RU2532828C1 - Method of surface growing of microorganism on liquid culture medium and device for its realisation - Google Patents
Method of surface growing of microorganism on liquid culture medium and device for its realisation Download PDFInfo
- Publication number
- RU2532828C1 RU2532828C1 RU2013143591/10A RU2013143591A RU2532828C1 RU 2532828 C1 RU2532828 C1 RU 2532828C1 RU 2013143591/10 A RU2013143591/10 A RU 2013143591/10A RU 2013143591 A RU2013143591 A RU 2013143591A RU 2532828 C1 RU2532828 C1 RU 2532828C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- microorganism
- biomass
- nutrient medium
- growing
- cuvette
- Prior art date
Links
Abstract
Description
Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам выращивания штаммов-продуцентов микробиопрепаратов поверхностным методом на жидких питательных средах, и может быть использовано при производстве различных продуктов микробиологического синтеза, в том числе препаратов для защиты растений.The invention relates to the microbiological industry, and in particular to methods of growing strains of producers of microbiological products by the surface method on liquid nutrient media, and can be used in the production of various products of microbiological synthesis, including preparations for plant protection.
Основным промышленным способом получения микробиопрепаратов является жидкофазное глубинное культивирование, которое позволяет полностью контролировать процесс ферментации со сравнительно краткой продолжительностью (несколько суток).The main industrial method for producing microbiological preparations is liquid phase deep cultivation, which allows full control of the fermentation process with a relatively short duration (several days).
Однако этот способ благоприятен для бактериальных штаммов-продуцентов и мало пригоден - для грибных. Конидии грибов, полученных в глубинной культуре, по своим морфологическим и физиологическим свойствам значительно отличаются от воздушных, полученных при поверхностном культивировании, кроме того, к спороношению при глубинном культивировании способны не все микромицеты.However, this method is favorable for bacterial producer strains and is not very suitable for fungal ones. Conidia of fungi obtained in deep culture differ significantly in morphological and physiological properties from airborne fungi obtained by surface cultivation; moreover, not all micromycetes are capable of sporulation during deep cultivation.
Для грибов-продуцентов более естественной является твердофазная ферментация, с использованием разнообразных субстратов (органических или неорганических, с добавлением питательных веществ), с последующим высушиванием и размолом органического субстрата, или смывом спор с мицелием с неорганического и органического субстратов, с последующим смешиванием с наполнителем и высушиванием. Полученные этим способом споры грибов более выносливы к высушиванию и дольше сохраняют жизнеспособность.For producer mushrooms, solid-state fermentation is more natural, using a variety of substrates (organic or inorganic, with the addition of nutrients), followed by drying and grinding of the organic substrate, or washing the spores with mycelium from inorganic and organic substrates, followed by mixing with the filler and by drying. The fungal spores obtained by this method are more resistant to drying and retain viability for longer.
Однако биоматериал, полученный в результате твердофазной ферментации на органическом субстрате с последующим его высушиванием и размолом (порошок), мало пригоден для обработки вегетирующих растений из-за забивания отверстий распылителей. А биоматериал, полученный в результате жидкофазной или твердофазной ферментации грибов, с последующим отделением его от культуральной жидкости (культуральная жидкость или паста) и твердого субстрата (жидкая культура), как правило, хранится недолго. Даже при пониженной температуре споры грибов при достаточной влажности способны к прорастанию, что ведет к их гибели при отсутствии питания. Поэтому многие биопестициды, полученные на малотоннажных производствах, применяются не позже нескольких недель после окончания ферментации.However, the biomaterial obtained as a result of solid-phase fermentation on an organic substrate with its subsequent drying and grinding (powder) is not very suitable for treating vegetating plants due to clogging of the nozzle openings. And the biomaterial obtained as a result of liquid-phase or solid-phase fermentation of fungi, followed by its separation from the culture fluid (culture fluid or paste) and solid substrate (liquid culture), as a rule, is not stored for long. Even at low temperatures, spores of fungi with sufficient moisture are able to germinate, which leads to their death in the absence of nutrition. Therefore, many biopesticides obtained in small-scale industries are used no later than a few weeks after the end of fermentation.
Для сохранения жизнеспособности штаммов-продуцентов, как бактериальных, так и грибных, применяют концентрирование (концентраты суспензий, эмульсий, пасты), сушку (конвекционная, распылительная, лиофилизация), инкапсулирование (гели, гранулы, капсулы, микрокапсулы) и хранение биоматериала в определенных условиях.To maintain the viability of producer strains, both bacterial and fungal, concentration (suspensions, emulsions, pastes concentrates), drying (convection, spray, lyophilization), encapsulation (gels, granules, capsules, microcapsules) and storage of biomaterial under certain conditions are used .
Однако большинство имеющихся методов стабилизации мало подходят для грибных штаммов-продуцентов. Так, концентраты и пасты не хранятся более 3-х месяцев, даже в холодильнике. Кроме того, порошки биопрепаратов (если они выдерживают температуру сушки) получаются дорогими, со стоимостью почти на уровне химических препаратов.However, most of the stabilization methods available are of little use for fungal producer strains. So, concentrates and pastes are not stored for more than 3 months, even in the refrigerator. In addition, powders of biological products (if they can withstand the drying temperature) are expensive, with a cost almost at the level of chemicals.
