RU2517120C1 - Method for detecting botulinum toxins - Google Patents
Method for detecting botulinum toxins Download PDFInfo
- Publication number
- RU2517120C1 RU2517120C1 RU2012132516/15A RU2012132516A RU2517120C1 RU 2517120 C1 RU2517120 C1 RU 2517120C1 RU 2012132516/15 A RU2012132516/15 A RU 2012132516/15A RU 2012132516 A RU2012132516 A RU 2012132516A RU 2517120 C1 RU2517120 C1 RU 2517120C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- substrate
- botulinum toxins
- botulinum
- test material
- phosphate buffer
- Prior art date
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицины, а именно - к лабораторной диагностике и иммунологии, и может быть использовано для проведения исследований клинического материала и пищевых продуктов на наличие ботулотоксинов.The invention relates to medicine, namely to laboratory diagnostics and immunology, and can be used to conduct research on clinical material and food products for the presence of botulinum toxins.
Ботулизм - тяжелая токсикоинфекция с высокой летальностью (35-85%). Люди чрезвычайно чувствительны к ботулотоксинам. Смертельная доза токсина для человека составляет 1 нг/кг массы тела. Ботулинические токсины в обычных условиях внешней среды сохраняются до года, в консервированных продуктах - годами. Присутствие ботулотоксинов в пищевых продуктах не изменяет органолептических свойств последних.Botulism is a severe toxicoinfection with a high mortality rate (35-85%). People are extremely sensitive to botulinum toxins. The lethal dose of toxin for humans is 1 ng / kg body weight. Botulinum toxins in normal environmental conditions last up to a year, in canned products for years. The presence of botulinum toxins in food does not alter the organoleptic properties of the latter.
Ботулинические токсины - яды биологического происхождения II группы патогенности, с наибольшей вероятностью могут быть использованы в качестве поражающих агентов биотерроризма.Botulinum toxins - poisons of biological origin of the II group of pathogenicity, are most likely to be used as the damaging agents of bioterrorism.
Детекцию ботулотоксинов традиционно проводят двумя методами: постановкой реакций пассивной гемагглютинации (РПГА) и биологической нейтрализации токсина на белых мышах (РБНТ) с использованием диагностических противоботулинических поли- и моновалентных сывороток типов A, B, C, E и F. Ориентировочный ответ в РБНТ выдается лишь через 2 суток, окончательный - через 4-8 сут. К сожалению, не всегда имеется возможность проведения работ с лабораторными животными, да и сроки получения результатов в РБНТ длительны. В связи с ограниченной разрешающей способностью агглютинационных методов диагностики, в РПГА не всегда удается обнаружить небольшое количество токсина в клиническом материале, положительном в РБНТ.The detection of botulinum toxins is traditionally carried out by two methods: staging passive hemagglutination reactions (RPHA) and biological neutralization of toxin in white mice (RBNT) using diagnostic anti-botulinum poly- and monovalent sera types A, B, C, E and F. An indicative response in RBNT is issued only after 2 days, the final - after 4-8 days. Unfortunately, it is not always possible to work with laboratory animals, and the timing for obtaining results in RBNT is long. Due to the limited resolution of agglutination diagnostic methods, it is not always possible to detect a small amount of toxin in the clinical material positive in RBNT in RPHA.
Поэтому разработка новых и усовершенствование существующих способов детекции ботулинических токсинов остаются актуальной задачей.Therefore, the development of new and improvement of existing methods for the detection of botulinum toxins remain an urgent task.
Один из способов обнаружения ботулотоксинов - постановка РПГА. Перед постановкой реакции исследуемый на ботулотоксины материал прогревают при 56°C 20 мин, адсорбируют 50% взвесью формалинизированных эритроцитов барана в течение 15 мин и центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин. РПГА с надосадочной жидкостью ставят в 96-луночном полистироловом планшете с четырьмя или пятью типами ботулинических иммуноглобулиновых антитоксических эритроцитарных диагностикумов. В лунки верхнего ряда микропланшета (за исключением предпоследней лунки) автоматическим дозатором вносят 50 мкл забуференного физиологического раствора pH 7.2 (ЗФР), содержащего 1% нормальной кроличьей сыворотки (разводящая жидкость). Затем в первую лунку вносят 50 мкл исследуемого материала и титруют, перемешивая содержимое лунок и перенося по 50 мкл из 1-ой лунки во 2-ю, из 2-ой в 3-ю и т.д. до 10 лунки включительно, из которой 50 мкл раститрованного исследуемого материала удаляют в дезинфицирующий раствор. Предпоследняя лунка содержит 50 мкл заведомо положительного образца (положительный контроль). Последняя лунка - контроль эритроцитарного диагностикума. После серии двукратного разбавления исследуемого материала в каждую лунку вносят по 1 капле ботулинического иммуноглобулинового антитоксического эритроцитарного диагностикума (из моновалентных сывороток типов A, B, C, E и F). Планшет оставляют на 2-2.5 ч при комнатной температуре. После этого учитывают результаты: в лунках, которые содержат материал в котором присутствуют ботулотоксины, формируются «зонтики», в отсутствие ботулотоксинов в лунке формируются «пуговки». (Г.Г. Онищенко, Ю.М. Федоров, Н.Я. Жилина, В.Г. Субботин, В.В. Алексеев и др. Практическое пособие для подготовки врачей-бактериологов и эпидемиологов по вопросам противодействия биотерроризму. - Волгоград, 2004. - С.44-52.).One of the methods for detecting botulinum toxins is by using RPHA. Before setting up the reaction, the material studied for botulinum toxins is heated at 56 ° C for 20 minutes, adsorbed with a 50% suspension of formalinized sheep erythrocytes for 15 minutes, and centrifuged for 5 minutes at 3000 rpm. RPHA with supernatant is placed in a 96-well polystyrene plate with four or five types of botulinum immunoglobulin antitoxic erythrocyte diagnostics. In the wells of the upper row of the microplate (with the exception of the penultimate well), 50 μl of buffered saline solution pH 7.2 (PBS) containing 1% normal rabbit serum (diluting liquid) is added with an automatic dispenser. Then, 50 μl of the test material is introduced into the first well and titrated, mixing the contents of the wells and transferring 50 μl from the 1st well to the 2nd, from the 2nd to the 3rd, etc. up to 10 wells inclusive, from which 50 μl of the cultured test material is removed into the disinfectant solution. The penultimate well contains 50 μl of a known positive sample (positive control). The last hole is the control of the red blood cell diagnosticum. After a series of two-fold dilution of the test material, 1 drop of botulinum immunoglobulin antitoxic erythrocyte diagnosticum (from monovalent types A, B, C, E and F) is added to each well. The tablet is left for 2-2.5 hours at room temperature. After that, the results are taken into account: in the wells that contain the material in which botulinum toxins are present, “umbrellas” are formed, in the absence of botulinum toxins, “buttons” are formed in the hole. (G.G. Onishchenko, Yu.M. Fedorov, N.Ya. Zhilina, V.G. Subbotin, V.V. Alekseev, and others. A practical guide for training bacteriologists and epidemiologists on countering bioterrorism. - Volgograd, 2004. - S. 44-52.).
