RU2515341C2

RU2515341C2 - Two-photon scanning microscope with automatic precision image focusing and method for automatic precision image focusing

Info

Publication number: RU2515341C2
Application number: RU2012135405/28A
Authority: RU
Inventors: Елена Дмитриевна Мишина; Сергей Владимирович Семин; Наталия Эдуардовна Шерстюк; Сергей Дмитриевич Лавров
Priority date: 2012-08-20
Filing date: 2012-08-20
Publication date: 2014-05-10
Also published as: RU2012135405A

Abstract

FIELD: physics, optics.

SUBSTANCE: microscope has a platform for placing a sample which is capable of moving at least vertically and horizontally, a laser radiation source for directing radiation incident on the analysed sample through a half-wave plate mounted on an automated rotating platform, a mirror system, a focusing device, a receiving part for automatic adjustment of the position of the analysed point on the surface of a sample at the focal point of the focusing device upon receiving radiation reflected from the analysed sample at second harmonic frequencies and two-photon luminescence. The focusing device is a lens system, or a light-beam expander and a gradient-index lens, or an objective lens, mounted on an automated micrometre translator, connected to a controller of the movement of the focusing device. The receiving part includes a detector used to receive reflected radiation through a polariser, a spectral filtration device and a short-focal length lens to the entrance aperture of optical fibre connected to the spectral filtration device.

EFFECT: providing automatic adjustment of the position of the analysed point on the surface of a sample in the focal point when receiving radiation reflected from the sample.

2 cl, 13 dwg

Description

Изобретение относится к области физических и химических исследований свойств материалов, микро- и наноструктур.The invention relates to the field of physical and chemical studies of the properties of materials, micro- and nanostructures.

Фокусировка однофотонных (обычных) сканирующих микроскопов осуществляется перемещением фокусатора или образца вдоль оптической оси, при этом контроль за наилучшей фокусировкой может осуществляться либо визуально, либо при помощи электронной регистрации.Single-photon (conventional) scanning microscopes are focused by moving the focuser or sample along the optical axis, and the best focus can be controlled either visually or by electronic recording.

Физический принцип, лежащий в основе распознавания положения наилучшего фокуса - дифракция световой волны на апертуре фокусирующей линзы, описываемая функцией размытия точки [R.H.Webb, Rep.Prog. Phys. 59 (1996) 427-471]. При различных положениях линзы относительно образца распределение светового поля лазерного пучка на образце различно (описывается функцией (sin(х)/х)², где х является функцией координат р в плоскости образца и z вдоль оптической оси (фиг.1 из работы R.H.Webb Webb).The physical principle underlying the recognition of the position of the best focus is the diffraction of the light wave at the aperture of the focusing lens, described by the point blur function [RHWebb, Rep.Prog. Phys. 59 (1996) 427-471]. At different positions of the lens relative to the sample, the distribution of the light field of the laser beam on the sample is different (described by the function (sin (x) / x) ² , where x is a function of the coordinates p in the plane of the sample and z along the optical axis (Fig. 1 from RHWebb Webb) .

Для идентификации положения по оси z наилучшей фокусировки необходимо наличие в микроскопе отдельной (видео)регистрации, позволяющей зафиксировать пространственное распределение светового поля (сечения, изображенные на фиг.1). Для микроскопов с невысоким пространственным разрешением, если возможно выделение и детектирование только центральной области пятна Эйри, возможно построение функции Эйри при сканировании фокусатора относительно образца вдоль оптической оси (US 5672861). Используются также методики контроля за контрастом изображения (US 6128129, US 7109459), которые также предусматривают визуализацию изображения для фокусировки.To identify the position along the z axis of the best focusing, it is necessary to have a separate (video) recording in the microscope, which allows you to fix the spatial distribution of the light field (sections shown in figure 1). For microscopes with low spatial resolution, if it is possible to isolate and detect only the central region of the Airy spot, it is possible to construct the Airy function when scanning the focuser relative to the sample along the optical axis (US 5672861). Image contrast control techniques are also used (US 6128129, US 7109459), which also provide for visualization of the image for focusing.

В случае однофотонного микроскопа функции фокусировки и собственно получения изображении совмещены, и такие методики работают достаточно эффективно.In the case of a single-photon microscope, the focusing functions and the actual image acquisition are combined, and such techniques work quite efficiently.

В случае когда получение изображения пятна Эйри или выделение центральной зоны пятна Эйри не предусматривается, и все излучение, отраженное от (или прошедшее через) образца попадает в детектор, то сканирование фокусатора вдоль оптической оси не приводит к существенной зависимости интенсивности регистрируемого сигнала от положения фокусатора.In the case when the image of the Airy spot is not provided or the central zone of the Airy spot is not provided, and all the radiation reflected from (or transmitted through) the sample enters the detector, scanning the focuser along the optical axis does not significantly affect the recorded signal intensity from the position of the focuser.

В случае двухфотонного микроскопа осуществляется именно описанная конфигурация: все излучение на длине волны второй гармоники, генерируемое в образце (в геометрии на просвет или в геометрии на отражение), попадает в детектор, то есть визуализация центральной части пятна Эйри невозможна (или требует существенного усложнения и удорожания микроскопа).In the case of a two-photon microscope, the described configuration is realized: all the radiation at the second harmonic wavelength generated in the sample (in the geometry of the light or in the geometry of the reflection) falls into the detector, i.e., the visualization of the central part of the Airy spot is impossible (or requires significant complication and the cost of the microscope).

Двухфотонная микроскопия является частным случаем многофотонной микроскопии и находит широкое применение при изучении различных физических и биологических явлений и объектов, как правило, в конфокальной геометрии. Данный метод диагностики материалов включает в себя такие методики, как генерация второй оптической гармоники (ГВГ) и двухфотонная люминесценция (ДФЛ).Two-photon microscopy is a special case of multiphoton microscopy and is widely used in the study of various physical and biological phenomena and objects, as a rule, in confocal geometry. This method of materials diagnostics includes such techniques as second-harmonic generation (SHG) and two-photon luminescence (DFL).

