RU2496871C1

RU2496871C1 - Method to extract stem cells from bone marrow for intravascular introduction

Info

Publication number: RU2496871C1
Application number: RU2012134097/10A
Authority: RU
Inventors: Александр Сергеевич Немков; Сергей Алексеевич Белый; Сергей Владимирович Осутин
Original assignee: Сергей Владимирович Осутин
Priority date: 2012-08-09
Filing date: 2012-08-09
Publication date: 2013-10-27

Abstract

FIELD: biotechnologies.

SUBSTANCE: method is proposed to extract stem cells, including whirling of heparinised bone marrow with hydroxyethyl starch at the ratio of source ingredients of 1:2 with speed of 700g for 15 min. in the closed system of three haematological containers connected to each other with tubes with subsequent removal of fat admixtures and plasma into the container No.1, transfer of the mononuclear fraction of bone marrow, a part of supernatant and erythrocytes adjoining the interface of two media into the container No.2. Sludged erythrocytes and bone fragments remain in the main container, whirling of the produced sample with the speed of 900g for 15 min. in the container No.2 to produce cell material for intravascular introduction, at the same time after the specified whirling a part of supernatant is removed into the container No.1 without unsealing of the system.

EFFECT: production of paracrine effect of bone marrow mononuclear cells and provision of safety.

1 tbl, 2 ex

Description

Изобретение относится к регенераторной терапии в области кардиологии, в частности к разработке способов сепарации костного мозга для получения максимального количества жизнеспособных стволовых клеток с целью внутрисосудистого введения для регенерации органа.The invention relates to regenerative therapy in the field of cardiology, in particular to the development of methods for bone marrow separation to obtain the maximum number of viable stem cells for intravascular administration for organ regeneration.

Выделение мононуклеарной фракции костного мозга (МФКМ) для экспериментальных целей известно с 1960-х гг. Именно в МФКМ обнаружены все известные до настоящего времени стволовые клетки человека, а именно: гемопоэтические стволовые клетки, мезенхимальные стволовые клетки, эндотелиальные стволовые клетки и другие. В течение последних лет МФКМ стали использовать для регенераторной терапии прежде всего в кардиологии. С 2002 года немецкие кардиологи (Strauer BE, Brehm M, Zeus Т et al. Repair of infarcted myocardium by autologous intracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in humans. Circ 2002; 106:1913-1918 Strauer BE, Brehm M, Zeus Т et al. Repair of infarcted myocardium by autologous intracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in humans. Circ 2002; 106:1913-1918) начали применять МФКМ для лечения кардиологических больных, преимущественно при инфаркте миокарда.Isolation of the bone marrow mononuclear fraction (BFMC) for experimental purposes has been known since the 1960s. It is in MFKM that all the human stem cells known to date have been discovered, namely: hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, endothelial stem cells and others. In recent years, MPCMs have been used for regenerative therapy primarily in cardiology. Since 2002, German cardiologists (Strauer BE, Brehm M, Zeus T et al. Repair of infarcted myocardium by autologous intracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in humans. Circ 2002; 106: 1913-1918 Strauer BE, Brehm M, Zeus T et al Repair of infarcted myocardium by autologous intracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in humans. Circ 2002; 106: 1913-1918) began to use IFCM for the treatment of cardiac patients, mainly with myocardial infarction.

Первое исследование по оценке регенераторной терапии с помощью МФКМ проведено в 2004 г. Германии. - TOPCARE-AMI (Transplantation Of Progenitor Cells And Regeneration Enhancement in Acute Myocardial Infarction) (2001-2003, Германия). Результаты исследования показали полезность использования МФКМ при лечении острого инфаркта миокарда: у больных улучшалась фракция изгнания, лучше восстанавливалась работа левого желудочка сердца. В 2010 году опубликованы результаты большого контролируемого исследования STAR-heart study: аутологичные мононуклеары костного мозга, полученные с помощью градиентного центрифугирования с фиколлом, вводились больным с сердечной недостаточностью с фракцией изгнания 35% и меньше. Через 5 лет отмечено улучшение показателей сократимости миокарда и выживаемость в исследовательской группе по сравнению с контролем (консервативное лечение без введения мононуклеаров) (Strauer B.E., Yousef M., Schannwell C.M. The acute and long-term effects of intracoronary Stem cell Transplantation in 191 patients with chronic heart failure: the STAR-heart study. European Journal of Heart Failure 2010. - V12. - p.721-729).The first study to evaluate regenerative therapy using IFCM was conducted in 2004 in Germany. - TOPCARE-AMI (Transplantation Of Progenitor Cells And Regeneration Enhancement in Acute Myocardial Infarction) (2001-2003, Germany). The results of the study showed the usefulness of using MFKM in the treatment of acute myocardial infarction: in patients the ejection fraction improved, the work of the left ventricle of the heart was better restored. In 2010, the results of a large controlled study STAR-heart study were published: autologous bone marrow mononuclear cells obtained by gradient centrifugation with ficoll were administered to patients with heart failure with an ejection fraction of 35% or less. After 5 years, there was an improvement in myocardial contractility and survival in the study group compared to the control (conservative treatment without the introduction of mononuclear cells) (Strauer BE, Yousef M., Schannwell CM The acute and long-term effects of intracoronary Stem cell Transplantation in 191 patients with chronic heart failure: the STAR-heart study. European Journal of Heart Failure 2010. - V12. - p. 721-729).

