JP2009031024A - Measuring method of antigen or antibody - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、抗原又は抗体を高感度かつ簡易に測定する方法に関する。 The present invention relates to a method for measuring an antigen or antibody with high sensitivity and ease.
近年、健康や環境問題の高まりから、水質、大気、土壌などの環境中に含まれるアレルゲンや化学物質等の微量成分の測定のための、高感度かつ簡易な測定方法の開発が求められている。 In recent years, the development of highly sensitive and simple measurement methods for the measurement of trace components such as allergens and chemicals contained in the environment such as water quality, air, and soil has been demanded due to increasing health and environmental problems. .
アレルゲンとはアレルギー疾患を持っている人の抗体と特異的に反応する抗原であり、
ダニの虫体や糞などを含むハウスダスト、イヌ、ネコなどのフケなどの皮屑、細菌、真菌などの微生物、スギ花粉、イネ科植物花粉、キク科植物花粉などの花粉、大豆、卵、牛乳などの食品、ペニシリンなどの薬剤等、その対象は、生物から低分子化合物までの多岐にわたる。さらに、細菌、細菌の死骸、毒素やその代謝産物等に対する抗体もアレルゲンとなることが知られている。これらのアレルゲンは微量であってもアレルギー反応を引き起こすことから、食品衛生法にもとづき、アレルギー物質を使用している旨の表示が義務付けられている。
Allergens are antigens that specifically react with antibodies of people with allergic diseases,
House dust including ticks and feces, dandruff such as dogs and cats, microorganisms such as bacteria and fungi, cedar pollen, grass pollen, pollen such as asteraceae pollen, soybeans, eggs, The targets of foods such as milk and drugs such as penicillin range from organisms to low-molecular compounds. Furthermore, it is known that antibodies against bacteria, bacterial dead bodies, toxins and metabolites thereof are allergens. Since these allergens cause allergic reactions even in trace amounts, labeling that allergens are being used is required under the Food Sanitation Law.
また、食の安心・安全に対する関心が高まり、そのためのチェックシステムの整備が社会的に求められている。最近、いわゆるポジティブリスト制度が採用され、基準が設定されていない農薬等であっても、一定量（０．０１ｐｐｍ）以上含まれる食品の流通が原則禁止されている。農薬等の低分子化合物であっても、ハプテンと呼ばれる、免疫原性を欠くが抗原性のみをもつ抗原も知られている。また、免疫学的手法の発達により、抗原性のない低分子化合物であっても、それに特異的な抗体を作製することが可能になっている。この場合、それ自体では、抗原性のない物質であっても、抗原抗体反応を利用して抗原として検出することができる。 In addition, there is a growing interest in food safety and security, and there is a social demand for the development of a check system. Recently, the so-called positive list system has been adopted, and the distribution of foods containing more than a certain amount (0.01 ppm) is prohibited in principle, even for agricultural chemicals, etc. for which no standard has been set. Even a low molecular weight compound such as an agricultural chemical is known as an antigen called hapten which lacks immunogenicity but has only antigenicity. In addition, with the development of immunological techniques, it is possible to produce antibodies specific to even low molecular weight compounds having no antigenicity. In this case, even a substance having no antigenicity can be detected as an antigen using an antigen-antibody reaction.
従来の抗原抗体反応を利用した抗原又は抗体の測定法には、ポリスチレンなどの固相に結合させ不溶化した抗原に測定すべき抗体をトラップさせ、酵素標識二次抗体（抗体に対する抗体）を反応させて、固相に結合した酵素活性を測定する方法が知られている。より具体的には、標的物質に対する抗体をマイクロプレートなどに吸着させ、抗体に結合した標的物質に対してさらに第一の抗体とは異なるエピトープを認識する酵素標識した抗体を結合させるというサンドイッチ法、また、標的物質に対する抗体をあらかじめマイクロプレートなどに吸着させ、次に標的物質とともに、酵素標識した競合物質を反応させる競合法などが知られている。しかし、これらの方法は、いずれも、未反応の抗体を除去するための洗浄工程が必要であるという欠点があった。 In the conventional method for measuring an antigen or antibody using an antigen-antibody reaction, the antibody to be measured is trapped on an insolubilized antigen bound to a solid phase such as polystyrene and reacted with an enzyme-labeled secondary antibody (antibody against the antibody). Thus, a method for measuring enzyme activity bound to a solid phase is known. More specifically, a sandwich method in which an antibody against a target substance is adsorbed on a microplate or the like, and an enzyme-labeled antibody that recognizes an epitope different from the first antibody is further bound to the target substance bound to the antibody, Also known is a competition method in which an antibody against a target substance is previously adsorbed on a microplate or the like, and then an enzyme-labeled competitor substance is reacted with the target substance. However, each of these methods has a drawback that a washing step for removing unreacted antibodies is required.