Известна технология поверхностного периодического культивирования штамма гриба Trichoderma sp. МГ-97, используемого для защиты сеянцев хвойных от фузариозов (1). Посев гриба производят споровой культурой конидий из расчета 1×107 на 1 мл питательной среды. В качестве посевного материала используют споровую культуру штамма, выращенную на косяках с сусло-агаром, с необходимой концентрацией. Засев производят на оптимизированную питательную среду Захарченко в колбы Эрленмейера, объемом 250 мл, со 100 мл среды. Культивируют штамм в течение 15 суток при 28°С. После окончания культивирования мицелиальную пленку отделяют от питательной среды, высушивают до постоянного веса и измельчают на гомогенизаторе. Полученный биопрепарат представляет собой сухой порошок с титром 2×1011 спор/г.Known technology of surface periodic cultivation of a strain of the fungus Trichoderma sp. MG-97, used to protect coniferous seedlings from Fusarium infections (1). The fungus is inoculated with a spore culture of conidia at the rate of 1 × 10 7 per 1 ml of culture medium. As a seed, a spore culture of the strain grown on jambs with wort agar with the required concentration is used. Sowing is carried out on an optimized nutrient medium Zakharchenko in Erlenmeyer flasks, a volume of 250 ml, with 100 ml of medium. The strain is cultured for 15 days at 28 ° C. After cultivation, the mycelial film is separated from the nutrient medium, dried to constant weight and crushed on a homogenizer. The resulting biological product is a dry powder with a titer of 2 × 10 11 spores / g
Однако предложенная технология не применима в условиях промышленного производства из-за необходимости применения ручного труда на всех стадиях получения биопрепарата и невозможности получения достаточного количества препарата в малых объемах колб.However, the proposed technology is not applicable in industrial production due to the need for manual labor at all stages of obtaining a biological product and the inability to obtain a sufficient amount of the drug in small volumes of flasks.
Известен препарат на основе штамма Trichoderma harzianum, который используют для защиты виноградников и плодовых деревьев от некоторых болезней, вызываемых грибными патогенами (2). Препарат представляет собой споровую массу гриба и продуцируемые грибом пептиды. Получают препарат, культивируя гриб в жидкой среде, разлив ее тонким слоем на подносы, до полного созревания спор. Затем всю биомассу высушивают, тонко размалывают и просеивают.A known drug based on the Trichoderma harzianum strain, which is used to protect vineyards and fruit trees from certain diseases caused by fungal pathogens (2). The preparation is the spore mass of the fungus and the peptides produced by the fungus. The preparation is obtained by cultivating the fungus in a liquid medium, spilling it with a thin layer on trays until the spores mature completely. Then all the biomass is dried, finely ground and sieved.
Однако такой способ производства препарата трудоемок из-за необходимости применения ручного труда на всех стадиях получения биопрепарата.However, this method of production of the drug is time-consuming due to the need for manual labor at all stages of obtaining a biological product.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению является метод массового выращивания грибного гиперпаразита из рода Ampelomices для борьбы с мучнистыми росами сельскохозяйственных культур (3), при котором чистую культуру гриба выращивают на косом картофельно-глюкозном агаре, а маточную культуру выращивают на жидкой картофельно-глюкозной среде в течение 8-10 дней при температуре 24-25°С в состоянии покоя. Массовое выращивание гриба осуществляют в предварительно продезинфицированных 0,5% хлорамином или 3% раствором перекиси водорода эмалированных кюветах (30×35 см) на простерилизованной, подкисленной до рН 6,3 жидкой картофельно-глюкозной среде, слоем 2 см. После засева гриба из маточной культуры кюветы закрывают продезинфицированной полиэтиленовой пленкой, которую снимают через 4-5 суток. На 10-е сутки с поверхности питательной среды снимают грибную пленку и помещают на рамку с полиэтиленовой пленкой на двое суток для дозревания недозревших пикнид и спор. После этого грибную пленку сушат в термостате до воздушно-сухого состояния при температуре 28-30°С. Для поглощения влаги в термостате устанавливают чашки Петри с обезвоженным хлористым кальцием. Сухую грибную пленку размалывают на электрической кофемолке.Closest to the proposed invention is a method of mass growing mushroom hyperparasite from the genus Ampelomices to control powdery mildew of crops (3), in which a pure mushroom culture is grown on oblique potato-glucose agar, and the uterine culture is grown on liquid potato-glucose medium for 8-10 days at a temperature of 24-25 ° C at rest. Mass cultivation of the fungus is carried out in enamelled cuvettes (30 × 35 cm) pre-disinfected with 0.5% chloramine or 3% hydrogen peroxide in a sterilized, potato-glucose-liquid acidified medium to pH 6.3, with a layer of 2 cm. After inoculation of the fungus from the uterine the cell culture is covered with a disinfected plastic film, which is removed after 4-5 days. On the 10th day, a mushroom film is removed from the surface of the nutrient medium and placed on a frame with a plastic film for two days to ripen unripened picnids and spores. After that, the mushroom film is dried in an thermostat to an air-dry state at a temperature of 28-30 ° C. To absorb moisture in the thermostat set Petri dishes with dehydrated calcium chloride. Dry mushroom film is ground on an electric coffee grinder.
Недостатками известного способа являются: необходимость применения ручного труда на всех стадиях получения биопрепарата; невозможность обеспечения оптимальных параметров культивирования штаммов-продуцентов: стерильности, температуры, газовоздушного обмена, влажности и освещенности в условиях промышленного производства.The disadvantages of this method are: the need for manual labor at all stages of obtaining a biological product; the impossibility of ensuring optimal cultivation parameters of producer strains: sterility, temperature, gas-air exchange, humidity and light exposure in industrial production.
Целью изобретения является разработка промышленного способа поверхностного выращивания микроорганизмов (грибов, бактерий, актиномицетов, дрожжей) на жидкой питательной среде с минимальным применением ручного труда.The aim of the invention is to develop an industrial method for the surface growth of microorganisms (fungi, bacteria, actinomycetes, yeast) in a liquid nutrient medium with minimal use of manual labor.
