoligotyping database (SpolDB4) for classification, population genetics and epidemiology. BMC Microbiol. 2006. 6 (6): 23].
Генотип Ural. Широко распространенная на юге и юго-востоке Российской Федерации группа [Mokrousov I. The quiet and controversial: Ural family of Mycobacterium tuberculosis. Infect Genet Evol. 2012 12(4):619-29]. Штаммы, относящиеся к данному генотипу, были обнаружены в Абхазии, Грузии, Индии и Иране. [Ilina E.N. et al. Comparative Genomic Analysis of Mycobacterium tuberculosis Drug Resistant Strains from Russia. PLoS One. 2013. 8(2): e56577].Ural genotype. A group widespread in the south and southeast of the Russian Federation [Mokrousov I. The quiet and controversial: Ural family of Mycobacterium tuberculosis. Infect Genet Evol. 2012 12 (4): 619-29]. Strains related to this genotype were found in Abkhazia, Georgia, India and Iran. [Ilina E.N. et al. Comparative Genomic Analysis of Mycobacterium tuberculosis Drug Resistant Strains from Russia. Plos one. 2013.8 (2): e56577].
Генотип LAM. Представляет собой разнородную группу, распространенную повсеместно в мире. Является преобладающим генотипом на территории Южной Америки [Bazira J. et al., Genetic diversity of Mycobacterium tuberculosis in Mbarara, South Western Uganda. Afr Health Sci. 2010. (4):306-3 II]. В России распространен кластер 9 генотипа LAM (LAM9).LAM genotype. It is a heterogeneous group, distributed throughout the world. It is the predominant genotype in South America [Bazira J. et al., Genetic diversity of Mycobacterium tuberculosis in Mbarara, South Western Uganda. Afr Health Sci. 2010. (4): 306-3 II].
Генотип F15/LAM4/KZN. Данный генотип принадлежит к генотипу LAM, и при сполиготипировании определяется как LAM4. Но при помощи RFLP-типирования он выделяется достаточно четко в отдельную группу. К данному генотипу относится группа высоковирулентных штаммов с множественной и широкой лекарственной устойчивостью распространенных на Юге и Юго-Востоке Африки [Loerger T.R. et al. Genome analysis of multi- and extensively-drug resistant tuberculosis from KwaZulu-Natal, South Africa. PLoS ONE. 2009. (4)11].Genotype F15 / LAM4 / KZN. This genotype belongs to the LAM genotype, and when spoligotyping is defined as LAM4. But with the help of RFLP-typing, it stands out quite clearly in a separate group. This genotype includes a group of highly virulent strains with multidrug and wide drug resistance widespread in the South and Southeast of Africa [Loerger T.R. et al. Genome analysis of multi- and extensively-drug resistant tuberculosis from KwaZulu-Natal, South Africa. PLOS ONE. 2009. (4) 11].
Генотип SMI-049. К генотипу SMI-049 относят эндемичные для скандинавских стран, устойчивые к изониазиду штаммы ВТВ 05-559, S96-129 и ВТВ05-552 [Sandegren L. et al. Genomic stability over 9 years of an isoniazid resistant Mycobacterium tuberculosis outbreak strain in Sweden. PLoS One. 2011. 6(1): el6647]. Отличаются высоким генетическим сходством и стабильностью.Genotype SMI-049. The SMI-049 genotype includes strains BTB 05-559, S96-129 and BTB05-552 endemic for Scandinavian countries, resistant to isoniazid [Sandegren L. et al. Genomic stability over 9 years of an isoniazid resistant Mycobacterium tuberculosis outbreak strain in Sweden. Plos one. 2011.6 (1): el6647]. They are distinguished by high genetic similarity and stability.
Генотип Haarlem. Штаммы данной группы распространены в Африке, но в последние годы все чаще встречаются в Аргентине, Бразилии, странах Карибского бассейна и США.The genotype of Haarlem. Strains of this group are common in Africa, but in recent years are increasingly found in Argentina, Brazil, the Caribbean and the USA.
Генотип Т. Данный кластер, наряду с генотипами LAM и Haarlem, принадлежит к т.н. Евро-Американской линии. Чрезвычайно разнороден по своему составу. В данную группу входит референсный штамм H37Rv [Gagneux S., Deriemer K., Van Т. et al. Variable host-pathogen compatibility in Mycobacterium tuberculosis. Proc Natl Acad Sci USA. 2006. 103:2869-2873].Genotype T. This cluster, along with the genotypes LAM and Haarlem, belongs to the so-called Euro-American line. Extremely heterogeneous in composition. This group includes the reference strain H37Rv [Gagneux S., Deriemer K., Van T. et al. Variable host-pathogen compatibility in Mycobacterium tuberculosis. Proc Natl Acad Sci USA. 2006.103: 2869-2873].
Ряду штаммов, характерных для центральной и южной Африки, в частности генотипу F15/LAM4/KZN, присуща большая вирулентность и, по сравнению с европейскими штаммами, склонность к образованию MDR-форм [Chihota V.N. et al. Population structure of multi- and extensively drug-resistant Mycobacterium tuberculosis strains in South Africa. J. Clin. Microbio. 2012. 50(3):995-1002]. Подобное также характерно для представителей пекинского (Beiling) генотипа, широко распространенного не только в Юго-Восточной Азии, но в последние годы повсеместно в мире [Chakraborty P. et al. Drug resistant clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis from different genotypes exhibit differential host responses in THP-1 cells. PLoS One. 2013. 8(5): e62966] [Lasunskaia E. et al. Emerging multidrug resistant Mycobacterium tuberculosis strains of the Beijing genotype circulating in Russia express a pattern of biological properties associated with enhanced virulence. Microbes and Infection. 2010. 12:467-475] [Parwati I. et al. Possible underlying mechanisms for successful emergence of the Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype strains. Lancet Infect Dis. 2010. 10:103-111] [Devaux I. et al. Clusters of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis cases, Europe. Emerg Infect Dis. 2009. 15(7):1052-1060] [Von Groll A. et al. Fitness of Mycobacterium tuberculosis strains of the W-Beijing and Non- W-Beijing genotype. PLoS One 2010. 5: e10191].A number of strains characteristic of central and southern Africa, in particular the F15 / LAM4 / KZN genotype, are characterized by greater virulence and, compared with European strains, a tendency to form MDR forms [Chihota V.N. et al. Population structure of multi- and extensively drug-resistant Mycobacterium tuberculosis strains in South Africa. J. Clin. Microbio 2012. 50 (3): 995-1002]. Similar is also characteristic of representatives of the Beijing (Beiling) genotype, which is widespread not only in Southeast Asia, but in recent years everywhere in the world [Chakraborty P. et al. Drug resistant clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis from different genotypes exhibit differential host responses in THP-1 cells. Plos one. 2013. 8 (5): e62966] [Lasunskaia E. et al. Emerging multidrug resistant Mycobacterium tuberculosis strains of the Beijing genotype circulating in Russia express a pattern of biological properties associated with enhanced virulence. Microbes and Infection. 2010. 12: 467-475] [Parwati I. et al. Possible underlying mechanisms for successful emergence of the Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype strains. Lancet Infect Dis. 2010.10: 103-111] [Devaux I. et al. Clusters of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis cases, Europe. Emerg Infect Dis. 2009. 15 (7): 1052-1060] [Von Groll A. et al. Fitness of Mycobacterium tuberculosis strains of the W-Beijing and Non-W-Beijing genotype. PLoS One 2010.5: e10191].