Однако данный способ недостаточно чувствителен. Он не всегда позволяет обнаруживать небольшое количество ботулотоксинов в образцах, положительных в реакции биологической нейтрализации токсина на белых мышах.However, this method is not sensitive enough. It does not always allow detecting a small amount of botulinum toxins in samples that are positive in the biological neutralization of the toxin in white mice.
Наиболее близким к предлагаемому является практически 100% достоверный способ детекции ботулотоксинов - РБНТ, включающий введение внутрибрюшинно двум белым мышам по 0.5 мл исследуемого материала. Для контроля специфичности определения токсина четырем белым мышам вводят внутрибрюшинно по 1 мл смеси, состоящей из 0.5 мл материала, содержащего ботулотоксин, и 0.5 мл смеси из моновалентных концентрированных противоботулинических сывороток типов A, B, C, E, F производства НПО «Аллерген» г. Ставрополь.Closest to the proposed is an almost 100% reliable method for detecting botulinum toxins - RBNT, including the administration of 0.5 ml of the studied material intraperitoneally to two white mice. To control the specificity of determining the toxin, four white mice are injected intraperitoneally with 1 ml of a mixture consisting of 0.5 ml of material containing botulinum toxin and 0.5 ml of a mixture of monovalent concentrated anti-botulinum serums of types A, B, C, E, F produced by NPO Allergen, Stavropol.
Смесь исследуемого материала выдерживают с противоботулиническими сыворотками при комнатной температуре в течение 15-30 мин с целью нейтрализации неизвестного ботулинического токсина соответствующими ему антитоксинами и после этого вводят смесь контрольным белым мышам. За мышами, которым ввели только материал, содержащий токсин, наблюдают 44-48 ч с целью выявления у них признаков отравления. Поражение белых мышей ботулиническим токсином проявляется в виде общей слабости, парезов задних конечностей и паралича диафрагмы. Это обусловливает характерные признаки отравления: лежачее положение животных, втянутые бока («осиная талия»), дыхание редкое и глубокое. Сроки проявления указанных признаков и сроки гибели животных зависят от дозы токсина, его активности и типа.The mixture of the test material is kept with anti-botulinum sera at room temperature for 15-30 minutes in order to neutralize the unknown botulinum toxin with its corresponding antitoxins and then the mixture is administered to control white mice. Mice that were injected with toxin-containing material alone were monitored for 44-48 hours to detect signs of poisoning. The defeat of white mice with botulinum toxin manifests itself in the form of general weakness, paresis of the hind limbs and paralysis of the diaphragm. This causes the characteristic signs of poisoning: the lying position of the animals, retracted sides ("wasp waist"), breathing rare and deep. The timing of the manifestation of these signs and the timing of the death of animals depends on the dose of the toxin, its activity and type.
При наличии больших концентраций токсина гибель животных обычно наступает в течение первых суток. При малых концентрациях токсина в исследуемой пробе гибель мышей (или появление признаков отравления) может наблюдаться в более поздние сроки (3-8 сут). У животных (4 контрольные белые мыши), которым ввели смесь материала, содержащего ботулотоксины, с противоботулинической поливалентной сывороткой признаки отравления токсинами должны отсутствовать. Если опытные белые мыши погибают, а контрольные остаются живыми, выдают заключение о наличии ботулинических токсинов в исследуемом материале. Если и опытные, и контрольные мыши живы, то определяют отсутствие ботулотоксинов в исследуемом материале (Г.Г. Онищенко, Ю.М. Федоров, Н.Я. Жилина, В.Г. Субботин, В.В. Алексеев и др. Практическое пособие для подготовки врачей-бактериологов и эпидемиологов по вопросам противодействия биотерроризму. - Волгоград, 2004. - С.44-52).In the presence of high concentrations of toxin, the death of animals usually occurs within the first day. At low concentrations of toxin in the test sample, the death of mice (or the appearance of signs of poisoning) can be observed at a later date (3-8 days). In animals (4 control white mice), which were injected with a mixture of material containing botulinum toxins, with anti-botulinum polyvalent serum, there should be no signs of toxin poisoning. If the experimental white mice die, and the control remains alive, they give a conclusion about the presence of botulinum toxins in the test material. If both experimental and control mice are alive, then the absence of botulinum toxins in the test material is determined (G.G. Onishchenko, Yu.M. Fedorov, N.Ya. Zhilina, V.G. Subbotin, V.V. Alekseev, and others. Practical manual for the training of bacteriologists and epidemiologists on countering bioterrorism. - Volgograd, 2004. - P.44-52).
Цель изобретения - сокращение времени обнаружения ботулотоксинов, упрощение способа, повышение доступности.The purpose of the invention is to reduce the detection time of botulinum toxins, simplifying the method, increasing accessibility.