К 2011 году уже проведено более 30 пилотных и рандомизированных, плацебо контролируемых исследований. Наиболее значимые из них: MAGIC, BOOST, TOPCARE-AMI, REPAIR-AMI, ASTAMI, STAR-heart и другие. Результаты этих исследований в подавляющем большинстве свидетельствуют в пользу применения МФКМ для лечения кардиологических больных. Практически во все работах, посвященных клеточной терапии в кардиологии, выделение МФКМ проводилось с помощью фиколла.By 2011, more than 30 pilot and randomized, placebo-controlled trials had already been conducted. The most significant of them: MAGIC, BOOST, TOPCARE-AMI, REPAIR-AMI, ASTAMI, STAR-heart and others. The results of these studies overwhelmingly support the use of MPCM for the treatment of cardiac patients. In almost all works devoted to cell therapy in cardiology, the isolation of MFCM was carried out using ficoll.

Известен способ выделения стволовых клеток с помощью магнитного сортинга, который позволяет получить отдельные пулы стволовых клеток, к которым имеются моноклональные антитела с фиксированными на них атомами железа. Магнитный сортинг позволяет получить максимально чистые пулы клеток, что важно в научно-исследовательской работе. Однако для больных с тяжелым поражением органа, например сердца, важно получить максимально возможное число стволовых клеток, которые будут обеспечивать регенерацию не только кардиомиоцитов, но и сосудов проводящей системы сердца, элементов стромы и внеклеточного матрикса. Поэтому важно получение всего спектра стволовых клеток, которые задействованы в регенерации. Причем наиболее ранние стволовые клетки могут не иметь поверхностных маркеров, или они неизвестны, следовательно, эти стволовые клетки невозможно выделить методом магнитного сортинга.A known method for the isolation of stem cells using magnetic sorting, which allows you to get individual pools of stem cells to which there are monoclonal antibodies with iron atoms fixed on them. Magnetic sorting allows you to get the most pure pools of cells, which is important in research work. However, for patients with severe organ damage, such as the heart, it is important to obtain the maximum possible number of stem cells that will ensure the regeneration of not only cardiomyocytes, but also the vessels of the cardiac conduction system, stromal elements and extracellular matrix. Therefore, it is important to obtain the entire spectrum of stem cells that are involved in regeneration. Moreover, the earliest stem cells may not have surface markers, or they are unknown, therefore, these stem cells cannot be distinguished by magnetic sorting.

Известен способ выделения МФКМ с помощью желатина, который предполагает первичное осаждение эритроцитов с помощью указанных веществ в течение 1,5-3 часов без центрифугирования до образования тромбоцитарно-лейкоцитарной пленки (Инструкция по выделению, консервированию и применению лейкоцитарной массы. Москва, 1969), что существенно увеличивает время окончательного выделения МФКМ и делает практически невозможным одновременное проведение реваскуляризации миокарда и введение аутологичных клеток костного мозга (МФКМ) во время одной процедуры. Кроме того, раствор желатина - белковый продукт животного происхождения, на который описаны анафилактические реакции. (Б.А. Барышев. Кровезаменители. Справочник для врачей. СПб. 2001. - с.15-19).A known method for the isolation of MPCM using gelatin, which involves the primary deposition of red blood cells using these substances for 1.5-3 hours without centrifugation until the formation of platelet-leukocyte film (Instructions for the isolation, preservation and use of leukocyte mass. Moscow, 1969), which significantly increases the time of final isolation of MFKM and makes it almost impossible to simultaneously conduct myocardial revascularization and the introduction of autologous bone marrow cells (MFKM) during one procedure Ry. In addition, a gelatin solution is a protein product of animal origin, to which anaphylactic reactions are described. (B.A. Baryshev. Blood substitutes. Handbook for doctors. St. Petersburg. 2001. - p.15-19).