В связи с этим для разработки и назначения правильной схемы лечения большое значение имеет генотипирование микобактерий. В настоящее время для идентификации микобактерий применяются следующие методы:In this regard, the genotyping of mycobacteria is of great importance for the development and appointment of the correct treatment regimen. Currently, the following methods are used to identify mycobacteria:
1. Сполиготипирование - основной стандартный метод генотипирования микобактерий. В основе метода лежит полиморфизм хромосомного DR-локуса (от англ. direct repeat - прямой повтор) [Kamerbeek J., et al. Simultaneous detection and strain differentiation of Mycobacterium tuberculosis for diagnosis and epidemiology. J Clin Microbiol. 1997. 35:907-14]. Данный метод требует проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) и последующей ДНК-гибридизации с иммобилизованными на мембране зондами в специальном приборе (миниблоттере) и выявлением сигналов хемилюминесценции на светочувствительной пленке. Метод сполиготипирования позволяет идентифицировать несколько наиболее значимых в эпидемиологическом отношении генотипов: Beijing, Haarlem, LAM, EAI и т.д. В последние годы также выделяют генотип Ural [Ilina E.N. et al. Comparative genomic analysis of Mycobacterium tuberculosis drug resistant strains from Russia. PLoS One. 2013. 8(2): e56577].1. Spoligotyping is the main standard method of genotyping of mycobacteria. The method is based on the polymorphism of the chromosomal DR locus (from the English direct repeat - direct repeat) [Kamerbeek J., et al. Simultaneous detection and strain differentiation of Mycobacterium tuberculosis for diagnosis and epidemiology. J Clin Microbiol. 1997. 35: 907-14]. This method requires polymerase chain reaction (PCR) and subsequent DNA hybridization with probes immobilized on the membrane in a special device (mini-blotter) and detection of chemiluminescence signals on a photosensitive film. The spoligotyping method allows one to identify several epidemiologically most significant genotypes: Beijing, Haarlem, LAM, EAI, etc. In recent years, the Ural genotype [Ilina E.N. et al. Comparative genomic analysis of Mycobacterium tuberculosis drug resistant strains from Russia. Plos one. 2013.8 (2): e56577].
Метод имеет ряд преимуществ: высокая специфичность, экономичность (в т.ч. возможность использовать гибридизационные мембраны до 20 раз) и в настоящее время считается классическим методом штаммовой дифференцировки. Создана международная база данных по сполиготипам микобактерий туберкулезного комплекса SpolDB4 (www.pasteur.fr/ip/easysite/pasteur/fr).The method has several advantages: high specificity, cost-effectiveness (including the ability to use hybridization membranes up to 20 times) and is currently considered the classic method of strain differentiation. An international database of spoligotypes of Mycobacterium tuberculosis complex SpolDB4 (www.pasteur.fr/ip/easysite/pasteur/fr) has been created.
Недостатком данного метода является его трудоемкость, потребность в специальном оборудовании и программном обеспечении, что делает его неприменимым для использования в практических бактериологических лабораториях.The disadvantage of this method is its complexity, the need for special equipment and software, which makes it inapplicable for use in practical bacteriological laboratories.
2. Метод RFLP-типирования. Данный метод основан на анализе полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, получающихся при расщеплении геномной ДНК по специфическим сайтам эндонуклеазами рестрикции [van Embden, J.D.A. et al. Strain identification of Mycobacterium tuberculosis by DNA fingerprinting: recommendations for a standardized methodology. J. Clin. Microbiol. 1993. 31:(406-409)]. Размеры и взаимное расположение рестрикционных фрагментов ДНК после их электрофоретического разделения определяются путем гибридизации по Саузерну. RFLP - метод имеет несколько модификаций, но наиболее распространенным маркером является последовательность транспозона IS6110. Метод обладает высокой разрешающей способностью.2. The method of RFLP typing. This method is based on the analysis of restriction fragment length polymorphism resulting from the cleavage of genomic DNA at specific sites by restriction endonucleases [van Embden, J.D.A. et al. Strain identification of Mycobacterium tuberculosis by DNA fingerprinting: recommendations for a standardized methodology. J. Clin. Microbiol. 1993.31: (406-409)]. The sizes and relative positions of restriction DNA fragments after their electrophoretic separation are determined by Southern hybridization. The RFLP method has several modifications, but the most common marker is the IS6110 transposon sequence. The method has a high resolution.
Недостатком данного метода является значительная подвижность и способность IS6110-элементов к геномным транспозициям, а также потребность в значительном количестве ДНК, для выделения которой необходимо большое количество биомассы М.tuberculosis.The disadvantage of this method is the significant mobility and ability of IS6110 elements to genomic transpositions, as well as the need for a significant amount of DNA, for the isolation of which a large amount of M. tuberculosis biomass is required.
3. Методы, основанные на IS6110-амплификации:3. Methods based on IS6110 amplification:
- Гнездовая (вложенная) и полугнездовая IS6110-ПЦР (Hemi-nested PCR).- Nest (nested) and semi-nest IS6110-PCR (Hemi-nested PCR).
Данный метод позволяет повысить чувствительность реакции амплификации за счет последовательного применения двух пар праймеров - внешней и внутренней [Miyazaki Y. et al. Nested polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical samples. Clin. Microbiol. 1993. 31(8):2228-2232].This method allows to increase the sensitivity of the amplification reaction due to the sequential use of two pairs of primers - external and internal [Miyazaki Y. et al. Nested polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical samples. Clin. Microbiol. 1993.31 (8): 2228-2232].
- Двойная ПЦР повторяющихся элементов (double - repetitive - element PCR).- Double PCR of repeating elements (double - repetitive - element PCR).
Метод основан на амплификации и анализе последовательности участков между двумя повторяющимися участками ДНК, которыми чаще всего выступают IS6110-элементы, а также PGRS-последовательности [Friedman C.R et al. Double repetitive element PCR method for subtyping Mycobacterium tuberculosis clinical isolates. J. Clin. Microbiol. 1995. 33:1064-1069].The method is based on amplification and sequence analysis of regions between two repeating DNA regions, which are most often the IS6110 elements, as well as PGRS sequences [Friedman C.R et al. Double repetitive element PCR method for subtyping Mycobacterium tuberculosis clinical isolates. J. Clin. Microbiol. 1995. 33: 1064-1069].
- Инвертированная IS6110-ПЦР.- Inverted IS6110-PCR.
Данный метод используется в случае, если в необходимой для анализа последовательности изестен небольшой участок, и особенно полезен, если требуется определить последовательность после инсерции [Plikaytis В.В. et al. Rapid, amplification-based fingerprinting of Mycobacterium tuberculosis. J. Gen. Microbiol. 1993. 139:1537-1542].This method is used if a small portion is needed in the sequence required for analysis, and is especially useful if it is necessary to determine the sequence after insertion [Plikaytis V.V. et al. Rapid, amplification-based fingerprinting of Mycobacterium tuberculosis. J. Gen. Microbiol. 1993. 139: 1537-1542].
Недостатком этих методов является значительная подвижность и способность IS6110-элементов к геномным транспозициям, приводящая к изменению характерного для штамма рисунка генотипирования спустя 3-5 лет. Кроме того, данные методы типирования не всегда оказываются пригодным для идентификации штаммов микобактерий туберкулезного комплекса с малым (не более 5) числом копий IS6110 или с полным их отсутствием.The disadvantage of these methods is the significant mobility and ability of IS6110 elements to genomic transpositions, leading to a change in the genotyping pattern characteristic of the strain after 3-5 years. In addition, these typing methods are not always suitable for identifying mycobacterial strains of the tuberculosis complex with a small (not more than 5) number of copies of IS6110 or with their complete absence.
4. Метод количества тандемных повторов (variable number of tandem repeats, VNTR) [Iwamoto T. et al. Hypervariable loci that enhance the discriminatory ability of newly proposed 15-loci and 24-loci variable-number tandem repeat typing method on Mycobacterium tuberculosis strains predominated by the Beijing family. FEMS Microbiol. Lett. 2007. 272:282-283]. В качестве маркеров используются геномные локусы М.tuberculosis, содержащие консервативные тандемные повторы (exact tandem repeats; ETR). Их количество в каждом локусе варьирует у различных штаммов. Методика обладает высокой дифференцирующей способностью. Одним из усовершенствований данного метода является т.н. MIRU-VNTR. В основе метода лежит амплификация локусов, содержащих распределенные по геному микобактериальные повторяющиеся элементы (mycobacterial interspersed repetitive units, MIRU).4. The method of the number of tandem repeats (variable number of tandem repeats, VNTR) [Iwamoto T. et al. Hypervariable loci that enhance the discriminatory ability of newly proposed 15-loci and 24-loci variable-number tandem repeat typing method on Mycobacterium tuberculosis strains predominated by the Beijing family. FEMS Microbiol. Lett. 2007.272: 282-283]. Genomic M. tuberculosis loci containing conservative tandem repeats (exact tandem repeats; ETR) are used as markers. Their number at each locus varies among different strains. The technique has a high differentiating ability. One of the improvements to this method is the so-called. MIRU-VNTR. The method is based on the amplification of loci containing mycobacterial interspersed repetitive units (MIRUs) distributed across the genome.
Недостатками всех указанных методов являются: сложность и/или неоднозначная интерпретация полученных результатов.The disadvantages of all these methods are: complexity and / or ambiguous interpretation of the results.
