RU2498558C2

RU2498558C2 - Method of producing liquid mycelium for use in protein enrichment of animal feed

Info

Publication number: RU2498558C2
Application number: RU2011152718/13A
Authority: RU
Inventors: Андрей Геннадьевич Шестаков; Игорь Олегович Золотовский; Виктор Николаевич Маслов; Сергей Геннадьевич Новиков
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью "ОВЛП"
Priority date: 2011-12-22
Filing date: 2011-12-22
Publication date: 2013-11-20
Also published as: RU2011152718A

Abstract

FIELD: chemistry.

SUBSTANCE: invention relates to agricultural biotechnology, particularly culturing a basidiomycete micellar mass and can be used in producing liquid seeding mycelium Pleurotus oustreatus. The liquid mycelium is obtained by submerged cultivation of Pleurotus ostreatus fungus on a low-viscosity culture medium and then separating the biomass. The cultivation process is carried out on a low-viscosity liquid culture medium containing MgSO₄ - 0.2-0.8 g/l, KH₂PO₄ - 0.2-0.8 g/l, K₂HPO₄ - 0.5-2.0 g/l, MnSO₄ - 0.0005-0.005 g/l, ZnSO₄ -0.0005-0.005 g/l, dry enzymatic peptone - 0.5-2.0 g/l, starch - 5.0-15.0 g/l, sodium succinate 5.0-12.0 g/l.

EFFECT: use of the invention enables to enrich animal feed with protein.

1 ex

Description

Особое место среди мицелиальных грибов занимают базидиомицеты, которые сегодня по праву рассматриваются как перспективные продуценты белка кормового и пищевого достоинства. Основные подходы к технологическим режимам и условиям культивирования, при производстве кормов такого рода, отличаются от традиционных технологий, направленных на выгонку плодовых тел. Ключевым моментом при производстве корма с использованием Pleurotus ostreatus является культивирование «посевного» мицелия в жидкой среде, с составом микроэлементов и питательных веществ подобранными эмпирически. Основным требованием к жидкой питательной среде для культивирования базидиомицетов, является выход наибольшего объема жизнеспособной биомассы Pleurotus ostreatus при наименьших технических решениях. Для глубинного культивирования могут применяться натуральные (жидкое сусло) и синтетические среды (глюкозопептонная среда и др.). Важную роль в процессе роста культуры играют источники углерода, так как культуре для развития необходимо достаточное количество легко утилизируемых Сахаров, а содержание азота в среде не оказывает существенного влияния на накопление биомассы. Вместе с тем установлено, что штаммы Pleurotus ostreatus не способны расти на средах, содержащих только неорганические источники азота.A special place among mycelial fungi is occupied by basidiomycetes, which today are rightfully considered as promising producers of protein of fodder and nutritional value. The main approaches to technological regimes and cultivation conditions in the production of feed of this kind differ from traditional technologies aimed at forcing fruit bodies. The key point in the production of feed using Pleurotus ostreatus is the cultivation of "seed" mycelium in a liquid medium, with the composition of trace elements and nutrients selected empirically. The main requirement for a liquid nutrient medium for the cultivation of basidiomycetes is the yield of the largest volume of viable Pleurotus ostreatus biomass with the least technical solutions. For deep cultivation, natural (liquid wort) and synthetic media (glucose peptone medium, etc.) can be used. An important role in the process of culture growth is played by carbon sources, since a culture needs a sufficient amount of easily utilizable Sugars for development, and the nitrogen content in the medium does not significantly affect biomass accumulation. However, it was found that Pleurotus ostreatus strains are not able to grow on media containing only inorganic nitrogen sources.

Известен «Способ получения посевного мицелия съедобных грибов» (патент РФ 2249614). Для решения поставленной задачи в способе получения посевного мицелия съедобных грибов, включающем приготовление мицелиальной биомассы на питательной среде в присутствии стимулятора роста, посев мицелиальной биомассы на зерновую питательную среду, согласно изобретению, мицелиальную биомассу готовят путем глубинного культивирования, в качестве питательной среды используют картофельно-пшеничную, а в качестве стимулятора роста - суспензию бактерий Azospirillum.The well-known "Method for producing seed mycelium of edible mushrooms" (RF patent 2249614). To solve the problem in a method for producing seed mycelium of edible mushrooms, including the preparation of mycelial biomass on a nutrient medium in the presence of a growth stimulator, sowing mycelial biomass on a grain nutrient medium, according to the invention, the mycelial biomass is prepared by deep cultivation, potato and wheat are used as a nutrient medium , and as a growth promoter - a suspension of bacteria Azospirillum.

