RU2542396C1 - Method and kit for enhanced laboratory diagnosis of pertussis infection - Google Patents
Method and kit for enhanced laboratory diagnosis of pertussis infection Download PDFInfo
- Publication number
- RU2542396C1 RU2542396C1 RU2013149234/15A RU2013149234A RU2542396C1 RU 2542396 C1 RU2542396 C1 RU 2542396C1 RU 2013149234/15 A RU2013149234/15 A RU 2013149234/15A RU 2013149234 A RU2013149234 A RU 2013149234A RU 2542396 C1 RU2542396 C1 RU 2542396C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- pertussis
- clinical
- dna
- mixture
- patient
- Prior art date
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицинской микробиологии, в частности к лабораторной диагностике возбудителей инфекционных заболеваний.The invention relates to the field of medical microbiology, in particular for laboratory diagnosis of infectious pathogens.
Лабораторная диагностика коклюша включает в себя как прямые методы выделения возбудителя, так и непрямые - серологическая диагностика (обнаружение антител к возбудителю коклюша). Однако проведение бактериологического исследования занимает достаточно продолжительное время (от начала исследования до выдачи ответа проходит от 5 до 7 дней), а эффективность выделения возбудителя в практических условиях не превышает 10,0% [1, 2, 3, 4] и в редких случаях доходит до 20%, что обусловлено, как биологическими особенностями самого возбудителя коклюша, так и недостатками на этапе обследования больных. Эффективность бактериологической диагностики зависит от сроков обследования и терапии антибактериальными препаратами - в более поздние сроки и на фоне антибиотикотерапии высеваемость возбудителя коклюша резко снижается. Существующие серологические методы лабораторной диагностики коклюша результативны только к 4-ой неделе заболевания и, поэтому, могут быть использованы только для ретроспективного анализа [1, 2, 3, 4, 5, 6]. Серологическое обследование является информативным только для не вакцинированных детей старше 1 года и взрослых. Кроме того, существует сложность интерпретации результатов серологического обследования у привитых детей, а также низкая продукция противококлюшных антител у детей в возрасте до 1 года, что затрудняет использование данного метода в практических условиях. Следовательно, основные методы индикации возбудителя коклюша являются недостаточно чувствительными и эффективными или используются для ретроспективного анализа, что, в свою очередь, приводит к снижению качества лабораторной диагностики коклюшной инфекции.Laboratory diagnosis of pertussis includes both direct methods for isolating the pathogen, and indirect methods - serological diagnosis (detection of antibodies to the causative agent of pertussis). However, the bacteriological study takes a fairly long time (from the start of the study to the response passes from 5 to 7 days), and the efficiency of isolation of the pathogen in practical conditions does not exceed 10.0% [1, 2, 3, 4] and in rare cases it reaches up to 20%, which is due to both biological characteristics of the pertussis pathogen itself and deficiencies at the stage of examination of patients. The effectiveness of bacteriological diagnosis depends on the timing of the examination and treatment with antibacterial drugs - at a later date and against the background of antibiotic therapy, the seeding rate of the pertussis pathogen decreases sharply. Existing serological methods for laboratory diagnosis of pertussis are effective only by the 4th week of the disease and, therefore, can only be used for retrospective analysis [1, 2, 3, 4, 5, 6]. Serological examination is informative only for unvaccinated children older than 1 year and adults. In addition, there is a difficulty in interpreting the results of a serological examination in vaccinated children, as well as low production of antitussive antibodies in children under the age of 1 year, which complicates the use of this method in practical conditions. Therefore, the main methods for indicating the pertussis pathogen are not sensitive enough and effective or are used for retrospective analysis, which, in turn, leads to a decrease in the quality of laboratory diagnosis of pertussis infection.
Поэтому использование молекулярно-генетических технологий с целью разработки высокочувствительных, специфичных, ускоренных и информативных способов обнаружения возбудителя коклюшной инфекции является актуальным и наиболее перспективным, как с точки зрения ранней диагностики коклюша, так и при обследовании детей младенческого возраста, установлении источника в окружении больного и при обследовании очагов инфекции.Therefore, the use of molecular genetic technologies in order to develop highly sensitive, specific, accelerated, and informative methods for detecting the causative agent of pertussis infection is relevant and most promising, both from the point of view of early diagnosis of whooping cough, and when examining infants, establishing a source in the patient’s environment, and examination of foci of infection.
Зарубежные исследователи на протяжении последних 10 лет используют, в основном, полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Были предложены различные ПЦР-технологии - классический вариант ПЦР, nested-ПЦР, ПЦР в режиме реального времени, позволяющие выявлять различные мишени в геноме B. pertussis [7, 5, 8, 9, 6, 10, 11]. Так ПЦР, основанная на выявлении промоторной области коклюшного токсина, является высокоспецифичной для B. pertussis, но имеет низкую чувствительность [5, 8]. В отличие от нее, IS 481 ПЦР метод высокочувствителен, однако данный вариант ПЦР выявляет не только B. pertussis, но и другие бордетеллы [7, 10, 11]. Учитывая большую гомологию геномов представителей рода Bordetella, применение ПЦР при лабораторной диагностике коклюша и других бордетеллезах имеет целый ряд недостатков.Over the past 10 years, foreign researchers have been using mainly the polymerase chain reaction (PCR). Various PCR technologies have been proposed — the classic version of PCR, nested-PCR, and real-time PCR, which make it possible to identify various targets in the B. pertussis genome [7, 5, 8, 9, 6, 10, 11]. So PCR, based on the identification of the promoter region of pertussis toxin, is highly specific for B. pertussis, but has a low sensitivity [5, 8]. In contrast, the IS 481 PCR method is highly sensitive, however, this PCR variant reveals not only B. pertussis, but also other bordetella [7, 10, 11]. Given the great homology of the genomes of representatives of the genus Bordetella, the use of PCR for laboratory diagnosis of whooping cough and other bordetellosis has a number of drawbacks.