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Задачей данного изобретения является разработка метода универсальной и быстрой молекулярно-генетической идентификации основных генотипов штаммов М.tuberculosis с использованием генетического материала изолята.The objective of the invention is to develop a method of universal and rapid molecular genetic identification of the main genotypes of M. tuberculosis strains using the genetic material of the isolate.
В заявленном изобретении предложен метод идентификации, основанный на однонуклеотидных полиморфизмах генов систем токсин-антитоксин II типа у М.tuberculosis.The claimed invention proposed an identification method based on single nucleotide polymorphisms of genes of toxin-antitoxin type II systems in M. tuberculosis.
Системы токсин-антитоксин (ТА) II типа широко распространены у М.tuberculosis и представляют собой модуль из двух генов, располагающихся друг за другом (иногда перекрываясь) и образуя оперон [Yamaguchi Y. et al. Toxin-antitoxin systems in bacteria and archaea. Annu Rev Genet. 2011. 45:61-79] [Прозоров А.А., Даниленко В.Н. Системы "токсин-антитоксин" у бактерий: инструмент апоптоза или модуляторы метаболизма? Микробиология. 2010. Т.79. №2. С.147-159] [Sala A. et al. Toxin-antitoxin loci in Mycobacterium tuberculosis. In: Gerdes K., editor. Prokaryotic toxin-antitoxins. Berlin: Springer. 2013. P.295-314]. В настоящее время у М.tuberculosis обнаружено более 75 пар систем-антитоксин.Type II toxin-antitoxin (TA) systems are widespread in M. tuberculosis and are a module of two genes located one after another (sometimes overlapping) and forming an operon [Yamaguchi Y. et al. Toxin-antitoxin systems in bacteria and archaea. Annu Rev Genet. 2011. 45: 61-79] [Prozorov A.A., Danilenko V.N. Toxin-antitoxin systems in bacteria: an apoptosis tool or metabolic modulators? Microbiology. 2010.V. 79. No. 2. P.147-159] [Sala A. et al. Toxin-antitoxin loci in Mycobacterium tuberculosis. In: Gerdes K., editor. Prokaryotic toxin-antitoxins. Berlin: Springer. 2013. P.295-314]. Currently, M. tuberculosis has detected more than 75 pairs of antitoxin systems.
Основные функции генов систем токсин-антитоксин у М.tuberculosis включают в себя контроль роста клетки в неблагоприятных условиях, переход клеток в покоящееся состояние, апоптоз и др. [Ramage H.R. et al. Comprehensive functional analysis of Mycobacterium tuberculosis toxin-antitoxin systems: implications for pathogenesis, stress responses, and evolution. PLoS Genet. 2009. 5: e1000767].The main functions of the genes of the toxin-antitoxin systems in M. tuberculosis include control of cell growth under adverse conditions, the transition of cells to a resting state, apoptosis, etc. [Ramage H.R. et al. Comprehensive functional analysis of Mycobacterium tuberculosis toxin-antitoxin systems: implications for pathogenesis, stress responses, and evolution. PLoS Genet. 2009.5: e1000767].
Предлагаемый нами метод типирования имеет ряд преимуществ по сравнению с имеющимися аналогами - использование функциональных регуляторных генов, важных для толерантности, персистенции и вирулентности М.tuberculosis, а также универсальность (возможность использования при мультилокусном секвенировании, ПЦР-РВ, ПЦР), простота в исполнении, надежность, небольшое число генов, быстрота.Our typing method has several advantages over its analogues - the use of functional regulatory genes that are important for M. tuberculosis tolerance, persistence and virulence, as well as versatility (can be used in multilocus sequencing, PCR-RV, PCR), simplicity in execution, reliability, a small number of genes, speed.
1. Биоинформатический анализ наличия генов систем токсин-антитоксин II типа у штаммов M.tuberculosis1. Bioinformatics analysis of the presence of genes of toxin-antitoxin type II systems in M. tuberculosis strains
Авторами настоящего изобретения был проведен анализ in silico 75 пар генов систем токсин-антитоксин в 22 «complete»- и 138 «draft»-геномах секвенированных (по данным на ноябрь 2013 г.) штаммов М.tuberculosis с использованием баз данных: National Center for Biotechnology Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), UniProt (http://www.uniprot.org/), Tuberculist (http://tuberculist.epfl.ch/index.html), Pathosystems Resours Integration Center (http://patricbrc.org/portal/portal/patric/Taxon?cType=taxon&cId=1763), TADB (http://bioinfo-mml.sjtu.edu.cn/TADB/). Сравнительный анализ последовательностей обнаруженных генов проводили с использованием программ BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit), LALIGN (http://www.ch.embnet.org/software/ LALIGN_form.html), Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) и CLUSTALW (www.ch.embnet.org/software/ClustalW.html).The authors of the present invention carried out an in silico analysis of 75 pairs of toxin-antitoxin system genes in 22 “complete” and 138 “draft” genomes of sequenced (as of November 2013) M. tuberculosis strains using the databases: National Center for Biotechnology Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), UniProt (http://www.uniprot.org/), Tuberculist (http://tuberculist.epfl.ch/index. html), Pathosystems Resources Integration Center (http://patricbrc.org/portal/portal/patric/Taxon?cType=taxon&cId=1763), TADB (http://bioinfo-mml.sjtu.edu.cn/TADB/) . A comparative analysis of the sequences of the detected genes was performed using the BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit), LALIGN (http://www.ch.embnet.org/software/ LALIGN_form.html) programs, Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) and CLUSTALW (www.ch.embnet.org/software/ClustalW.html).
Было установлено, что геномы всех штаммов M.tuberculosis содержат 75 пар ТА-модулей, принадлежащих к 5 суперсемействам - VapBC, RelBE, MazEF, ParDE, HigAB, a также новые системы, обозначенные как novel, которые к настоящему моменту не могут быть однозначно классифицированы. К суперсемейству VapBC из них принадлежат 48, к RelBE - 4, к MazEF - 9, к ParDE - 2, к HigAB - 1, к novel - 11. При анализе были найдено значительное число snp-полиморфизмов, представляющих собой миссенс- и сеймсенс-замены, а также делеции и вставки отдельных нуклеотидов, приводящие к сдвигу рамки считывания. Из обнаруженных snp-полиморфизмов 29 относились к миссенс-мутациям, 19 - к сеймсенс-мутациям, 3 - к мутациям сдвига рамки считывания. Во избежание возможных неточностей, связанных с ошибками секвенирования, учитывались snp-полиморфизмы, повторяющиеся у нескольких штаммов. Для дальнейшего анализа были первоначально отобраны 8 генов, степень полиморфизма которых была достаточно высока и удовлетворяла целям настоящего изобретения (Таблица 1).It was found that the genomes of all M. tuberculosis strains contain 75 pairs of TA modules belonging to 5 superfamilies - VapBC, RelBE, MazEF, ParDE, HigAB, as well as new systems designated as novel, which at present cannot be unambiguously classified . Of these, 48 belong to the VapBC superfamily, to RelBE - 4, to MazEF - 9, to ParDE - 2, to HigAB - 1, to novel - 11. During the analysis, a significant number of snp polymorphisms were found, which are missense and seismic substitutions, as well as deletions and insertions of individual nucleotides, leading to a shift in the reading frame. Of the detected snp polymorphisms, 29 were related to missense mutations, 19 to seismic mutations, 3 to reading frame shift mutations. To avoid possible inaccuracies associated with sequencing errors, snp polymorphisms repeated in several strains were taken into account. For further analysis, 8 genes were initially selected, the degree of polymorphism of which was quite high and met the objectives of the present invention (Table 1).
2. Биоинформатический анализ snp-полиморфизмов выбранных генов у штаммов M.tuberculosis, относящихся к разным генотипам2. Bioinformatics analysis of snp polymorphisms of selected genes in M. tuberculosis strains belonging to different genotypes
2.1. Анализ полиморфизмов в геномах штаммов M.tuberculosis из зарубежных коллекций2.1. Analysis of polymorphisms in the genomes of M. tuberculosis strains from foreign collections
Был осуществлен анализ in silico нуклеотидных последовательностей выбранных генов с использованием программы Blast. Для анализа были использованы доступные в базе данных геномы M.tuberculosis с известной генотипической принадлежностью.An in silico analysis of the nucleotide sequences of the selected genes was performed using the Blast program. For analysis, the M. tuberculosis genomes with known genotypic affiliation, available in the database, were used.