Применение способов-аналогов, в том числе с использованием ГЭК для выделения МФКМ, выявило существенные недостатки этих способов в виде больших потерь различных пулов стволовых клеток. Причем часть стволовых клеток, в том числе гематопоэтических, определена среди эритроцитов, располагающихся на разных уровнях под лейкоцитарно-лимфоцитарной пленкой. Эта часть, по нашим данным, составляет от 25 до 50% всех гемопоэтических стволовых клеток и именно эта часть клеток удаляется вместе с эритроцитами при использовании всех способов-аналогов и способа-прототипа выделения стволовых клеток. Все указанные выше способы-аналоги и способ-прототип использовались, чтобы подготовить стволовые клетки костного мозга для криоконсервации с последующим длительным хранением их до момента требования. Поэтому основное требование к ним было максимальное удаление эритроцитов, так как они резко ухудшают результаты криохранения образцов костного мозга. Однако, если выделяемые стволовые клетки предполагается не консервировать, а использовать этому же пациенту сразу после их выделения внутрисосудисто, то степень удаления эритроцитов из смеси МФКМ становится не принципиальной, а расположенные среди эритроцитов стволовые клетки, имеющие активные молекулы адгезии на своей поверхности, проходя через микроциркуляторное русло пораженного органа, эффективно фиксируются к эндотелию сосудов, проникают в ткани и обеспечивают в дальнейшем его регенерацию. Объем плазмы, который остается в предлагаемом способе вместе с МФКМ и частью эритроцитов, будет на порядок больше, чем в способах-аналогах и способе-прототипе, так как полученная взвесь клеток вводится внутрисосудисто. Принципиально важным при таком способе введения становится полное удаление жира, костных отломков и тромбов, так как это может привести к фатальной эмболии периферического русла сосудов.The use of analogue methods, including the use of HES to isolate MPCM, revealed significant disadvantages of these methods in the form of large losses of various stem cell pools. Moreover, part of the stem cells, including hematopoietic, is defined among red blood cells located at different levels under the leukocyte-lymphocytic film. This part, according to our data, makes up from 25 to 50% of all hematopoietic stem cells, and it is this part of the cells that is removed together with red blood cells using all analog methods and the prototype stem cell isolation method. All of the above analogue methods and the prototype method were used to prepare bone marrow stem cells for cryopreservation, followed by their long storage until the moment of requirement. Therefore, the main requirement for them was the maximum removal of red blood cells, since they sharply worsen the results of cryopreservation of bone marrow samples. However, if the stem cells to be secreted are not supposed to be preserved, but intravascular is used immediately after their isolation, then the degree of erythrocyte removal from the MPCM mixture becomes not essential, but the stem cells located among red blood cells having active adhesion molecules on their surface, passing through microcirculatory the channel of the affected organ is effectively fixed to the vascular endothelium, penetrates the tissues and ensures its further regeneration. The plasma volume that remains in the proposed method together with MPCM and part of the red blood cells will be an order of magnitude greater than in the analogue methods and the prototype method, since the obtained suspension of cells is injected intravascularly. Of fundamental importance with this method of administration is the complete removal of fat, bone fragments and blood clots, as this can lead to a fatal embolism of the peripheral blood vessels.

Наиболее близким по технической сущности является выделение мононуклеарной фракции крови и костного мозга по методу Boyum (Boyum A. Separation of leukocytes from blood and bone marrow // Scand. J. Clin. Lab. Investig. - 1968. - Vol.21 - Suppl.97, p.1-9). Принцип метода основан на различии в плавучей плотности форменных элементов крови. Смесь полисахарида фиколла и рентгеноконтрастного вещества изопак или верографин создает градиент плотности, который позволяет при центрифугировании разделить клетки периферической крови и костного мозга на мононуклеарную фракцию, в которую входят лимфоциты, моноциты и стволовые клетки, и фракцию, содержащую гранулоциты и эритроциты. Клетки мононуклеарной фракции обладают меньшей, чем фиколл, плотностью и располагаются над ним. Плотность эритроцитов больше и они проходят через фиколл, опускаясь на дно пробирки.The closest in technical essence is the allocation of the mononuclear fraction of blood and bone marrow according to the method of Boyum (Boyum A. Separation of leukocytes from blood and bone marrow // Scand. J. Clin. Lab. Investig. - 1968. - Vol.21 - Suppl. 97, p. 1-9). The principle of the method is based on the difference in the floating density of blood cells. A mixture of ficoll polysaccharide and isopack or verographin radiopaque substance creates a density gradient, which allows centrifugation to separate peripheral blood and bone marrow cells into a mononuclear fraction, which includes lymphocytes, monocytes and stem cells, and a fraction containing granulocytes and red blood cells. The cells of the mononuclear fraction have a lower density than ficoll and are located above it. The density of red blood cells is higher and they pass through the ficoll, dropping to the bottom of the tube.