Поставленная цель достигается тем, что твердую пористую подложку перед нанесением исследуемого образца погружают при комнатной температуре на 1 ч в раствор поливалентной противоботулинической диагностической сыворотки. Далее подложку высушивают на воздухе, точечно наносят на нее исследуемый материал (образцы клинического материала от больных или образцы пищевых продуктов) в объеме 1-2 мкл, через 15 мин после полного впитывания материала и подсыхания подложки ее промывают дважды 0.01 M фосфатным буфером pH 7.2 (ФБР), содержащим 0.05% твина 20 (ФБР-твин), и погружают в раствор инертного белка (2%-ный раствор бычьего сывороточного альбумина на 0.01 M фосфатном буфере pH 7.2 или 2%-ный раствор казеината натрия на ФБР). После последующего двукратного промывания ФБР-твином подложку на 1 ч помещают в поливалентную противоботулиническую сыворотку, меченную частицами коллоидного серебра. Далее подложку трехкратно промывают ФБР-твином, двукратно - дистиллированной водой и затем погружают в водный раствор, содержащий 0.5% лимонной кислоты, 0.1% метола и 0.2% азотнокислого серебра на 3-5 мин, после чего подложку промывают проточной водой и высушивают на воздухе. Результаты реакции учитывают визуально. Если формируются разного оттенка серые пятна на подложке в местах нанесения образцов, определяют наличие ботулотоксинов в исследуемом материале. Если в местах нанесения образцов подложка имеет первоначальный белый цвет - определяют отсутствие ботулотоксинов в исследуемом материале.This goal is achieved by the fact that a solid porous substrate before applying the test sample is immersed at room temperature for 1 h in a solution of polyvalent anti-botulinum diagnostic serum. Next, the substrate is dried in air, the test material (samples of clinical material from patients or food samples) is spotted on it in a volume of 1-2 μl, 15 minutes after the material is completely absorbed and the substrate is dried, it is washed twice with 0.01 M phosphate buffer pH 7.2 ( FBI) containing 0.05% Tween 20 (FBI-Tween) and immersed in an inert protein solution (2% solution of bovine serum albumin in 0.01 M phosphate buffer pH 7.2 or 2% solution of sodium caseinate on the FBI). After subsequent double washing with PBS-Tween, the substrate was placed for 1 h in polyvalent anti-botulinum serum labeled with colloidal silver particles. Next, the substrate is washed three times with FBI-tween, twice with distilled water and then immersed in an aqueous solution containing 0.5% citric acid, 0.1% metol and 0.2% silver nitrate for 3-5 min, after which the substrate is washed with running water and dried in air. The reaction results are taken into account visually. If gray spots on a substrate are formed in different shades at the places where the samples were applied, the presence of botulinum toxins in the test material is determined. If the substrate has the initial white color at the sample application sites, the absence of botulinum toxins in the test material is determined.
Сопоставительный анализ с прототипом показал, что предлагаемый способ отличается от известного тем, что твердую подложку с размером пор 0,17-0,45 мкм погружают на 1 ч в раствор поливалентной противоботулинической сыворотки, разведенной 1:100 0.01 M фосфатным буфером pH 7.2, далее подложку подсушивают на воздухе, затем точечно наносят исследуемый материал в объеме 1-2 мкл, после полного впитывания исследуемого материала подложку промывают дважды 0.01 M фосфатным буфером pH 7.2, содержащим 0.05% твина 20, затем погружают в раствор инертного белка и выдерживают в течение 30 мин при температуре 18-26°C, после чего подложку двукратно промывают ФБР-твином. Затем подложку помещают в раствор поливалентной противоботулинической сыворотки, меченной частицами коллоидного серебра, при комнатной температуре на 1 ч, после этого погружают подложку на 3-5 мин в водный раствор, содержащий 0.5% лимонной кислоты, 0.1% метола и 0.2% азотнокислого серебра, и затем промывают подложку проточной водой, подсушивают на воздухе, после чего определяют наличие ботулинических токсинов в исследуемом материале - если на подложке сформировались темно-серые пятна в местах нанесения образцов, то исследуемый материал содержит ботулинические токсины, если подложка не окрасилась - материал не содержит ботулинических токсинов.Comparative analysis with the prototype showed that the proposed method differs from the known one in that a solid substrate with a pore size of 0.17-0.45 μm is immersed for 1 h in a solution of polyvalent anti-botulinum serum diluted 1: 100 with 0.01 M phosphate buffer pH 7.2, then the substrate is dried in air, then the test material is spotted in a volume of 1-2 μl, after the test material is completely absorbed, the substrate is washed twice with 0.01 M phosphate buffer pH 7.2 containing 0.05% Tween 20, then immersed in an inert protein solution and kept for 30 min at a temperature of 18-26 ° C, after which the substrate is washed twice with PBS-Tween. Then, the substrate is placed in a solution of polyvalent anti-botulinum serum labeled with colloidal silver particles at room temperature for 1 hour, after which the substrate is immersed for 3-5 minutes in an aqueous solution containing 0.5% citric acid, 0.1% metol and 0.2% silver nitrate, and then the substrate is washed with running water, dried in air, and then the presence of botulinum toxins in the test material is determined - if dark gray spots have formed on the substrate at the sites of application of the samples, then the test material contains t botulinum toxins, if the substrate was drowned - material does not contain botulinum toxins.
Таким образом, предлагаемый способ соответствует критерию изобретения «новизна».Thus, the proposed method meets the criteria of the invention of "novelty."
Проведенный анализ патентной и специальной литературы показал, что предлагаемый способ отличается как от прототипа, так и от других технических решений в данной и смежных областях. Так, авторами не найден способ детекции ботулотоксинов, который осуществлялся бы на твердых пористых подложках (нитроцеллюлозных мембранах) с применением в качестве диагностикума поливалентной противоботулинической сыворотки, меченной коллоидным серебром. Предлагаемые режимы способа позволяют достичь поставленной цели - ускорить получение результатов анализа и отказаться от использования лабораторных животных, тем самым повысить доступность способа обнаружения ботулинических токсинов. При этом предлагаемый способ специфичен, характеризуется отсутствием положительного реагирования с материалом от больных острыми кишечными инфекциями, а также не контаминированными ботулотоксинами пищевыми продуктами и позволяет обнаруживать минимальные количества ботулотоксинов, экспрессен, экономичен, прост в постановке и учете результатов реакции, доступен для широкого применения, не требует оснащения дорогостоящими реактивами и оборудованием.The analysis of patent and specialized literature showed that the proposed method differs from both the prototype and other technical solutions in this and related fields. Thus, the authors did not find a method for detecting botulinum toxins that would be carried out on solid porous substrates (nitrocellulose membranes) using polyvalent antibotulinic serum labeled with colloidal silver as a diagnosticum. The proposed modes of the method allow to achieve the goal - to accelerate the receipt of analysis results and to abandon the use of laboratory animals, thereby increasing the availability of a method for detecting botulinum toxins. Moreover, the proposed method is specific, characterized by the absence of a positive reaction with the material from patients with acute intestinal infections, as well as non-contaminated botulinum toxins foods and allows to detect minimal amounts of botulinum toxins, it is expressed, economical, easy to set up and take into account the results of the reaction, is available for wide use, is requires equipping with expensive reagents and equipment.