Одной из перспективных технологий в настоящее время является использование изотермальной амплификации - loop-mediated isothermal amplification (LAMP), обладающей высокой чувствительностью и специфичностью, многократно превышающей технологии ПЦР, а также высокой амплификационной эффективностью [12]. Однако предложенный зарубежными исследователями вариант для выявления возбудителя коклюша был апробирован только на чистых культурах B. pertussis [13], а при испытании ограниченного количества клинического материала от больных давал ложноположительные результаты. Кроме того, способ предусматривал использование дорогостоящих реагентов и невозможность широкого применения в клинической диагностике в нашей стране.One of the promising technologies at present is the use of isothermal amplification - loop-mediated isothermal amplification (LAMP), which has high sensitivity and specificity, many times higher than PCR technology, as well as high amplification efficiency [12]. However, the option proposed by foreign researchers to identify the pertussis pathogen was tested only on pure cultures of B. pertussis [13], and when testing a limited amount of clinical material from patients, it gave false-positive results. In addition, the method involved the use of expensive reagents and the impossibility of widespread use in clinical diagnostics in our country.
На основе этой технологии в ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека был разработан способ и набор для ускоренной диагностики коклюша [14, 15, 16], который позволял выявить возбудителя заболевания в течение 9-10 часов от начала исследования непосредственно в клиническом материале от больного без этапа выделения «чистой» культуры. Недостатками данного способа является достаточная трудоемкость и длительность проведения этапа выделения ДНК из клинического материала, которая занимала 3-4 часа; использование большого набора реагентов для выделения ДНК; длительные периоды подготовки реакционной смеси и проведения амплификации, что в целом приводило к увеличению продолжительности исследования, которая составляла 9-10 часов.Based on this technology, FBSI “Moscow Research Institute of Epidemiology and Microbiology named after G.N. Gabrichevsky Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Well-Being, a method and kit for the accelerated diagnosis of whooping cough [14, 15, 16] was developed, which made it possible to identify the causative agent of the disease within 9-10 hours from the start of the study directly in the clinical material from patient without the stage of allocation of "pure" culture. The disadvantages of this method is the sufficient complexity and duration of the stage of DNA extraction from clinical material, which took 3-4 hours; the use of a large set of reagents for DNA isolation; long periods of preparation of the reaction mixture and amplification, which generally led to an increase in the duration of the study, which was 9-10 hours.
Задачей настоящего изобретения является разработка унифицированного, высокочувствительного и специфичного, малотрудоемкого способа и набора для ускоренной лабораторной диагностики коклюшной инфекции с целью выявления возбудителя заболевания в клиническом материале от больных в кратчайшие сроки (4,5-5 часов) и вне зависимости от стадии заболевания, а также при различных формах клинического течения, эффективного при обследовании больных любого возраста, очагов коклюшной инфекции и установлении источника инфекции.The objective of the present invention is to develop a unified, highly sensitive and specific, low-labor method and kit for accelerated laboratory diagnosis of pertussis infection in order to identify the causative agent of the disease in the clinical material from patients in the shortest possible time (4.5-5 hours) and regardless of the stage of the disease, and also with various forms of the clinical course, effective in examining patients of any age, foci of pertussis infection and establishing the source of infection.
В соответствии с поставленной задачей разработан способ и набор для ускоренной лабораторной диагностики коклюшной инфекции. Разработанный способ включает проведение следующих этапов: взятие патологического материала с задней стенки глотки больного, пробоподготовка клинического образца (смыв клинического материала с тампона от больного), выделение (экстракция) ДНК из клинического материала сорбционным методом, проведение амплификации при изотермальных условиях и электрофореза в агарозном геле.In accordance with the task, a method and kit for accelerated laboratory diagnosis of pertussis infection was developed. The developed method includes the following steps: taking pathological material from the back wall of the patient’s pharynx, sample preparation of the clinical sample (washing the clinical material from the patient’s swab), extraction (extraction) of DNA from the clinical material by the sorption method, amplification under isothermal conditions, and agarose gel electrophoresis .