Технический результат достигается тем, что в известном способе массового выращивания микроорганизма, включающем выращивание чистой культуры микроорганизма на косом агаре, выращивание маточной культуры микроорганизма на жидкой питательной среде, выращивание биомассы микроорганизма путем соединения маточной культуры с жидкой питательной средой и поверхностного ее выращивания в тонком слое в кювете, отделение образовавшейся пленки биомассы микроорганизма от остатков питательной среды и ее доращивание в течение двух суток, сушку пленки биомассы до воздушно-сухого состояния, выгрузку сухой пленки биомассы, согласно изобретению выращивание маточной культуры микроорганизма на жидкой питательной среде осуществляют глубинным методом, соединение маточной культуры микроорганизма с жидкой питательной средой осуществляют в смесителе-дозаторе, где смесь аэрируют воздухом или газовоздушной смесью в потоке, а затем подают ее в кювету, поверхностное выращивание биомассы микроорганизма в тонком слое в кювете осуществляют со свободно опущенной на дно кюветы транспортной сеткой, изготовленной из нейтрального материала, отделение полученной пленки биомассы микроорганизма от остатков питательной среды осуществляют с помощью транспортной сетки путем ее натяжения и поднятия над поверхностью жидкости в кювете с последующим ее сливом, доращивание пленки биомассы осуществляют на транспортной сетке с последующим нанесением на пленку биомассы поверхностно-активных веществ ПАВ путем тонкодисперсного распыления раствора ПАВ над поверхностью биомассы, сушку пленки биомассы осуществляют в кювете с закрытой крышкой, путем подачи сушильного агента под транспортную сетку, а выгрузку сухой пленки биомассы из кюветы осуществляют с помощью той же транспортной сетки, причем выращивание маточной культуры микроорганизма осуществляют в течение 2-4 суток при 25-30°С, выращивание биомассы ведут до максимального использования сухих веществ жидкой питательной среды, определяемого по ее плотности и кислотности, с обеспечением оптимальных для каждого микроорганизма воздухообмена и освещенности, а при сушке пленки биомассы температуру сушильного агента устанавливают в зависимости от стойкости используемого микроорганизма.The technical result is achieved by the fact that in the known method of mass growing a microorganism, including growing a pure culture of a microorganism on oblique agar, growing a mother culture of a microorganism on a liquid nutrient medium, growing a biomass of a microorganism by combining a mother culture with a liquid nutrient medium and surface growing it in a thin layer in cuvette, separating the resulting biomass film of the microorganism from the remains of the nutrient medium and growing it for two days, drying the captive ki of biomass to an air-dry state, unloading of a dry film of biomass, according to the invention, the growth of the uterine culture of a microorganism in a liquid nutrient medium is carried out by the deep method, the connection of the uterine culture of a microorganism with a liquid nutrient medium is carried out in a metering mixer, where the mixture is aerated with air or gas-air mixture and then it is fed into the cuvette; surface biomass of the microorganism is grown in a thin layer in the cuvette with the transport set freely lowered to the bottom of the cuvette Oh, made of a neutral material, the separation of the resulting biomass film of the microorganism from the remains of the nutrient medium is carried out using a transport grid by tensioning and raising it above the surface of the liquid in a cuvette, followed by its discharge, growing the biomass film is carried out on a transport grid, followed by applying onto the biomass film surface -active surfactant substances by fine spraying a surfactant solution above the biomass surface, drying the biomass film is carried out in a cuvette with a closed lid th, by supplying a drying agent under the transport net, and the unloading of a dry biomass film from the cuvette is carried out using the same transport net, whereby the mother culture of the microorganism is grown for 2-4 days at 25-30 ° С, the biomass is grown to maximum use solids of a liquid nutrient medium, determined by its density and acidity, ensuring optimal air exchange and illumination for each microorganism, and when drying a biomass film, the temperature of the drying agent is set pour depending on the resistance of the microorganism used.
Кроме того, технический результат достигается тем, что устройство для поверхностного выращивания микроорганизма на жидкой питательной среде способом по п.1 включает кювету с поддоном, снабженную свободно опущенной на ее дно транспортной сеткой, выполненной из нейтрального материала и закрепленной своими концами на приводных барабанах с приводом, обеспечивающих поднятие транспортной сетки со дна кюветы путем ее натяжения и ее продольное перемещение, приемное устройство с клапаном для присоединения к смесителю-дозатору и подачи смеси жидкой питательной среды с маточной культурой в кювету, поворотными заслонками для регулирования обмена воздуха в кювете, установленными по торцам кюветы, сливное устройство для слива культуральной жидкости из кюветы, патрубок для подачи сушильного агента под сетку, пробоотборник и сменные светофильтры в фонарях для регулирования освещенности, расположенные на боковых стенках кюветы, и крышку, герметично закрывающую кювету, выполненную с возможностью ее открывания и/или снятия, снабженную форсунками для распыления раствора ПАВ над поверхностью выращиваемой в кювете биомассы и моющими головками для осуществления санитарной обработки устройства.In addition, the technical result is achieved in that the device for surface cultivation of a microorganism in a liquid nutrient medium according to claim 1, includes a cuvette with a pallet equipped with a transport net freely lowered to its bottom, made of a neutral material and fixed at its ends to drive drums with a drive providing lifting the transport net from the bottom of the cuvette by tensioning it and moving it longitudinally, a receiving device with a valve for connecting to the metering mixer and supplying the mixture a nutrient medium with a uterine culture in the cuvette, rotary dampers for regulating the air exchange in the cuvette, installed at the ends of the cuvette, a drain device for draining the culture fluid from the cuvette, a nozzle for supplying a drying agent under the grid, a sampler and replaceable filters in the lights to control the illumination, located on the side walls of the cuvette, and a lid hermetically closing the cuvette, made with the possibility of opening and / or removing it, equipped with nozzles for spraying a surfactant solution over erhnostyu grown in cell biomass and washing heads for sanitization of the device.