Данный способ детекции ботулотоксинов может быть использован в клинических, санитарно-гигиенических и научно-исследовательских лабораториях, занимающихся исследованиями на ботулизм.This method of detecting botulinum toxins can be used in clinical, sanitary-hygienic and research laboratories involved in research on botulism.
Таким образом, предлагаемый способ детекции ботулотоксинов соответствует критериям «изобретательский уровень» и «промышленная применимость».Thus, the proposed method for the detection of botulinum toxins meets the criteria of "inventive step" and "industrial applicability".
Предлагаемый способ детекции ботулотоксинов осуществляется следующим образом: твердую пористую подложку с размером пор 0,17-0,45 мкм (нитроцеллюлозные мембраны, либо фильтры «Synpor», Чехия) погружают при комнатной температуре на 1 ч в раствор поливалентной противоботулинической против типов A, B, C, E, F сыворотки (производства НПО «Аллерген», г. Ставрополь), разведенной 1:100 0.01 M фосфатным буфером pH 7.2. Далее подложку высушивают на воздухе, точечно наносят исследуемый материал в объеме 1-2 мкл, после полного впитывания и подсыхания на подложке образца ее помещают в чашку Петри, промывают дважды 0.01 M фосфатным буфером pH 7.2, содержащим 0.05% твина 20, и погружают в раствор инертного белка (2%-ный раствор бычьего сывороточного альбумина на 0.01 M фосфатном буфере pH 7.2 или 2%-ный раствор казеината натрия на ФБР), блокируя оставшиеся свободные участки на подложке в течение 30 мин при комнатной температуре. После последующего двукратного промывания ФБР-твином подложку помещают в раствор поливалентной противоботулинической сыворотки, меченной частицами коллоидного серебра, на 1 ч. Результаты реакции учитываются визуально после погружения подложки на 3-5 мин в водный раствор, содержащий 0,5% лимонной кислоты, 0,1% метола и 0,2% азотнокислого серебра, и последующего промывания проточной водой. Если формируются разного оттенка серые пятна на подложке в местах нанесения образцов, то определяют наличие ботулотоксинов в исследуемом материале. Если в местах нанесения образцов подложка имеет первоначальный (белый) цвет определяют отсутствие ботулотоксинов в исследуемом материале.The proposed method for detecting botulinum toxins is as follows: a solid porous substrate with a pore size of 0.17-0.45 μm (nitrocellulose membranes, or Synpor filters, Czech Republic) is immersed at room temperature for 1 h in a solution of polyvalent anti-botulinum against types A, B , C, E, F serum (produced by NPO Allergen, Stavropol) diluted 1: 100 with 0.01 M phosphate buffer pH 7.2. Next, the substrate is dried in air, the test material is spotted in a volume of 1-2 μl, after complete absorption and drying on the sample substrate, it is placed in a Petri dish, washed twice with 0.01 M phosphate buffer pH 7.2 containing 0.05% Tween 20, and immersed in a solution inert protein (2% solution of bovine serum albumin on 0.01 M phosphate buffer pH 7.2 or 2% solution of sodium caseinate on the FBI), blocking the remaining free areas on the substrate for 30 minutes at room temperature. After subsequent double washing with PBS, the substrate is placed in a solution of polyvalent anti-botulinum serum labeled with colloidal silver particles for 1 hour. The reaction results are taken into account visually after immersing the substrate for 3-5 minutes in an aqueous solution containing 0.5% citric acid, 0, 1% metol and 0.2% silver nitrate, and subsequent washing with running water. If gray spots of a different shade are formed on the substrate at the sites of application of the samples, then the presence of botulinum toxins in the test material is determined. If the substrate has the initial (white) color at the sample application sites, the absence of botulinum toxins in the test material is determined.
Параллельно ставят положительный контроль (материал заведомо содержит ботулотоксины, т.е. данный материал дал положительный результат в РБНТ) и отрицательный контроль (разводящая жидкость). В местах нанесения материала содержащего ботулотоксины формируются серые пятна, в местах нанесения разводящей жидкости серые пятна не формируются, подложка сохраняет первоначальный белый цвет.In parallel, they put a positive control (the material obviously contains botulinum toxins, i.e. this material gave a positive result in RBNT) and a negative control (diluting liquid). Gray spots form at the places where the material containing botulinum toxins is applied, gray spots do not form at the places where the spreading liquid was applied, the substrate retains its original white color.