На сегодняшний день основное применение многофотонной конфокальной микроскопии - биология. Это связано с тем, что данная методика позволяет получать трехмерные изображения тканей за счет изменения фокусировки лазерного излучения (W. Denk, J.H. Strickler, and W.W. Webb, Science 248, 73, 1990), что оказывается возможным в связи с существенно большей глубиной проникновения излучения на основной длине волны (700-1000 нм) в биологические ткани (биологическое окно прозрачности - B.J. Tromberg, N.Shah, R. Lanning, A. Cerussi, J. Espinoza. T. Pham, L. Svaasand. J. Butler. Neoplasia. 2000, 2(1-2). Для исследования материалов методом двухфотонной микроскопии разработаны коммерческие образцы двухфотонных микроскопов. Такого рода приборы присутствуют в модельном ряду компаний, занимающихся изготовлением оптических микроскопов и комплектующих к ним, например Nikon (AlR МР), Olympus (FV1000 МРЕ), Carl Zeiss (LSM 510 NLO). Для исследования твердотельных микроструктур (для микроэлектроники) выпускаются конфокальные профилометры, однако эти приборы являются однофотонными и их функциональные возможности достаточно ограничены.To date, the main application of multiphoton confocal microscopy is biology. This is due to the fact that this technique allows one to obtain three-dimensional images of tissues by changing the focus of laser radiation (W. Denk, JH Strickler, and WW Webb, Science 248, 73, 1990), which is possible due to the significantly greater penetration depth of radiation at the main wavelength (700-1000 nm) in biological tissues (biological transparency window - BJ Tromberg, N. Shah, R. Lanning, A. Cerussi, J. Espinoza. T. Pham, L. Svaasand. J. Butler. Neoplasia 2000, 2 (1-2) For the study of materials by two-photon microscopy, commercial samples of two-photon microscopes have been developed. Such devices are present in the model range of companies manufacturing optical microscopes and accessories for them, for example Nikon (AlR MP), Olympus (FV1000 MPE), Carl Zeiss (LSM 510 NLO). Confocal profilometers are available for studying solid-state microstructures (for microelectronics) However, these devices are single-photon and their functionality is quite limited.

Так, например, известен конфокальный сканирующий микроскоп, характеризующийся тем, что содержит платформу для размещения исследуемого образца, источник лазерного излучения для направления излучения через ориентированно расположенные под углом к направлению излучения зеркала для последующей передачи излучения на образец, размещенный на платформе, кроме того, в системе присутствует большое количество направляющих зеркал и фокусирующих линз для передачи отраженного излучения в блоке его приема и обработки (US №7180661, G02B 21/06, G01J 3/30, F21V 9/16, опубл. 20.02.2007). Принято в качестве прототипа. Особенностью данного микроскопа является также то, что часть направляющих излучение зеркал выполнены с автономными приводами, используемыми для регулировки положения этих зеркал при настройке параметров излучения по отношению к исследуемому образцу.For example, a confocal scanning microscope is known, characterized in that it contains a platform for placing the sample under study, a laser source for directing radiation through mirrors oriented at an angle to the direction of radiation for subsequent transmission of radiation to a sample placed on the platform, in addition, the system has a large number of guide mirrors and focusing lenses for transmitting reflected radiation in the unit for its reception and processing (US No. 7180661, G02B 21/06, G01J 3/30, F21V 9/16, about UBL. 20.02.2007). Adopted as a prototype. A feature of this microscope is also that part of the radiation directing mirrors are made with self-contained drives used to adjust the position of these mirrors when adjusting the radiation parameters with respect to the test sample.

В исследовательских лабораториях двухфотонная микроскопия используется для получения изображения полупроводниковых металлических наноструктур (Shuhua Yue, Mikhail N. Slipchenko, and Ji-Xin Cheng, Multimodal nonlinear optical microscopy. Laser Photonics Rev., 1-17 (2011), а также доменной структуры (V. Kirilyuk, A. Kirilyuk, and Th. Rasing. Appl. Phys. Lett. 70 (17), 28 April 1997; Th. Lottermoser, D. Meier, R.V. Pisarev, and M. Fiebig, Phys. Rev. В 80, 100101(R) (2009) в сегнетоэлектрических и мультиферроидных пленках. Очевидно, что для полноценного анализа параметров неорганических твердотельных структур функции микроскопов, ориентированных на биологические объекты, недостаточно. Это связано с особенностями генерации второй оптической гармоники и двухфотонной люминесценции в неорганических твердотельных микро- и наноструктурах.Two-photon microscopy is used in research laboratories to obtain images of semiconductor metal nanostructures (Shuhua Yue, Mikhail N. Slipchenko, and Ji-Xin Cheng, Multimodal nonlinear optical microscopy. Laser Photonics Rev., 1-17 (2011), as well as domain structure (V . Kirilyuk, A. Kirilyuk, and Th. Rasing. Appl. Phys. Lett. 70 (17), 28 April 1997; Th. Lottermoser, D. Meier, RV Pisarev, and M. Fiebig, Phys. Rev. B 80, 100101 (R) (2009) in ferroelectric and multiferroic films. Obviously, for a full analysis of the parameters of inorganic solid-state structures, the functions of microscopes oriented to biological objects This is due to the peculiarities of the generation of the second optical harmonic and two-photon luminescence in inorganic solid-state micro- and nanostructures.