Сопоставительный анализ заявляемых технических решений с прототипом позволяет сделать вывод, что заявляемый способ отличается от известного условиями осуществления действий, а именно: в прототипе маточную культуру микроорганизма выращивают поверхностным методом в покое, а в заявляемом способе - глубинным; соединение маточной культуры микроорганизма с жидкой питательной средой для выращивания его биомассы осуществляют в известном способе путем засева гриба из маточной культуры на жидкую питательную среду в кювете методом штрихов, а в заявляемом способе - соединение маточной культуры с жидкой питательной средой осуществляют в смесителе-дозаторе, где смесь аэрируют воздухом или газовоздушной смесью в потоке, а затем подают ее в кювету, на дно которой помещена транспортная сетка, изготовленная из материала, нейтрального к питательной среде с микроорганизмами; отделение полученной пленки биомассы микроорганизма от остатков питательной среды в прототипе осуществляют так: снимают грибную пленку и помещают на рамку с полиэтиленовой пленкой, а в заявляемом способе грибную пленку отделяют с помощью транспортной сетки путем натяжения последней барабанами и поднятия ее над поверхностью культуральной жидкости в кювете с последующим сливом этой жидкости; доращивание пленки биомассы в прототипе осуществляют на рамке с п/э пленкой, а в заявляемом способе - на транспортной сетке с последующим нанесением на пленку биомассы ПАВ путем тонкодисперсного распыления раствора ПАВ на поверхность биомассы; сушку пленки биомассы в прототипе осуществляют в термостате, для поглощения влаги в котором устанавливают чашки Петри с обезвоженным хлористым кальцием, а в заявляемом способе сушку пленки биомассы осуществляют в той же кювете, где выращивалась и доращивалась биомасса, с закрытой крышкой путем подачи сушильного агента под транспортную сетку, с помощью которой и выгружают пленку биомассы из кюветы.A comparative analysis of the claimed technical solutions with the prototype allows us to conclude that the claimed method differs from the known conditions for the implementation of actions, namely: in the prototype, the uterine culture of the microorganism is grown by the surface method at rest, and in the claimed method by deep; the connection of the uterine culture of the microorganism with a liquid nutrient medium for growing its biomass is carried out in the known method by seeding the fungus from the uterine culture on a liquid nutrient medium in a cuvette by the stroke method, and in the claimed method, the connection of the uterine culture with a liquid nutrient medium is carried out in a metering mixer, where the mixture is aerated with air or a gas-air mixture in a stream, and then it is fed into a cuvette at the bottom of which a transport net made of a material that is neutral to the nutrient medium is placed with micro-organisms; The separation of the obtained biomass film of the microorganism from the remains of the nutrient medium in the prototype is carried out as follows: remove the mushroom film and place it on a frame with a plastic film, and in the inventive method, the mushroom film is separated using a transport net by pulling the last reels and raising it above the surface of the culture fluid in a cuvette with subsequent discharge of this fluid; growing the biomass film in the prototype is carried out on a frame with plastic film, and in the inventive method, on a transport net, followed by applying surfactant biomass to the film by finely dispersing the surfactant solution on the biomass surface; drying of the biomass film in the prototype is carried out in a thermostat, to absorb moisture in which Petri dishes with dehydrated calcium chloride are installed, and in the inventive method, the drying of the biomass film is carried out in the same cuvette where the biomass was grown and grown, with the lid closed by supplying a drying agent under the transport a grid with which the biomass film is unloaded from the cell.
А заявляемое устройство для выращивания микроорганизма на жидкой питательной среде отличается от известного дополнительными конструктивными элементами, которыми снабжена кювета: транспортной сеткой, которая закреплена своими концами на приводных барабанах; поворотными заслонками, установленными по торцам кюветы; приемным устройством с клапаном для подсоединения к смесителю-дозатору; устройством для слива культуральной жидкости; устройством для подачи сушильного агента; пробоотборником, сменными светофильтрами в фонарях, расположенных на боковых стенках кюветы, и крышкой, снабженной форсунками для распыления ПАВ над поверхностью выращиваемой в кювете биомассы и моющими головками.And the inventive device for growing a microorganism in a liquid nutrient medium differs from the known additional structural elements, which are equipped with a cuvette: a transport net, which is fixed at its ends to drive drums; rotary dampers installed at the ends of the cell; a receiving device with a valve for connecting to a metering mixer; a device for draining the culture fluid; a device for supplying a drying agent; a sampler, interchangeable filters in the lamps located on the side walls of the cell, and a lid equipped with nozzles for spraying surfactants above the surface of the biomass grown in the cell and washing heads.
Таким образом, заявляемые технические решения соответствуют критерию патентоспособности новизна.Thus, the claimed technical solutions meet the criteria of patentability novelty.
Исследуя уровень техники в процессе проведения патентного поиска по всем видам сведений, общедоступных в печати, мы не выявили технических решений, имеющих отличительные признаки заявляемого способа, связанные с транспортной сеткой и ее функциями, обеспечивающей в совокупности с другими признаками достижение поставленной цели. Мы также не выявили технических решений, имеющих отличительные признаки заявляемого устройства.Studying the state of the art in the process of conducting a patent search on all types of information publicly available in the press, we have not identified technical solutions that have distinctive features of the proposed method associated with the transport network and its functions, which, together with other signs, achieve the goal. We also did not identify technical solutions that have distinctive features of the claimed device.
К заявляемой совокупности признаков мы пришли после многолетних исследований и опытов, проводимых с целью разработки промышленного способа поверхностного выращивания микроорганизмов (грибов, бактерий, актиномицетов, дрожжей) на жидкой питательной среде с минимальным применением ручного труда. Следовательно, вся совокупность отличительных от прототипа признаков является новой и заявляемые технические решения соответствуют критерию патентоспособности изобретательский уровень.After the many years of research and experiments conducted with the aim of developing an industrial method of surface cultivation of microorganisms (fungi, bacteria, actinomycetes, yeast) in a liquid nutrient medium with minimal use of manual labor, we came to the claimed combination of features. Therefore, the whole set of features distinctive from the prototype is new and the claimed technical solutions meet the patentability criterion of inventive step.