Методика: мононуклеарную фракцию выделяют из гепаринизированного костного мозга (20 ME гепарина/мл для костного мозга). Костный мозг разводят физиологическим раствором (рН 7,2) в соотношении 1:5. Разведенный костный мозг центрифугируют в градиенте плотности фиколл-верографин, плотность 1,077 г/мл (Хейфиц Л.Б., Абалкин В.А. Разделение форменных элементов крови человека в градиенте плотности верографин-фиколл // Лаб. дело, 1973. - 10. - С.579-581) при 400g в течение 30 мин в специальной пробирке с пробкой. Полученную путем забора стерильной пипеткой мононуклеарную фракцию трижды отмывают в ЗФФР (физиологический раствор, забуференный с помощью фосфатно-солевого буфера) и ресуспендируют в среде RPMI-1640 (Flow Laboratories, Англия) в концентрации 10⁶ клеток в 1 мл. Жизнеспособность клеток, определяемая по методу окрашивания с трипановым синим, не превышает 96%. Для обеспечения стерильности такой открытой системы все манипуляции с клеточным материалом проводят в специально оборудованных стерильных помещениях.Methodology: the mononuclear fraction is isolated from heparinized bone marrow (20 IU heparin / ml for bone marrow). The bone marrow is diluted with saline (pH 7.2) in a ratio of 1: 5. Diluted bone marrow is centrifuged in a density gradient of ficoll-verographin, density 1.077 g / ml (Kheifits L.B., Abalkin V.A. Separation of human blood cells in the density gradient of verographin-ficoll // Lab. Delo, 1973.- 10. - S.579-581) at 400g for 30 min in a special tube with a stopper. The mononuclear fraction obtained by sterile pipetting is washed three times in PBS (physiological saline buffered with phosphate-buffered saline) and resuspended in RPMI-1640 medium (Flow Laboratories, England) at a concentration of 10 ⁶ cells in 1 ml. Cell viability, determined by the method of staining with trypan blue, does not exceed 96%. To ensure the sterility of such an open system, all manipulations with cellular material are carried out in specially equipped sterile rooms.

К недостаткам способа можно отнести следующие.The disadvantages of the method include the following.

1. Невозможно соблюдение полной стерильности, учитывая негерметичность системы.1. It is impossible to maintain complete sterility, given the leaks of the system.

Исходно этот способ был предложен для лабораторных исследований. В исследовании ASTAMI имел место 1 случай сепсиса из-за инфицирования материала в процессе выделения АМКМ.Initially, this method was proposed for laboratory research. In the ASTAMI study, there was 1 case of sepsis due to infection of the material during the isolation of AMKM.

2. Использование токсичных реактивов вынуждает троекратно отмывать полученную МФКМ в физиологическом растворе перед использованием у пациентов, что не гарантирует полного отмывания и не гарантирует отсутствия негативного влияния токсичных веществ на потенциальные способности стволовых клеток.2. The use of toxic reagents forces three times washing the obtained MFCM in physiological saline before use in patients, which does not guarantee complete laundering and does not guarantee the absence of negative effects of toxic substances on the potential abilities of stem cells.

3. Одновременно при отмывке происходит удаление полезных продуктов стволовых клеток костного мозга - факторов роста, цитокинов, хемокинов, которые играют положительную роль для регенерации тканей.3. At the same time, washing removes the useful products of bone marrow stem cells - growth factors, cytokines, chemokines, which play a positive role for tissue regeneration.

4. Выделенные с помощью фиколла стволовые клетки производят колонии, образующие единицы в среде альфа-МЭМ хуже, чем стволовые клетки, выделенные другими способами, т.е. они теряют часть своих потенциальных возможностей, которые в дальнейшем важны для регенерационной терапии.4. Stem cells isolated using ficoll produce colonies that form units in alpha-MEM medium worse than stem cells isolated by other methods, ie they lose part of their potential capabilities, which are subsequently important for regenerative therapy.