С другой стороны, в случае двухфотонного микроскопа возможно использование методик фокусировки, разработанных для однофотонных микроскопов, однако эти методики работают только для «грубой» фокусировки. Это связано с тем, что в силу ахроматичности оптики положение фокуса для излучения накачки (основной длины волны) не совпадает с положением фокуса для излучения второй гармоники (ахроматические линзы и объективы для такого широкого спектрального диапазона не эффективны). Кроме того, переход от основного излучения к излучения второй гармоники требует добавление (замену) в оптическую схему целого ряда элементов, что приводит к нарушению фокусировки.On the other hand, in the case of a two-photon microscope, it is possible to use focusing techniques developed for single-photon microscopes, however, these techniques work only for “rough” focusing. This is due to the fact that, due to the achromatic nature of optics, the position of the focus for pump radiation (the main wavelength) does not coincide with the position of the focus for second harmonic radiation (achromatic lenses and lenses for such a wide spectral range are not effective). In addition, the transition from the main radiation to the radiation of the second harmonic requires the addition (replacement) of a number of elements in the optical circuit, which leads to focus disruption.

Настоящее изобретение направлено на достижение технического результата, заключающегося в повышении технических характеристик за счет обеспечения автоматической настройки положения исследуемой точки поверхности образца точно в фокусе фокусатора при приеме отраженного от исследуемого образца излучения на частотах второй гармоники.The present invention is aimed at achieving a technical result, which consists in improving technical characteristics by providing automatic adjustment of the position of the studied point of the sample surface exactly in the focus of the focuser when receiving radiation reflected from the studied sample at the frequencies of the second harmonic.

Указанный технический результат для устройства достигается тем, что двухфотонный сканирующий микроскоп с автоматической точной фокусировкой изображения содержит платформу для размещения исследуемого образца, выполненную с возможностью перемещения по крайней мере в вертикальном и горизонтальном направлениях, источник лазерного излучения для направления излучения, падающего на исследуемый образец через полуволновую пластинку, установленную на автоматизированной вращающейся платформе, систему зеркал и фокусатор, представляющий собой систему линз или расширитель светового пучка и градиентную линзу или объектив, закрепленные на автоматизированном микрометрическом трансляторе, связанном с контроллером перемещения фокусатора, приемную часть для автоматической настройки положения исследуемой точки поверхности образца точно в фокусе фокусатора при приеме отраженного от исследуемого образца излучения на частотах второй гармоники и двухфотонной люминесценции, включающую в себя детектор, используемый для приема отраженного излучения через поляризатор, устройство спектральной фильтрации и короткофокусную линзу на входную апертуру оптического волокна, связанного с устройством спектральной фильтрации путем измерения интенсивности генерации второй гармоники и двухфотонной люминесценции при изменении положения фокусатора и автоматического выбора и последующего фиксирования точки максимальной интенсивности для получения изображения в положении точного фокуса фокусатора.The specified technical result for the device is achieved by the fact that the two-photon scanning microscope with automatic precise focusing of the image contains a platform for placement of the test sample, configured to move at least in the vertical and horizontal directions, a laser source for directing radiation incident on the test sample through the half-wave a plate mounted on an automated rotating platform, a system of mirrors and a focuser representing a combat lens system or a light beam expander and a gradient lens or objective mounted on an automated micrometric translator connected to a focuser movement controller, a receiving part for automatically adjusting the position of the studied point of the sample surface exactly in the focus of the focuser when receiving radiation reflected from the studied sample at second harmonic frequencies and two-photon luminescence, including a detector used to receive reflected radiation through a polarizer, devices spectral filtering and short-focus lens onto the entrance aperture of the optical fiber associated with the spectral filter device by measuring the intensity of the second harmonic generation and two-photon luminescence by changing the position and focusator automatic selection and subsequent fixation of the point of maximum intensity for the images in exact focus position focusator.

Указанный технический результат для способа достигается тем, что способ автоматической точной фокусировки изображения на двухфотонном сканирующем микроскопе заключается в размещении исследуемого образца на расстоянии от фокусатора, равном фокусному расстоянию по паспорту этого микроскопа, направлении излучения на исследуемый образец и приеме отраженного излучения на длине волны второй гармоники, затем смещают фокусатор для его выхода из точки фокуса и смещают фокусатор вдоль оптической оси в направлении к точке фокуса по паспорту с шагом, меньшим первого смещения и с переходом через точку фокуса по паспорту, и регистрируют отраженное излучение на длине волны второй гармоники и двухфотонной люминесценции в каждом шаге смещения с регистрацией по крайней мере одной координаты положения фокусатора в каждой точке шагового смещения, а затем выстраивают график зависимости мощности, измеряемой детектором на длине волны второй гармоники и двухфотонной люминесценции, и определяют положение точного фокуса на линии оптической оси по координате на графике, абсолютные значения которой меньше значений каждой из всех остальных координат на этом графике.The indicated technical result for the method is achieved in that the method for automatically accurately focusing the image on a two-photon scanning microscope consists in placing the test sample at a distance from the focuser equal to the focal length according to the passport of this microscope, directing the radiation to the test sample and receiving reflected radiation at a second harmonic wavelength , then the focuser is shifted to exit the focal point and the focuser is shifted along the optical axis towards the focal point according to the passport a step smaller than the first bias and with a pass through the focal point according to the passport, and the reflected radiation is recorded at the second harmonic and two-photon luminescence wavelengths at each bias step with at least one focusing position coordinate being recorded at each step bias point, and then the dependence is plotted power measured by the detector at the second harmonic wavelength and two-photon luminescence, and determine the position of the exact focus on the optical axis line from the coordinate on the graph, the absolute values which is less than the values of each of all other coordinates on this graph.

Указанные признаки являются существенными и взаимосвязаны с образованием устойчивой совокупности существенных признаков, достаточной для получения требуемого технического результата.These features are significant and are interconnected with the formation of a stable set of essential features sufficient to obtain the desired technical result.