Отличительными особенностями предложенного способа от вышеупомянутого прототипа являются: взятие патологического материала осуществляется двумя тампонами с задней стенки глотки больного и помещение их в транспортную среду, представляющую собой стерильный физиологический раствор в пробирке типа эппендорф; пробоподготовка клинического образца представляет собой смыв клинического материала с тампона путем перешивания пробирок типа эппендорф, содержащих тампоны, на микроцентрифуге типа вортекс в течение 5 минут, дальнейшее удаление тампонов из пробирок, отжимая содержимое о край пробирки, центрифугирование пробирок с клиническим материалом на микроцентрифуге при 12000 оборотах/мин в течение 3 минут, удаление надосадочной жидкости до окончательного объема в 200 мкл, встряхивание клинического материала на микроцентрифуге типа вортекс до полного ресуспендирования осадка; выделение (экстракция) ДНК из клинического материала осуществляется набором реагентов, который основан на сорбционном методе (в качестве коммерческого набора может быть использован набор для выделения ДНК «ДНК-сорбАМ» (производства «Интерлабсервис», г. Москва); приготовление реакционной смеси проводится путем смешивания первой смеси (смесь №1) (включает следующие реагенты: 10х реакционный буфер для ПЦР, 2 mM смесь нуклеотидов (dNTPs), 25 mM MgCl2, раствор Betaine и три пары праймеров (BP-F3 5′-CCGCATACGTGTTGGCA-3′ и BP-B3 5′-TGCGTTTTGATGGTGCCT-3′, BP-FIP 5′-TTGGATTGCAGTAGCGGGATGTGCATGCGTGCAGATTCGTC-3′ и BP-BIP 5′-CGCAAAGTCGCGCGATGGTAACGGATCACACCATGGCA-3′, BP-LF 5′-ACGGAAGAATCGAGGGTTTTGTAC-3′ и BP-LB 5′-GTCACCGTCCGGACCGTG-3′) и второй смеси (смесь №2), содержащей рабочее разведение Bst полимеразы в буферном растворе; амплификацию выполняют в изотермальном режиме при 65°C в течение 60 минут и далее при 80°C в течение 2 минут (продолжительность амплификации 62 минуты); далее проводят электрофорез в 2% агарозном геле при 160 V в течение 40 минут и продукты амплификации подвергают дифференциации путем сравнения электрофоретической подвижности полученных фрагментов ДНК с подвижностью контрольного образца ДНК штамма B. pertussis. При наличии специфического светящегося профиля, аналогичного контрольному образцу ДНК штамма B. pertussis, данный образец ДНК регистрируется, как содержащий ДНК штамма B. pertussis.Distinctive features of the proposed method from the aforementioned prototype are: the pathological material is taken with two tampons from the back wall of the patient’s pharynx and placed in a transport medium, which is a sterile physiological solution in an eppendorf tube; sample preparation of a clinical sample consists in flushing clinical material from a swab by reshaping eppendorf tubes containing swabs on a vortex microcentrifuge for 5 minutes, further removing tampons from the tubes, squeezing the contents on the edge of the tube, centrifuging the tubes with clinical material in a microcentrifuge at 12,000 rpm / min for 3 minutes, removing the supernatant to a final volume of 200 μl, shaking the clinical material in a microcentrifuge such as a vortex until fully resuspension of sediment; DNA extraction (extraction) from clinical material is carried out using a reagent kit that is based on the sorption method (a DNA sorbAM kit for DNA isolation (manufactured by Interlabservice, Moscow) can be used as a commercial kit; preparation of the reaction mixture is carried out by mixing the first mixture (mixture No. 1) (includes the following reagents: 10x PCR reaction buffer, 2 mM nucleotide mixture (dNTP s ), 25 mM MgCl 2 , Betaine solution, and three primer pairs (BP-F3 5′-CCGCATACGTGTTGGCA-3 ′ and BP-B3 5′-TGCGTTTTGATGGTGCCT-3 ′, BP-FIP 5′-TTGGATTGCAGTAGCGGGATGTGCATGCGTGCAGATTCG TC-3 ′ and BP-BIP 5′-CGCAAAGTCGCGCGATGGTAACGGATCACACCATGGCA-3 ′, BP-LF 5′-ACGGAAGAATCGAGGGTTTTTTGTAC-3 ′ and BP-LB 5′-GTCACCGTCCGGACCGTG-2 mix, 2 times working mixture) Bst polymerase in a buffer solution; amplification is carried out isothermally at 65 ° C for 60 minutes and then at 80 ° C for 2 minutes (duration of amplification 62 minutes); then electrophoresis is carried out on a 2% agarose gel at 160 V for 40 minutes and amplification products are differentiated by comparing the electrophoretic mobility of the obtained DNA fragments with the mobility of the control of sample DNA of the strain B. pertussis. In the presence of a specific luminous profile similar to the control sample of DNA of B. pertussis strain, this DNA sample is registered as containing the DNA of B. pertussis strain.
Апробация и клинические испытания способа для ускоренной лабораторной диагностики коклюшной инфекции проведены совместно с инфекционистами клинического отдела ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека на базе Инфекционной клинической больницы №1 г. Москвы.Testing and clinical trials of the method for accelerated laboratory diagnosis of pertussis infection were carried out jointly with infectious disease specialists of the clinical department of the Moscow Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology. G.N. Gabrichevsky ”Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Well-Being at the Infectious Clinical Hospital No. 1 of Moscow.
