RU2647429C1 - Biomedical cell preparation - Google Patents
Biomedical cell preparation Download PDFInfo
- Publication number
- RU2647429C1 RU2647429C1 RU2017103692A RU2017103692A RU2647429C1 RU 2647429 C1 RU2647429 C1 RU 2647429C1 RU 2017103692 A RU2017103692 A RU 2017103692A RU 2017103692 A RU2017103692 A RU 2017103692A RU 2647429 C1 RU2647429 C1 RU 2647429C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- patient
- cell
- stem cells
- blood
- Prior art date
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 111
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 claims abstract description 50
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 claims abstract description 50
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 42
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 30
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 16
- 102100031585 ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 101000777636 Homo sapiens ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 10
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 claims abstract description 5
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 claims abstract description 5
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 21
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 18
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 10
- BDLFEAFWNOROAK-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(hydroxymethyl)-4-methylphenol Chemical compound CC1=CC=C(O)C(CO)=C1CO BDLFEAFWNOROAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 7
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 abstract description 7
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 abstract description 7
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 abstract description 5
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 abstract description 5
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 238000011338 personalized therapy Methods 0.000 abstract description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 abstract 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 abstract 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 31
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 24
- 239000000306 component Substances 0.000 description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 description 22
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 16
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 14
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 14
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 13
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 12
- 239000000463 material Substances 0.000 description 12
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 11
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 11
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 9
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 9
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 9
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 9
- 102000036693 Thrombopoietin Human genes 0.000 description 8
- 108010041111 Thrombopoietin Proteins 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 102100032528 C-type lectin domain family 11 member A Human genes 0.000 description 7
- 101710167766 C-type lectin domain family 11 member A Proteins 0.000 description 7
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 7
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 7
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 description 7
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 7
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 7
- 239000012217 radiopharmaceutical Substances 0.000 description 7
- 229940121896 radiopharmaceutical Drugs 0.000 description 7
- 230000002799 radiopharmaceutical effect Effects 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 5
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 5
- 238000000575 proteomic method Methods 0.000 description 5
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 5
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 5
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 4
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 4
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 4
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 4
- PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N ionomycin Chemical compound O1[C@H](C[C@H](O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)/C=C/C[C@@H](C)C[C@@H](C)C(/O)=C/C(=O)[C@@H](C)C[C@@H](C)C[C@@H](CCC(O)=O)C)CC[C@@]1(C)[C@@H]1O[C@](C)([C@@H](C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N 0.000 description 4
- PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N ionomycin Natural products O1C(CC(O)C(C)C(O)C(C)C=CCC(C)CC(C)C(O)=CC(=O)C(C)CC(C)CC(CCC(O)=O)C)CCC1(C)C1OC(C)(C(C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 102100039502 E3 ubiquitin-protein ligase RNF34 Human genes 0.000 description 3
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 3
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 3
- 101001103581 Homo sapiens E3 ubiquitin-protein ligase RNF34 Proteins 0.000 description 3
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 3
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 3
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 3
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 238000011222 transcriptome analysis Methods 0.000 description 3