Настоящее изобретение поясняется конкретным примером исполнения, который, однако, не является единственно возможным, но наглядно демонстрирует возможность достижения требуемого технического результата.The present invention is illustrated by a specific example of execution, which, however, is not the only possible, but clearly demonstrates the possibility of achieving the desired technical result.

На фиг.1 - вид функции размытия точки при фокусировке фокусатора;Figure 1 - view of the blur function of the point when focusing the focuser;

фиг.2 - представлена блок-схема экспериментальной установки микроскопа согласно изобретению со схемой регистрации излучения от исследуемого объекта;figure 2 - presents a block diagram of the experimental setup of the microscope according to the invention with a scheme for recording radiation from the studied object;

фиг.3 - зависимость диаметра перетяжки, координата z=0 - точка точного фокуса;figure 3 - dependence of the diameter of the waist, the coordinate z = 0 is the exact focus point;

фиг.4 - зависимость мощности, детектируемой детектором на длине волны второй гармоники, при перемещении фокусатора, координата z=0 - точка точного фокуса;figure 4 - dependence of the power detected by the detector at a wavelength of the second harmonic when moving the focuser, the coordinate z = 0 is the exact focus point;

фиг.5 - блок-схема устройства;5 is a block diagram of a device;

фиг.6 - представлен вид внешней панели программы управления транслятором фокусатора. В одном из окон показан график зависимости мощности ВГ, измеряемой детектором на длине волны второй гармоники при его автоматическом перемещении, координата z=3.4 mm - точка точного фокуса;6 is a view of an external panel of the focus translator control program. One of the windows shows a graph of the dependence of the SH power measured by the detector at the second harmonic wavelength during its automatic movement, the coordinate z = 3.4 mm is the exact focus point;

фиг.7 - изображение 80×80 мкм² образца пептидных трубок на поверхности стекла, полученное при освещении лазерным пучком с длиной волны 800 нм при положении линзы 2 мм, дополнительная подсветка осуществлялась лампой с широким сплошным спектром;Fig.7 is an image of 80 × 80 μm ^{2 of a} sample of peptide tubes on a glass surface, obtained when illuminated with a laser beam with a wavelength of 800 nm with a lens position of 2 mm, additional illumination was carried out with a lamp with a wide continuous spectrum;

фиг.8 - изображение 80×80 мкм² образца пептидных трубок на поверхности стекла, полученное при освещении лазерным пучком с длиной волны 800 нм при положении линзы 3.4 мм, дополнительная подсветка осуществлялась лампой с широким сплошным спектром;Fig. 8 is an image of an 80 × 80 μm ² peptide tube sample on a glass surface obtained by irradiation with a laser beam with a wavelength of 800 nm with a lens position of 3.4 mm, additional illumination was carried out with a lamp with a wide continuous spectrum;

фиг.9 - изображения на длине волны второй гармоники для фокусатора в положении 2 мм;Fig.9 - image at a wavelength of the second harmonic for the focuser in position 2 mm;

фиг.10 - интенсивностные сечения вдоль красной линии для фокусатора в положении 2 мм;figure 10 - intensity section along the red line for the focuser in the 2 mm position;

фиг.11 - изображения на длине волны второй гармоники для фокусатора в положении 3.4 мм;11 - image at a wavelength of the second harmonic for the focuser in position 3.4 mm;

фиг.12 - интенсивностные сечения вдоль красной линии для фокусатора в положении 3.4 мм;Fig - intensity section along the red line for the focuser in position 3.4 mm;

фиг.13 - алгоритм работы по наведению точной фокусировки изображения.13 is a flowchart for guiding the precise focusing of an image.

В рамках настоящего изобретения рассматривается эффективный и надежный способ автоматической фокусировки двухфотонного микроскопа, используемого для исследования микроструктур на длинах волн второй оптической гармоники и двухфотонной люминесценции. Микроскоп позволяет исследовать зависимость изображений от угла падения и азимута, угла приема излучения, а также поляризационные характеристики в органических и неорганических структурах. В качестве примеров проведены исследования нелинейно-оптических свойств пептидных трубок и микроструктур на основе оксида цинка.In the framework of the present invention, an effective and reliable method for automatically focusing a two-photon microscope used to study microstructures at wavelengths of the second optical harmonic and two-photon luminescence is considered. The microscope allows you to study the dependence of images on the angle of incidence and azimuth, the angle of reception of radiation, as well as the polarization characteristics in organic and inorganic structures. As examples, studies were made of the nonlinear optical properties of peptide tubes and microstructures based on zinc oxide.