В соответствии с поставленной задачей обследовано 295 пациентов с клиническим диагнозом «коклюш» (различной степени тяжести) в возрасте от 1 месяца до 56 лет, в том числе 196 (66,4%) пациентов в возрасте до 1 года и 99 (33,6%) пациентов старше 1 года. Диагноз «коклюш» устанавливался на основании характерной клинической картины болезни, оценки эпидемиологической ситуации в окружении больного и результатов лабораторных обследований. Тяжесть коклюша оценивалась согласно общепринятой классификации, в соответствии с которой у 53 (17,9%) больных коклюш протекал в тяжелой форме, у 156 (52,8%) больных - в среднетяжелой форме и у 86 (29,3%) больных - в легкой форме. Больные были обследованы на разных сроках от момента начала заболевания. Способ был высокоэффективен при обследовании больных коклюшем с различными формами клинического течения заболевания - удельный вес положительных результатов выявления ДНК B. pertussis при тяжелой и легкой формах болезни был практически одинаковым и составлял - 87,4% и 83,1%, соответственно. Разработанный способ был высокоэффективен при обследовании детей раннего возраста - среди больных коклюшем в возрасте до 1 года ДНК возбудителя коклюша обнаружена в 88,4% случаев, а среди детей старше 1 года - в 60,0%. Кроме того, показана высокая эффективность способа при обследовании больных коклюшем в различные сроки от начала заболевания, начиная с 3 дня заболевания и до 31 дня от начала болезни. Таким образом, разработанный ускоренный способ лабораторной диагностики коклюшной инфекции обладает высокой диагностической эффективностью, эффективен на любых сроках от начала заболевания, при любых формах клинического течения, начиная с легких и стертых до тяжелых форм, а также на фоне проведения антибиотикотерапии. Кроме того, способ наиболее эффективен у детей в возрасте до 1 года, у взрослых со стертой клинической картиной заболевания, при расследовании источника инфекции в окружении больного, а также при обследовании очагов.In accordance with the task, 295 patients with a clinical diagnosis of pertussis (of varying severity) aged 1 month to 56 years were examined, including 196 (66.4%) patients under the age of 1 year and 99 (33.6 %) patients older than 1 year. The diagnosis of whooping cough was established on the basis of the characteristic clinical picture of the disease, the assessment of the epidemiological situation in the patient’s environment, and the results of laboratory examinations. Pertussis severity was assessed according to the generally accepted classification, according to which, in 53 (17.9%) patients, pertussis proceeded in a severe form, in 156 (52.8%) patients in a moderate form, and in 86 (29.3%) patients - in a light form. Patients were examined at different times from the onset of the disease. The method was highly effective in examining patients with whooping cough with various forms of the clinical course of the disease - the proportion of positive results of B. pertussis DNA detection in severe and mild forms of the disease was almost the same and amounted to 87.4% and 83.1%, respectively. The developed method was highly effective in examining young children: among patients with pertussis under the age of 1 year, the DNA of the pertussis pathogen was detected in 88.4% of cases, and among children over 1 year of age - in 60.0%. In addition, the high efficiency of the method is shown when examining patients with whooping cough at different times from the onset of the disease, starting from 3 days of the disease and up to 31 days from the onset of the disease. Thus, the developed accelerated method for laboratory diagnosis of pertussis infection has high diagnostic efficiency, is effective at any time from the onset of the disease, in any forms of the clinical course, from mild and erased to severe forms, as well as against the background of antibiotic therapy. In addition, the method is most effective in children under the age of 1 year, in adults with an erased clinical picture of the disease, when investigating the source of infection in the patient’s environment, and also when examining foci.
Техническим результатом заявленного изобретения является унифицированный, высокочувствительный, высокоспецифичный, малотрудоемкий способ для ускоренной лабораторной диагностики коклюшной инфекции, позволяющий выявлять возбудителя заболевания в течение 4,5-5 часов от начала исследования непосредственно в материале от больного вне зависимости от стадии заболевания и при различных формах клинического течения, а также на фоне проведения антибиотикотерапии. Применение разработанного способа и набора в практическом здравоохранении приведет к быстрому лабораторному подтверждению диагноза «коклюш» независимо от сроков заболевания и формы клинического течения, что будет способствовать назначению своевременной и адекватной терапии; значительно повысит возможности обследования детей возрасте до 1 года при коклюшеподобных заболеваниях и взрослых со стертой клинической картиной заболевания; позволит проводить выявление больных коклюшем при обследовании очагов коклюшной инфекции и установление источника инфекции в окружении больного в максимально короткие сроки.The technical result of the claimed invention is a unified, highly sensitive, highly specific, low-labor method for accelerated laboratory diagnosis of pertussis infection, which allows to identify the causative agent of the disease within 4.5-5 hours from the start of the study directly in the material from the patient, regardless of the stage of the disease and in various forms of clinical course, as well as against the background of antibiotic therapy. The application of the developed method and kit in practical public health will lead to rapid laboratory confirmation of the diagnosis of whooping cough, regardless of the duration of the disease and the form of the clinical course, which will facilitate the appointment of timely and adequate therapy; significantly increase the possibilities of examining children under the age of 1 year with pertussis-like diseases and adults with an erased clinical picture of the disease; will allow for the identification of patients with whooping cough during examination of foci of pertussis infection and to establish the source of infection in the patient’s environment as soon as possible.