При анализе snp-полиморфизмов выбранных генов у всех штаммов, относящихся к генотипу Beijing, были выявлены следующие нуклеотидные замены:When analyzing snp polymorphisms of the selected genes in all strains belonging to the Beijing genotype, the following nucleotide substitutions were revealed:
- для гена rv2103c (токсин VapC37) характерна замена A46→G46;- the gene rv2103c (toxin VapC37) is characterized by the replacement of A 46 → G 46 ;
- для гена rv1956 (токсин HigA) характерна замена C363→T363;- the rv1956 gene (HigA toxin) is characterized by the replacement of C 363 → T 363 ;
- для гена rv2494 (токсин VapC38) характерна замена T143→C143.- the rv2494 gene (VapC38 toxin) is characterized by the replacement of T 143 → C 143 .
Анализ полиморфизма выбранных генов у штаммов генотипа EAI показал наличие характерных для данного генотипа замен:An analysis of the polymorphism of the selected genes in strains of the EAI genotype showed the presence of substitutions characteristic of this genotype:
- в гене rv0749 (токсин Vap31) обнаружены две замены C267→G267 и A268→G268;- two replacements C 267 → G 267 and A 268 → G 268 were found in the rv0749 gene (Vap31 toxin);
- в гене rv2595 (антитоксин VapB40) обнаружена замена G192→A192.- in the rv2595 gene (VapB40 antitoxin), a replacement G 192 → A 192 was detected.
Анализ полиморфизма выбранных генов у штаммов генотипа F15/LAM4/KZN показал наличие двух характерных для данного генотипа замен:An analysis of the polymorphism of the selected genes in the strains of the F15 / LAM4 / KZN genotype showed the presence of two substitutions characteristic of this genotype:
- в гене rv2494 (токсин VapC38) обнаружена замена C168→T168;- in the rv2494 gene (VapC38 toxin), a C 168 → T 168 substitution was detected;
- в гене rv1740 (антитоксин VapB34)обнаружена замена C140→A140.- in the rv1740 gene (VapB34 antitoxin), a replacement of C 140 → A 140 was detected.
Анализ полиморфизма выбранных генов у штаммов генотипа SMI-049 показал наличие характерной замены G213→C213 в гене rv2526 (антитоксин VapB17).An analysis of the polymorphism of the selected genes in strains of genotype SMI-049 showed the presence of a characteristic substitution G 213 → C 213 in the rv2526 gene (antitoxin VapB17).
Анализ полиморфизма выбранных генов у штаммов генотипа Haarlem показал наличие замены G197→С197 в гене rv2494 (токсин VapC38).An analysis of the polymorphism of the selected genes in strains of the Haarlem genotype showed the presence of the G 197 → C 197 substitution in the rv2494 gene (VapC38 toxin).
Анализ полиморфизма выбранных генов у штаммов генотипа Т выявил наличие полиморфизма T137→C137 в гене rv3408 (токсин VapC47).An analysis of the polymorphism of the selected genes in strains of genotype T revealed the presence of the T 137 → C 137 polymorphism in the rv3408 gene (VapC47 toxin).
Анализ штаммов генотипа LAM показал очень низкую степень полиморфизма не только по выбранным генам, но также по всем 150 генам систем ТА. Выделить данный генотип на основании полиморфизма выбранных десяти генов можно путем детекции полиморфизма по гену токсина VapC47 (rv3408): наличие в гене в 137-м положении тимина и отсутствии других полиморфизмов, маркирующих остальные генотипы.Analysis of strains of the LAM genotype showed a very low degree of polymorphism not only for the selected genes, but also for all 150 genes of TA systems. This genotype can be distinguished based on the polymorphism of the selected ten genes by detecting the polymorphism by the VapC47 toxin gene (rv3408): the presence of thymine in the gene at the 137th position and the absence of other polymorphisms marking the remaining genotypes.
Полученные результаты представлены в таблице 1.The results are presented in table 1.
2.2. Анализ полиморфизмов в геномах штаммов M.tuberculosis из российских коллекций2.2. Analysis of polymorphisms in the genomes of M. tuberculosis strains from Russian collections
Проведен анализ in silico выбранных генов систем токсин-антитоксин в геномах 38 эпидемиологически значимых штаммов, выделенных у пациентов на территории Российской Федерации [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=SRA061654]. Принадлежность штаммов к различным генотипам (Уральский, пекинский и LAM9) была установлена перед депонированием методом сполиготипирования. К уральскому генотипу принадлежат семь штаммов: MOS9; SP24; SP25; SP28; SP31; SP32; SP33.An in silico analysis of the selected genes of the toxin-antitoxin systems in the genomes of 38 epidemiologically significant strains isolated from patients in the Russian Federation was performed [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=SRA061654]. The belonging of the strains to different genotypes (Ural, Beijing and LAM9) was established before deposition by spoligotyping. Seven strains belong to the Ural genotype: MOS9; SP24; SP25; SP28; SP31; SP32; SP33.
В ходе работы было установлено, что штаммы уральского генотипа не имеют полиморфизмов по анализируемым генам. Был проведен анализ ряда других генов систем ТА суперсемейства VapBC. Результатом работы стало обнаружение snp-полиморфизма в гене токсина VapC10 (rv1397c) замены C394→T394. Данная замена присутствует у всех представителей уральского генотипа и отсутствует у штаммов, принадлежащих к другим филогенетическим группам.In the course of the work, it was found that strains of the Ural genotype do not have polymorphisms for the analyzed genes. An analysis was made of a number of other genes of the TA systems of the VapBC superfamily. The result of the study was the discovery of snp polymorphism in the VapC10 toxin gene (rv1397c) of the substitution C 394 → T 394 . This replacement is present in all representatives of the Ural genotype and is absent in strains belonging to other phylogenetic groups.
К генотипу LAM9 относятся 9 штаммов: MOS2, MOS7, SP34, SP35, SP36, SP37, SP38. Полиморфизмов в системах токсин-антитоксин суперсемейства VapBC не было выявлено. При анализе генов других систем токсин-антитоксин, обнаружена замена G3→A3 в гене токсина MazF8 (rv2274c). Замена присутствует у всех штаммов данного генотипа.9 strains belong to the LAM9 genotype: MOS2, MOS7, SP34, SP35, SP36, SP37, SP38. No polymorphisms were detected in the toxin-antitoxin systems of the VapBC superfamily. When analyzing the genes of other toxin-antitoxin systems, a G 3 → A 3 substitution was found in the MazF8 toxin gene (rv2274c). Substitution is present in all strains of this genotype.
3. Разработка олигонуклеотидов для идентификации основных генотипов M.tuberculosis3. The development of oligonucleotides to identify the main genotypes of M. tuberculosis
Основным требованием к данному набору праймеров является их универсальность и высокая специфичность. Для выбора праймеров учтены требования к длине фрагмента ДНК в случае применения различных методик секвенирования.The main requirement for this set of primers is their versatility and high specificity. For the selection of primers, the requirements for the length of the DNA fragment in the case of applying various sequencing techniques were taken into account.
Для мультилокусного секвенирования, в соответствии с характеристиками системы (http://roche-applied-science.ru/assets/files/GS_Junior.pdf), максимальная длина анализируемого фрагмента не должна превышать 500 п.н., средняя длина - 400 п.н. При использовании метода PCR-real time длина амплифицируемого фрагмента не должна превышать 200 п.н. Исходя из этих требований, подбор праймеров осуществлялся в интервале 100-150 нуклеотидов от точки замены. Для удобства применения при мультилокусном секвенировании все праймеры должны иметь сходную температуру отжига (64°).For multilocus sequencing, in accordance with the characteristics of the system (http://roche-applied-science.ru/assets/files/GS_Junior.pdf), the maximum length of the analyzed fragment should not exceed 500 bp, the average length is 400 bp. n When using the PCR-real time method, the length of the amplified fragment should not exceed 200 bp Based on these requirements, the selection of primers was carried out in the range of 100-150 nucleotides from the point of substitution. For ease of use in multilocus sequencing, all primers should have a similar annealing temperature (64 °).