Микроскоп предназначен для детектирования спектров излучения на длинах волн в видимой области спектра (фиг.2). В качестве источника 1 лазерного излучения использовался фемтосекундный Ti:Sap лазер с частотой повторения импульсов 100 МГц и длительностью импульсов не более 100 фс. Лазер позволяет автоматически перестраивать рабочую длину волны в диапазоне от 690 до 1040 нм. Средняя выходная мощность излучения составляет от 0.5 до 2 Вт. Для модуляции, а также для предварительного снижения мощности падающего на образец излучения был использован оптико-механический прерыватель 2. После лазера установлен оптический вентиль 3. Далее излучение проходит через последовательно стоящие друг за другом зеркала 4 (систему зеркал) к полуволновой пластинке 5, установленной на автоматически вращающейся платформе для выбора падающей поляризации. Излучение фокусируется на образце 6 фокусирующей линзой 8 с фокусным расстоянием 3 см, закрепленной на автоматизированной микрометрической подвижке (образец закреплен на трехкоординатной или двухкоординатной трансляционной платформе 7, установленной на гониометре). Фокусирующая линза 8 изготовлена из стекла с градиентным показателем преломления. Такая конструкция линзы позволяет получить меньший диаметр лазерного пятна в перетяжке по сравнению с линзами, изготовленными из однородного стекла при аналогичных фокусных расстояниях. В данной экспериментальной установке диаметр пятна в перетяжке составляет 2 мкм. Приемная система расположена перпендикулярно поверхности образца на трехкоординатной или двухкоординатной трансляционной платформе 7, что позволяет точно позиционировать детектор. Приемная часть этой системы включает в себя поляризатор с функцией анализатора состояния поляризации излучения на удвоенной частоте 5, детектор, используемый для приема отраженного излучения через фильтр 9, и короткофокусную линзу на входную апертуру оптического волокна. При этом входная апертура волокна установлена на гониометре с возможностью изменения своего углового положения по отношению к поверхности образца с целью получения изображений с произвольной угловой направленностью и связан с монохроматором. Исследуемый образец 6 закреплен на трехкоординатной или двухкоординатной трансляционной платформе 7, которая перемещает образец в вертикальном и горизонтальном направлениях с точностью до 500 нм, а также позволяет вращать образец относительно оси перпендикулярной плоскости образца.The microscope is designed to detect radiation spectra at wavelengths in the visible region of the spectrum (figure 2). A femtosecond Ti: Sap laser with a pulse repetition rate of 100 MHz and a pulse duration of not more than 100 fs was used as a source of laser radiation 1. The laser allows you to automatically tune the operating wavelength in the range from 690 to 1040 nm. The average output radiation power is from 0.5 to 2 watts. For modulation, as well as for preliminary reduction in the power of radiation incident on the sample, an opto-mechanical chopper 2 was used. An optical valve 3 was installed after the laser. Next, the radiation passes through successive mirrors 4 (a system of mirrors) to a half-wave plate 5 mounted on automatically rotating platform to select the incident polarization. The radiation is focused on sample 6 by a focusing lens 8 with a focal length of 3 cm fixed on an automated micrometer shift (the sample is mounted on a three-coordinate or two-coordinate translation platform 7 mounted on a goniometer). The focusing lens 8 is made of glass with a gradient refractive index. This design of the lens allows you to get a smaller diameter of the laser spot in the constriction compared with lenses made of uniform glass at similar focal lengths. In this experimental setup, the diameter of the spot in the constriction is 2 μm. The receiving system is located perpendicular to the surface of the sample on a three-coordinate or two-coordinate translation platform 7, which allows you to accurately position the detector. The receiving part of this system includes a polarizer with the function of an analyzer of the state of polarization of radiation at double frequency 5, a detector used to receive reflected radiation through a filter 9, and a short-focus lens at the input aperture of the optical fiber. In this case, the input fiber aperture is mounted on the goniometer with the possibility of changing its angular position with respect to the surface of the sample in order to obtain images with an arbitrary angular directivity and is connected with a monochromator. The studied sample 6 is mounted on a three-coordinate or two-coordinate translation platform 7, which moves the sample in the vertical and horizontal directions with an accuracy of 500 nm, and also allows you to rotate the sample relative to the axis of the perpendicular plane of the sample.

Излучение от образца проходит через фильтр 9 (Schott Glass BG-39, область пропускания от 320 до 650 нм) для того, чтобы отсечь излучение на основной частоте лазера, но пропустить излучение второй гармоники или двухфотонной люминесценции, прогенерированное в образце, затем с помощью короткофокусной линзы 10 собирается на входной апертуре 11 оптического волокна диаметром до 1 мм. Волокно представляет собой пучок из 19 волноводов диаметром 200 мкм (245 мкм с обкладкой). На одном конце волокна волноводы формируют линейку, что позволяет снизить потери при сопряжении со щелью монохроматора 12, служащего для спектрального анализа прогенерированного в образце излучения. На другом конце волноводы формируют круг для лучшего сопряжения с собирающей линзой. Перед входной щелью установлен еще один фильтр BG-39. Монохроматор 12 за счет поворотного зеркала позволяет переключаться между выходом, связанным с ПЗС матрицей 13, используемой для регистрации спектральных зависимостей, и выходом 14, связанным с ФЭУ, используемым для регистрации сигнала на определенной длине волны. Монохроматор 12 снабжен автоматизированной турелью, позволяющей программно менять дифракционные решетки. На турели установлены решетки 150, 300 и 600 штр/мм. Для снижения уровня шумов ПЗС матрица охлаждается при помощи жидкого азота до температуры -1200°С. Сигнал от ПЗС-матрицы направляется на плату регистрации, подключенную к компьютеру.The radiation from the sample passes through a filter 9 (Schott Glass BG-39, transmission range from 320 to 650 nm) in order to cut off the radiation at the fundamental frequency of the laser, but to skip the second harmonic or two-photon luminescence radiation generated in the sample, then using short-focus the lens 10 is collected at the input aperture 11 of the optical fiber with a diameter of up to 1 mm The fiber is a bundle of 19 waveguides with a diameter of 200 microns (245 microns with a lining). The waveguides form a ruler at one end of the fiber, which makes it possible to reduce losses in conjunction with the slit of the monochromator 12, which serves for spectral analysis of the radiation generated in the sample. At the other end, the waveguides form a circle for better coupling with the collecting lens. In front of the entrance slit is another BG-39 filter. The monochromator 12 due to the rotary mirror allows you to switch between the output associated with the CCD matrix 13, used to register spectral dependencies, and the output 14, associated with the PMT, used to register the signal at a specific wavelength. The monochromator 12 is equipped with an automated turret that allows you to programmatically change the diffraction gratings. The turrets are equipped with grids 150, 300 and 600 lines / mm. To reduce the noise level of the CCD, the matrix is cooled with liquid nitrogen to a temperature of -1200 ° C. The signal from the CCD is sent to the registration board connected to the computer.