特許文献１には、測定対象である抗原（又は抗体）を基材に固定し、この固定した抗原（又は抗体）に特異的な標識された抗体（又は抗原）が結合した抗原抗体複合体を、測定対象である抗原（又は抗体）を含む被検液と接触させ、測定対象である抗原（又は抗体）の濃度に応じて、測定対象である抗原（又は抗体）と前記抗原抗体複合体から遊離した抗体（又は抗原）とで被検液中に新たな抗原抗体複合体を形成させ、被検液から基材を分離した後に、新たに形成された抗原抗体複合体中の前記標識物質の量を測定する抗原（又は抗体）の測定方法が記載されている。
この方法は、測定対象である抗原又は抗体が基材に遊離することができない態様で固定されており（固定種）、この固定種と被検液中の遊離した測定対象（遊離種）とが、固定種と免疫学的に対合する関係にある遊離可能な種（遊離可能種）との結合を競合することを特徴とする。すなわち、被検液中の遊離種が抗原抗体複合体から遊離可能種を連れ出し、新たな抗原抗体複合体を形成する、いわば、「連れ出し法」といえるものである。この「連れ出し法」においては、測定対象が抗原又は抗体のいずれであっても、被検液中での新たな抗原抗体複合体の形成を必要とする。また、測定対象は、この新たに形成された抗原抗体複合体である。さらに、標識は、測定対象ではなく、測定対象と免疫学的に対合する関係にある種、すなわち、測定対象が抗原であれば標識対象は抗体であり、これとは反対に、測定対象が抗体であれば標識対象は抗原である。 In this method, the antigen or antibody to be measured is immobilized in such a manner that it cannot be released to the base material (fixed species), and the fixed species and the free measurement target (free species) in the test solution are It is characterized by competing for binding with a releasable species (releasable species) that is immunologically paired with a fixed species. That is, it can be said that the free species in the test solution take away the releasable species from the antigen-antibody complex to form a new antigen-antibody complex. This “take-out method” requires the formation of a new antigen-antibody complex in the test solution, regardless of whether the measurement target is an antigen or an antibody. The measurement object is the newly formed antigen-antibody complex. Furthermore, the label is not the measurement target, but is a species that is immunologically paired with the measurement target, that is, if the measurement target is an antigen, the labeling target is an antibody. If it is an antibody, the labeling target is an antigen.
しかし、上記の「連れ出し法」では、遊離種が遊離可能種を連れ出し、被検液中で新たな抗原抗体複合体を形成させることが必要とされるという問題があった。
本発明は、前記の従来の方法の問題点を解決した高感度かつ簡易な抗原又は抗体の測定方法を提供する。 The present invention provides a highly sensitive and simple antigen or antibody measurement method that solves the problems of the conventional methods described above.
本発明者は、鋭意研究に励んだ結果、驚くべきことに、標識された抗原又は抗体を有する抗原抗体複合体と測定対象である抗原又は抗体とを接触させた場合、標識された抗原抗体複合体より測定対象中の抗原又は抗体量に対応した量で標識された抗原又は抗体が測定対象を含む溶液中に遊離し、この遊離した抗原又は抗体の標識の量を測定することによって、測定対象中に存在していた抗原又は抗体を測定することができることを見出し、本発明を完成した。 As a result of diligent research, the inventor surprisingly found that when an antigen-antibody complex having a labeled antigen or antibody was brought into contact with the antigen or antibody to be measured, the labeled antigen-antibody complex The antigen or antibody labeled with an amount corresponding to the amount of the antigen or antibody in the measurement target is released from the body into the solution containing the measurement target, and the amount of the label of the released antigen or antibody is measured to measure the measurement target. It was found that the antigen or antibody present therein could be measured, and the present invention was completed.
すなわち、本発明は、
１．下記工程：
（１）基材に固定した抗原抗体複合体を測定対象である抗原又は抗体を含む溶液と接触させる工程、
ここで、測定対象が抗原である場合には、前記基材に固定した抗原抗体複合体は、測定対象である抗原に特異的な抗体を基材に固定し、この固定した抗体に標識された測定対象である抗原が結合したものであり、測定対象が抗体である場合には、前記基材に固定した抗原抗体複合体は、測定対象である抗体に特異的な抗原を基材に固定し、この固定した抗原に標識された測定対象である抗体が結合したものである、
（２）前記基材に固定した抗原抗体複合体を測定対象である抗原又は抗体を含む溶液と分離する工程、及び
（３）前記測定対象である抗原又は抗体を含む溶液中の標識された測定対象である抗原又は抗体の量を測定する工程
を含む、抗原又は抗体の測定方法、
２．下記：
（１）抗原抗体複合体を固定した基材、
ここで、測定対象が抗原である場合には、前記基材に固定した抗原抗体複合体は、測定対象である抗原に特異的な抗体を基材に固定し、この固定した抗体に標識された測定対象である抗原が結合したものであり、測定対象が抗体である場合には、前記基材に固定した抗原抗体複合体は、測定対象である抗体に特異的な抗原を基材に固定し、この固定した抗原に標識された測定対象である抗体が結合したものである、及び
（２）測定対象である抗原又は抗体を含む溶液を収容することができる容器
を含む、抗原又は抗体の測定装置、
に関する。
That is, the present invention
1. The following process:
(1) A step of bringing an antigen-antibody complex immobilized on a substrate into contact with a solution containing an antigen or antibody to be measured,
Here, when the measurement target is an antigen, the antigen-antibody complex immobilized on the base material is immobilized on the base material with an antibody specific to the antigen as the measurement target. When the measurement target antigen is bound and the measurement target is an antibody, the antigen-antibody complex immobilized on the base material immobilizes the antigen specific to the measurement target antibody on the base material. The antibody to be measured labeled to the fixed antigen is bound,
(2) a step of separating the antigen-antibody complex immobilized on the substrate from a solution containing the antigen or antibody to be measured; and (3) a labeled measurement in the solution containing the antigen or antibody to be measured. A method for measuring an antigen or antibody, comprising a step of measuring the amount of the target antigen or antibody;
2. following:
(1) a substrate on which an antigen-antibody complex is immobilized,
Here, when the measurement target is an antigen, the antigen-antibody complex immobilized on the base material is immobilized on the base material with an antibody specific to the antigen as the measurement target. When the measurement target antigen is bound and the measurement target is an antibody, the antigen-antibody complex immobilized on the base material immobilizes the antigen specific to the measurement target antibody on the base material. Measurement of antigen or antibody comprising a container that can contain a solution containing the antigen or antibody to be measured, which is bound to the antibody to be measured labeled to the fixed antigen, and (2) apparatus,
About.