Недостатком способа является использование в качестве стимулятора роста суспензии бактерий Azospirillum, так как появляется необходимость в дополнительных манипуляциях с бактериальными штаммами, что требует дополнительных технических решений.The disadvantage of this method is the use of a suspension of Azospirillum bacteria as a growth promoter, since there is a need for additional manipulations with bacterial strains, which requires additional technical solutions.

Наиболее близким по техническому решению является «Способ получения белковой биомассы гриба», который может служить прототипом (патент РФ 2189395). В способе описано техническое решение, а именно частичный отъем мицелиарной массы до 40-50% из питательной среды. В качестве основного компонента питательной среды используется молочная сыворотка, а в качестве пеногасителя предлагается использовать нерафинированное растительное масло. В качестве источника азота предлагается аммоний сернокислый или аммоний фосфорнокислый двузамещенный. Процесс ферментации ведется в стерильных условиях в периодическом режиме, при аэрировании среды воздухом и подтитровкой 3% раствором NaOH.Closest to the technical solution is the "Method of obtaining protein biomass of the fungus", which can serve as a prototype (RF patent 2189395). The method describes a technical solution, namely a partial weaning of the mycelial mass of up to 40-50% of the nutrient medium. As the main component of the nutrient medium, whey is used, and it is proposed to use unrefined vegetable oil as an antifoam. Ammonium sulfate or ammonium phosphate disubstituted are proposed as a source of nitrogen. The fermentation process is carried out under sterile conditions in a batch mode, by aerating the medium with air and subtitling with a 3% NaOH solution.

Недостатком способа является необходимость аэрирования среды воздухом и подтитровка 3% раствором NaOH. Недостатком среды, также, является использование пеногасителя. Кроме того, присутствуют дополнительные манипуляции, связанные с отъемом мицелиарной массы и подтитровкой 3% раствором NaOH, что требует дополнительных технических решений.The disadvantage of this method is the need for aeration of the medium with air and subtitling with a 3% NaOH solution. A disadvantage of the medium is also the use of an antifoam. In addition, there are additional manipulations associated with weaning of the mycelial mass and subtitling with a 3% NaOH solution, which requires additional technical solutions.

Цель предлагаемого способа - выращивание мицелиарной массы Pleurotus oustreatus, в жидкой питательной среде с использованием сукцината натрия без принудительного аэрирования воздухом и дополнительной подтитровки 3%-м раствором NaOH.The purpose of the proposed method is the cultivation of the mycelial mass of Pleurotus oustreatus, in a liquid nutrient medium using sodium succinate without forced aeration with air and additional undertaking with a 3% NaOH solution.

Результатом использования способа является получение жидкого мицелия при меньшем количестве технических решений, для применения в обогащении белком кормов для животных.The result of using the method is to obtain liquid mycelium with fewer technical solutions for use in protein enrichment of animal feed.

Обоснованием предлагаемого способа является использование сукцината натрия в качестве источника углерода и энергии, средства снижающего явления гипоксии в клетках мицелия Pleurotus oustreatus, a также солей калия фосфорнокислого, выступающих в качестве фосфатного буфера.The rationale for the proposed method is the use of sodium succinate as a source of carbon and energy, a means of reducing the phenomenon of hypoxia in the cells of the mycelium Pleurotus oustreatus, as well as potassium salts of phosphate, acting as a phosphate buffer.