5. Достаточно трудоемкий метод; на выделение стволовых клеток уходит от 3 до 5 часов и требуется достаточно опытный персонал, так как даже минимальное нарушение технологии выделения приводит к потери практически всех стволовых клеток.5. A rather laborious method; stem cell isolation takes from 3 to 5 hours and requires quite experienced personnel, since even a minimal violation of the isolation technology leads to the loss of almost all stem cells.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа выделения максимального количества жизнеспособных стволовых клеток из костного мозга в закрытой (стерильной) системе без применения токсичных веществ для внутрисосудистого введения полученного клеточного материала.The present invention is to develop a method for isolating the maximum number of viable stem cells from the bone marrow in a closed (sterile) system without the use of toxic substances for intravascular administration of the obtained cellular material.

Технический результат заключается в увеличении количества жизнеспособных стволовых клеток костного мозга при осуществлении разработанного способа, а также усиления кровоснабжения и регенерации органов и тканей при внутрисосудистом введении.The technical result consists in increasing the number of viable bone marrow stem cells during the implementation of the developed method, as well as increasing blood supply and regeneration of organs and tissues with intravascular administration.

Разработанный способ обеспечивает использование паракринного эффекта мононуклеаров костного мозга и безопасность внутрисосудистого введения полученного клеточного материала.The developed method ensures the use of the paracrine effect of bone marrow mononuclear cells and the safety of intravascular administration of the obtained cellular material.

В предлагаемом способе не используются токсичные вещества для выделения МФКМ. Гидроксиэтилкрахмал - один из широко используемых кровезаменителей (9).The proposed method does not use toxic substances for the allocation of MPCM. Hydroxyethyl starch is one of the widely used blood substitutes (9).

Все факторы роста, цитокины и хемокины, продуцируемые клетками, входящими в состав мононуклеарной фракции, при использовании предлагаемого способа сохраняются и в дальнейшем вводятся вместе с полученным клеточным материалом. Жизнеспособность стволовых клеток в предлагаемом способе - 98% и выше, что также говорит о наиболее щадящем режиме выделения стволовых клеток (в прототипе этот показатель не выше 96%). Применение предлагаемого способа выделения стволовых клеток из костного мозга для внутрисосудистого введения позволяет избежать потерь стволовых клеток или они сведены к минимуму. Система остается замкнутой в течение всего периода выделения МФКМ, что обеспечивает полную стерильность на всех этапах выделения.All growth factors, cytokines and chemokines produced by cells that are part of the mononuclear fraction, when using the proposed method are stored and subsequently introduced together with the obtained cellular material. The viability of stem cells in the proposed method is 98% and higher, which also indicates the most sparing mode of stem cell isolation (in the prototype, this indicator is not higher than 96%). The use of the proposed method for the isolation of stem cells from bone marrow for intravascular administration avoids the loss of stem cells or they are minimized. The system remains closed during the entire period of MFKM isolation, which ensures complete sterility at all stages of isolation.

Сущность способа заключается в следующем.The essence of the method is as follows.

Костный мозг, полученный в операционной при пункции плоских костей (грудины, подвздошных костей) в объеме 140 мл, стабилизированный с помощью раствора гепарина (15-30 ед на 1 мл костного мозга) в стерильных условиях вводится в основной пластиковый гематологический контейнер, соединенный трубками с двумя контейнерами №1 и №2; в него добавляется Гидроксиэтилкрахмал в объеме 1:2. Система герметизируется в операционной. На первом этапе проводится центрифугирование указанной взвеси с ускорением 700g в течение 15 мин, после чего с помощью фракционатора медицинского компонентов крови проводится удаление примесей жира и плазмы в контейнер №1, а МФКМ, часть супернатанта и эритроцитов, примыкающих к линии разделения 2-х сред, переводится в контейнер-спутник №2. При этом в основном контейнере остаются сладжированные эритроциты и костные фрагменты. На втором этапе для редукции полученного объема проводят второе центрифугирование клеточной взвеси в режиме 900g в течение 15 мин для получения окончательного объема суспензии (60 мл), для этого после центрифугирования удаляют часть супернатанта в контейнер №1. Таким образом, от момента эксфузии костного мозга и герметизации его в операционной до момента введения клеточного материала в сосудистое русло пациента сохраняется стерильность полученного образца. В конце процедуры выделения блокируются (запаиваются) трубки, соединяющие основной контейнер с контейнерами №1 и №2. Для внутрисосудистого введения используется клеточный материал из контейнера №2.The bone marrow obtained in the operating room during puncture of flat bones (sternum, iliac bones) in a volume of 140 ml, stabilized with a heparin solution (15-30 units per 1 ml of bone marrow) is introduced into sterile conditions into the main plastic hematological container, connected by tubes with two containers No. 1 and No. 2; Hydroxyethyl starch is added to it in a volume of 1: 2. The system is sealed in the operating room. At the first stage, the indicated suspension is centrifuged with an acceleration of 700g for 15 min, after which the impurities of fat and plasma are removed using the fractionator of the medical blood components in container No. 1, and the MPCM, part of the supernatant and red blood cells adjacent to the separation line of 2 media , is transferred to satellite container No. 2. At the same time, in the main container, slugged red blood cells and bone fragments remain. At the second stage, to reduce the obtained volume, a second centrifugation of the cell suspension is carried out in the 900g mode for 15 min to obtain the final suspension volume (60 ml); for this, a part of the supernatant is removed into the container No. 1 after centrifugation. Thus, from the moment of bone marrow exfusion and its sealing in the operating room until the introduction of cellular material into the patient’s vascular bed, the obtained sample remains sterile. At the end of the isolation procedure, tubes connecting the main container with containers No. 1 and No. 2 are blocked (sealed). For intravascular administration, cellular material from container No. 2 is used.