すなわち、本発明の方法は、測定対象と免疫学的に対合する関係にある種が基材に遊離することができない態様で固定されている（固定種）。そのため、固定種は、他のどの種とも免疫学的な競合関係にない。本発明の方法においては、被検液中の遊離した測定対象（遊離種）と、固定種と免疫学的に対合する関係にある遊離可能な種（遊離可能種）とが、固定種との結合を競合することを特徴とする。すなわち、被検液中の遊離種が抗原抗体複合体から遊離可能種を追い出し、遊離可能種の位置に取って代わろうするものである、いわば、「追い出し法」といえるものである。本発明の「追い出し法」においては、測定対象が抗原又は抗体のいずれであっても、被検液中の新たな抗原抗体複合体の形成を必要とはしない。また、測定対象は、抗原抗体複合体ではなく、被検液中に遊離した遊離可能種である。さらに、標識は、測定対象と免疫学的に同一の関係にある種、すなわち、測定対象が抗原であれば標識対象も抗原であり、これと同様に、測定対象が抗体であっても標識対象は抗体である。 That is, in the method of the present invention, species that are immunologically paired with the measurement target are immobilized in such a manner that they cannot be released to the substrate (fixed species). Therefore, the fixed species is not in immunological competition with any other species. In the method of the present invention, the liberated measurement object (free species) in the test solution and the releasable species (releasable species) that are immunologically paired with the fixed species are fixed species. It is characterized by competing for binding. That is, it can be said that the free species in the test solution expel the free species from the antigen-antibody complex and replace the position of the free species. In the “kick-out method” of the present invention, it is not necessary to form a new antigen-antibody complex in the test solution, regardless of whether the measurement target is an antigen or an antibody. Further, the measurement target is not an antigen-antibody complex, but a releasable species released in the test solution. Furthermore, the label is a species immunologically identical to the measurement target, that is, if the measurement target is an antigen, the label target is also an antigen. Similarly, even if the measurement target is an antibody, the label target Is an antibody.
上記のように、本発明の「追い出し法」は、従来の「連れ出し法」とは、「追い出し法」では、測定対象と免疫学的に対合する関係にある種を固定種とするのに対し、「連れ出し法」では、測定対象と免疫学的に同一の関係にある種を固定種とする点、「追い出し法」では、被検液中の新たな抗原抗体複合体の形成を必要とはしないのに対し、「連れ出し法」では、被検液中の新たな抗原抗体複合体の形成を必要とする点、「追い出し法」では、測定対象が被検液中に遊離した遊離可能種であるのに対し、「連れ出し法」では、測定対象が被検液中に新たに形成された抗原抗体複合体である点、さらに、「追い出し法」では、測定対象と免疫学的に同一の関係にある種が標識されるのに対し、「連れ出し法」では、測定対象と免疫学的に対合する関係にある種が標識される点で相違する。すなわち、本発明の「追い出し法」は、従来の「連れ出し法」とは、根本的な発想を異にする、斬新かつ画期的な方法である。 As described above, the “kick-out method” of the present invention is different from the conventional “kick-out method” in that the “kick-out method” uses a species that is immunologically matched to the measurement target as a fixed species. In contrast, the “take-out method” uses a species that is immunologically identical to the measurement target as a fixed species, and the “kick-out method” requires the formation of a new antigen-antibody complex in the test solution. In contrast, the “take-out method” requires the formation of a new antigen-antibody complex in the test solution, while the “kick-out method” requires free species that have been released into the test solution. In contrast, in the “take-out method”, the measurement target is an antigen-antibody complex newly formed in the test solution, and in the “kick-out method”, it is immunologically identical to the measurement target. In contrast to the related species that are labeled, the “take-out method” is immunologically coupled to the measurement target. That certain relationship is different in that it is labeled. That is, the “push-out method” of the present invention is a novel and epoch-making method that has a fundamental idea different from the conventional “take-out method”.