Питательная среда имеет следующий состав: MgSO₄ - 0,2-0,8 г/л; KH₂PO₄ - 0,2-0,8 г/л; K₂HPO₄ - 0,5-2,0 г/л; MnSO₄ - 0,0005-0,005 г/л; ZnSO₄ -0.0005-0,005 г/л; пептон сухой ферментативный - 0,5-2,0 г/л; крахмал - 5,0-15,0 г/л; сукцинат натрия 5,0-12,0 г/л.The nutrient medium has the following composition: MgSO ₄ - 0.2-0.8 g / l; KH ₂ PO ₄ 0.2-0.8 g / l; K ₂ HPO ₄ - 0.5-2.0 g / l; MnSO ₄ - 0.0005-0.005 g / l; ZnSO ₄ -0.0005-0.005 g / l; dry enzymatic peptone - 0.5-2.0 g / l; starch - 5.0-15.0 g / l; sodium succinate 5.0-12.0 g / l.

Соли магния, марганца и цинка в среде являются источниками ионов указанных металлов и анионов серы. Указанные соли, являются факторами роста в среде играющие важную роль в ферментативных процессах и биосинтезе белка. Соли калия фосфорнокислого одно и двух замещенного, в указанной концентрации, выполняют роль буферной системы и позволяют поддерживать pH среды в диапазоне 6,0-4,0, снижая тем самым агрессивное влияние кислот на клетки мицелия. Кроме того, фосфаты калия в среде служат источником ионов калия, участвующего в транспорте веществ в клетку, обменных процессах и фосфора, необходимого для энергетического метаболизма и как следствие прироста биомассы Pleurotus ostreatus.Salts of magnesium, manganese and zinc in the medium are sources of ions of these metals and sulfur anions. These salts are growth factors in the environment that play an important role in enzymatic processes and protein biosynthesis. One and two substituted potassium salts of phosphate, in the indicated concentration, play the role of a buffer system and allow maintaining the pH of the medium in the range of 6.0-4.0, thereby reducing the aggressive effect of acids on mycelial cells. In addition, potassium phosphates in the medium serve as a source of potassium ions involved in the transport of substances into the cell, metabolic processes, and phosphorus, which is necessary for energy metabolism and, as a result, an increase in Pleurotus ostreatus biomass.

Сопоставительный анализ заявляемого решения с прототипом показывает, что заявляемый способ отличается от известного тем, что питательная среда, содержащая крахмал после приготовления имеет незначительную вязкость, однако через 24 часа вязкость среды исчезает, за счет расщепления крахмала амилазами Pleurotus ostreatus; сукцинат натрия обеспечивает устойчивость клеток мицелия к гипоксии; отсутствует необходимость в отъеме мицелиарной массы и подтитровке среды. Таким образом, заявляемый способ соответствует критерию изобретения "новизна".A comparative analysis of the proposed solution with the prototype shows that the claimed method differs from the known one in that the nutrient medium containing starch after preparation has a low viscosity, however, after 24 hours the viscosity of the medium disappears due to the breakdown of the starch with Pleurotus ostreatus amylases; sodium succinate ensures the resistance of mycelium cells to hypoxia; there is no need for weaning of the mycelial mass and subtitling of the medium. Thus, the claimed method meets the criteria of the invention of "novelty."

Мицелий, полученный в глубинных условиях, может найти применение в технологии производства ферментированных кормов для сельскохозяйственных животных.Mycelium obtained in deep conditions can find application in the technology for the production of fermented feed for farm animals.