Заявляемые технические решения соответствуют и критерию патентоспособности промышленная применимость, т.к. они могут быть использованы в микробиологической промышленности, в частности при производстве биопрепаратов для защиты растений.The claimed technical solutions also meet the patentability criterion of industrial applicability, because they can be used in the microbiological industry, in particular in the production of biological products for plant protection.
Способ осуществляется следующим образом.The method is as follows.
Выращивают чистую культуру выбранного микроорганизма на косом агаре (например, картофельно-глюкозном). Далее выращивают маточную культуру микроорганизма на жидкой питательной среде (например, на среде Рудакова) глубинным методом (на качалке). Для выращивания биомассы микроорганизма полученную маточную культуру соединяют с жидкой питательной средой в смесителе-дозаторе, где смесь аэрируют воздухом или газовоздушной смесью в потоке, а затем подают ее в кювету и осуществляют поверхностное выращивание биомассы в тонком слое в кювете со свободно опущенной на дно кюветы транспортной сеткой, изготовленной из материала, нейтрального к питательной среде с микроорганизмами. Полученную пленку биомассы микроорганизма отделяют от остатков питательной среды с помощью транспортной сетки путем ее натяжения и поднятия над поверхностью жидкости в кювете с последующим сливом этой жидкости. Доращивание пленки биомассы осуществляют на транспортной сетке с последующим нанесением на пленку биомассы поверхностно-активных веществ (ПАВ) путем тонко-дисперсного распыления их раствора над поверхностью биомассы. Сушку пленки биомассы осуществляют в кювете с закрытой крышкой путем подачи сушильного агента под транспортную сетку. Выгрузку сухой пленки биомассы осуществляют с помощью той же транспортной сетки.A pure culture of the selected microorganism is grown on oblique agar (for example, potato-glucose). Next, the uterine culture of the microorganism is grown on a liquid nutrient medium (for example, on Rudakov's medium) by the deep method (on a rocking chair). To grow the biomass of the microorganism, the resulting uterine culture is combined with a liquid nutrient medium in a metering mixer, where the mixture is aerated with air or a gas-air mixture in a stream, and then it is fed into a cuvette and surface biomass is grown in a thin layer in a cuvette with the transport cell freely lowered to the bottom of the cuvette a grid made of a material neutral to the nutrient medium with microorganisms. The resulting film of the biomass of the microorganism is separated from the remains of the nutrient medium using a transport net by tensioning it and lifting it above the surface of the liquid in a cuvette, followed by discharge of this liquid. The biomass film is grown on a transport net, followed by the application of surface-active substances (SAS) to the biomass film by finely dispersed spraying of their solution over the biomass surface. Drying of the biomass film is carried out in a cuvette with a closed lid by feeding a drying agent under the transport grid. Dry biomass film is unloaded using the same transport net.
Устройство для выращивания микроорганизма на жидкой питательной среде схематически представлено на чертеже и включает емкость для выращивания микроорганизма в виде кюветы с поддоном 1, транспортную сетку 1, свободно опущенную на дно кюветы и изготовленную из нейтрального к питательной среде с микрооранизмами материала, сетка закреплена своими концами на приводных барабанах 3 с приводом 4, обеспечивающих ее поднятие со дна кюветы путем ее натяжения, а также ее продольное перемещение, приемное устройство 5 с клапаном 6 для подсоединения его к смесителю-дозатору (на чертеже не показан), поворотные заслонки 7, установленные по торцам кюветы, устройство 8 для слива культуральной жидкости из кюветы, устройство 9 для подачи сушильного агента, установленные на боковой стенке 10 кюветы пробоотборник 11 и сменные светофильтры 12 в фонарях 13, а также крышку 14, снабженную моющими головками 15 и форсунками 16.A device for growing a microorganism in a liquid nutrient medium is schematically shown in the drawing and includes a container for growing a microorganism in the form of a cuvette with a tray 1, a transport net 1 freely lowered to the bottom of the cuvette and made of a material neutral to the nutrient medium with microoranisms, the grid is fixed at its ends to drive drums 3 with drive 4, ensuring its lifting from the bottom of the cuvette by tensioning it, as well as its longitudinal movement, receiving device 5 with valve 6 for connecting it to the metering mixer (not shown in the drawing), rotary shutters 7 installed at the ends of the cell, device 8 for draining the culture fluid from the cell, device 9 for supplying a drying agent, a sampler 11 installed on the side wall of the cell 10 and replaceable light filters 12 in the lamps 13, as well as a cover 14 provided with washing heads 15 and nozzles 16.
Устройство для выращивания микроорганизма на жидкой питательной среде работает следующим образом.A device for growing a microorganism in a liquid nutrient medium works as follows.
В поддон 1 кюветы с опущенной в него сеткой 2 через приемное устройство 5 подается жидкая питательная среда, смешанная с маточной культурой микроорганизма и насыщенная стерильным воздухом в смесителе-дозаторе до заполнения поддона 1 (кюветы) до уровня, определяемого в зависимости от выращиваемого штамма продуцента.A liquid nutrient medium mixed with the uterine culture of the microorganism and saturated with sterile air in the metering mixer is fed into the pan 1 of the cell with the net 2 lowered into it through the receiving device 5 until the pan 1 (cuvette) is filled to a level determined depending on the producer strain grown.
В период выращивания биомассы микроорганизма интенсивность естественного обмена воздуха в кювете регулируется поворотными заслонками 7, а освещенность - путем установки соответствующих светофильтров 12 в фонарях 13, установленных на боковых стенках 10 кюветы. Контроль за ростом микроорганизма и состоянием питательной среды ведется через пробоотборники 11.During the growth of the biomass of the microorganism, the intensity of the natural air exchange in the cuvette is controlled by rotary dampers 7, and the illumination by installing the appropriate filters 12 in the lanterns 13 mounted on the side walls 10 of the cuvette. Control over the growth of the microorganism and the state of the nutrient medium is carried out through samplers 11.