На основании сравнительного анализа последовательностей выбранных генов разработан набор из 10 пар олигонуклеотидов для идентификации основных генотипов М.tuberculosis: Rv0749N-Rv0749C, Rv2103cN-Rv2103cC, Rv1740N-Rv1740C, Rv1956N-Rv1956C, Rv2526N-Rv2526C, Rv2529N-Rv2529C, Rv2494N-Rv2494C, Rv1397cN-Rv1397cC, Rv2274cN-Rv2274cC, Rv3408N-Rv3408C представленный в таблице 2.Based on a comparative analysis of the sequences of the selected genes, a set of 10 pairs of oligonucleotides was developed to identify the main M. tuberculosis genotypes: Rv0749N-Rv0749C, Rv2103cN-Rv2103cC, Rv1740N-Rv1740C, Rv1956N-Rv19NC, Rv2526N-Rv25NC-Rv2529 -Rv1397cC, Rv2274cN-Rv2274cC, Rv3408N-Rv3408C shown in Table 2.
На последовательностях 1-10 (см. перечень последовательностей) представлен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей выбранных генов с локализацией всех олигонуклеотидов для генотипирования. Все выявленные полиморфизмы выделены красным цветом.On sequences 1-10 (see the list of sequences), a comparative analysis of the nucleotide sequences of the selected genes with the localization of all oligonucleotides for genotyping is presented. All identified polymorphisms are highlighted in red.
Таким образом:In this way:
1) Метод генотипирования Mycobacterium tuberculosis по настоящему изобретению основан на однонуклеотидном полиморфизме функциональных регуляторных генов систем токсин-антитоксин суперсемейств VapBC, MazEF и HigAB.1) The genotyping method of Mycobacterium tuberculosis of the present invention is based on a single nucleotide polymorphism of the functional regulatory genes of the VapBC, MazEF and HigAB superfamily toxin-antitoxin systems.
2) Предлагаемый метод предусматривает проведение амплификации с геномной ДНК с использованием предлагаемого набора 10 пар олигонуклеотидов с последующим секвенированием наработанных фрагментов.2) The proposed method involves amplification with genomic DNA using the proposed set of 10 pairs of oligonucleotides, followed by sequencing of the generated fragments.
3) Предлагаемый метод позволяет точно и быстро проводить генотипирование микобактерий в режиме ПЦР, ПЦР в реальном времени, мультилокусной ПЦР с последующим секвенированием, в том числе в системе MiSeq («Illumina», США) и GS Junior («Roche», Швейцария).3) The proposed method allows accurate and fast genotyping of mycobacteria in PCR, real-time PCR, multilocus PCR followed by sequencing, including in the MiSeq system (Illumina, USA) and GS Junior (Roche, Switzerland).
Осуществление изобретенияThe implementation of the invention
Культуру микобактерий выращивают в жидкой питательной среде LB при 37°С в аэрируемых условиях в термостатируемом шейкере-инкубаторе Multitron («Infors») при 250 об/мин в течение 18 часов, после чего выделяют геномную ДНК.A mycobacterial culture was grown in LB liquid medium at 37 ° C under aerated conditions in a Multitron temperature-controlled incubator shaker (“Infors”) at 250 rpm for 18 hours, after which genomic DNA was isolated.
Для этого клетки из 20 мл ночной культуры осаждают центрифугированием при 4000g в течение 10 мин и ресуспендируют в 10 мл буфера (10 мМ Трис-HCl, 10 мМ ЭДТА-Na2, рН 8.0). Полученную суспензию центрифугируют в тех же условиях и осадок ресуспендируют в 500 мкл выше указанного буфера, затем суспензию переносят в 2-мл центрифужную пробирку и добавляют 50 мкл хлороформа. Смесь энергично встряхивают с помощью вортекса (5 раз по 10 сек), вносят 100 мкл раствора лизоцима (60 мг/мл) и инкубируют 30 мин при 37°С. Добавляют 6 мкл РНКазы А (10 мг/мл) и инкубируют еще 30 мин при 37°С. Для лизиса клеток к суспензии добавляют 200 мкл 10% SDS и 200 мкл 5М NaCl, осторожно перемешивают и инкубируют 16 ч при 65°С. Полученный лизат клеток остужают до комнатной температуры, добавляют 1 мл смеси фенол/хлороформ (1:1) и перемешивают путем переворачивания пробирки в течение 5 мин до состояния гомогенной эмульсии. Затем смесь центрифугируют при 12000g в течение 15 мин. Водную фазу, содержащую ДНК, отбирают в новую 1.5-мл пробирку и смешивают с 600 мкл изопропанола. Смесь инкубируют 30 мин при комнатной температуре и центрифугируют при 12000g в течение 20 мин. Осадок ДНК трижды промывают порциями по 0.5 мл 75% этанола с центрифугированием по 5 мин при 12000g и растворяют в 100 мкл воды.For this, cells from 20 ml of overnight culture are pelleted by centrifugation at 4000 g for 10 min and resuspended in 10 ml of buffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA-Na 2 , pH 8.0). The resulting suspension was centrifuged under the same conditions and the pellet was resuspended in 500 μl above the indicated buffer, then the suspension was transferred to a 2 ml centrifuge tube and 50 μl of chloroform was added. The mixture is vigorously shaken with a vortex (5 times for 10 seconds), 100 μl of lysozyme solution (60 mg / ml) is added and incubated for 30 min at 37 ° C. Add 6 μl of RNase A (10 mg / ml) and incubate for another 30 min at 37 ° C. For cell lysis, 200 μl of 10% SDS and 200 μl of 5M NaCl are added to the suspension, mix gently and incubate for 16 hours at 65 ° C. The resulting cell lysate was cooled to room temperature, 1 ml of a phenol / chloroform mixture (1: 1) was added and stirred by inverting the tube for 5 min to a homogeneous emulsion. The mixture is then centrifuged at 12000g for 15 minutes. The aqueous phase containing DNA was taken into a new 1.5 ml tube and mixed with 600 μl of isopropanol. The mixture was incubated for 30 minutes at room temperature and centrifuged at 12000g for 20 minutes. The DNA precipitate is washed three times with 0.5 ml of 75% ethanol each by centrifugation for 5 min at 12000 g and dissolved in 100 μl of water.
При выборе для генотипирования режима ПЦР амплификацию ДНК проводят с использованием набора High Fidelity PCR Enzyme Mix («Fermentas») на приборе «Терцик» («ДНК-технология»). Состав смеси для ПЦР (на 100 мкл): 10 мкл 10×ПЦР буфера (10Х High Fidelity PCR Buffer with 15 mM MgCl2), 10 мкл смеси 2 mM ΣdNTPs (либо 2 мкл 10 mM ΣdNTPs), 5 мкл DMSO, 0.3 мкг геномной ДНК и 1 мкл (1.25 и) фермента High Fidelity PCR Enzyme Mix. Олигонуклеотидные праймеры добавляют в концентрации 20 пмоль на 100 мкл смеси.When choosing the PCR mode for genotyping, DNA amplification is performed using the High Fidelity PCR Enzyme Mix kit (“Fermentas”) on a Tertsik device (“DNA technology”). Composition of the mixture for PCR (per 100 μl): 10 μl of 10 × PCR buffer (10X High Fidelity PCR Buffer with 15 mM MgCl2), 10 μl of a mixture of 2 mM ΣdNTPs (or 2 μl of 10 mM ΣdNTPs), 5 μl of DMSO, 0.3 μg of genomic DNA and 1 μl (1.25 i) of High Fidelity PCR Enzyme Mix. Oligonucleotide primers are added at a concentration of 20 pmol per 100 μl of the mixture.
Параметры ПЦР реакции: 95°С в течение 5 мин (лизис клеток и денатурация геномной ДНК); затем 35 циклов амплификации - 94°С - 1 мин (денатурация), 64°С в течение 0.5 мин (отжиг олигонуклеотидов), 72°С - 40 сек (достройка (элонгация) цепи); финальная элонгация фрагментов при 72°С - 10 мин, хранение при 4°С.PCR reaction parameters: 95 ° C for 5 min (cell lysis and denaturation of genomic DNA); then 35 cycles of amplification - 94 ° С - 1 min (denaturation), 64 ° С for 0.5 min (annealing of oligonucleotides), 72 ° С - 40 sec (completion (extension) of the chain); final elongation of fragments at 72 ° С - 10 min, storage at 4 ° С.