Пример Биомассу мицелия, использующуюся при внесении в питательную среду, на начальном этапе культивирования готовят в колбах объемом 1000 мл. Для этого, культуру высшего гриба Pleurotus ostreatus выращивают на питательной среде с добавлением агар-агара в чашках Петри при температуре 23-28°C в течение 3-5 суток. Среда имеет следующий состав: MgSO₄ - 0,2-0,8 г/л; KH₂PO₄ - 0,2-0,8 г/л; K₂HPO₄ - 0,5-2,0 г/л; MnSO₄ - 0.0005-0,005 г/л; ZnSO₄ -0,0005-0,005 г/л; пептон сухой ферментативный - 0,5-2,0 г/л; крахмал - 5,0-15,0 г/л; сукцинат натрия 5,0-12,0 г/л; агар-агар 1%-3%. Затем стерильно переносят культуру в качалочные колбы объемом 1000 мл, в количестве 6 штук, где приготовлена жидкая питательная среда, указанная выше, без добавления агар-агара. Выращивание мицелия проводят на качалке при 150-190 об/мин и температуре 23-28°C, pH среды 5,8-6,2 в течение 3-5 суток, обеспечивающийся за счет буферной системы. Затем, из 6 колб, выращенный посевной материал в виде мелких глобул стерильно переносят в биокультиватор рабочим объемом 65 л. В биокультиваторе «Б65АМЦ-01» предварительно стерилизуют питательную среду при 0,5 атм в течение 50-70 мин, состоящую из MgSO₄ - 0,2-0,8 г/л; KH₂PO₄ - 0,2-0,8 г/л; K₂HPO₄ - 0,5-2,0 г/л; MnSO₄ - 0.0005-0,005 г/л; ZnSO₄ -0.0005-0,005 г/л; пептон сухой ферментативный - 0,5-2,0 г/л; крахмал - 5,0-15,0 г/л; сукцинат натрия 5,0-12,0 г/л. Процесс культивирования протекает в течение 80-96 ч при вращении лопастной мешалки, приводимой в движение асинхронным двигателем. Вращение мешалки соответствует 35-45 об/мин. На начальной стадии в течение 18-20 ч выращивания мицелиарной массы наблюдается снижение вязкости среды, за счет ферментации крахмала. Выход сухой биомассы гриба составляет 20-25 г/л с питательной среды.Example The biomass of mycelium used when added to the nutrient medium is prepared in 1000 ml flasks at the initial stage of cultivation. For this, the culture of the higher fungus Pleurotus ostreatus is grown on a nutrient medium with the addition of agar-agar in Petri dishes at a temperature of 23-28 ° C for 3-5 days. The medium has the following composition: MgSO ₄ - 0.2-0.8 g / l; KH ₂ PO ₄ 0.2-0.8 g / l; K ₂ HPO ₄ - 0.5-2.0 g / l; MnSO ₄ - 0.0005-0.005 g / l; ZnSO ₄ -0.0005-0.005 g / l; dry enzymatic peptone - 0.5-2.0 g / l; starch - 5.0-15.0 g / l; sodium succinate 5.0-12.0 g / l; agar-agar 1% -3%. Then the culture is sterilized transferred to rocking flasks with a volume of 1000 ml, in the amount of 6 pieces, where the liquid nutrient medium described above is prepared without adding agar-agar. The cultivation of mycelium is carried out on a rocking chair at 150-190 rpm and a temperature of 23-28 ° C, a pH of 5.8-6.2 for 3-5 days, provided by the buffer system. Then, from 6 flasks, the grown seed in the form of small globules is sterile transferred to a biocultivator with a working volume of 65 l. In the B65AMC-01 biocultivator, the nutrient medium is pre-sterilized at 0.5 atm for 50-70 min, consisting of MgSO ₄ - 0.2-0.8 g / l; KH ₂ PO ₄ 0.2-0.8 g / l; K ₂ HPO ₄ - 0.5-2.0 g / l; MnSO ₄ - 0.0005-0.005 g / l; ZnSO ₄ -0.0005-0.005 g / l; dry enzymatic peptone - 0.5-2.0 g / l; starch - 5.0-15.0 g / l; sodium succinate 5.0-12.0 g / l. The cultivation process proceeds for 80-96 hours during the rotation of the paddle mixer, driven by an asynchronous motor. The rotation of the stirrer corresponds to 35-45 rpm. At the initial stage, during 18-20 hours of growing mycelial mass, a decrease in the viscosity of the medium is observed due to the fermentation of starch. The yield of dry biomass of the fungus is 20-25 g / l from the nutrient medium.

Claims

A method of producing liquid mycelium by deep cultivation of the fungus Pleurotus ostreatus in a nutrient medium followed by separation of biomass, characterized in that the cultivation process is carried out on a low viscosity liquid nutrient medium containing MgSO ₄ 0.2-0.8 g / l, KH ₂ PO ₄ 0.2-0.8 g / l, K ₂ HPO ₄ 0.5-2.0 g / l, MnSO ₄ 0.0005-0.005 g / l, ZnSO ₄ 0.0005-0.005 g / l, dry peptone enzymatic 0.5-2.0 g / l, starch 5.0-15.0 g / l, sodium succinate 5.0-12.0 g / l.