В микроскопе элементами отсечения являются «фильтр 9 (Schott Glass BG-39, область пропускания от 320 до 650 нм) для того, чтобы предварительно отсечь излучение на основной частоте, затем с помощью короткофокусной линзы 10 собирается на входной апертуре 11 монохроматора 12, дополнительно позволяющего анализировать спектральный состав излучения двухфотонной люминесценции (то есть отсекающие элементы - это фильтр 9 и монохроматор 12).In the microscope, the cut-off elements are “filter 9 (Schott Glass BG-39, transmission range from 320 to 650 nm) in order to pre-cut the radiation at the fundamental frequency, then using the short-focus lens 10 it is collected at the input aperture 11 of the monochromator 12, which additionally allows analyze the spectral composition of the radiation of two-photon luminescence (that is, the cut-off elements are a filter 9 and a monochromator 12).

Сигнал, зарегистрированный фотоэлектронным умножителем (ФЭУ), поступает на синхронный детектор 15, синхронизированный с оптико-механическим прерывателем. ФЭУ работает в режиме регистрации фототока, однако для регистрации световых потоков низкой интенсивности возможна работа в режиме счета фотонов. Для этого в установку должны быть включены счетчик фотонов и предусилитель сигнала. Сбор данных от синхронного детектора 15 или счетчика фотонов осуществляется через интерфейс GPIB в компьютере 16. Положение лазерного пятна на образце контролируется с помощью камеры 17 с увеличивающим объективом и микроскопом. Автоматизация экспериментальной установки осуществлена в программной среде LabView. Установка позволяет проводить сканирование поверхности образца и регистрацию в отдельной точке, как спектров, так и излучения на отдельных длинах волн. Полученные экспериментальные данные могут дать представление о спектральном составе излучения в различных точках образца, а также свойствах кристаллической структуры материала. Программа позволяет управлять такими параметрами сканирования, как область сканирования, шаг сканирования и получать предварительные данные о топографии поверхности. Также она позволяет контролировать параметры лазера (длина волны, мощность накачки) и монохроматора. В частности, можно управлять шириной входной щели монохроматора, временем выдержки, сменой дифракционных решеток.The signal recorded by the photomultiplier tube (PMT) is fed to a synchronous detector 15, synchronized with the optical-mechanical chopper. The PMT operates in the photocurrent registration mode, however, for recording low-intensity light fluxes, it is possible to operate in the photon counting mode. For this, the photon counter and signal preamplifier must be included in the installation. Data collection from the synchronous detector 15 or the photon counter is carried out through the GPIB interface in the computer 16. The position of the laser spot on the sample is controlled using a camera 17 with a magnifying lens and a microscope. Automation of the experimental setup was carried out in the LabView software environment. The setup allows scanning the surface of a sample and recording at a separate point both spectra and radiation at individual wavelengths. The obtained experimental data can give an idea of the spectral composition of radiation at various points of the sample, as well as the properties of the crystal structure of the material. The program allows you to control such scanning parameters as the scan area, scan step and obtain preliminary data on the surface topography. It also allows you to control the parameters of the laser (wavelength, pump power) and monochromator. In particular, it is possible to control the width of the entrance slit of the monochromator, the exposure time, and the change of diffraction gratings.

Способ автоматической фокусировки двухфотонного микроскопа основан на самом физическом принципе процесса генерации двухфотонных процессов (второй гармоники ВГ и двухфотонной люминесценции). Фокусирующий элемент (это может быть градиентная линза, система линз или объектив) установлен на автоматизированном микрометрическом трансляторе. Работа автофокусатора основана на одном из основных свойств двухфотонных процессов (ДФП) (это может быть и генерация ВГ и двухфотонная люминесценция) - квадратичной зависимости интенсивности излучения L_2ω от падающей интенсивности (==плотности мощности): поскольку ${\vec{E}}_{2 ω} \propto \hat{χ} {\vec{E}}_{ω} {\vec{E}}_{ω}$

, то

I_{2 ω} \propto {\hat{χ}}^{2} I_{ω}^{2}

.The method of automatic focusing of a two-photon microscope is based on the physical principle of the process of generating two-photon processes (second harmonic of the second harmonic and two-photon luminescence). The focusing element (it can be a gradient lens, a lens system or a lens) is mounted on an automated micrometric translator. Autofocus operation is based on one of the main properties of two-photon processes (DFT) (this can be SH generation and two-photon luminescence) - the quadratic dependence of the radiation intensity L _2ω on the incident intensity (== power density): since

{\vec{E}}_{2 ω} \propto \hat{χ} {\vec{E}}_{ω} {\vec{E}}_{ω}

then

I_{2 ω} \propto {\hat{χ}}^{2} I_{ω}^{2}

.

Плотность мощности определяется отношением мощности падающей волны W к площади светового пятна S:The power density is determined by the ratio of the incident wave power W to the area of the light spot S:

$\begin{array}{l} I_{ω} = W_{ω} / S \\ S = S_{0} [1 + {(\frac{λ z}{π S_{0}})}^{2}] (1) \end{array}$

\begin{array}{l} I_{ω} = W_{ω} / S \\ S = S_{0} [one + {(\frac{λ z}{π S_{0}})}^{2}] (one) \end{array}

С другой стороны, детектор измеряет мощность излучения:On the other hand, the detector measures the radiation power:

W_2ω=I_2ω·S,W _2ω = I _2ω · S,

то естьi.e

$W_{2 ω} \propto {\hat{χ}}^{2} \frac{W_{ω}^{2}}{S_{0} [1 + {(\frac{λ z}{π S_{0}})}^{2}]} (2)$

W_{2 ω} \propto {\hat{χ}}^{2} \frac{W_{ω}^{2}}{S_{0} [one + {(\frac{λ z}{π S_{0}})}^{2}]} (2)

Графики зависимостей (1) и (2) представлены на фиг.7-12 соответственно.The dependency graphs (1) and (2) are shown in Figs. 7-12, respectively.