Пример 1.Example 1
Взятие клинического материала от больного осуществлять двумя зондами, используя сухие стерильные зонды из полистирола с вискозными тампонами. Материал собирать вращательными движениями с задней стенки ротоглотки, аккуратно прижимая язык пациента шпателем, не касаясь щек, миндалин и языка. После взятия материала рабочую часть зонда с тампоном поместить на глубину 1,5 см в стерильную одноразовую пробирку типа эппендорф с 0,5 мл стерильного физиологического раствора (предварительно разлитые по пробиркам типа эппердорф), суспендировать тампон вращательными движениями и отломать, придерживая крышкой пробирки с расчетом, чтобы он позволил плотно закрыть пробирку. Пробирку герметично закрыть, промаркировать.Clinical material from the patient should be taken with two probes using dry, sterile polystyrene probes with viscose tampons. Collect material by rotational movements from the back wall of the oropharynx, gently pressing the patient's tongue with a spatula, without touching the cheeks, tonsils and tongue. After taking the material, place the working part of the probe with the swab to a depth of 1.5 cm in a sterile disposable tube of type eppendorf with 0.5 ml of sterile saline solution (previously spilled on tubes of type epperdorf), suspend the swab by rotational movements and break off, holding the cap with the calculation so that it allows tightly closing the tube. Seal the tube tightly and mark.
Пробоподготовка клинического образца.Sample preparation of a clinical sample.
Пробирки с тампонами с клиническим материалом суспендировать в физиологическом растворе в течение 5 минут на микроцентрифуге типа вортекс, удалить тампон; центрифугировать при 12000 об/мин 10 минут; удалить супернатант, оставив 200 мкл в пробе; далее пробы встряхивать на микроцентрифуге типа вортекс до полного ресуспендирования осадка.Suspend tubes with tampons with clinical material in physiological saline for 5 minutes on a vortex-type microcentrifuge, remove the tampon; centrifuge at 12,000 rpm for 10 minutes; remove the supernatant, leaving 200 μl in the sample; shake the samples further on a vortex-type microcentrifuge until the sediment is completely resuspended.
Выделение (экстракция) ДНК из клинического материала.Isolation (extraction) of DNA from clinical material.
Для выделения ДНК из клинического материала использовать набор реагентов «ДНК-сорб-АМ». Работа проводится согласно инструкции. Возможно использование других наборов реагентов для выделения (экстракции) ДИК из клинического материала, которые основаны на сорбционном методе, а также зарегистрированы и разрешены к применению на территории Российской Федерации. Проведение амплификации.To isolate DNA from clinical material, use the DNA sorb-AM reagent kit. Work is carried out according to the instructions. It is possible to use other sets of reagents for the isolation (extraction) of DIC from clinical material, which are based on the sorption method, as well as registered and approved for use in the Russian Federation. Amplification.
Отобрать необходимое количество пробирок для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб, промаркировать. В каждую пробирку внести сначала 18,0 мкл первой смеси (смесь №1), затем 8,0 мкл ДНК пробы, полученной в результате экстракции из исследуемого или контрольного образца; добавить 1 каплю минерального масла, прогреть пробы в течение 5 минут. Далее в каждую пробу под минеральное масло внести 1,0 мкл смеси №2 и слегка перемешать на микроцентрифуге типа вортекс. Поместить пробы в програмируемый микротермостат (типа «Гном») или в термоциклер.Select the required number of tubes for amplification of the DNA of the studied and control samples, mark. First, add 18.0 μl of the first mixture to each tube (mixture No. 1), then 8.0 μl of the DNA of the sample obtained by extraction from the test or control sample; add 1 drop of mineral oil, warm samples for 5 minutes. Next, add 1.0 μl of mixture No. 2 to each sample under mineral oil and mix lightly in a vortex-type microcentrifuge. Place the samples in a programmable microthermostat (such as "Gnome") or in a thermal cycler.
Состав реакционной смеси (на 1 пробу):The composition of the reaction mixture (for 1 sample):
Режим амплификации:Amplification Mode:
1. 65°C - 60 минут1. 65 ° C - 60 minutes
2. 80°C - 2 минуты.2. 80 ° C - 2 minutes.
Электрофорез в агарозном геле.Agarose gel electrophoresis.
Приготовить 2% агарозный гель. В штативе смешать 2 мкл 6х Mass Loading Dye Solution, 4 мкл SybrGreen и 10 мкл ампликонов; режим электрофореза - 160 V 40 минут. Результат реакции регистрировать с помощью УФ-трансиллюминатора и фотографировать. В качестве маркера молекулярных весов использовать DNA Ladder Mix («Fermentas», Литва). Так, если у исследуемого образца ДНК имеются специфические светящиеся профили, аналогичные профилю контрольного штамма В. pertussis, то данные образцы регистрируются как содержащие ДНК штамма В. pertussis.Prepare a 2% agarose gel. In a rack, mix 2 μl of 6x Mass Loading Dye Solution, 4 μl of SybrGreen and 10 μl of amplicons; electrophoresis mode - 160 V 40 minutes. The result of the reaction is recorded using a UV transilluminator and photographed. As a molecular weight marker, use DNA Ladder Mix (Fermentas, Lithuania). So, if the studied DNA sample has specific luminous profiles similar to the profile of the control B. pertussis strain, then these samples are registered as containing the DNA of B. pertussis strain.