Результаты амплификации учитывают путем анализа продуктов амплификации исследуемых образцов методом электрофореза в 1% агарозном геле. В пробирки с исследуемыми образцами после завершения амплификации вносят аккуратно под масло 1/5 объема раствора 6Х DNA Loading Dye («Fermentas»), перемешивают и 10 мкл полученного образца вносят в лунки агарозного геля. Электрофорез проводят в камере для горизонтального электрофореза "SE-2" (Компания «Хеликон») с источником питания "Эльф-4" («ДНК-технология») при напряжении 120 вольт в течение 60 мин. Результаты электрофореза учитывают в ультрафиолетовом свете с длинной волны 254 нм на трансиллюминаторе TCP-20 MC («Vilber Lourmat», Франция). В качестве контроля размера полученного фрагмента используют ДНК маркер GeneRuler™ 50+ п.н. («Fermentas»).The amplification results are taken into account by analyzing the amplification products of the test samples by electrophoresis in 1% agarose gel. After amplification is completed, 1/5 of the 6X DNA Loading Dye solution (Fermentas) is carefully added under oil to the tubes with the test samples after amplification, mixed, and 10 μl of the obtained sample is added to the wells of the agarose gel. Electrophoresis is carried out in a SE-2 horizontal electrophoresis chamber (Helikon Company) with an Elf-4 power source (DNA technology) at a voltage of 120 volts for 60 minutes. The results of electrophoresis are taken into account in ultraviolet light with a wavelength of 254 nm on a TCP-20 MC transilluminator (Vilber Lourmat, France). As a control of the size of the obtained fragment, a DNA marker GeneRuler ™ 50+ bp was used. ("Fermentas").
Полученные целевые фрагменты выделяют из ПЦР-смеси с использованием набора QIAquick® PCR Purification Kit («Qiagen») или GeneJET™ PCR Purification Kit («Fermentas») и секвенируют для выявления полиморфизмов, соответствующих генотипам штаммов М.tuberculosis.The resulting target fragments were isolated from the PCR mixture using the QIAquick® PCR Purification Kit (“Qiagen”) or GeneJET ™ PCR Purification Kit (“Fermentas”) and sequenced to identify polymorphisms corresponding to the genotypes of M. tuberculosis strains.
Предлагаемый метод идентификации можно использовать для генотипирования в режиме ПЦР в реальном времени, мультилокусной ПЦР с последующим секвенированием.The proposed identification method can be used for genotyping in real-time PCR mode, multilocus PCR followed by sequencing.
Оценка результатовEvaluation of the results
Исследуемый штамм относится к генотипу Beijing в случае выявления полиморфизмов A46→G46 при секвенировании фрагмента, наработанного при использовании олигонуклеотидов Rv2103cN-Rv2103cC; C363→T363 при использовании олигонуклеотидов Rv1956N-Rv1956C и T143→C143 при использовании олигонуклеотидов Rv2494N-Rv2494C.The studied strain belongs to the Beijing genotype in the case of detection of A 46 → G 46 polymorphisms during sequencing of a fragment obtained using Rv2103cN-Rv2103cC oligonucleotides; C 363 → T 363 when using Rv1956N-Rv1956C oligonucleotides and T 143 → C 143 when using Rv2494N-Rv2494C oligonucleotides.
Исследуемый штамм относится к генотипу EAI в случае выявления полиморфизмов C267→G267 и A268→G268 при секвенировании фрагмента, наработанного при использовании олигонуклеотидов Rv0749N-Rv0749C и G192→A192 при использовании олигонуклеотидов Rv2595N-Rv2595C.The studied strain belongs to the EAI genotype in the case of the identification of C 267 → G 267 and A 268 → G 268 polymorphisms when sequencing a fragment obtained using Rv0749N-Rv0749C and G 192 → A 192 oligonucleotides using Rv2595N-Rv2595C oligonucleotides.
Исследуемый штамм относится к генотипу Ural в случае выявления полиморфизма C394→T394 при секвенировании фрагмента, наработанного при использовании олигонуклеотидов Rv1397N-Rv1397C.The studied strain belongs to the Ural genotype in the case of the detection of C 394 → T 394 polymorphism during sequencing of a fragment obtained using Rv1397N-Rv1397C oligonucleotides.
Исследуемый штамм относится к генотипу LAM9 в случае выявления полиморфизма G3→А3 при секвенировании фрагмента, наработанного при использовании олигонуклеотидов Rv2274N-Rv2274C.The studied strain belongs to the LAM9 genotype in the case of detection of G 3 → A 3 polymorphism during sequencing of a fragment obtained using Rv2274N-Rv2274C oligonucleotides.
Исследуемый штамм относится к генотипу LAM в случае выявления полиморфизма C137→Т137 при секвенировании фрагмента, наработанного при использовании олигонуклеотидов Rv3408N-Rv3408C и при отсутствии других полиморфизмов.The studied strain belongs to the LAM genotype in the case of detection of C 137 → T 137 polymorphism during sequencing of a fragment obtained using Rv3408N-Rv3408C oligonucleotides and in the absence of other polymorphisms.
Исследуемый штамм относится к генотипу F15/LAM4/KZN в случае выявления полиморфизмов C168→Т168 при секвенировании фрагмента, наработанного при использовании олигонуклеотидов Rv2494N-Rv2494C и C140→A140 при использовании олигонуклеотидов Rv1740N-Rv1740C.The studied strain belongs to the F15 / LAM4 / KZN genotype in the case of detection of C 168 → T 168 polymorphisms when sequencing a fragment obtained using Rv2494N-Rv2494C oligonucleotides and C 140 → A 140 using Rv1740N-Rv1740C oligonucleotides.
Исследуемый штамм относится к генотипу SMI-049 в случае выявления полиморфизма G213→C213 при секвенировании фрагмента, наработанного при использовании олигонуклеотидов Rv2526N-Rv2526C.The studied strain belongs to the genotype SMI-049 in the case of detection of polymorphism G 213 → C 213 when sequencing a fragment obtained using Rv2526N-Rv2526C oligonucleotides.
Исследуемый штамм относится к генотипу Haarlem в случае выявления полиморфизма G197→C197 при секвенировании фрагмента, наработанного при использовании олигонуклеотидов Rv2494N-Rv2494C.The studied strain belongs to the Haarlem genotype in the case of detection of the G 197 → C 197 polymorphism during sequencing of a fragment obtained using Rv2494N-Rv2494C oligonucleotides.
Исследуемый штамм относится к генотипу Т в случае выявления полиморфизмов T137→C137 при секвенировании фрагмента, наработанного при использовании олигонуклеотидов Rv3408N-Rv3408C.The studied strain belongs to the T genotype in the case of detection of T 137 → C 137 polymorphisms during sequencing of a fragment obtained using Rv3408N-Rv3408C oligonucleotides.
Примеры идентификации по настоящему изобретениюIdentification Examples of the Present Invention
Пример 1.Example 1
Наработка фрагментов с геномной ДНК контрольного секвенированного штамма M.tuberculosis H37Rv с использованием сконструированных олигонуклеотидов.Generation of fragments with genomic DNA of a control sequenced strain of M. tuberculosis H37Rv using constructed oligonucleotides.
Для проверки правильности конструирования олигонуклеотидов была проведена амплификация с геномной ДНК типового штамма M.tuberculosis H37Rv по методике, описанной выше. Анализ ПЦР продуктов в 1% агарозном геле показал, что в процессе реакции получены 10 ампликонов ожидаемой длины. Секвенирование выделенных фрагментов и анализ in silico показали 100% идентичность с соответствующими участками генома штамма H37Rv.To verify the correct construction of oligonucleotides, amplification with genomic DNA of a typical strain of M. tuberculosis H37Rv was carried out according to the procedure described above. Analysis of PCR products in a 1% agarose gel showed that 10 amplicons of the expected length were obtained during the reaction. Sequencing of the isolated fragments and in silico analysis showed 100% identity with the corresponding regions of the H37Rv strain genome.
Таким образом, предлагаемый набор олигонуклеотидов позволяет селективно отбирать фрагменты для последующего выявления полиморфизмов, соответствующих разным генотипам M.tuberculosis.Thus, the proposed set of oligonucleotides allows you to selectively select fragments for subsequent identification of polymorphisms corresponding to different M. tuberculosis genotypes.
Пример 2.Example 2
Генотипирование изолятов M.tuberculosis из российских коллекций с применением предлагаемого метода идентификации.Genotyping of M. tuberculosis isolates from Russian collections using the proposed identification method.
Для анализа использованы 18 образцов геномной ДНК M.tuberculosis, полученной из коллекции Центрального научно-исследовательского института эпидемиологии (г. Москва). Образцы выделены из мокроты пациентов, больных туберкулезом.For analysis, 18 samples of M. tuberculosis genomic DNA obtained from the collection of the Central Research Institute of Epidemiology (Moscow) were used. Samples isolated from sputum of patients with tuberculosis.