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 description 3
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 description 2
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 2
- 201000006935 Becker muscular dystrophy Diseases 0.000 description 2
- 208000037663 Best vitelliform macular dystrophy Diseases 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 2
- 102100020715 Fms-related tyrosine kinase 3 ligand protein Human genes 0.000 description 2
- 101710162577 Fms-related tyrosine kinase 3 ligand protein Proteins 0.000 description 2
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 2
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 2
- 108010062867 Lenograstim Proteins 0.000 description 2
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 2
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 2
- BPEGJWRSRHCHSN-UHFFFAOYSA-N Temozolomide Chemical compound O=C1N(C)N=NC2=C(C(N)=O)N=CN21 BPEGJWRSRHCHSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 2
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 2
- 230000002435 cytoreductive effect Effects 0.000 description 2
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 2
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 2
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 102220240796 rs553605556 Human genes 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 229960004964 temozolomide Drugs 0.000 description 2
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- 208000020938 vitelliform macular dystrophy 2 Diseases 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MWWPXANGCUTKTQ-ZJOUEHCJSA-N (4s)-4-amino-5-[[(2r)-1-(carboxymethylamino)-3-[2-[[(2s)-2,5-diaminopentanoyl]amino]-4-methoxy-5-[(1-methylpiperidin-4-yl)carbamoyl]phenyl]sulfanyl-1-oxopropan-2-yl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound COC1=CC(NC(=O)[C@@H](N)CCCN)=C(SC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O)C=C1C(=O)NC1CCN(C)CC1 MWWPXANGCUTKTQ-ZJOUEHCJSA-N 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- ZKTPOUXCUHYLDZ-SAYNGHPTSA-N C(CCCC[C@@H]1SC[C@@H]2NC(=O)N[C@H]12)(=O)NCCCCNC(=O)C1CCC(CC1)CN1C(C=CC1=O)=O Chemical group C(CCCC[C@@H]1SC[C@@H]2NC(=O)N[C@H]12)(=O)NCCCCNC(=O)C1CCC(CC1)CN1C(C=CC1=O)=O ZKTPOUXCUHYLDZ-SAYNGHPTSA-N 0.000 description 1
- 102000013925 CD34 antigen Human genes 0.000 description 1
- 108050003733 CD34 antigen Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 1
- 101001052849 Homo sapiens Tyrosine-protein kinase Fer Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 239000007760 Iscove's Modified Dulbecco's Medium Substances 0.000 description 1
- 102100020880 Kit ligand Human genes 0.000 description 1
- 101710177504 Kit ligand Proteins 0.000 description 1
- NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N Lidocaine Chemical compound CCN(CC)CC(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100335081 Mus musculus Flt3 gene Proteins 0.000 description 1
- NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N N-[2-oxo-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010014608 Proto-Oncogene Proteins c-kit Proteins 0.000 description 1
- 102000016971 Proto-Oncogene Proteins c-kit Human genes 0.000 description 1
- 108090000873 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000004278 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108700003596 S-(2-ornithylamino-4-methoxy-5-(1'-methyl-4'-piperidylamino)carboxyphenyl)glutathione Proteins 0.000 description 1
- 206010039580 Scar Diseases 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 102100024537 Tyrosine-protein kinase Fer Human genes 0.000 description 1
- 206010063661 Vascular encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 239000002269 analeptic agent Substances 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 210000000702 aorta abdominal Anatomy 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- FNVBALFTMLKFEC-UHFFFAOYSA-N bis(4-methyl-2-oxochromen-7-yl) phosphono phosphate Chemical compound CC1=CC(=O)OC2=CC(OP(=O)(OC3=CC=4OC(=O)C=C(C=4C=C3)C)OP(O)(O)=O)=CC=C21 FNVBALFTMLKFEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 210000001959 bmcp Anatomy 0.000 description 1
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000013276 bronchoscopy Methods 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 239000012560 cell impurity Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 208000015114 central nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000005056 compaction Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 1
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000011500 cytoreductive surgery Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002692 epidural anesthesia Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000000763 evoking effect Effects 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000000004 hemodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 210000002758 humerus Anatomy 0.000 description 1
- 210000003692 ilium Anatomy 0.000 description 1
- 210000001621 ilium bone Anatomy 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000013394 immunophenotyping Methods 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 1
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000007914 intraventricular administration Methods 0.000 description 1
- 239000002555 ionophore Substances 0.000 description 1