本発明によれば、抗原や抗体の未知の濃度を、特異的に高感度で、洗浄工程を省いて迅速かつ簡便に測定する方法及び装置を提供することができる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the method and apparatus which measure the unknown density | concentration of an antigen and an antibody with specific high sensitivity rapidly and simply without a washing | cleaning process can be provided.
本発明において抗原抗体複合体とは、測定対象が抗原である場合には、測定対象である抗原に特異的な抗体を基材に固定し、この固定した抗体に標識された測定対象である抗原が結合したものであり、測定対象が抗体である場合には、測定対象である抗体に特異的な抗原を基材に固定し、この固定した抗原に標識された測定対象である抗体が結合したものである In the present invention, the antigen-antibody complex refers to an antigen that is a measurement object that is immobilized on an antibody that is specific for the antigen that is the measurement object and is labeled on the substrate when the measurement object is an antigen. When the measurement target is an antibody, an antigen specific to the measurement target antibody is immobilized on a substrate, and the measurement target labeled with the immobilized antigen is bound. Is a thing
本発明では、前記基材に固定した抗原抗体複合体を測定対象である抗原又は抗体を含む溶液と接触させることにより、溶液中の測定対象である抗原又は抗体の濃度に応じて、標識された測定対象である抗原又は抗体を抗原抗体複合体から溶液中に遊離させ、この遊離された標識された測定対象である抗原又は抗体を測定する。 In the present invention, the antigen-antibody complex immobilized on the substrate is contacted with the antigen to be measured or a solution containing the antibody, thereby being labeled according to the concentration of the antigen or antibody to be measured in the solution. The antigen or antibody to be measured is released from the antigen-antibody complex into the solution, and the released labeled antigen or antibody to be measured is measured.
本発明で接触とは、抗原抗体複合体と測定対象である抗原又は抗体が同時に同一空間に存在していることをいう。 In the present invention, “contact” means that the antigen-antibody complex and the antigen or antibody to be measured are simultaneously present in the same space.
本発明の一態様においては、基材に固定した測定対象である抗原に対する抗体と酵素標識抗原との複合体を、測定対象である抗原を含む溶液と接触させる。この工程によって、前記溶液中に含まれる抗原の量に対応した量の酵素標識抗原を前記溶液中に遊離させることができる。基材に固定した測定対象である抗原に対する抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であってもよい。 In one embodiment of the present invention, a complex of an antibody against an antigen to be measured immobilized on a substrate and an enzyme-labeled antigen is brought into contact with a solution containing the antigen to be measured. By this step, an amount of enzyme-labeled antigen corresponding to the amount of antigen contained in the solution can be released into the solution. The antibody against the antigen to be measured immobilized on the substrate may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
また、基材に固定した抗体又は抗原は、一定量であれば良く、その量は任意である。当業者であれば、サンプル中に含まれる抗原又は抗体の予想量又は所望の測定範囲から、基材に固定した抗体又は抗原の量を適宜設計することができる。また、基材に固定した抗体又は抗原の全てが標識抗原又は抗体との複合体である必要もない。 In addition, the antibody or antigen immobilized on the substrate may be a certain amount, and the amount is arbitrary. A person skilled in the art can appropriately design the amount of antibody or antigen immobilized on a substrate from the expected amount of antigen or antibody contained in the sample or the desired measurement range. Further, it is not necessary that all of the antibody or antigen immobilized on the substrate is a complex with the labeled antigen or antibody.
本発明の一態様において、測定対象である抗原は低分子化合物であってもよい。本発明において低分子化合物とは、分子量が５０００以下、好ましくは、１０００以下、より好ましくは、５００以下の化合物をいう。 In one embodiment of the present invention, the antigen to be measured may be a low molecular compound. In the present invention, the low molecular weight compound means a compound having a molecular weight of 5000 or less, preferably 1000 or less, more preferably 500 or less.
本発明において、低分子化合物は、生理活性を有する物質、例えば、農薬、医薬、食品添加物、飼料添加物又は動物用医薬であってもよい。より具体的には、本発明の低分子化合物は、ニューキノロン系抗生物質である。ニューキノロン系抗菌剤としては、ノルフロキサシン(norfloxacin)、エンロフロキサシン(enrofloxacin)、シプロフロキサシン(ciprofloxacin)、又はダノフロキサシン(danofloxacin)などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。 In the present invention, the low molecular weight compound may be a physiologically active substance such as an agrochemical, a pharmaceutical, a food additive, a feed additive, or an animal medicine. More specifically, the low molecular weight compound of the present invention is a new quinolone antibiotic. Examples of the new quinolone antibacterial agent include, but are not limited to, norfloxacin, enrofloxacin, ciprofloxacin, and danofloxacin.