Процедура мечения поливалентной противоботулинической сыворотки частицами коллоидного серебра, включает 2 этапа: приготовление раствора коллоидного серебра и мечения им специфических противоботулинических антител. Золь серебра получают восстановлением азотнокислого серебра боргидридом натрия. Для этого к 5 мл 0.05% водного раствора боргидрида натрия одномоментно приливают равный объем 0.02% водного раствора азотнокислого серебра. Интенсивно встряхивают на шуттеле при комнатной температуре в течение 15 мин. Цельную поливалентную противоботулиническую сыворотку предварительно диализуют в течение 5-6 ч против дистиллированной воды, осветляют центрифугированием (12000g, 2 мин) и в объеме 62.5 мкл вносят в стакан, куда одномоментно быстро выливают 10 мл золя серебра. Смесь перемешивают на магнитной мешалке 20 мин при комнатной температуре, затем в течение последующих 20 мин стабилизируют внесением равного объема 0.01 M фосфатного буфера pH 7.2, содержащего 1% бычьего сывороточного альбумина, 2 мл предварительно отцентрифугированной нормальной кроличьей сыворотки (12000g, 15 мин) и 2.0 мл 0.5%-ного водного раствора полиэтиленгликоля - 20000. Далее в полученный комплекс добавляют 0.15 M хлористого натрия и 0.1% боргидрида натрия, и дополнительно легко перемешивают 5-10 мин.The procedure for labeling polyvalent anti-botulinum serum with colloidal silver particles includes 2 steps: preparing a solution of colloidal silver and labeling specific anti-botulinum antibodies with it. Silver sol is obtained by reducing silver nitrate with sodium borohydride. For this, an equal volume of 0.02% silver nitrate aqueous solution is simultaneously poured into 5 ml of a 0.05% aqueous solution of sodium borohydride. Shake vigorously on the shutter at room temperature for 15 minutes. Whole multivalent antitobulinic serum is pre-dialyzed for 5-6 hours against distilled water, clarified by centrifugation (12000g, 2 min) and added to a glass in a volume of 62.5 μl, where 10 ml of silver sol is immediately poured quickly. The mixture is stirred on a magnetic stirrer for 20 minutes at room temperature, then stabilized over the next 20 minutes by adding an equal volume of 0.01 M phosphate buffer pH 7.2 containing 1% bovine serum albumin, 2 ml of pre-centrifuged normal rabbit serum (12000g, 15 min) and 2.0 ml of a 0.5% aqueous solution of polyethylene glycol - 20,000. Next, 0.15 M sodium chloride and 0.1% sodium borohydride are added to the resulting complex, and additionally mix for 5-10 minutes.
Пример 1. Детекцию ботулинических токсинов проводили как описано выше: образцы клинического материала (рвотные массы), предварительно подготовленные к исследованию в соответствии с «Инструкцией по применению сывороток диагностических ботулинических типов A, B, C, E, F нативных лошадиных или крупного рогатого скота сухих для реакции биологической нейтрализации (1998)», наносили в виде капель объемом 1 мкл на твердую пористую подложку с размером пор 0,17 мкм, заранее обработанную в течение 1 ч при комнатной температуре поливалентной противоботулинической сывороткой в разведении 1:100 ФБР и высушенной на воздухе. После полного впитывания материала и подсыхания подложки ее помещали в чашку Петри и дважды промывали ФБР-твином. Далее подложку погружали на 30 мин в 2% раствор бычьего сывороточного альбумина на ФБР, после чего дважды промывали ФБР-твином. Затем подложку погружали в раствор поливалентной противоботулинической сыворотки, меченной коллоидным серебром, на 1 ч при комнатной температуре. После тщательного трехкратного промывания ФБР-твином и двукратного дистиллированной водой подложку погружали на 3 мин в водный раствор, содержащий 0.5% лимонной кислоты, 0.1% метола и 0.2% азотнокислого серебра. Затем подложку промывали проточной водой и высушивали на воздухе. Регистрацию результатов реакции проводили визуально. В местах нанесения исследуемого образца (рвотных масс) и в параллельно поставленных положительных контролях (заведомо положительный материал в РБНТ от больных с установленным клиническим диагнозом ботулизма) на подложке сформировались четкие окрашенные в серый цвет пятна. В местах нанесения отрицательных контролей (ФБР, клинический материал от больного с ОКИ неустановленной этиологии) окрашенных пятен на подложке не наблюдалось, подложка осталась белой.Example 1. The detection of botulinum toxins was performed as described above: samples of clinical material (vomit), previously prepared for the study in accordance with the "Instructions for the use of sera diagnostic diagnostic botulinum types A, B, C, E, F of native horse or cattle dry for the biological neutralization reaction (1998), "was applied in the form of droplets with a volume of 1 μl onto a solid porous substrate with a pore size of 0.17 μm, pre-treated for 1 h at room temperature with a polyvalent anti-botulinum 1: 100 FBI and dried in air. After complete absorption of the material and drying of the substrate, it was placed in a Petri dish and washed twice with PBS. Next, the substrate was immersed for 30 min in a 2% solution of bovine serum albumin on the FBI, and then washed twice with FBI-tween. Then, the substrate was immersed in a solution of polyvalent anti-botulinum serum labeled with colloidal silver for 1 h at room temperature. After thorough washing three times with FBI-tween and twice with distilled water, the substrate was immersed for 3 min in an aqueous solution containing 0.5% citric acid, 0.1% metol, and 0.2% silver nitrate. Then the substrate was washed with running water and dried in air. The reaction results were recorded visually. In the places of application of the test sample (vomit) and in parallel posed positive controls (obviously positive material in RBNT from patients with an established clinical diagnosis of botulism), clear gray-colored spots formed on the substrate. In the places where negative controls were applied (FBI, clinical material from a patient with acute intestinal infections of unknown etiology), no stained spots were observed on the substrate, the substrate remained white.
Таким образом, исследуемый образец (рвотные массы), содержит ботулинические токсины.Thus, the test sample (vomit) contains botulinum toxins.
Параллельно определяли наличие ботулотоксинов в исследуемом образце по способу-прототипу (в РБНТ) - опытные белые мыши погибли через 37 часов, контрольные мыши остались живыми. Таким образом, результаты, полученные по предлагаемому способу и способу-прототипу, совпали - исследуемый образец содержит ботулинические токсины.In parallel, the presence of botulinum toxins in the test sample was determined by the prototype method (in RBNT) - the experimental white mice died after 37 hours, the control mice remained alive. Thus, the results obtained by the proposed method and the prototype method coincided - the test sample contains botulinum toxins.