- 230000000236 ionophoric effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- UWKQSNNFCGGAFS-XIFFEERXSA-N irinotecan Chemical compound C1=C2C(CC)=C3CN(C(C4=C([C@@](C(=O)OC4)(O)CC)C=4)=O)C=4C3=NC2=CC=C1OC(=O)N(CC1)CCC1N1CCCCC1 UWKQSNNFCGGAFS-XIFFEERXSA-N 0.000 description 1
- 229960004768 irinotecan Drugs 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 229960004194 lidocaine Drugs 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000002690 local anesthesia Methods 0.000 description 1
- 238000009593 lumbar puncture Methods 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000037841 lung tumor Diseases 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010309 neoplastic transformation Effects 0.000 description 1
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 230000008816 organ damage Effects 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011458 pharmacological treatment Methods 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 210000003281 pleural cavity Anatomy 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 229960005205 prednisolone Drugs 0.000 description 1
- OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N prednisolone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003238 somatosensory effect Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000002693 spinal anesthesia Methods 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 238000013125 spirometry Methods 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 210000001562 sternum Anatomy 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 210000002330 subarachnoid space Anatomy 0.000 description 1
- 210000001321 subclavian vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000011491 transcranial magnetic stimulation Methods 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
- 230000003202 urodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
- A61K33/14—Alkali metal chlorides; Alkaline earth metal chlorides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/15—Cells of the myeloid line, e.g. granulocytes, basophils, eosinophils, neutrophils, leucocytes, monocytes, macrophages or mast cells; Myeloid precursor cells; Antigen-presenting cells, e.g. dendritic cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2121/00—Preparations for use in therapy
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к получению биомедицинского клеточного препарата (БМКП) гемопоэтических стволовых клеток и может быть использовано для протеом-основанной персонифицированной терапии первичных и метастатических опухолей головного мозга и востребован в терапии ряда неврологических заболеваний.The invention relates to the production of a biomedical cell preparation (BMPC) of hematopoietic stem cells and can be used for proteome-based personalized therapy of primary and metastatic brain tumors and is in demand in the treatment of a number of neurological diseases.
Известен клеточный препарат, содержащий аутологичные гемопоэтические стволовых клетки экспрессирующие антиген SV40 (см. RU №2216336, МПК А61K 35/48, А61Р 25/00, 2003).Known cell preparation containing autologous hematopoietic stem cells expressing the SV40 antigen (see RU No. 2216336, IPC A61K 35/48, A61P 25/00, 2003).
Недостаток этого решения - использование стволовых клеток, изъятых у пациента при пункции костного мозга, что является травматичным для пациента и достаточно трудным для медперсонала.The disadvantage of this solution is the use of stem cells taken from the patient during bone marrow puncture, which is traumatic for the patient and difficult enough for the medical staff.
Известен также биомедицинский клеточный препарат (БМКП), содержащий криоконсервированный антиген CD34+ после размораживания (см. RU №2283119, МПК А61K 35/14, А61Р 25/00, 2006).Also known is a biomedical cell preparation (BMPC) containing the cryopreserved CD34 + antigen after thawing (see RU No. 2283119, IPC A61K 35/14, A61P 25/00, 2006).
Биомедицинский клеточный препарат предназначен для лечения травматической болезни центральной нервной системы и не может быть использован для протеом-основанной персонифицированной терапии первичных и метастатических опухолей головного мозга.A biomedical cell preparation is intended for the treatment of a traumatic disease of the central nervous system and cannot be used for proteome-based personified therapy of primary and metastatic brain tumors.
Задачей, на решение которой направлено предлагаемое техническое решение, является обеспечение возможности использования биомедицинского клеточного препарата для протеом-основанной персонифицированной терапии первичных и метастатических опухолей головного мозга.The task to which the proposed technical solution is directed is to enable the use of a biomedical cell preparation for proteome-based personified therapy of primary and metastatic brain tumors.
Технический результат, получаемый при решении поставленной задачи, выражается в обеспечении возможности использования биомедицинского клеточного препарата для протеом-основанной персонифицированной терапии первичных и метастатических опухолей головного мозга и возможности использования препарата в терапии ряда неврологических заболеваний.The technical result obtained in solving this problem is expressed in providing the possibility of using a biomedical cell preparation for proteome-based personified therapy of primary and metastatic brain tumors and the possibility of using the drug in the treatment of a number of neurological diseases.