本発明の一態様において、抗原は、食品に由来することができる。食品としては、食肉、魚介類、植物などの天然食品又は加工食品が挙げることができる。例えば、畜産動物肉や養殖魚介肉、あるいは牛乳などの加工食品を好ましい例として挙げることができる。例えば、牛肉や豚肉などの畜産動物肉、鰻やハマチなどの養殖魚肉、アワビやサザエなどの養殖貝肉、あるいは鰻の蒲焼や牛乳などの加工食品を好ましい例として挙げることができる。本発明の方法では、これらの食品から採取した食品試料中に残留するニューキノロン系抗菌剤を測定することができるが、食品試料としては、食肉動物からの採取血液、あるいは食肉や加工食品の絞り汁又は抽出物などを用いることができる。血液、絞り汁、牛乳などを試料として用いる場合には緩衝液などで適宜希釈して測定を行なうことができる。食肉や加工食品の切片などからメタノール又はエタノールなどの有機溶媒を用いて抽出した抽出物を適宜の緩衝液で希釈して測定を行なってもよい。また、本発明の測定対象である抗原又は抗体は、食品のみならず、土壌、水質、血液などの生体成分、さらには、繊維等にふくまれるものもいう。 In one aspect of the invention, the antigen can be derived from a food product. Examples of the food include natural foods such as meat, seafood, and plants, or processed foods. For example, livestock animal meat, cultured seafood, or processed foods such as milk can be mentioned as preferred examples. Preferred examples include livestock animal meat such as beef and pork, cultured fish such as salmon and hamachi, cultured shellfish such as abalone and turban shell, or processed food such as salmon roast and milk. In the method of the present invention, it is possible to measure a new quinolone antibacterial agent remaining in a food sample collected from these foods. Examples of the food sample include blood collected from meat animals, or juice of meat and processed foods. Or an extract etc. can be used. When blood, juice, milk or the like is used as a sample, measurement can be performed by appropriately diluting with a buffer solution or the like. Measurement may be performed by diluting an extract extracted from meat or processed food using an organic solvent such as methanol or ethanol with an appropriate buffer. The antigen or antibody to be measured of the present invention refers not only to foods but also to biological components such as soil, water quality and blood, and further to fibers and the like.
本発明の一態様において、測定対象である抗体としては、動物体内に産生される体液中の抗体、たとえば、インスリン抗体、Ｏ−１５７抗体、ハシカ抗体、自己抗体を挙げることができる。抗体の測定系は、抗原についての測定系の抗原を抗体に替え、抗体を抗原に替えたものであり、一方を実施することができれば他方も実施することができることから、抗体の測定系については、説明を省略する。 In one embodiment of the present invention, examples of antibodies to be measured include antibodies in body fluids produced in an animal body, such as insulin antibodies, O-157 antibodies, sika deer antibodies, and autoantibodies. The antibody measurement system is a system in which the antigen in the measurement system for antigen is replaced with an antibody, and the antibody is replaced with an antigen. If one can be performed, the other can also be performed. The description is omitted.
本発明の抗体は、抗原を動物に投与して免疫することによりに容易に製造することができる。必要に応じて前記抗原溶液に適宜のアジュバントを添加してもよい。 The antibody of the present invention can be easily produced by administering an antigen to an animal and immunizing it. If necessary, an appropriate adjuvant may be added to the antigen solution.
免疫に用いる動物の種類も特に限定されず、例えばマウス、ラット、ウシ、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどを用いることができる。動物の免疫は当業界で利用可能な方法に従って行えばよく、例えば、抗原の溶液、好ましくはアジュバントとの混合物を哺乳動物の皮下、皮内、静脈、又は腹腔内に注射することにより免疫を行うことができる。 The type of animal used for immunization is also not particularly limited, and for example, mouse, rat, cow, rabbit, goat, sheep and the like can be used. Animal immunization may be performed according to methods available in the art, for example, by injecting a solution of an antigen, preferably a mixture with an adjuvant, subcutaneously, intradermally, intravenously, or intraperitoneally into a mammal. be able to.
免疫された動物の血清から本発明の抗体を取得することができる。抗体の精製は、例えば、抗体の精製はＤＥＡＥ陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、硫安分画法、ＰＥＧ分画法、エタノール分画法などを適宜組み合わせて行うことができる。 The antibody of the present invention can be obtained from the serum of the immunized animal. For example, antibody purification can be performed by appropriately combining DEAE anion exchange chromatography, affinity chromatography, ammonium sulfate fractionation, PEG fractionation, ethanol fractionation, and the like.
本発明の抗体として、免疫した動物のリンパ球を用いて製造したハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体を用いることもできる。モノクローナル抗体の製造方法については当業界で周知されており、かつ汎用されているので当業者は前記の抗原を用いることによって本発明の抗体を容易に製造することが可能である。 As the antibody of the present invention, a monoclonal antibody produced from a hybridoma produced using lymphocytes of an immunized animal can also be used. Monoclonal antibody production methods are well known in the art and are widely used, so that those skilled in the art can easily produce the antibody of the present invention by using the antigen described above.
本発明で基材に固定とは、基材に抗体又は抗原を物理的に吸着させ、あるいは化学的に結合させることをいう。本発明の基材としては、ポリスチレン樹脂などの高分子基材、ガラスなどの無機基材、セルロースやアガロースなどの多糖類基材などを挙げることができる。また、基材の形状は特に限定されず、板状、ビーズ状など任意の形状を選択することができる。 In the present invention, “fixed to a base material” means that an antibody or an antigen is physically adsorbed or chemically bound to the base material. Examples of the substrate of the present invention include a polymer substrate such as polystyrene resin, an inorganic substrate such as glass, and a polysaccharide substrate such as cellulose and agarose. The shape of the substrate is not particularly limited, and any shape such as a plate shape or a bead shape can be selected.