Пример 2. Набор для ускоренной лабораторной диагностики коклюшной инфекции.Example 2. A kit for accelerated laboratory diagnosis of pertussis infection.
Набор содержит смесь №1, которая включает следующие реагенты: 10х реакционный буфер для ПНР, 2 mM смесь нуклеотидов (dNTPs), 25 mM MgCl2, раствор Betaine и три пары праймеров (BP-F3 5′-CCGCATACGTGTTGGCA-3′ и BP-B3 5′-TGCGTTTTGATGGTGCCT-3′, BP-FIP 5′-TTGGATTGCAGTAGCGGGATGTGCATGCGTGCAGATTCGTC-3′ и BP-BIP 5′-CGCAAAGTCGCGCGATGGTAACGGATCACACCATGGCA-3′, BP-LF 5′-ACGGAAGAATCGAGGGTTTTGTAC-3′ и BP-LB 5′-GTCACCGTCCGGACCGTG-3′) и смесь №2, содержащую рабочее разведение Bst полимеразы в буферном растворе, а также контрольный образец с ДИК штамма Bordetella pertussis. Данный набор используется в соответствии с Примером 1.The kit contains mixture No. 1, which includes the following reagents: 10x reaction buffer for PNR, 2 mM nucleotide mixture (dNTP s ), 25 mM MgCl 2 , Betaine solution and three pairs of primers (BP-F3 5′-CCGCATACGTGTTGGCA-3 ′ and BP -B3 5'-TGCGTTTTGATGGTGCCT-3 ', BP-FIP 5'-TTGGATTGCAGTAGCGGGATGTGCATGCGTGCAGATTCGTC-3' and BP-BIP 5'-CGCAAAGTCGCGCGATGGTAACGGATCACACCATGGCA-3 ', BP-LF 5'-ACGGAAGAATCGAGGGTTTTGTAC-3' and BP-LB 5'-GTCACCGTCCGGACCGTG -3 ′) and mixture No. 2 containing a working dilution of Bst polymerase in a buffer solution, as well as a control sample with a DIC of Bordetella pertussis strain. This kit is used in accordance with Example 1.
ЛитератураLiterature
1. Инструкция по бактериологическому и серологическому исследованиям при коклюше и паракоклюше. Министерство здравоохранения СССР. Москва, 1983.1. Instructions for bacteriological and serological studies for whooping cough and pertussis. USSR Ministry of Health. Moscow, 1983.
2. Петрова М.С., Попова О.П., Москалева Т.Н. Коклюш и паракоклюш (профилактика, клиника, лечение). // Методические рекомендации. - М. - 2000. - 25 С.2. Petrova M.S., Popova O.P., Moskaleva T.N. Pertussis and pertussis (prevention, clinic, treatment). // Guidelines. - M. - 2000. - 25 S.
3. Селезнева Т.С. Серологический мониторинг за инфекциями, управляемыми средствами вакцинопрофилактики. // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. - 2004. - №5 (18). - С.14-16.3. Selezneva TS Serological monitoring of vaccine-preventable infections. // Epidemiology and vaccination. - 2004. - No. 5 (18). - S.14-16.
4. Ценева Г.Я., Курова Н.Н. Микробиологическая характеристика возбудителя коклюша и лабораторная диагностика коклюша. // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2003. - №4 (5). - С.329-341.4. Tseneva G.Ya., Kurova N.N. Microbiological characteristics of pertussis pathogen and laboratory diagnosis of pertussis. // Clinical microbiology and antimicrobial chemotherapy. - 2003. - No. 4 (5). - S. 329-341.
5. Grimprel E., Begue P., Anjak I. Comparison of polymerase chain reaction, culture, and Western immunoblot serology for diagnosis of Bordetella pertussis infection. J. of Clinical Microbiology. 1993, vol.31: 2745-2750.5. Grimprel E., Begue P., Anjak I. Comparison of polymerase chain reaction, culture, and Western immunoblot serology for diagnosis of Bordetella pertussis infection. J. of Clinical Microbiology. 1993, vol. 31: 2745-2750.
6. Fry N., Tzivra O., Li Y.T., McNiff A., Doshi N., Maple C., Crocroft N., Miller E., Goerge R., Harrison T. Laboratory diagnosis of pertussis infection: the role of PCR and serology. // J. Medical Microbiol. - 2004. - №53. - P.519-525.6. Fry N., Tzivra O., Li YT, McNiff A., Doshi N., Maple C., Crocroft N., Miller E., Goerge R., Harrison T. Laboratory diagnosis of pertussis infection: the role of PCR and serology. // J. Medical Microbiol. - 2004. - No. 53. - P.519-525.
7. Anderson T.P., Beynon K.A., Murdoch D.R. Comparison of real time PCR and conventional hemi-nested PCR for the detection of B. pertussis in nasopharyngeal samples. Clin. Microbiol. Infection. 2003, 9: 746-749.7. Anderson T.P., Beynon K.A., Murdoch D.R. Comparison of real time PCR and conventional hemi-tested PCR for the detection of B. pertussis in nasopharyngeal samples. Clin. Microbiol. Infection 2003, 9: 746-749.
8. Houard S., Hackel С., Herzog A. at all. Specific identification of B. pertussis by polymerase chain reaction. Res. Microbiology. 1989, 140: 477-487.8. Houard S., Hackel S., Herzog A. at all. Specific identification of B. pertussis by polymerase chain reaction. Res. Microbiology. 1989, 140: 477-487.