Поставленная задача решается тем, что биомедицинский клеточный препарат, содержащий криоконсервированный антиген CD34+ после размораживания, отличается тем, что он содержит линии аллогенных гемопоэтических стволовых клеток CD133+, ко-экспрессирующих поверхностные маркеры стволовых клеток: CD34+, CD38+, и CD34+, ко-экспрессирующих CD38+, CD117+, которые составляют 2% клеточной массы БМКП, и дополнительно содержит лейкоконцентрат аутологичных мобилизованных мононуклеарных клеток человека, причем названные компоненты смешаны с биологически стабильной стерильной средой, при конечной концентрации клеток линии CD34+ и CD133+ (40÷100)⋅106 клеток/мл раствора, и в качестве биологически стабильной стерильной среды использован 0,9% физиологический раствор натрия хлорида или гетерогенный биодеградируемый полимерный матрикс в необходимом количестве. Кроме того, аутологичные мобилизованные мононуклеарные клетки лейкоконцентрата очищены в градиенте плотности фикола.The problem is solved in that the biomedical cell preparation containing the cryopreserved CD34 + antigen after thawing is characterized in that it contains lines of allogeneic hematopoietic stem cells CD133 +, co-expressing surface markers of stem cells: CD34 +, CD38 +, and CD34 +, co-expressing CD38 +, CD117 +, which make up 2% of the cell mass of BMKP, and additionally contains a leukoconcentrate of autologous mobilized human mononuclear cells, and these components are mixed with biologically stable -sterile medium at a final concentration of cell lines CD34 + and CD133 + (40 ÷ 100) ⋅10 6 cells / ml, and as a biologically stable sterile medium used 0.9% saline solution of sodium chloride or heterogeneous biodegradable polymer matrix in the necessary amount. In addition, autologous mobilized mononuclear cells of the leukoconcentrate are purified in the density gradient of ficol.
Сопоставительный анализ признаков заявленного решения с признаками прототипа и аналогов свидетельствует о соответствии заявленного решения критерию «новизна».A comparative analysis of the features of the claimed solution with the signs of the prototype and analogues indicates the conformity of the claimed solution to the criterion of "novelty."
Совокупность признаков формулы изобретения обеспечивает решение поставленной задачи, при этом признаки отличительной части формулы изобретения решают следующие функциональные задачи:The combination of features of the claims provides a solution to the problem, while the features of the distinctive part of the claims solve the following functional tasks:
Признак, указывающий, что БМКП «содержит линии аллогенных гемопоэтических стволовых клеток CD133+, ко-экспрессирующих поверхностные маркеры стволовых клеток: CD34+, CD38+, и CD34+, ко-экспрессирующих CD38+, CD117+», обеспечивает повышение эффективности восстановления нарушенного гемопоэза после химиотерапии или лучевой терапии при трансплантации костного мозга у онкологических больных, т.к. в чистом виде эти клетки не приживались в костном мозге реципиента и чистая культура клеток ГСК CD34+ была не способна обеспечивать восстановление поврежденного гемопоэза.A sign indicating that BMD “contains CD133 + allogeneic hematopoietic stem cell lines co-expressing surface stem cell markers: CD34 +, CD38 +, and CD34 + co-expressing CD38 +, CD117 +”, provides an increase in the efficiency of restoration of impaired hematopoiesis after chemotherapy or radiation therapy with bone marrow transplantation in cancer patients, as in pure form, these cells did not take root in the recipient's bone marrow, and a pure HSC CD34 + cell culture was not capable of restoring damaged hematopoiesis.
Признак, указывающий, что ГСК составляет «2% клеточной массы БМКП», обеспечивает терапевтическую эффективность препарата, при исключении опасности интенсификации процесса онкогенеза.A sign indicating that HSC makes up “2% of the BMCC cell mass” ensures the therapeutic efficacy of the drug, while eliminating the danger of intensification of the oncogenesis process.