По окончании процесса выращивания биомассы микроорганизма сетка 2 натягивается приводными барабанами 3. Усилие натяга сетки 2 регулируется мотор-редукторами привода 4 барабанов. При подъеме сетки выращенная биомасса отделяется от культуральной жидкости, которая удаляется из поддона 1 (кюветы) через сливное устройство 8. Биомасса микроорганизма доращивается в течение двух суток на транспортной сетке 2, а затем, через форсунки 16, установленные на крышке 14 кюветы, на поверхность биомассы наносится поверхностно-активное вещество (ПАВ).At the end of the process of growing the biomass of the microorganism, the mesh 2 is tensioned by the drive drums 3. The tension of the mesh 2 is regulated by the gear motors of the drive 4 drums. When raising the grid, the grown biomass is separated from the culture fluid, which is removed from the pan 1 (cuvette) through the drain device 8. The biomass of the microorganism is grown for two days on the transport grid 2, and then, through nozzles 16 installed on the cover 14 of the cuvette, to the surface biomass is applied surfactant (surfactant).
Подача сушильного агента с заданной температурой осуществляется под сетку 2 через патрубок 9.The supply of a drying agent with a given temperature is carried out under the grid 2 through the pipe 9.
Выгрузка сухой биомассы из устройства осуществляется путем перемещения сетки 2 с одного приводного барабана 3 на другой.Unloading dry biomass from the device is carried out by moving the grid 2 from one drive drum 3 to another.
Для осуществления санитарной обработки устройства на моющие головки 15, установленные на крышке 14, подаются соответствующие растворы, удаляемые через сливные устройства 8. После чего установка сушится и стерилизуется горячим воздухом через устройство 9 для подачи сушильного агента.To carry out the sanitization of the device to the washing heads 15 installed on the cover 14, appropriate solutions are removed through the drain devices 8. After that, the installation is dried and sterilized with hot air through the device 9 for supplying a drying agent.
Предлагаемое устройство апробировано на макете технологической линии в полупромышленных условиях, описанных в примерах 1 и 2.The proposed device is tested on the layout of the production line in semi-industrial conditions described in examples 1 and 2.
Пример 1. Способ поверхностного выращивания на жидкой питательной среде штамма-продуцента гриба Penicillium vermiculatum для получения микробиопрепарата. Example 1. A method of surface cultivation on a liquid nutrient medium of a producer strain of the fungus Penicillium vermiculatum to obtain a microbiological product.
Чистую культуру гриба выращивали в пробирках на косом картофельно-глюкозном агаре (в течение 7 суток). Маточную культуру штамма-продуцента выращивали на жидкой питательной среде Рудакова (Сахароза - 50 г, Кукурузный экстракт - 10 г, KH2PO4 - 2 г, MgSO4 - 2 г, FeSO4 - 0.1 г, CuSO4 - 0.1 г, MnSO4 - 1 г, вода дистиллированная до 1 л, Ph естественная) в трехлитровых баллонах, с объемом питательной среды 1 литр, на термостатированной качалке, с оборотом двигателя 200 об/мин в течение 3-х суток, при температуре 27°С. Выросшую маточную культуру смешивали с жидкой питательной средой Рудакова в смесителе-дозаторе, при этом смесь аэрировали воздухом в потоке и через подающие устройства передавали в культиватор, представленный поддоном в виде кюветы с опущенной в нее транспортной сеткой. Гриб выращивали в течение 7 суток в тонком слое питательной среды (2,0 см) до максимального использования сухих веществ в остатках питательной среды (1,5%) и Ph 4,8, с открытием поворотных заслонок на угол 5°, с использованием дымчатого светофильтра в фонарях. Затем осуществляли отделение биомассы штамма-продуцента от остатков питательной среды путем подъема транспортной сетки над поверхностью жидкости, с последующим ее сливом. Доращивание биомассы штамма-продуцента осуществляли в течение 2-х суток на транспортной сетке с последующим нанесением на поверхность биомассы поверхностно-активных веществ (лактозы) путем тонко-дисперсного распыления раствора ПАВ над поверхностью биомассы через форсунки в крышке кюветы. Сушку биомассы штамма-продуцента осуществляли путем подачи сушильного агента под транспортную сетку через патрубок, температура сушильного агента составляла 35°С. Затем биомассу выгружали транспортной сеткой.A pure fungus culture was grown in test tubes on an oblique potato-glucose agar (for 7 days). The mother culture of the producer strain was grown on Rudakov’s liquid nutrient medium (Sucrose - 50 g, Corn extract - 10 g, KH 2 PO 4 - 2 g, MgSO 4 - 2 g, FeSO 4 - 0.1 g, CuSO 4 - 0.1 g, MnSO 4 - 1 g, distilled water up to 1 l, Ph natural) in three-liter containers, with a volume of nutrient medium 1 liter, on a thermostatic rocking chair, with an engine speed of 200 rpm for 3 days, at a temperature of 27 ° C. The grown uterine culture was mixed with Rudakov’s liquid nutrient medium in a metering mixer, while the mixture was aerated with air in a stream and transferred through a feeding device to a cultivator represented by a tray in the form of a cuvette with a transport net lowered into it. The fungus was grown for 7 days in a thin layer of the nutrient medium (2.0 cm) to the maximum use of solids in the remains of the nutrient medium (1.5%) and Ph 4.8, with the opening of rotary dampers at an angle of 5 °, using smoky light filter in the lanterns. Then, the biomass of the producer strain was separated from the remains of the nutrient medium by lifting the transport net above the surface of the liquid, followed by its discharge. The biomass of the producer strain was grown for 2 days on a transport net, followed by the application of surfactants (lactose) to the biomass surface by finely dispersed spraying of a surfactant solution over the biomass surface through nozzles in the cell lid. Drying the biomass of the producer strain was carried out by feeding a drying agent under the transport grid through the pipe, the temperature of the drying agent was 35 ° C. Then the biomass was unloaded by a transport net.