9. Farell D.J., Daggard G., Mukkur T.K.S. Nested duplex PCR to detect B. pertussis and B. parapertussis and its application in diagnosis of pertussis in nonmetropolitan southeast Queensland, Australia. J. Clin. Microbiology. 1999, 37: 606-610.9. Farell D.J., Daggard G., Mukkur T.K.S. Nested duplex PCR to detect B. pertussis and B. parapertussis and its application in diagnosis of pertussis in nonmetropolitan southeast Queensland, Australia. J. Clin. Microbiology. 1999, 37: 606-610.
10. Lind-Brandberg L., Welinder-Olsson C., Lagergard Т., Tarager J., Trollfors В., Zackrisson G. Evalution of PCR for diagnosis of Bordetella pertussis and Bordetella parapertussis infections. // J. Clin. Microbiol. - 1998. - Vol.36. - P.679-683.10. Lind-Brandberg L., Welinder-Olsson C., Lagergard T., Tarager J., Trollfors B., Zackrisson G. Evaluation of PCR for diagnosis of Bordetella pertussis and Bordetella parapertussis infections. // J. Clin. Microbiol. - 1998. - Vol. 36. - P.679-683.
11. Reischl U., Lehn N., Sanden G.N. et all. Real-time PCR assay targeting IS481 of B. pertussis and molecular basis for detecting B. holmesii. // J. Clin. Microbiology. 2001, 39: 1963-1966.11. Reischl U., Lehn N., Sanden G.N. et all. Real-time PCR assay targeting IS481 of B. pertussis and molecular basis for detecting B. holmesii. // J. Clin. Microbiology. 2001, 39: 1963-1966.
12.. Notomi Т., Okayama H., Masubuchi H., Yonekawa Т., Watanabe К., Amino N., Hase T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. // Nucl. Acids Research. - 2000. - Vol.28. - №12. - P.63.12 .. Notomi T., Okayama H., Masubuchi H., Yonekawa T., Watanabe K., Amino N., Hase T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. // Nucl. Acids Research. - 2000. - Vol. 28. - No. 12. - P.63.
13. Kamachi K., Toyoizumi-Ajisaka H., Toda K. et all. Development and evaluation of a loop-mediated isothermal amplification method for rapid diagnosis of B. pertussis infection. // J. of Clinical Microbiology. 2006, 44: 1899-1902.13. Kamachi K., Toyoizumi-Ajisaka H., Toda K. et all. Development and evaluation of a loop-mediated isothermal amplification method for rapid diagnosis of B. pertussis infection. // J. of Clinical Microbiology. 2006, 44: 1899-1902.
14. Борисова О.Ю., Мазурова И.К., Комбарова С.Ю., Гадуа Н.Т., Петрова М.С., Попова О.П., Алешкин В.А. Патент на изобретение «Способ и набор для ускоренной диагностики коклюша» №2346987 от 20 февраля 2009 г. (приоритет изобретения от 25 декабря 2007 г.).14. Borisova O.Yu., Mazurova I.K., Kombarova S.Yu., Gadua N.T., Petrova M.S., Popova O.P., Aleshkin V.A. Patent for invention “Method and kit for accelerated diagnosis of whooping cough” No. 2346987 dated February 20, 2009 (priority of the invention dated December 25, 2007).
15. Борисова О.Ю., Гадуа Н.Т., Петрова М.С., Попова О.П., Комбарова С.Ю., Мазурова И.К., Алешкин В.А. Ускоренный молекулярно-генетический метод выявления возбудителя коклюша. // Медицинский альманах. - 2009. - №2 (7). - С.51-53.15. Borisova O.Yu., Gadua N.T., Petrova M.S., Popova O.P., Kombarova S.Yu., Mazurova I.K., Aleshkin V.A. Accelerated molecular genetic method for the detection of pertussis pathogen. // Medical almanac. - 2009. - No. 2 (7). - S. 51-53.