抗原抗体複合体と測定対象を含む溶液との分離の工程は、溶液から抗原抗体複合体を除去するか、又は前記溶液の一部を回収する等の任意の方法を用いることができる。 In the step of separating the antigen-antibody complex from the solution containing the measurement target, any method such as removing the antigen-antibody complex from the solution or recovering a part of the solution can be used.
本発明に用いることができる標識としては、たとえば、放射性同位体、酵素、蛍光色素等を用いることができる。 Examples of labels that can be used in the present invention include radioisotopes, enzymes, fluorescent dyes, and the like.
本発明の一態様では、抗体を直接標識するのではなく、標識された抗抗体抗体（二次抗体）を用いて、間接的に標識することもできる。 In one embodiment of the present invention, the antibody can be indirectly labeled using a labeled anti-antibody antibody (secondary antibody) instead of directly labeling the antibody.
本発明で用いる酵素標識としては、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びガラクトシダーゼを挙げることができ、好ましくは、ホースラディッシュパーオキシダーゼである。また、発色基質は、ホースラディッシュパーオキシダーゼの場合には、例えば３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）である。 Examples of the enzyme label used in the present invention include horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, and galactosidase, and horseradish peroxidase is preferable. In the case of horseradish peroxidase, the chromogenic substrate is, for example, 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB).
本発明において「測定」とは、標識された抗原又は抗体の存在を検出することにより、測定対象中の標識されていない抗原又は抗体の存在を検出することをいう。たとえば、酵素標識の場合は、発色基質を添加し、溶液の吸光度を測定することにより、測定対象中の標識されていない抗原又は抗体の存在を検出することをいう。 In the present invention, “measurement” refers to detecting the presence of an unlabeled antigen or antibody in a measurement target by detecting the presence of a labeled antigen or antibody. For example, in the case of enzyme labeling, the presence of unlabeled antigen or antibody in the measurement target is detected by adding a chromogenic substrate and measuring the absorbance of the solution.
本発明の一態様は、測定対象である抗原に特異的な抗体を基材に固定し、この固定した抗体に標識された測定対象である抗原が結合した、標識された抗原抗体複合体、及び、発色基質を含む、抗原の測定のためのキットである。また、本発明の一態様は、測定対象である抗体に特異的な抗原を基材に固定し、この固定した抗原に標識された測定対象である抗体が結合した、標識された抗体抗原複合体、及び、発色基質を含む、抗体の測定のためのキットである。また、さらなる本発明の一態様は、測定対象である抗原に特異的な抗体を基材に固定し、この固定した抗体に標識された測定対象である抗原が結合した、標識された抗原抗体複合体、及び、発色基質を含む、抗原の測定のための全自動フローセル装置である。また、別の本発明の一態様は、測定対象である抗体に特異的な抗原を基材に固定し、この固定した抗原に標識された測定対象である抗体が結合した、標識された抗体抗原複合体、及び、発色基質を含む、抗体の測定のための全自動フローセル装置である。 One aspect of the present invention is a labeled antigen-antibody complex in which an antibody specific to an antigen to be measured is immobilized on a base material, and the antigen to be measured is bound to the immobilized antibody, and This is a kit for measuring an antigen containing a chromogenic substrate. One embodiment of the present invention is a labeled antibody-antigen complex in which an antigen specific for an antibody to be measured is immobilized on a base material, and the antibody to be measured is bound to the immobilized antigen. And a kit for the measurement of an antibody containing a chromogenic substrate. Further, according to one aspect of the present invention, a labeled antigen-antibody complex in which an antibody specific to an antigen to be measured is immobilized on a base material, and the antigen to be measured is bound to the immobilized antibody. A fully automatic flow cell device for the measurement of antigens, including a body and a chromogenic substrate. Another embodiment of the present invention is a labeled antibody antigen in which an antigen specific for an antibody to be measured is immobilized on a substrate, and the antibody to be measured is bound to the immobilized antigen. Fully automated flow cell device for the measurement of antibodies, including complex and chromogenic substrate.
標識がホースラディッシュパーオキシダーゼである場合には、発色基質として、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）溶液をキットに含ませることができ、場合によりＴＭＢ安定化基質を加えることもできる。 When the label is horseradish peroxidase, a 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) solution can be included in the kit as a chromogenic substrate, optionally adding a TMB stabilizing substrate. You can also.
本発明のキットの一態様を図３に示した。 One embodiment of the kit of the present invention is shown in FIG.
抗原測定用抗体結合プレート：基材（マイクロプレート）−第一抗体（抗ノルフロキサシン抗体）−ＨＲＰ標識抗原（ノルフロキサシン）について、抗原と反応させ、抗原―ＨＲＰの遊離量の変化を検討した。 Antibody-binding plate for antigen measurement: Substrate (microplate) -first antibody (anti-norfloxacin antibody) -HRP-labeled antigen (norfloxacin) was reacted with the antigen and the change in the amount of antigen-HRP released was examined.