ПРИМЕР ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ СПОСОБАEXAMPLE OF IMPLEMENTATION OF THE METHOD

Костный мозг, полученный в операционной при пункции плоских костей (грудины, подвздошных костей) в объеме 140 мл, стабилизированный с помощью раствора гепарина (25-30 ед на 1 мл костного мозга), вводится в основной пластиковый гематологический контейнер, соединенный трубками с двумя контейнерами №1 и №2; в него добавляется 6% гидроксиэтилкрахмал в объеме 1:2 (1 часть гидроксиэтилкрахмала и 2 части костного мозга). Система герметизируется в операционной. Проводится центрифугирование указанной взвеси с ускорением 700g в течение 15 мин, после чего с помощью фракционатора медицинского компонентов крови проводится удаление примесей жира и плазмы в контейнер №1, а мононуклеарную фракцию костного мозга, часть супернатанта и эритроцитов, примыкающих к линии разделения двух сред, переводится в контейнер №2, при этом в основном контейнере остаются сладжированные эритроциты и костные фрагменты. Для окончательного выделения МФКМ с оставлением необходимого объема плазмы (60 мл) необходимо второе центрифугирование клеточной взвеси в режиме 900g в течение 15 мин. В конце процедуры выделения блокируются (запаиваются) трубки, соединяющие основной контейнер с контейнерами. Для исследования клеточности полученного материала часть его (2 мл) может быть отдельно запаяна в ближайшей части одной из соединительных трубок. Таким образом, контрольная проба может быть взята на исследование без вскрытия основного контейнера, что является дополнительным положительным элементом предлагаемого способа. Для внутрисосудистого введения используется клеточный материал из контейнера №2. Разработанный способ выделения МФКМ подходит только для внутрисосудистого введения в любой орган при аутологичном использовании: в сердце, в печень, в почки. Возможен не только внутриартериальный способ введения, но и внутривенный, например, через пупочную вену в систему воротной вены печени.The bone marrow obtained in the operating room during puncture of flat bones (sternum, ilium) in a volume of 140 ml, stabilized with a heparin solution (25-30 units per 1 ml of bone marrow), is introduced into the main plastic hematological container, connected by tubes with two containers No. 1 and No. 2; 6% hydroxyethyl starch is added to it in a volume of 1: 2 (1 part hydroxyethyl starch and 2 parts of bone marrow). The system is sealed in the operating room. This suspension is centrifuged with an acceleration of 700g for 15 minutes, after which the impurities of fat and plasma are removed using the fractionator of the medical components of blood into container No. 1, and the mononuclear fraction of the bone marrow, part of the supernatant and red blood cells adjacent to the separation line of the two media, is transferred into container No. 2, while in the main container, slugged red blood cells and bone fragments remain. For the final isolation of MFKM with the necessary plasma volume (60 ml) remaining, a second centrifugation of the cell suspension in the 900g mode for 15 min is necessary. At the end of the isolation procedure, the tubes connecting the main container to the containers are blocked (sealed). To study the cellularity of the obtained material, a part of it (2 ml) can be separately sealed in the nearest part of one of the connecting tubes. Thus, a control sample can be taken for examination without opening the main container, which is an additional positive element of the proposed method. For intravascular administration, cellular material from container No. 2 is used. The developed method for the isolation of MPKM is suitable only for intravascular injection into any organ during autologous use: in the heart, liver, and kidneys. Not only an intra-arterial route of administration is possible, but also intravenous, for example, through the umbilical vein into the portal portal vein system of the liver.