Пример 2. Детекцию ботулинических токсинов проводили как описано выше: образцы клинического материала (промывные воды кишечника), предварительно подготовленные к исследованию в соответствии с «Инструкцией по применению сывороток диагностических ботулинических типов A, B, C, E, F нативных лошадиных или крупного рогатого скота сухих для реакции биологической нейтрализации (1998)», наносили в виде капель объемом 2 мкл на твердую пористую подложку с размером пор 0,45 мкм, заранее обработанную в течение 1 ч при комнатной температуре поливалентной противоботулинической сывороткой в разведении 1:100 ФБР и высушенной на воздухе. После полного впитывания материала и подсыхания подложки ее помещали в чашку Петри и дважды промывали ФБР-твином. Далее подложку погружали на 30 мин в 2% раствор казеината натрия на ФБР, после чего дважды промывали ФБР-твином. Затем погружали подложку в раствор поливалентной противоботулинической сыворотки, меченной коллоидным серебром, на 1 ч при комнатной температуре. После тщательного трехкратного промывания ФБР-твином и двукратного дистиллированной водой подложку погружали на 5 мин в водный раствор, содержащий 0.5% лимонной кислоты, 0.1% метола и 0.2% азотнокислого серебра. Затем подложку промывали проточной водой и высушивали на воздухе. Регистрацию результатов реакции проводили визуально. В местах нанесения исследуемого образца (промывные воды кишечника) на подложке сформировались четкие окрашенные в серый цвет пятна. В местах нанесения положительных контролей (заведомо положительный материал в РБНТ от больных с установленным клиническим диагнозом ботулизма) на подложке также сформировались четкие окрашенные в серый цвет пятна. В местах нанесения отрицательных контролей (ФБР, клинический материал от больного с ОКИ неустановленной этиологии) окрашенных пятен на подложке не наблюдалось, подложка осталась белой.Example 2. The detection of botulinum toxins was carried out as described above: samples of clinical material (intestinal lavage), previously prepared for the study in accordance with the "Instructions for the use of serum diagnostic botulinum types A, B, C, E, F of native horses or cattle dry for the biological neutralization reaction (1998) ”, was applied in the form of droplets with a volume of 2 μl on a solid porous substrate with a pore size of 0.45 μm, pre-treated for 1 h at room temperature with polyvalent tivobotulinicheskoy serum diluted 1: 100 PBS and air-dried. After complete absorption of the material and drying of the substrate, it was placed in a Petri dish and washed twice with PBS. Next, the substrate was immersed for 30 min in a 2% solution of sodium caseinate on PBS, and then washed twice with PBS-Tween. Then, the substrate was immersed in a solution of polyvalent anti-botulinum serum labeled with colloidal silver for 1 h at room temperature. After thorough washing three times with FBI-tween and twice with distilled water, the substrate was immersed for 5 min in an aqueous solution containing 0.5% citric acid, 0.1% metol, and 0.2% silver nitrate. Then the substrate was washed with running water and dried in air. The reaction results were recorded visually. In the places where the test sample was applied (intestinal washings), clear gray-colored spots formed on the substrate. In the places of applying positive controls (obviously positive material in RBNT from patients with an established clinical diagnosis of botulism), clear gray-colored spots also formed on the substrate. In the places where negative controls were applied (FBI, clinical material from a patient with acute intestinal infections of unknown etiology), no stained spots were observed on the substrate, the substrate remained white.
Таким образом, исследуемый образец (промывные воды кишечника) содержит ботулинические токсины.Thus, the test sample (intestinal lavage) contains botulinum toxins.
Параллельно определяли наличие ботулотоксинов в исследуемом образце (промывные воды кишечника) по способу-прототипу (в РБНТ) - опытные белые мыши погибли через 46 часов, контрольные мыши остались живыми. Таким образом, результаты, полученные по предлагаемому способу и способу-прототипу, совпали - исследуемый образец содержит ботулинические токсины.In parallel, the presence of botulinum toxins in the test sample (intestinal lavage) was determined by the prototype method (in RBNT) - experimental white mice died after 46 hours, control mice remained alive. Thus, the results obtained by the proposed method and the prototype method coincided - the test sample contains botulinum toxins.
Пример 3. Детекцию ботулинических токсинов проводили как описано выше: исследуемый образец (рыба холодного копчения), предварительно подготовленная к исследованию в соответствии с ГОСТ 10444.7-86 «Методы выявления ботулинических токсинов и C. Botulinum», наносили в виде капель объемом 1 мкл на твердую пористую подложку с размером пор 0,17 мкм, заранее обработанную в течение 1 ч при комнатной температуре поливалентной противоботулинической сывороткой в разведении 1:100 на ФБР. После полного впитывания материала и подсыхания подложки ее дважды промывали ФБР-твином. Далее подложку погружали на 30 мин в 2% раствор бычьего сывороточного альбумина на ФБР, после чего дважды промывали ФБР-твином. Затем погружали подложку в раствор поливалентной противоботулинической сыворотки, меченной коллоидным серебром, на 1 ч при комнатной температуре. После трехкратного промывания ФБР-твином и двукратного дистиллированной водой подложку погружали на 3 мин в водный раствор, содержащий 0.5% лимонной кислоты, 0.1% метола и 0.2% азотнокислого серебра. Далее промывали подложку проточной водой и высушивали на воздухе. Регистрацию результатов реакции проводили визуально. В местах нанесения исследуемого образца (рыба холодного копчения) на подложке сформировались окрашенные в серый цвет пятна. В местах нанесения положительных контролей (заведомо положительный материал в РБНТ - рыба холодного копчения, содержащая ботулотоксины) также сформировались окрашенные в серый цвет пятна. В местах нанесения отрицательных контролей (ФБР, образцы из свежепойманной сырой рыбы, отрицательные в РБНТ) пятен нет, подложка осталась белой.Example 3. The detection of botulinum toxins was carried out as described above: the test sample (cold smoked fish), previously prepared for the study in accordance with GOST 10444.7-86 "Methods for the detection of botulinum toxins and C. Botulinum", was applied in the form of droplets with a volume of 1 μl per solid a porous substrate with a pore size of 0.17 μm, pretreated for 1 h at room temperature with polyvalent anti-botulinum serum at a dilution of 1: 100 on the FBI. After complete absorption of the material and drying of the substrate, it was washed twice with PBS. Next, the substrate was immersed for 30 min in a 2% solution of bovine serum albumin on the FBI, and then washed twice with FBI-tween. Then, the substrate was immersed in a solution of polyvalent anti-botulinum serum labeled with colloidal silver for 1 h at room temperature. After washing three times with FBI-tween and twice with distilled water, the substrate was immersed for 3 min in an aqueous solution containing 0.5% citric acid, 0.1% metol, and 0.2% silver nitrate. Then the substrate was washed with running water and dried in air. The reaction results were recorded visually. In the places where the test sample was applied (cold-smoked fish), gray-colored spots formed on the substrate. In places of applying positive controls (obviously positive material in RBNT - cold smoked fish containing botulinum toxins), gray-colored spots also formed. There are no spots in the places of applying negative controls (FBI, samples from freshly caught raw fish, negative in RBNT), the substrate remains white.