Полученный по этому примеру микробиопрепарат имел титр 1012 КОЕ/г. Выход сухого порошка составлял 270 г с 1 м2 или 38 г с 1 литра питательной среды через 20 суток цикла против 30 г с 1 литра питательной среды через 31 сутки с титром 109 КОЕ/г - в прототипе.The microbiological product obtained in this example had a titer of 10 12 CFU / g. The yield of dry powder was 270 g with 1 m 2 or 38 g with 1 liter of culture medium after 20 days of the cycle versus 30 g with 1 liter of culture medium after 31 days with a titer of 10 9 CFU / g in the prototype.
По примеру 1 выращивали штаммы-продуценты из рода Trichoderma (Tr. harzianum), Gliocladium (G. catenulatum), Penicillium (P. verrucosum), Chaetomium (Ch. olivaceum) для получения микробиопрепаратов.In Example 1, producer strains from the genus Trichoderma (Tr. Harzianum), Gliocladium (G. catenulatum), Penicillium (P. verrucosum), Chaetomium (Ch. Olivaceum) were grown to obtain microbiological preparations.
Пример 2. Способ поверхностного выращивания штамма-продуцента бактерии Bacillus licheniformis для получения микробиопрепаратаExample 2. A method of surface growing a strain of the producer of the bacterium Bacillus licheniformis to obtain a microbiological product
Чистую культуру бактерии выращивали в пробирках на косом картофельно-глюкозном агаре. Маточную культуру штамма-продуцента выращивали на жидкой питательной среде Тайлона 3 (Сахароза - 10 г, Сухой кукурузный экстракт - 5 г, (NH4)2HPO4 - 2 г, KH2PO4 - 2 г, MgSO4×7H2O - 0.25 г, СаСО3 - 1 г, вода дистиллированная - 1 л, Ph - 6,35) в трехлитровых баллонах, с объемом питательной среды 1 литр, на термостатированной качалке, с оборотом двигателя 200 об/мин в течение 2-х суток, при температуре 28°С. Выросшую маточную культуру смешивали с жидкой питательной средой Тайлона 3 в смесителе-дозаторе и через подающие устройства подавали в кювету-культиватор. При этом смесь аэрировали воздухом. Бактерию выращивали в течение 5 суток в тонком слое питательной среды (2,0 см) до максимального использования сухих веществ питательной среды (2,0 %), с открытием поворотных заслонок на угол 2,5°, с использованием светло-зеленого светофильтра в фонарях. Следующие этапы соответствовали примеру 1. Полученный по этому примеру микробиопрепарат имел титр 1013 КОЕ/г. Выход сухого порошка составлял 200 г с 1 м2 пленки биомассы.Pure culture bacteria were grown in test tubes on an oblique potato-glucose agar. The mother culture of the producer strain was grown on Taylon 3 liquid nutrient medium (Sucrose - 10 g, Dry corn extract - 5 g, (NH 4 ) 2 HPO 4 - 2 g, KH 2 PO 4 - 2 g, MgSO 4 × 7H 2 O - 0.25 g, CaCO 3 - 1 g, distilled water - 1 l, Ph - 6.35) in three-liter containers, with a volume of nutrient medium 1 liter, on a thermostatic rocking chair, with an engine speed of 200 rpm for 2 days at a temperature of 28 ° C. The grown uterine culture was mixed with Tylon 3 liquid nutrient medium in a metering mixer and fed through a feeding device to a cultivator cell. The mixture was aerated with air. The bacterium was grown for 5 days in a thin layer of the nutrient medium (2.0 cm) to the maximum use of solids of the nutrient medium (2.0%), with the opening of rotary dampers at an angle of 2.5 °, using a light green filter in the lights . The following steps corresponded to Example 1. The microbiological product obtained from this example had a titer of 10 13 CFU / g. The yield of dry powder was 200 g with 1 m 2 of biomass film.
Итак, при реализации заявляемых изобретений, устраняется недостаток прототипа. Отличительные от прототипа признаки заявляемых изобретений необходимы и достаточны для того, чтобы обеспечить возможность промышленного способа поверхностного выращивания микроорганизмов на жидкой питательной среде с минимальным применением ручного труда, т.е. для достижения поставленной цели и решения поставленной задачи.So, when implementing the claimed inventions, the disadvantage of the prototype is eliminated. Distinctive features of the prototype of the features of the claimed inventions are necessary and sufficient to enable the industrial method of surface cultivation of microorganisms in a liquid nutrient medium with minimal use of manual labor, i.e. to achieve the goal and solve the problem.
Источники информацииInformation sources
1. Патент РФ №2171580 по заявке №99126556/13 от 17.12.1999 г. Опубл. 10.08.2001 г. «Штамм гриба Trichoderma sp. МГ-97, используемый для защиты сеянцев хвойных от фузариозов», авт.: Громовых Т.И., Шмарловская С.В., Тюльпанова В.А., Громовых B.C.1. RF patent No. 2171580 by application No. 99126556/13 of 12/17/1999, Publ. August 10, 2001 “The strain of the fungus Trichoderma sp. MG-97, used to protect coniferous seedlings from Fusarium infections ", author: Gromovy TI, Shmarlovskaya SV, Tyulpanova VA, Gromovy B.C.
2. Патент Франция №2545099, C12N 1/14. Новый штамм Trichoderma harzianum, способ его выделения и культивирования, пептиды, продуцируемые этим штаммом, и применение штамма и новых пептидов или продуктов, полученных в процессе культивирования, как средство биологической борьбы в форме фитосанитарных препаратов, - 1984 г.2. French Patent No. 2545099, C12N 1/14. The new strain of Trichoderma harzianum, the method of isolation and cultivation, the peptides produced by this strain, and the use of the strain and new peptides or products obtained during cultivation, as a means of biological control in the form of phytosanitary preparations, 1984.