Ограничения: данный способ не подходит для целей консервации стволовых клеток, для интрамиокардиального введения полученной взвеси МФКМ, для целей аллогенной трансплантации.Limitations: this method is not suitable for the purpose of preservation of stem cells, for intramyocardial administration of the obtained suspension of MFKM, for the purpose of allogeneic transplantation.

Оценка количества ядросодержащих клеток, количества мононуклеаров, количества стволовых гемопоэтических клеток (CD34+) с помощью проточной цитофлюориметрии в пробах при сравнительном выделении мононуклеаров с помощью предлагаемого способа и способа-прототипа показали сопоставимость полученных результатов, причем показатели по цитозу, количеству мононуклеаров и количеству гематопоэтических клеток оказалось лучше в предлагаемом способе (таблица 1), при этом время, затраченное на выделение МФКМ, с помощью способа-прототипа составило от 3 до 4 ч, а с помощью предлагаемого способа - 45 мин.Evaluation of the number of nucleated cells, the number of mononuclear cells, the number of stem hematopoietic cells (CD34 +) using flow cytofluorimetry in the samples with the comparative isolation of mononuclear cells using the proposed method and the prototype method showed the comparability of the results, and the cytosis, the number of mononuclear cells and the number of hematopoietic cells turned out to be better in the proposed method (table 1), while the time spent on the allocation of MFKM using the prototype method was 3 up to 4 hours, and using the proposed method - 45 minutes

Пациент Н. и/б №17140 с/оPatient N. and / b No. 17140 s / o ПрототипPrototype Предлагаемый способThe proposed method Количество ядросодержащих клеток (в 1 л)The number of nucleated cells (in 1 l) 18,2×10⁹ 18.2 × 10 ⁹ 28,4×10⁹ 28.4 × 10 ⁹ Количество мононуклеаров (в 1 л)The number of mononuclear cells (in 1 l) 3,36×10⁹(18,5%)3.36 × 10 ⁹ (18.5%) 6,5×10⁹(22,8%)6.5 × 10 ⁹ (22.8%) Количество CD 34+(в 1 л)The number of CD 34+ (in 1 l) 1,1×10⁷ (0,6%)1.1 × 10 ⁷ (0.6%) 2,6×10⁷ (0,8%)2.6 × 10 ⁷ (0.8%) Абсолютное число клеток CD34+ в 50 мл взвесиThe absolute number of CD34 + cells in 50 ml of suspension 5,5×10⁶ 5.5 × 10 ⁶ 13×10⁶ 13 × 10 ⁶ ЖизнеспособностьViability 96%96% 98%98% Пациент П. и/б №18131 с/оPatient P. and / b No. 18131 s / o прототипprototype Предлагаемый способThe proposed method Количество ядросодержащих клеток (в 1 л)The number of nucleated cells (in 1 l) 9,36×10⁹ 9.36 × 10 ⁹ 10,1×10⁹ 10.1 × 10 ⁹ Количество мононуклеаров (в 1 л)The number of mononuclear cells (in 1 l) 1,05×10⁹(11,23%)1.05 × 10 ⁹ (11.23%) 1,28×10⁹(12,76%)1.28 × 10 ⁹ (12.76%) Количество CD34+ (в 1 л)The number of CD34 + (in 1 l) 3,1×10⁷(0,3%)3.1 × 10 ⁷ (0.3%) 6,6×10⁷(0,61%)6.6 × 10 ⁷ (0.61%) Абсолютное число клеток CD34+ в 50 мл взвесиThe absolute number of CD34 + cells in 50 ml of suspension 1,5×10⁶ 1.5 × 10 ⁶ 3,3×10⁶ 3.3 × 10 ⁶ ЖизнеспособностьViability 95%95% 100%one hundred%

КЛИНИЧЕСКИЕ ПРИМЕРЫ.CLINICAL EXAMPLES

Пример 1. Больной В. 68 лет (и/б №17821 с/о). В 2001 году больному выполнена операция: аорто-коронарное шунтирование. В 2004 году в связи с рецидивом стенокардии была выполнена внутрикоронарная трансплантация МФКМ для целей регенерации микроциркулярного русла коронарных артерий. Выделение МФКМ осуществлялось вышеописанным способом. Через 1 год отмечено отчетливое уменьшение зоны недостаточного кровоснабжения левого желудочка по данным однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (ОФЭКТ); при этом имело место отчетливое улучшение клинического состояния: уменьшилось количество приступов стенокардии напряжения, исчезли приступы стенокардии в покое, улучшилась толерантность к физической нагрузке. Пациент перешел из IV во II функциональный класс стенокардии напряжения. Улучшение продолжается в течение 3 лет наблюдения.Example 1. Patient B., 68 years old (and / b No. 17821 s / o). In 2001, the patient underwent surgery: coronary artery bypass grafting. In 2004, in connection with a relapse of angina pectoris, IFCM intracoronary transplantation was performed for the regeneration of the microvasculature of the coronary arteries. The allocation of MFKM was carried out as described above. After 1 year, a marked decrease in the zone of insufficient blood supply to the left ventricle was observed according to single photon emission computed tomography (SPECT); at the same time, there was a distinct improvement in the clinical condition: the number of angina attacks decreased, angina attacks at rest disappeared, and exercise tolerance improved. The patient moved from IV to II functional class of angina pectoris. Improvement continues for 3 years of observation.