Таким образом, исследуемый образец (рыба горячего копчения) содержит ботулинические токсины.Thus, the test sample (hot smoked fish) contains botulinum toxins.
Параллельно определяли наличие ботулотоксинов в исследуемом образце по способу-прототипу (в РБНТ) - опытные белые мыши погибли через 34 часа, контрольные мыши остались живыми. Таким образом, результаты, полученные по предлагаемому способу и способу-прототипу, совпали - исследуемый образец содержит ботулинические токсины.In parallel, the presence of botulinum toxins in the test sample was determined by the prototype method (in RBNT) - experimental white mice died after 34 hours, control mice remained alive. Thus, the results obtained by the proposed method and the prototype method coincided - the test sample contains botulinum toxins.
Пример 4. Детекцию ботулинических токсинов проводили, как описано выше: исследуемый образец (рыба горячего копчения) предварительно подготовленный к исследованию в соответствии с ГОСТ 10444.7-86 «Методы выявления ботулинических токсинов и C. Botulinum», наносили в виде капель объемом 2 мкл на твердую пористую подложку с размером пор 0,45 мкм, заранее обработанную в течение 1 ч при комнатной температуре поливалентной противоботулинической сывороткой в разведении 1:100 на ФБР. После полного впитывания материала и подсыхания подложки ее дважды промывали ФБР-твином. Далее подложку погружали на 30 мин в 2% раствор казеината натрия на ФБР, после чего дважды промывали ФБР-твином. Затем погружали подложку в раствор поливалентной противоботулинической сыворотки, меченной коллоидным серебром, на 1 ч. После тщательного трехкратного промывания ФБР-твином и двукратного дистиллированной водой подложку погружали на 5 мин в водный раствор, содержащий 0.5% лимонной кислоты, 0.1% метола и 0.2% азотнокислого серебра, далее промывали подложку проточной водой и высушивали на воздухе. Регистрацию результатов проводили визуально. В местах нанесения исследуемого образца подложка осталась белой (пятен нет). В местах нанесения на подложку положительных контролей (заведомо положительный материал в РБНТ - рыба холодного копчения, содержащая ботулотоксины) сформировались окрашенные в серый цвет пятна. В местах нанесения отрицательных контролей (ФБР, образцы из свежепойманной сырой рыбы, отрицательные в РБНТ) окрашенные пятна не формируются, подложка остается белой.Example 4. The detection of botulinum toxins was carried out as described above: the test sample (hot smoked fish) previously prepared for the study in accordance with GOST 10444.7-86 "Methods for the detection of botulinum toxins and C. Botulinum", was applied in the form of drops with a volume of 2 μl on solid a porous substrate with a pore size of 0.45 μm, pre-treated for 1 h at room temperature with polyvalent anti-botulinum serum at a dilution of 1: 100 on the FBI. After complete absorption of the material and drying of the substrate, it was washed twice with PBS. Next, the substrate was immersed for 30 min in a 2% solution of sodium caseinate on PBS, and then washed twice with PBS-Tween. Then, the substrate was immersed in a solution of polyvalent anti-botulinum serum labeled with colloidal silver for 1 hour. After thoroughly washing three times with FBI-tween and twice with distilled water, the substrate was immersed for 5 minutes in an aqueous solution containing 0.5% citric acid, 0.1% metol and 0.2% nitric acid silver, then washed the substrate with running water and dried in air. The results were recorded visually. In the places where the test sample was applied, the substrate remained white (no spots). In places where positive controls were applied to the substrate (obviously positive material in RBNT - cold smoked fish containing botulinum toxins), gray-colored spots formed. In places where negative controls were applied (FBI, samples from freshly caught raw fish, negative in RBNT), colored spots do not form, the substrate remains white.
Таким образом, в исследуемом образце не обнаружены ботулотоксины.Thus, botulinum toxins were not found in the test sample.
Параллельно определяли наличие ботулотоксинов в исследуемом образце по способу-прототипу (в РБНТ) - опытные и контрольные мыши остались живыми. Таким образом, результаты, полученные по предлагаемому способу и способу-прототипу, совпали - исследуемый образец не содержит ботулинические токсины.In parallel, the presence of botulinum toxins in the test sample was determined by the prototype method (in RBNT) - the experimental and control mice remained alive. Thus, the results obtained by the proposed method and the prototype method coincided - the test sample does not contain botulinum toxins.
Указанный способ детекции ботулотоксинов использован при анализе 57 проб клинического материала и пищевых продуктов, поступивших на исследование в лабораторию.The indicated method for detecting botulinum toxins was used in the analysis of 57 samples of clinical material and food products that were submitted to the laboratory for research.
Исследование материала на наличие ботулотоксинов параллельно проводили по способу-прототипу (в РБНТ) и по способу-аналогу (в РПГА). Отмечено полное совпадение результатов, полученных при детекции ботулотоксинов в исследуемых образцах, по способу-прототипу и по предлагаемому способу.The study of the material for the presence of botulinum toxins was simultaneously carried out by the prototype method (in RBNT) and by the analogue method (in RPGA). A complete coincidence of the results obtained during the detection of botulinum toxins in the studied samples, the prototype method and the proposed method.