９６穴プレートに抗ニューキノロンモノクローナル抗体（１０μｇ／ｍＬ）を１００μＬコーティングし、その後２．５％カゼインでブロッキングを行い、反応プレートとした。このプレートにノルフロキサシン−ＨＲＰ（１．５μｇ／ｍＬ）１００μＬを室温で１時間反応させ、ＰＢＳ−Ｔ（０．０２５％ｔｗｅｅｎ２０含有）で３回洗浄した。同様に、このプレートに各濃度のエンロフロキサシン（０、１０、１００、１０００ｎｇ／ｍＬ）１００μＬを室温で１時間反応させた後、プレートのウエル内の溶液７５μＬを分取して、他の空ウエルに分注し、その中に基質であるＴＭＢ１００μＬを添加して、１０分後にその発色量を測定した。 A 96-well plate was coated with 100 μL of anti-new quinolone monoclonal antibody (10 μg / mL), and then blocked with 2.5% casein to obtain a reaction plate. To this plate, 100 μL of norfloxacin-HRP (1.5 μg / mL) was reacted at room temperature for 1 hour, and washed 3 times with PBS-T (containing 0.025% tween 20). Similarly, after reacting 100 μL of each concentration of enrofloxacin (0, 10, 100, 1000 ng / mL) on this plate for 1 hour at room temperature, 75 μL of the solution in the well of the plate was separated, The mixture was dispensed into empty wells, 100 μL of TMB as a substrate was added thereto, and the color development amount was measured after 10 minutes.
なお、本発明の抗ニューキノロンモノクローナル抗体は、ピリド［１，２，３−ｄｅ］［１，４］ベンゾキサジン−６−カルボン酸骨格を有するニューキノロン系抗菌剤であるオフロキサシンやレボフロキサシン、あるいは１−アルキル−６−フルオロ−４−オキソ−１，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−３−カルボン酸骨格を有するエノキサシンなどに対しては反応性が低いか、あるいは実質的に反応性を有しない。特に３環性の基本骨格を有するオフロキサシンやレボフロキサシンに対しては実質的に反応しない。この抗ニューキノロンモノクローナル抗体は、平成１９年６月２６日付けで、受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１３１１として、特許生物寄託センターに寄託されている。 In addition, the anti-new quinolone monoclonal antibody of the present invention includes ofloxacin, levofloxacin, or 1-alkyl- which is a new quinolone antibacterial agent having a pyrido [1,2,3-de] [1,4] benzoxazine-6-carboxylic acid skeleton. It has low reactivity or substantially no reactivity with enoxacin having a 6-fluoro-4-oxo-1,4-dihydro-1,8-naphthyridine-3-carboxylic acid skeleton. In particular, it does not substantially react with ofloxacin or levofloxacin having a tricyclic basic skeleton. This anti-new quinolone monoclonal antibody has been deposited with the Patent Organism Depositary on June 26, 2007 as receipt number FERM AP-21311.
なお、抗原抗体のプレートへの吸着時には０．１Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ８．５）を使用し、その他はすべてＰＢＳ−Ｔ（ｐＨ７．４）を使用した。この結果を図１に示した。 In addition, 0.1M carbonate buffer (pH 8.5) was used for the adsorption of the antigen antibody to the plate, and PBS-T (pH 7.4) was used for all others. The results are shown in FIG.
この結果から、１０ｎｇ／ｍＬの濃度でもコントロール（０ｎｇ／ｍＬ）との有意差がみられ、かつ反応比率も顕著に高かった。 From this result, even at a concentration of 10 ng / mL, a significant difference from the control (0 ng / mL) was observed, and the reaction ratio was remarkably high.
したがって、本発明の方法は、優れた感度を有することが実証された。 Thus, the method of the present invention has been demonstrated to have excellent sensitivity.
抗原としてマラカイトグリーン（発癌性）を、ノルフロキサシンの代わりに用いた以外は、実施例１と同様に操作して、実施例１と同様の結果を得た。すなわち、抗原測定用抗体結合プレート：基材（マイクロプレート）−第一抗体（抗マラカイトグリーン抗体）−ＨＲＰ標識抗原（マラカイトグリーン）について、抗原と反応させ、抗原―ＨＲＰの遊離量の変化を検討した。 The same results as in Example 1 were obtained except that malachite green (carcinogenicity) was used instead of norfloxacin as an antigen. That is, antibody-binding plate for antigen measurement: base material (microplate)-primary antibody (anti-malachite green antibody)-HRP-labeled antigen (malachite green) is reacted with antigen, and changes in the amount of antigen-HRP released are examined. did.