Генотипирование проводили путем амплификации с использованием предложенного набора праймеров. Результаты секвенирования полученных фрагментов показали, что 9 штаммов из исследованного набора принадлежат к пекинскому генотипу, 1 штамм к генотипу Haarlem и 8 штаммов - к генотипу LAM (Таблица 3). Таким образом, результаты совпали с данными генотипирования, полученными методом сполиготипирования. Результаты также совпадают с эпидемиологическими данными по распространению на территории РФ различных генотипов [Mokrousov I. et al. Mycobacterium tuberculosis population in northwestern Russia: an update from Russian-EU/Latvian border region. PLoS One. 2012. 7(7): e41318].Genotyping was performed by amplification using the proposed set of primers. Sequencing of the obtained fragments showed that 9 strains from the studied set belong to the Beijing genotype, 1 strain to the Haarlem genotype and 8 strains to the LAM genotype (Table 3). Thus, the results coincided with the genotyping data obtained by spoligotyping. The results also coincide with epidemiological data on the distribution of various genotypes in the territory of the Russian Federation [Mokrousov I. et al. Mycobacterium tuberculosis population in northwestern Russia: an update from Russian-EU / Latvian border region. Plos one. 2012.7 (7): e41318].
Пример 3.Example 3
Генотипирование изолятов M.tuberculosis из российских коллекций с помощью коммерческих наборов для штаммовой идентификации.Genotyping of M. tuberculosis isolates from Russian collections using commercial strain identification kits.
Для анализа использованы 18 образцов геномной ДНК, полученной из коллекции Центрального научно-исследовательского института эпидемиологии.For analysis, 18 samples of genomic DNA obtained from the collection of the Central Research Institute of Epidemiology were used.
В работе был использованы набор АМПЛИТУБ-Beijing («Синтол», Россия), позволяющий определить принадлежность штамма к пекинскому генотипу. По результатам ПЦР-РТ, проведенной с набором АМПЛИТУБ-Beijing, из 18 исследованных штаммов 9 принадлежат к пекинскому генотипу, что совпадает с генотипированием по предлагаемому методу идентификации.In the work, we used the AMPLITUB-Beijing kit (Synthol, Russia), which allows us to determine the belonging of the strain to the Beijing genotype. According to the results of PCR-RT performed with the AMPLITUB-Beijing kit, of the 18 studied strains, 9 belong to the Beijing genotype, which coincides with genotyping by the proposed identification method.
Пример 4.Example 4
Биоинформатический анализ секвенированных геномов российских штаммов M.tuberculosis, представленных в базе данных SRA.Bioinformatics analysis of sequenced genomes of Russian M. tuberculosis strains presented in the SRA database.
С использованием разработанных праймеров для 10 генов систем ТА с использованием программы BLAST проанализировано 38 секвенированных геномов M.tuberculosis российского происхождения, депонированных в базе данных SRA (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra), относящихся к 3 генотипам: Beijing, Ural и LAM. Генотипы всех штаммов, установленные с использованием предлагаемых нами генов, полностью идентичны генотипам, заявленным авторами представленных в базе штаммов.Using the developed primers for 10 genes of TA systems using the BLAST program, 38 sequenced genomes of M. tuberculosis of Russian origin were analyzed, deposited in the SRA database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra), belonging to 3 genotypes : Beijing, Ural and LAM. The genotypes of all strains identified using the genes we offer are completely identical to the genotypes declared by the authors of the strains presented in the database.
Пример 5.Example 5
Биоинформатическое генотипирование M.tuberculosis из базы данных секвенированных геномов, изолированных в Панаме.Bioinformatic genotyping of M. tuberculosis from a database of sequenced genomes isolated in Panama.
С использованием разработанных праймеров для 10 генов систем ТА проведен анализ 67 draft-геномов лекарственно-устойчивых штаммов Mycobacterium tuberculosis, изолированных в Панаме. [Lanzas F. et al. Multidrug-resistant tuberculosis in Panama is driven by clonal expansion of a multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis strain related to the KZN extensively drug-resistant M.tuberculosis strain from South Africa., J Clin Microbiol, 2013. 51(10):3277-85]. Перед депонированием штаммов в базу данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/) были определены их сполиготипы.Using the developed primers for 10 genes of TA systems, 67 draft genomes of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis strains isolated in Panama were analyzed. [Lanzas F. et al. Multidrug-resistant tuberculosis in Panama is driven by clonal expansion of a multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis strain related to the KZN extensively drug-resistant M. tuberculosis strain from South Africa., J Clin Microbiol, 2013.51 (10): 3277-85 ]. Before the strains were deposited in the NCBI database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/), their spoligotypes were determined.
Штаммы PanR0605 и PanR0606 имели следующие snp-полиморфизмы, на основании которых относятся к генотипу Beijing:The strains PanR0605 and PanR0606 had the following snp polymorphisms, based on which belong to the Beijing genotype:
- в гене rv2103c (токсин VapC37) обнаружена замена A46→G46;- in the rv2103c gene (VapC37 toxin), the replacement A 46 → G 46 was detected;
- в гене rv1956 (токсин HigA) характерна замена C363→T363;- in the rv1956 gene (HigA toxin), the replacement is C 363 → T 363 ;
- в гене rv2494 (токсин VapC38) характерна замена T143→C143.- in the rv2494 gene (VapC38 toxin), the replacement is T 143 → C 143 .
На основании сполиготипирования данные штаммы также отнесены к линии PGG-1, которой соответствует генотипу Beijing [Rahim Z. et al. Assessment of population structure and major circulating phylogeographical clades of Mycobacterium tuberculosis complex in Bangladesh suggests a high prevalence of a specific subclade of ancient M.tuberculosis genotypes. J Clin Microbiol. 2007. 45(11):3791-3794].Based on spoligotyping, these strains are also assigned to the PGG-1 line, which corresponds to the Beijing genotype [Rahim Z. et al. Assessment of population structure and major circulating phylogeographical clades of Mycobacterium tuberculosis complex in Bangladesh suggests a high prevalence of a specific subclade of ancient M. tuberculosis genotypes. J Clin Microbiol. 2007. 45 (11): 3791-3794].
В гене токсина VapC38 (rv2494) у штаммов PanR0907, PanR0902, PanR0801, PanR0206, PanR0315, PanR0301, PanR0305, PanR0316 была обнаружена замена G197→C197, соответствующая генотипу Haarlem.In the VapC38 toxin gene (rv2494) in the strains PanR0907, PanR0902, PanR0801, PanR0206, PanR0315, PanR0301, PanR0305, PanR0316, the replacement G 197 → C 197 corresponding to the Haarlem genotype was found.
У штамма PanR0908 присутствует замена C137→T137 в гене rv3408, характерная для генотипа Т.The strain PanR0908 has a C 137 → T 137 substitution in the rv3408 gene, characteristic of genotype T.
У штаммов PanR0202, PanR0208 и PanR0309 в гене токсина Vap31 (rv0749) обнаружены две замены C267→G267 и A268→G268, но замены в гене rv2595, характерной для EAI (включая линию филлипин), обнаружено не было. На основании сполиготипирования данные штаммы отнесены к кластеру Т. Можно сделать предположение, что PanR0202, PanR0208 и PanR0309 занимают промежуточное положение между Т и подгруппой филлипин генотипа EAI.Two strains C 267 → G 267 and A 268 → G 268 were found in the strains PanR0202, PanR0208, and PanR0309 in the Vap31 toxin gene (rv0749), but no substitutions were found in the rv2595 gene characteristic of EAI (including the phillipin line). Based on spoligotyping, these strains are assigned to cluster T. It can be assumed that PanR0202, PanR0208, and PanR0309 occupy an intermediate position between T and the phillipin subgroup of the EAI genotype.