По сравнению со способом-аналогом предлагаемый способ более чувствителен: при использовании предлагаемого способа ботулотоксины были определены в 39 пробах (из 57), что полностью совпало с результатами, полученными по способу-прототипу. По способу-аналогу ботулотоксины были определены только в 23 пробах (из 57).Compared with the analogue method, the proposed method is more sensitive: when using the proposed method, botulinum toxins were determined in 39 samples (out of 57), which completely coincided with the results obtained by the prototype method. By the method analogous to botulinum toxins, only 23 samples were determined (out of 57).
Однако по сравнению со способом-прототипом предлагаемый способ обнаружения ботулинических токсинов доступнее, быстрее, проще, не требует использования лабораторных животных, может осуществляться в полевых условиях.However, compared with the prototype method, the proposed method for detecting botulinum toxins is more affordable, faster, simpler, does not require the use of laboratory animals, can be carried out in the field.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012132516/15A RU2517120C1 (en) | 2012-09-05 | 2012-09-05 | Method for detecting botulinum toxins |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012132516/15A RU2517120C1 (en) | 2012-09-05 | 2012-09-05 | Method for detecting botulinum toxins |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2517120C1 true RU2517120C1 (en) | 2014-05-27 |
Family
ID=50779394
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012132516/15A RU2517120C1 (en) | 2012-09-05 | 2012-09-05 | Method for detecting botulinum toxins |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2517120C1 (en) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2152036C1 (en) * | 1998-05-12 | 2000-06-27 | Научно-производственное объединение "Биомед" | Method of assay and differentiation of botulinic toxins type a and b |
| RU2202799C2 (en) * | 2000-07-05 | 2003-04-20 | Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока | Method for detecting brucella antigens |
| RU2320994C1 (en) * | 2004-11-24 | 2008-03-27 | Институт Молекулярной Биологии Им. В.А.Энгельгардта Российской Академии Наук | Method for assay of biological toxins |
| RU2408021C2 (en) * | 2009-06-01 | 2010-12-27 | Федеральное государственное учреждение здравоохранения "Иркутский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУЗ "ИркутскНИПЧИ Сибири и ДВ" Роспо | Method for detecting plague microbe antigens |
-
2012
- 2012-09-05 RU RU2012132516/15A patent/RU2517120C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2152036C1 (en) * | 1998-05-12 | 2000-06-27 | Научно-производственное объединение "Биомед" | Method of assay and differentiation of botulinic toxins type a and b |
| RU2202799C2 (en) * | 2000-07-05 | 2003-04-20 | Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока | Method for detecting brucella antigens |
| RU2320994C1 (en) * | 2004-11-24 | 2008-03-27 | Институт Молекулярной Биологии Им. В.А.Энгельгардта Российской Академии Наук | Method for assay of biological toxins |
| RU2408021C2 (en) * | 2009-06-01 | 2010-12-27 | Федеральное государственное учреждение здравоохранения "Иркутский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУЗ "ИркутскНИПЧИ Сибири и ДВ" Роспо | Method for detecting plague microbe antigens |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Nouri et al. | Designing a direct ELISA kit for the detection of Staphylococcus aureus enterotoxin A in raw milk samples | |
| JP2894841B2 (en) | Compositions and methods for control of reactivity between diagnostic reagents and microorganisms | |
| WO2014190944A1 (en) | Biochip and method for simultaneously and visually detecting multiple antibiotics, illegal additives, and biotoxins | |
| CN102586452A (en) | Vibrio parahemolyticus detection kit and detection method thereof | |
| CN102338801B (en) | High-sensitivity immunochip detection system and application method thereof | |
| CN103941000A (en) | A dipstick used for testing sulfonamides and fluoroquinolones and test method thereof | |
| CN101526537A (en) | Elisa reagent for detecting chloramphenicol and method thereof | |
| CN101887061A (en) | Colloidal gold immuno-chromatography test paper strip used for detecting escherichia coil F5 pilus and preparation method thereof | |
| CN102539766A (en) | Beta-bungarotoxin detection kit and preparation method thereof | |
| RU191660U1 (en) | IMMUNOCHROMATOGRAPHIC TEST STRIP FOR THE EXPRESS METHOD OF DETERMINING FOUR GROUPS OF ANTIBIOTICS IN MILK WITH EXCLUSION OF POSSIBLE FORMATION OF THE SAMPLE | |
| Mine | Separation of Salmonella enteritidis from experimentally contaminated liquid eggs using a hen IgY immobilized immunomagnetic separation system | |
| RU2517120C1 (en) | Method for detecting botulinum toxins | |
| CN104569400B (en) | A kind of incomplete antibody examination colloidal gold kit and preparation method thereof | |
| CN102128937B (en) | Evaluating and monitoring method for effect of desensitization therapy, detection kit of allergen specificity IgG4 antibody and preparation method thereof | |
| CN110988344B (en) | Fluorescent staining reagent for rapidly identifying staphylococcus aureus and preparation method thereof | |
| Paim et al. | Serum proteinogram, acute phase proteins and immunoglobulins in dogs experimentally infected with Rangelia vitalii | |
| DE2755689A1 (en) | METHOD FOR DETERMINING THE PRESENCE OF A COMPONENT OF AN IMMUNCHEMICAL REACTION AND DIAGNOSTIC IMMUNCHEMICAL TEST MATERIAL FOR PERFORMING THE METHOD | |
| JP6358942B2 (en) | Reagent for measuring endotoxin and method for measuring endotoxin | |
| JP2009031024A (en) | Measuring method of antigen or antibody | |
| RU2408021C2 (en) | Method for detecting plague microbe antigens | |
| CN103424550A (en) | Detection kit for chloramphenicol and detection method thereof | |
| CN102435744A (en) | Toxoplasma gondii total antibody colloidal gold immunochromatographic assay reagent strip and preparation method thereof | |
| RU196919U1 (en) | DEVICE FOR IMMUNOCHROMATOGRAPHIC SIMULTANEOUS INDIVIDUAL DETECTION OF FLUORQUINOLONE ANTIBIOTICS OFLOXACIN, ENROFLOXACIN AND CYPROFLOXACIN IN FOOD | |
| RU2380708C1 (en) | Method for making antibody test system for latex fixation test | |
| RU2362995C1 (en) | Way of blood protozoan diseases diagnostics |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20140906 |