Пример 2. Больной Ж. История болезни №1831 с/о 2004 г. Страдал ишемической болезнью сердца в течение 5 лет. При госпитализации имел III функциональный класс стенокардии напряжения. При ОФЭКТ выявлена зона гипоперфузии миокарда. При коронарографии обнаружена окклюзия огибающей коронарной артерии. Выполнить коронарную ангиопластику невозможно из-за окклюзии на большом протяжении. Во время коронарографии выполнено введение МФКМ в левую коронарную артерию (40 мл) и 20 мл в правую коронарную артерию. Процедуру больной перенес хорошо. Каких-либо изменений терапии или других процедур не было. Через 6 мес. существенно уменьшились приступы стенокардии напряжения, они возникают только при большой физической нагрузке. Контрольная ОФЭКТ выявила существенное улучшение перфузии миокарда.Example 2. Patient J. Case history No. 1831 s / o 2004, suffered from coronary heart disease for 5 years. During hospitalization, he had III functional class of exertional angina. SPECT revealed a zone of myocardial hypoperfusion. Coronarography revealed occlusion of the envelope of the coronary artery. It is impossible to perform coronary angioplasty due to long-term occlusion. During coronary angiography, IFCM was introduced into the left coronary artery (40 ml) and 20 ml into the right coronary artery. The patient tolerated the procedure well. There were no changes in therapy or other procedures. After 6 months Attacks of angina pectoris have significantly decreased, they occur only with great physical exertion. Control SPECT revealed a significant improvement in myocardial perfusion.

Всего к 1 сентября 2011 года 170 больным выполнено введение МФКМ в коронарное русло. Осложнений не было. Клинически положительный результат подтвердился в виде уменьшения функционального класса стенокардии и сердечной недостаточности отмечают 97% больных. Инструментальное подтверждение уменьшения площади критической ишемии миокарда при оценке с помощью позитронно-эмиссионной томографии и однофотонной эмиссионной компьютерной томографии при наблюдении в динамике получено у 90% больных. У всех больных с хронической сердечной недостаточностью по данным эхокардиографии отмечалось улучшение сократительной способности миокарда. Эти данные показывают, что эффект внутрисосудистого введения МФКМ связан с усилением процессов кровоснабжения и регенерации в миокарде. Через 1 год положительный эффект сохраняется у 80% больных, через 5 лет - более чем у 60% больных.In total, by September 1, 2011, 170 patients had completed the introduction of MFKM into the coronary bed. There were no complications. A clinically positive result was confirmed in the form of a decrease in the functional class of angina pectoris and heart failure observed in 97% of patients. Instrumental confirmation of the decrease in the area of critical myocardial ischemia when assessed using positron emission tomography and single-photon emission computed tomography when observed in dynamics was obtained in 90% of patients. According to echocardiography, all patients with chronic heart failure showed an improvement in myocardial contractility. These data show that the effect of intravascular administration of MFKM is associated with increased blood supply and regeneration in the myocardium. After 1 year, a positive effect persists in 80% of patients, after 5 years - in more than 60% of patients.

Claims

A method for isolating stem cells from bone marrow for intravascular administration, including centrifugation of heparinized bone marrow, characterized in that the selection of stem cells is carried out in two stages, at the first stage, centrifugation of heparinized bone marrow with hydroxyethyl starch is performed in the ratio of the starting ingredients 1: 2 at a speed of 700g in for 15 minutes, while centrifugation is carried out in a closed system of three hematological containers, interconnected by tubes with after by removing fat and plasma impurities into container No. 1, the mononuclear fraction of the bone marrow, part of the supernatant and erythrocytes adjacent to the separation line of the two media is transferred to container No. 2, while the erythrocytes and bone fragments remain in the main container, the second stage is carried out by centrifugation the resulting sample at a speed of 900g for 15 min in a container No. 2 to obtain cellular material for intravascular administration, while after the centrifugation part of the supernatant is removed in Nteiner No. 1 without depressurization of the system.