В двухфотонном сканирующем микроскопе (фиг.2 и 5) с автоматической точной фокусировкой изображения излучение от источника 1 лазерного излучения падает на исследуемый образец через полуволновую пластинку 3, установленную на автоматизированной вращающейся платформе, систему зеркал 4 и фокусатор. Фокусатор 19 представляет собой систему линз или расширитель светового пучка и градиентную линзу или объектив, закрепленные на автоматизированном микрометрическом трансляторе 20, связанном с контроллером 21 перемещения фокусатора. Приемная часть служит для автоматической настройки положения исследуемой точки поверхности образца точно в фокусе фокусатора при приеме отраженного от исследуемого образца излучения на частотах второй гармоники и двухфотонной люминесценции. Эта приемная часть включает в себя детектор, используемый для приема отраженного излучения через поляризатор, устройство спектральной фильтрации и короткофокусную линзу на входную апертуру оптического волокна, связанного с устройством спектральной фильтрации путем измерения интенсивности генерации второй гармоники и двухфотонной люминесценции при изменении положения фокусатора и автоматического выбора и последующего фиксирования точки максимальной интенсивности для получения изображения в положении точного фокуса фокусатора.In a two-photon scanning microscope (FIGS. 2 and 5) with automatic accurate focusing of the image, the radiation from the laser radiation source 1 falls on the test sample through a half-wave plate 3 mounted on an automated rotating platform, a system of mirrors 4, and a focuser. The focuser 19 is a lens system or a light beam expander and a gradient lens or objective mounted on an automated micrometric translator 20 connected to the focuser movement controller 21. The receiving part serves to automatically adjust the position of the studied point of the sample surface exactly in the focus of the focuser when receiving radiation reflected from the studied sample at the frequencies of the second harmonic and two-photon luminescence. This receiving part includes a detector used to receive reflected radiation through a polarizer, a spectral filtering device, and a short-focus lens on the input aperture of an optical fiber connected to a spectral filtering device by measuring the second harmonic generation intensity and two-photon luminescence when the focuser is changed and automatic selection and subsequent fixation of the maximum intensity point to obtain an image in the exact focus position of the focuser.

Способ автоматической точной фокусировки изображения на двухфотонном сканирующем микроскопе заключается в размещении исследуемого образца на расстоянии от фокусатора, равном фокусному расстоянию по паспорту этого микроскопа, направлении излучения на исследуемый образец и приеме отраженного излучения на длине волны второй гармоники, затем смещают фокусатор для его выхода из точки фокуса и смещают фокусатор вдоль оптической оси в направлении к точке фокуса по паспорту с шагом, меньшим первого смещения и с переходом через точку фокуса по паспорту, и регистрируют отраженное излучение на длине волны второй гармоники и двухфотонной люминесценции в каждом шаге смещения с регистрацией по крайней мере одной координаты положения фокусатора в каждой точке шагового смещения, а затем выстраивают график зависимости мощности, измеряемой детектором на длине волны второй гармоники и двухфотонной люминесценции, и определяют положение точного фокуса на линии оптической оси по координате на графике, абсолютные значения которой меньше значений каждой из всех остальных координат на этом графике.The method of automatic accurate focusing of the image on a two-photon scanning microscope consists in placing the test sample at a distance from the focuser equal to the focal length according to the passport of this microscope, directing the radiation to the test sample and receiving the reflected radiation at the second harmonic wavelength, then the focuser is shifted to exit the point focus and shift the focuser along the optical axis towards the focal point according to the passport with a step smaller than the first offset and with the transition through the focal point according to the passport, and the reflected radiation is recorded at a wavelength of the second harmonic and two-photon luminescence at each bias step with recording at least one coordinate of the focuser position at each step of the bias shift, and then a graph is plotted of the power measured by the detector at the wavelength of the second harmonic and two-photon luminescence, and determine the position of the exact focus on the line of the optical axis by the coordinate on the graph, the absolute values of which are less than the values of each of all other coordinates by this chart.

Описание работы устройства по данному способу (производится автоматически программой, алгоритм которой представлен на фиг.13):Description of the operation of the device according to this method (performed automatically by the program, the algorithm of which is presented in Fig.13):

1. Грубо устанавливаем расстояние между образцом и фокусатором (в англоязычной патентной литературе использован термин "self-focusing" - фокусатор) (объективом, линзой и т.д.), равным фокусному расстоянию (по паспорту).1. We roughly set the distance between the sample and the focuser (the term "self-focusing" is used in the English patent literature) (lens, lens, etc.) equal to the focal length (according to the passport).

2. Грубо перемещаем фокусатор на расстояние, равное 5 мм.2. Roughly move the focuser to a distance equal to 5 mm.

3. Аккуратно сканируем фокусатор вдоль оптической оси с шагом в несколько десятков микрон (50 микрон в нашем примере).3. Carefully scan the focuser along the optical axis in increments of several tens of microns (50 microns in our example).

4. Получаем картинку, представленную на фиг.6.4. We get the picture presented in Fig.6.

5. Производим аппроксимацию полученной экспериментальной зависимости по формуле (2), определяем положение z=z₀ точного фокуса.5. We approximate the obtained experimental dependence by the formula (2), determine the position z = z _{0 of the} exact focus.

6. Устанавливаем фокусатор в положение z₀.6. Set the focuser to the position z ₀ .