У штаммов PanR1006, PanR1101, PanR0201, PanR0203, PanR0209, PanR0207, PanR0206, PanR0205, PanR0315, PanR0304, PanR0306, PanR0307, PanR0308, PanR0311, PanR0313, PanR0314, PanR0317, PanR0401, PanR0402, PanR0403, PanR0404, PanR0405, PanR0407, PanR0409, PanR0410, PanR0411, PanR0412, PanR0611, PanR0610, PanR0609, PanR0607, PanR0604, PanR0603, PanR0602, PanR0601, PanR0505, PanR0503, PanR0501, PanR1007, PanR0909, PanR0906, PanR0904, PanR0903, PanR0805, PanR0804, PanR0803, PanR0708, PanR0707, PanR0703 и PanR0702 в гене rv3408 был выявлен полиморфизм C137→T137, а другие полиморфизмы отсутствуют, это позволяет отнести их к генотипу LAM.In PanR1006 strains, PanR1101, PanR0201, PanR0203, PanR0209, PanR0207, PanR0206, PanR0205, PanR0315, PanR0304, PanR0306, PanR0307, PanR0308, PanR0311, PanR0313, PanR0314, PanR0317, PanR0401, PanR0402, PanR0403, PanR0404, PanR0405, PanR0407, PanR0409, PanR0410, PanR0411, PanR0412, PanR0611, PanR0610, PanR0609, PanR0607, PanR0604, PanR0603, PanR0602, PanR0601, PanR0505, PanR0503, PanR0501, PanR1007, PanR0909, PanR0906, PanR0904, PanR0903, PanR0805, PanR0804, PanR0803, PanR0708, PanR0707, PanR0703 and PanR0702 in the rv3408 gene, C 137 → T 137 polymorphism was detected, and other polymorphisms are absent, which allows us to attribute them to the LAM genotype.
Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает высокую чувствительность генотипирования Mycobacterium tuberculosis.Thus, the proposed method provides high sensitivity genotyping of Mycobacterium tuberculosis.
Claims (1)
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013155216/10A RU2547598C1 (en) | 2013-12-12 | 2013-12-12 | METHOD OF GENOTYPING STRAINS Mycobacterium tuberculosis |
| PCT/RU2014/000559 WO2015088384A1 (en) | 2013-12-12 | 2014-07-24 | Use of type ii toxin-antitoxin system genes to genotype strains of mycobacterium tuberculosis |
| EA201600315A EA028354B1 (en) | 2013-12-12 | 2014-07-24 | Use of type ii toxin-antitoxin system genes to genotype strains of mycobacterium tuberculosis |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013155216/10A RU2547598C1 (en) | 2013-12-12 | 2013-12-12 | METHOD OF GENOTYPING STRAINS Mycobacterium tuberculosis |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2547598C1 true RU2547598C1 (en) | 2015-04-10 |
Family
ID=53296402
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013155216/10A RU2547598C1 (en) | 2013-12-12 | 2013-12-12 | METHOD OF GENOTYPING STRAINS Mycobacterium tuberculosis |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EA (1) | EA028354B1 (en) |
| RU (1) | RU2547598C1 (en) |
| WO (1) | WO2015088384A1 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2612894C1 (en) * | 2015-12-11 | 2017-03-13 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН (ИХБФМ СО РАН) | Method for brca1 and brca2 genes exons nucleotide sequence determination |
| RU2689800C1 (en) * | 2017-12-07 | 2019-05-29 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for detection of isolates mycobacterium tuberculosis beijing 94-32-cluster in real time format |
| RU2760751C1 (en) * | 2021-06-09 | 2021-11-30 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр фтизиопульмонологии и инфекционных заболеваний" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ФПИ" Минздрава России) | Strain of mycobacterium tuberculosis bn for modelling latent tuberculosis infection |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106048019A (en) * | 2016-06-13 | 2016-10-26 | 遵义医学院附属医院 | Antituberculous drug drug-resistance gene and screening method thereof |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2237090C1 (en) * | 2003-04-24 | 2004-09-27 | Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН | Method for genetic typing mycobacterium strains of tuberculosis complex |
| RU2405836C2 (en) * | 2008-05-12 | 2010-12-10 | Федеральное государственное учреждение "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи" | Method for mycobacterium tuberculosis beijing genotype detection |
| US20110105531A1 (en) * | 2007-06-22 | 2011-05-05 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions and methods for identification of subspecies characteristics of mycobacterium tuberculosis |
-
2013
- 2013-12-12 RU RU2013155216/10A patent/RU2547598C1/en not_active IP Right Cessation
-
2014
- 2014-07-24 WO PCT/RU2014/000559 patent/WO2015088384A1/en active Application Filing
- 2014-07-24 EA EA201600315A patent/EA028354B1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2237090C1 (en) * | 2003-04-24 | 2004-09-27 | Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН | Method for genetic typing mycobacterium strains of tuberculosis complex |
| US20110105531A1 (en) * | 2007-06-22 | 2011-05-05 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions and methods for identification of subspecies characteristics of mycobacterium tuberculosis |
| RU2405836C2 (en) * | 2008-05-12 | 2010-12-10 | Федеральное государственное учреждение "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи" | Method for mycobacterium tuberculosis beijing genotype detection |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Jia-Ru Chang et al., Clonal Expansion of Both Modern and Ancient Genotypes of Mycobacterium tuberculosis in Southern Taiwan, PLOS ONE, August 2012, Volume 7, Issue 8, e43018-e43018 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2612894C1 (en) * | 2015-12-11 | 2017-03-13 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН (ИХБФМ СО РАН) | Method for brca1 and brca2 genes exons nucleotide sequence determination |
| RU2689800C1 (en) * | 2017-12-07 | 2019-05-29 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for detection of isolates mycobacterium tuberculosis beijing 94-32-cluster in real time format |
| RU2760751C1 (en) * | 2021-06-09 | 2021-11-30 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр фтизиопульмонологии и инфекционных заболеваний" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ФПИ" Минздрава России) | Strain of mycobacterium tuberculosis bn for modelling latent tuberculosis infection |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EA201600315A1 (en) | 2016-08-31 |
| EA028354B1 (en) | 2017-11-30 |
| WO2015088384A1 (en) | 2015-06-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Abadia et al. | Resolving lineage assignation on Mycobacterium tuberculosis clinical isolates classified by spoligotyping with a new high-throughput 3R SNPs based method | |
| Tarr et al. | Identification of Vibrio isolates by a multiplex PCR assay and rpoB sequence determination | |
| Crowder et al. | Genotypic variation and mixtures of Lyme Borrelia in Ixodes ticks from North America and Europe | |
| JP5116481B2 (en) | A method for simplifying microbial nucleic acids by chemical modification of cytosine | |
| TWI647236B (en) | Primers, snp markers and method for genotyping mycobacterium tuberculosis | |
| Shah et al. | Allele-specific PCR method based on rfbS sequence for distinguishing Salmonella gallinarum from Salmonella pullorum: serotype-specific rfbS sequence polymorphism | |
| RU2547598C1 (en) | METHOD OF GENOTYPING STRAINS Mycobacterium tuberculosis | |
| Whistler et al. | Use of whole-genome phylogeny and comparisons for development of a multiplex PCR assay to identify sequence type 36 Vibrio parahaemolyticus | |
| Hong et al. | Molecular markers reveal epidemiological patterns and evolutionary histories of the human pathogenic Cryptococcus | |
| Jeong et al. | CRISPR elements provide a new framework for the genealogy of the citrus canker pathogen Xanthomonas citri pv. citri | |
| US20190040455A1 (en) | Systems and methods for the detection of infectious diseases | |
| Alanagreh et al. | Assessing intragenomic variation of the internal transcribed spacer two: Adapting the Illumina metagenomics protocol | |
| Xiao et al. | Cas12a/guide RNA-based platform for rapid and accurate identification of major Mycobacterium species | |
| Chen et al. | Multi-locus characterization and phylogenetic inference of Leishmania spp. in snakes from Northwest China | |
| CN112384608A (en) | Bacterial capture sequencing platform and design, construction and use methods thereof | |
| Muñoz et al. | An American lineage of Helicobacter pylori prophages found in Colombia | |
| Guerbouj et al. | Molecular tools for understanding eco-epidemiology, diversity and pathogenesis of Leishmania parasites | |
| Asgharzadeh et al. | Current trends in molecular epidemiology studies of Mycobacterium tuberculosis | |
| RU2689800C1 (en) | Method for detection of isolates mycobacterium tuberculosis beijing 94-32-cluster in real time format | |
| Dijkshoorn | Acinetobacter baumannii | |
| JP2016049109A (en) | Genotyping method for escherichia coli, and primer set for use in the same | |
| RU2735415C1 (en) | Method for detecting mycobacteria tuberculosis central asian epidemic cluster beijing genotype | |
| CN114250310B (en) | DNA methylation marker, diagnosis model, methylation probe and kit for detecting tuberculosis | |
| Djelouadji et al. | Pyrosequencing identification of Mycobacterium tuberculosis W-Beijing | |
| JP2019004811A (en) | Clostridium difficile genotype typing method and primer set used therefor |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20201213 |