16. Борисова О.Ю., Петрова М.С., Гадуа Н.Т., Скачкова В.Г., Савинкова B.C., Попова О.П., Мазурова И.К., Алешкин В.А. Прямой ускоренный метод выявления возбудителя коклюша. // Клиническая лабораторная диагностика. - 2010. - №5. - С.53-55.16. Borisova O.Yu., Petrova M.S., Gadua N.T., Skachkova V.G., Savinkova B.C., Popova O.P., Mazurova I.K., Aleshkin V.A. Direct accelerated method for the detection of pertussis pathogen. // Clinical laboratory diagnostics. - 2010. - No. 5. - S.53-55.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013149234/15A RU2542396C1 (en) | 2013-11-06 | 2013-11-06 | Method and kit for enhanced laboratory diagnosis of pertussis infection |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013149234/15A RU2542396C1 (en) | 2013-11-06 | 2013-11-06 | Method and kit for enhanced laboratory diagnosis of pertussis infection |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2542396C1 true RU2542396C1 (en) | 2015-02-20 |
Family
ID=53288993
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013149234/15A RU2542396C1 (en) | 2013-11-06 | 2013-11-06 | Method and kit for enhanced laboratory diagnosis of pertussis infection |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2542396C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2700477C1 (en) * | 2018-10-01 | 2019-09-17 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Test system for detecting the genome of the causative agent of bordetella bronchiseptica dna in farm livestock |
| RU2703405C1 (en) * | 2018-10-01 | 2019-10-16 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Method for detection of dna of the bordetlelosis (bordetella bronchiseptica) agent genome in farm animals |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6261785B1 (en) * | 2000-07-27 | 2001-07-17 | Becton, Dickinson And Company | Amplification and detection of Bordetella pertussis |
| WO2002059148A2 (en) * | 2001-01-26 | 2002-08-01 | Intercell Ag | A method for identification, isolation and production of antigens to a specific pathogen |
| RU2346987C2 (en) * | 2007-12-25 | 2009-02-20 | Федеральное Государственное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Method and set for rapid pertussis diagnosis |
-
2013
- 2013-11-06 RU RU2013149234/15A patent/RU2542396C1/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6261785B1 (en) * | 2000-07-27 | 2001-07-17 | Becton, Dickinson And Company | Amplification and detection of Bordetella pertussis |
| WO2002059148A2 (en) * | 2001-01-26 | 2002-08-01 | Intercell Ag | A method for identification, isolation and production of antigens to a specific pathogen |
| RU2346987C2 (en) * | 2007-12-25 | 2009-02-20 | Федеральное Государственное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Method and set for rapid pertussis diagnosis |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Anderson T.P. et al. Comparison of real-time PCR and conventional hemi-nested PCR for the detection of B.pertussis in nasopharyngeal samples. Clin. Microbiol. Infection. 2003, 9, PP. 746-749 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2700477C1 (en) * | 2018-10-01 | 2019-09-17 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Test system for detecting the genome of the causative agent of bordetella bronchiseptica dna in farm livestock |
| RU2703405C1 (en) * | 2018-10-01 | 2019-10-16 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Method for detection of dna of the bordetlelosis (bordetella bronchiseptica) agent genome in farm animals |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Martinez‐Martinez et al. | Detection of periodontal bacterial DNA in serum and synovial fluid in refractory rheumatoid arthritis patients | |
| CN100580091C (en) | Zoonosis tuberculosis fluorescence PCR rapid diagnosis kit | |
| Zehnder et al. | Burkholderia pseudomallei isolates in 2 pet iguanas, California, USA | |
| Qi et al. | Development of a rapid and visual nucleotide detection method for a Chinese epidemic strain of Orientia tsutsugamushi based on recombinase polymerase amplification assay and lateral flow test | |
| Qi et al. | Rapid and visual detection of Coxiella burnetii using recombinase polymerase amplification combined with lateral flow strips | |
| Njeru et al. | Serological evidence of Francisella tularensis in febrile patients seeking treatment at remote hospitals, northeastern Kenya, 2014–2015 | |
| RU2542396C1 (en) | Method and kit for enhanced laboratory diagnosis of pertussis infection | |
| Vimala et al. | Leptospirosis in Vellore: A clinical and serological study | |
| Álvarez-Ojeda et al. | Comparison of the tests polymerase chain reaction, serology, and blood culture with respect to sensitivity and specificity for detection of Brucella spp. in human samples | |
| Garner-Spitzer et al. | Correlation between humoral and cellular immune responses and the expression of the hepatitis A receptor HAVcr-1 on T cells after hepatitis A re-vaccination in high and low-responder vaccinees | |
| JP2012531908A (en) | Methods and / or primers for detecting Mycobacterium tuberculosis | |
| Sukumar et al. | Goat milk as a non-invasive sample for confirmation of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis by IS900 PCR | |
| Aykur et al. | Genotyping and Molecular Identification of Acanthamoeba Genotype T4 and Naegleria fowleri from Cerebrospinal Fluid Samples of Patients in Turkey: Is it the Pathogens of Unknown Causes of Death? | |
| RU2346987C2 (en) | Method and set for rapid pertussis diagnosis | |
| CN101168783B (en) | Paratuberculosis fluorescence PCR rapid diagnosis kit | |
| Maurin et al. | Real-time PCR for diagnosis of oculoglandular tularemia | |
| RU2506316C2 (en) | Method of diagnosing whooping cough and determining avirulent mutants of causative agent and diagnostic kit | |
| Yagupsky | Blood cultures for the diagnosis of human Brucellosis | |
| RU2623149C1 (en) | Method and set for diphtheria diagnostics with verification of causative pathogen toxygen strains | |
| RU2688156C2 (en) | Method for assessing efficiency of the treatment of leprosy with polymerase chain reaction | |
| Sirin et al. | Determination of the prevalence of viral, bacterial and fungal pathogens causing Meningitis by using multiplex real-time polymerase chain reaction | |
| Roy et al. | Evaluation and use of a nested polymerase chain reaction assay in cats experimentally infected with Bartonella henselae genotype I and Bartonella henselae genotype II | |
| RU2702240C1 (en) | Method and kit for pertussis and pertussislike diseases genodiagnosis | |
| CN104388575B (en) | Kit for identifying nucleic acid of mycobacterium pathogeny through multiple PCR (polymerase chain reaction) | |
| Ayyez et al. | Serological and molecular detection of Mycoplasma pneumonia |