具体的には、イムノスティック（Nalge-Nunc 社製）に、０．１Ｍ炭酸緩衝液(pH 8.5)で5μg/mLの濃度に調整した抗マラカイトグリーンモノクローナル-抗体 １mLを室温で一時間反応させた。反応後、抗体が塗布されたイムノスティックを２．５％カゼイン溶液 ２mLに浸漬し、未反応領域のブロッキングを行った。室温で一時間反応後、０．０２％Tween-PBS溶液 ２mLの中に５分間浸漬した。ついで西洋ワサビペルオキシダーゼ標識マラカイトグリーンを０．０２％Tween-PBS溶液にて希釈し、ブロッキングが終了したイムノスティックと反応させた。室温で１５分反応後、０．０２％Tween-PBS溶液 １mLに浸漬し、余分な西洋ワサビペルオキシダーゼ標識マラカイトグリーンを除去した。その後、ＰＢＳに溶解したマラカイトグリーン（各１，１０，１００ng/mL）１mLを付属のチューブに加え、この中にイムノスティックを浸漬し、室温で１０分間反応させた。反応後、スティックを取り出し、ＰＢＳ溶液中に酵素基質溶液であるテトラメチルベンチジン（ＴＭＢ，ＤＡＫＯ社製）２００μLを各チューブに添加し、室温で１５分程反応させ発色を確認した。その結果を図２に示した。 Specifically, 1 mL of anti-malachite green monoclonal antibody adjusted to a concentration of 5 μg / mL with 0.1 M carbonate buffer (pH 8.5) was allowed to react at room temperature for 1 hour with an immunostic (manufactured by Nalge-Nunc). . After the reaction, the antibody-coated immunostic was immersed in 2 mL of a 2.5% casein solution to block unreacted areas. After reacting at room temperature for 1 hour, it was immersed in 2 mL of a 0.02% Tween-PBS solution for 5 minutes. Next, horseradish peroxidase-labeled malachite green was diluted with a 0.02% Tween-PBS solution and allowed to react with the immunostimulated blocking. After reacting at room temperature for 15 minutes, it was immersed in 1 mL of a 0.02% Tween-PBS solution to remove excess horseradish peroxidase-labeled malachite green. Thereafter, 1 mL of malachite green (1,10,100 ng / mL each) dissolved in PBS was added to the attached tube, and the immunostic was immersed therein and allowed to react at room temperature for 10 minutes. After the reaction, the stick was taken out, 200 μL of tetramethylbenzidine (TMB, manufactured by DAKO), which is an enzyme substrate solution, was added to each tube in a PBS solution, and reacted at room temperature for about 15 minutes to confirm color development. The results are shown in FIG.
以下に、本発明の「追い出し法」を図示した。
抗原又は抗体の測定に有用である。 Useful for measuring antigens or antibodies.
Claims (2)
（１）基材に固定した抗原抗体複合体を測定対象である抗原又は抗体を含む溶液と接触させる工程、
ここで、測定対象が抗原である場合には、前記基材に固定した抗原抗体複合体は、測定対象である抗原に特異的な抗体を基材に固定し、この固定した抗体に標識された測定対象である抗原が結合したものであり、測定対象が抗体である場合には、前記基材に固定した抗原抗体複合体は、測定対象である抗体に特異的な抗原を基材に固定し、この固定した抗原に標識された測定対象である抗体が結合したものである、
（２）前記基材に固定した抗原抗体複合体を測定対象である抗原又は抗体を含む溶液と分離する工程、及び
（３）前記測定対象である抗原又は抗体を含む溶液中の標識された測定対象である抗原又は抗体の量を測定する工程
を含む、抗原又は抗体の測定方法。 The following process:
(1) A step of bringing an antigen-antibody complex immobilized on a substrate into contact with a solution containing an antigen or antibody to be measured,
Here, when the measurement target is an antigen, the antigen-antibody complex immobilized on the base material is immobilized on the base material with an antibody specific to the antigen as the measurement target. When the measurement target antigen is bound and the measurement target is an antibody, the antigen-antibody complex immobilized on the base material immobilizes the antigen specific to the measurement target antibody on the base material. The antibody to be measured labeled to the fixed antigen is bound,
(2) a step of separating the antigen-antibody complex immobilized on the substrate from a solution containing the antigen or antibody to be measured; and (3) a labeled measurement in the solution containing the antigen or antibody to be measured. A method for measuring an antigen or antibody, comprising a step of measuring the amount of the target antigen or antibody.
（１）抗原抗体複合体を固定した基材、
ここで、測定対象が抗原である場合には、前記基材に固定した抗原抗体複合体は、測定対象である抗原に特異的な抗体を基材に固定し、この固定した抗体に標識された測定対象である抗原が結合したものであり、測定対象が抗体である場合には、前記基材に固定した抗原抗体複合体は、測定対象である抗体に特異的な抗原を基材に固定し、この固定した抗原に標識された測定対象である抗体が結合したものである、及び
（２）測定対象である抗原又は抗体を含む溶液を収容することができる容器
を含む、抗原又は抗体の測定装置。 following:
(1) a substrate on which an antigen-antibody complex is immobilized,
Here, when the measurement target is an antigen, the antigen-antibody complex immobilized on the base material is immobilized on the base material with an antibody specific to the antigen as the measurement target. When the measurement target antigen is bound and the measurement target is an antibody, the antigen-antibody complex immobilized on the base material immobilizes the antigen specific to the measurement target antibody on the base material. Measurement of antigen or antibody comprising a container that can contain a solution containing the antigen or antibody to be measured, which is bound to the antibody to be measured labeled to the fixed antigen, and (2) apparatus.
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