Точный фокус установлен, сканируем изображение. На фиг.6 представлен вид передней панели программы управления фокусатором. В одном из окон показан график зависимости мощности ВГ, измеряемой детектором на длине волны второй гармоники при его автоматическом перемещении, координата z=3.4 мм - точка точного фокуса. По выставленному графику на мониторе можно точно установить координаты точки точного фокуса.The exact focus is set, we scan the image. 6 is a front view of a focus control program. One of the windows shows a graph of the dependence of the SH power measured by the detector at the second harmonic wavelength during its automatic movement, the coordinate z = 3.4 mm is the exact focus point. According to the set schedule on the monitor, you can accurately set the coordinates of the exact focus point.

Исследования достижения поставленного технического результата проводились на примерах сканирования пептидных трубок. На фиг.7 представлено изображение 80×80 мкм² образца пептидных трубок на поверхности стекла, полученное при освещении лазерным пучком с длиной волны 800 нм при положении линзы 2 мм, дополнительная подсветка осуществлялась лампой с широким сплошным спектром. А на фиг.8 - изображение 80×80 мкм² образца пептидных трубок на поверхности стекла, полученное при освещении лазерным пучком с длиной волны 800 нм при положении линзы 3.4 мм, дополнительная подсветка осуществлялась лампой с широким сплошным спектром. Как видно, различия в изображениях по фиг.7 и по фиг.8 отсутствуют.Research to achieve the technical result was carried out on examples of scanning peptide tubes. Figure 7 presents the image of 80 × 80 μm ^{2 of a} sample of peptide tubes on the glass surface, obtained by irradiation with a laser beam with a wavelength of 800 nm with a lens position of 2 mm, additional illumination was carried out with a lamp with a wide continuous spectrum. And Fig. 8 is an image of an 80 × 80 μm ² sample of peptide tubes on a glass surface obtained by irradiation with a laser beam with a wavelength of 800 nm with a lens position of 3.4 mm, additional illumination was carried out with a lamp with a wide continuous spectrum. As you can see, the differences in the images of Fig.7 and Fig.8 are absent.

На фиг.9 представлено изображение образца на длине волны второй гармоники для фокусатора в положении 2 мм, а на фиг.10 - интенсивностные сечения вдоль красной линии для фокусатора в положении 2 мм для этого изображения. На фиг.11 - изображения на длине волны второй гармоники для фокусатора в положении 3.4 мм, а на фиг.12 - интенсивностные сечения вдоль красной линии для фокусатора в положении 3.4 мм для изображения по фиг.11. Из фиг.9-12 видно, что сдвиг фокуса на 1.4 мм от оптимальной точки (что соответствует разбросу положения объектива при фокусировке «на глаз») уменьшает яркость изображения в 3 раза и существенным образом ухудшает пространственное разрешение или «размазывает» изображение: трубки, которые четко видны раздельно в режиме автофокуса, неразличимы при фокусировке «на глаз».Figure 9 shows the image of the sample at the second harmonic wavelength for the focuser in the 2 mm position, and figure 10 - intensity section along the red line for the focuser in the 2 mm position for this image. In Fig.11 - image at a wavelength of the second harmonic for the focuser in the position of 3.4 mm, and Fig.12 - intensity section along the red line for the focuser in the position of 3.4 mm for the image in Fig.11. Figures 9-12 show that a focus shift of 1.4 mm from the optimal point (which corresponds to a spread in the position of the lens when focusing “on the eye”) reduces the image brightness by 3 times and significantly degrades the spatial resolution or “smears” the image: tubes, which are clearly visible separately in autofocus mode, are indistinguishable when focusing “on the eye”.

Таким образом, видно, что указанные в формуле совокупности существенных признаков, отражающие особенности исполнения автоматизированной фокусировки в двухфотонном сканирующем микроскопе, обеспечивает настройку положения исследуемой точки поверхности образца точно в фокусе фокусатора при приеме отраженного от исследуемого образца излучения на частотах второй гармоники.Thus, it is seen that the sets of essential features indicated in the formula that reflect the features of automated focusing in a two-photon scanning microscope provide the position of the studied point on the surface of the sample exactly in the focus of the focuser when receiving radiation reflected from the studied sample at the frequencies of the second harmonic.

Claims

1. Two-photon scanning microscope with automatic precise focusing of the image, characterized in that it contains a platform for placement of the test sample, configured to move at least in the vertical and horizontal directions, a laser source for directing radiation incident on the test sample through a half-wave plate, mounted on an automated rotating platform, a mirror system and a focuser, which is a lens system, or a light expander beam and a gradient lens, or lens, mounted on an automated micrometric translator connected to a focuser movement controller, the receiving part for automatically adjusting the position of the studied point of the sample surface exactly in the focus of the focuser when receiving radiation reflected from the studied sample at the frequencies of the second harmonic and two-photon luminescence, including a detector used to receive reflected radiation through a polarizer, a spectral filtering device and short-circuit a main lens on the input aperture of the optical fiber associated with the spectral filtering device by measuring the second harmonic generation intensity and two-photon luminescence when changing the focuser position and automatically selecting and subsequently fixing the maximum intensity point to obtain an image in the exact focus position of the focuser.

2. A method of automatically automatically focusing the image on a two-photon scanning microscope, which consists in placing the test sample at a distance from the focuser equal to the focal length according to the passport of this microscope, directing the radiation to the test sample and receiving the reflected radiation at a second harmonic wavelength, then the focuser is shifted for it exit from the focal point and shift the focuser along the optical axis in the direction of the focal point according to the passport with a step smaller than the first offset, and with the transition through the f pieces according to the passport, and the reflected radiation is recorded at the second harmonic wavelength and two-photon luminescence at each bias step with recording at least one coordinate of the focuser position at each step bias point, and then a graph of the power measured by the detector at the second harmonic wavelength and two-photon luminescence, and determine the position of the exact focus on the line of the optical axis by the coordinate on the graph, the absolute values of which are less than the values of each of all other coordinates at on this graph.