3. Л.А.Пузанова. Метод массового выращивания гиперпаразита из рода Ампеломицес для борьбы с мучнистыми росами сельскохозяйственных культур. Труды Кубанского сельскохозяйственного института. Вып.148, 1977, с.20-22.3. L.A. Puzanova. The method of mass cultivation of hyperparasite from the genus Ampelomitses to combat powdery mildew of crops. Proceedings of the Kuban Agricultural Institute. Issue. 148, 1977, pp. 20-22.
Claims (7)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013143591/10A RU2532828C1 (en) | 2013-09-26 | 2013-09-26 | Method of surface growing of microorganism on liquid culture medium and device for its realisation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013143591/10A RU2532828C1 (en) | 2013-09-26 | 2013-09-26 | Method of surface growing of microorganism on liquid culture medium and device for its realisation |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2532828C1 true RU2532828C1 (en) | 2014-11-10 |
Family
ID=53382503
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013143591/10A RU2532828C1 (en) | 2013-09-26 | 2013-09-26 | Method of surface growing of microorganism on liquid culture medium and device for its realisation |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2532828C1 (en) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU990814A1 (en) * | 1981-08-12 | 1983-01-23 | Всесоюзный Научно-Исследовательский Институт Генетики И Селекции Промышленных Микроорганизмов "Вниигенетика" | Process for producing p-tryptophan |
| RU2063434C1 (en) * | 1993-11-18 | 1996-07-10 | Товарищество с ограниченной ответственностью НВЦ "Биодрон" | Production line for microbiological preparations |
| RU2144952C1 (en) * | 1999-06-10 | 2000-01-27 | Сычев Анатолий Егорович | Apparatus for growth of microorganisms |
| RU2235767C2 (en) * | 1998-04-30 | 2004-09-10 | Профита Биологишер Пфланценшутц Гмбх | Solid-phase fermenter device and method for solid-phase culturing |
-
2013
- 2013-09-26 RU RU2013143591/10A patent/RU2532828C1/en active IP Right Revival
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU990814A1 (en) * | 1981-08-12 | 1983-01-23 | Всесоюзный Научно-Исследовательский Институт Генетики И Селекции Промышленных Микроорганизмов "Вниигенетика" | Process for producing p-tryptophan |
| RU2063434C1 (en) * | 1993-11-18 | 1996-07-10 | Товарищество с ограниченной ответственностью НВЦ "Биодрон" | Production line for microbiological preparations |
| RU2235767C2 (en) * | 1998-04-30 | 2004-09-10 | Профита Биологишер Пфланценшутц Гмбх | Solid-phase fermenter device and method for solid-phase culturing |
| RU2144952C1 (en) * | 1999-06-10 | 2000-01-27 | Сычев Анатолий Егорович | Apparatus for growth of microorganisms |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Jarstfer et al. | Aeroponic culture of VAM fungi | |
| CN101875571B (en) | Method for preparing enhanced liquid microbial organic fertilizer | |
| CN107427012A (en) | Microbial composite and method | |
| JP7319254B2 (en) | Large scale production of liquid and solid Trichoderma products | |
| JP4956751B2 (en) | Plant disease control agent and plant disease control method | |
| KR100483333B1 (en) | Production method of the cauliflower mushroom using fermented sawdust | |
| Subash et al. | Mass cultivation of Trichoderma harzianum using agricultural waste as a substrate for the management of damping off disease and growth promotion in chilli plants (Capsicum annuum L.) | |
| JPH0625A (en) | Cultivation of edible mushroom and medium therefor | |
| Coello-Castillo et al. | Production of Agaricus bisporus on substrates pre-colonized by Scytalidium thermophilum and supplemented at casing with protein-rich supplements | |
| CN106520595B (en) | A kind of arthrobacterium and its application in terms of biological control bacterial wilt of tomato | |
| CN109956835A (en) | A kind of organic compound fertilizer and its preparation method and application | |
| CA2714670A1 (en) | Bacillus subtilis and use thereof as a green mold inhibitor | |
| RU2532828C1 (en) | Method of surface growing of microorganism on liquid culture medium and device for its realisation | |
| JP5719067B1 (en) | Method for producing weed germination growth inhibiting material, weed germination growth inhibiting material obtained by the production method and cultivation method of paddy rice | |
| JP2021528082A (en) | Use of green microalgae to improve plant growth | |
| CN102523918A (en) | Gastrodia elata high-yield planting method by indoor microculture | |
| KR101693460B1 (en) | System for mass inoculation spawn of cauliflower mushroom | |
| CN109956779A (en) | A kind of dregs of beans mixed organic manure and its preparation method and application | |
| CN107580974A (en) | A kind of more batches of fruiting devices of flat mushroom and the fruiting method using the device | |
| RU2551968C2 (en) | Bacillus pumilus A 1.5 BACTERIA STRAIN AS AGENT FOR INCREASING PLANT PRODUCTIVITY AND PLANT PROTECTION FROM DISEASES CAUSED BY PHYTOPATHOGENIC MICROORGANISMS | |
| CN103387427B (en) | Method for manufacture of biofertilizer by pleuromutilin bacterial residue harmless treatment | |
| RU2376270C2 (en) | Method for production of biologically active organic fertiliser (baof) | |
| JP2013103870A (en) | Method for sterilizing organic fertilizer | |
| CN106417383A (en) | Anaerobic microbial bacteria preparation for preventing and controlling vegetable insect pests | |
| KR101693461B1 (en) | System capable of preventing infection and air pollution for mass inoculation spawn of cauliflower mushroom |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20160927 |
|
| TK4A | Correction to the publication in the bulletin (patent) |
Free format text: AMENDMENT TO CHAPTER -MM4A - IN JOURNAL: 16-2017 |
|
| PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20180228 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20180927 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20201109 |