Признак, указывающий, что БМКП «дополнительно содержит лейкоконцентрат аутологичных мобилизованных мононуклеарных клеток человека», обеспечивает сбалансированность и эффективность терапевтической композиции основных компонентов биомедицинского клеточного препарата, причем использование аутологичных мобилизованных мононуклеарных клеток человека» повышает эффективность противоопухолевого эффекта биопрепарата.A sign indicating that BMKP "additionally contains a leukoconcentrate of autologous mobilized human mononuclear cells" ensures the balance and effectiveness of the therapeutic composition of the main components of a biomedical cell preparation, and the use of autologous mobilized human mononuclear cells "increases the effectiveness of the antitumor effect of the biological product.
Признак, указывающий, что компоненты БМКП смешаны «с биологически стабильной стерильной средой, при конечной концентрации клеток линии CD34+ и CD133+ (40÷100)⋅106 клеток/мл раствора» обеспечивает терапевтическую эффективность препарата.A sign indicating that the BMCP components are mixed “with a biologically stable sterile medium, with a final concentration of CD34 + and CD133 + (40 ÷ 100) ⋅10 6 cells / ml cells”, ensures the therapeutic effectiveness of the drug.
Признак, указывающий, что «в качестве биологически стабильной стерильной среды использован 0,9% физиологический раствор натрия хлорида или гетерогенный биодеградируемый полимерный матрикс в необходимом количестве», конкретизируют возможный состав эффективной биологически стабильной стерильной среды.A sign indicating that "a 0.9% physiological solution of sodium chloride or a heterogeneous biodegradable polymer matrix in the required amount was used as a biologically stable sterile medium", specify the possible composition of an effective biologically stable sterile medium.
Признак, указывающий, что аутологичные мобилизованные мононуклеарные клетки лейкоконцентрата очищены в градиенте плотности фикола», повышает эффективность противоопухолевой терапии.A sign indicating that autologous mobilized mononuclear cells of the leukoconcentrate are purified in the density gradient of ficol ”, increases the effectiveness of antitumor therapy.
Заявленное изобретение иллюстрируется графическими материалами, где на фиг. 1 - фиг. 3 показана динамика МРТ пациента Г. с глиобластомой после лечения ППОП, при этом на фиг. 1 показана МРТ головного мозга, август 2006 г.; на фиг. 2 показана МРТ головного мозга, ноябрь 2006 г.; на фиг. 3 показана МРТ головного мозга, август 2007 г.; на фиг. 4 - фиг. 5 показана динамика PET сканирования головного мозга больного Г. с РФП 11C-metionin (все позитивные), при этом на фиг. 4 показана ПЭТ головного мозга в июле 2007 г.; на фиг. 5 показана ПЭТ головного мозга в январе 2009 г.The claimed invention is illustrated by graphic materials, where in FIG. 1 - FIG. 3 shows the dynamics of MRI of patient G. with glioblastoma after treatment with PPOP, while in FIG. Figure 1 shows an MRI of the brain, August 2006; in FIG. Figure 2 shows brain MRI, November 2006; in FIG. Figure 3 shows an MRI of the brain, August 2007; in FIG. 4 - FIG. 5 shows the dynamics of a PET scan of the brain of patient G. with radiopharmaceutical 11C-metionin (all positive), with FIG. 4 shows a PET of the brain in July 2007; in FIG. Figure 5 shows a brain PET scan in January 2009.
Заявленный биомедицинский клеточный препарат получают следующим образом.The claimed biomedical cell preparation is prepared as follows.
Клеточный препарат изготавливают ex tempore путем смешивания в стерильных условиях размороженных клеток линии ГСК (CD34+) полученными из тканей костного мозга или лейкоконцентрата (ЛК) периферической крови (ПК) донора (компонент А), размороженного на водяной бане и отмытого от ДМСО криоконсервированного ЛК ПК пациента с мобилизованными собственными ГСК (компонент Б) с 0,9% физиологическим раствором NaCl (ФР) или (и) гетерогенным биополимерным матриксом (ГБПМ) (компонент В).The cell preparation is prepared ex tempore by mixing under sterile conditions thawed HSC line cells (CD34 +) obtained from bone marrow tissue or peripheral blood leukoconcentrate (LC) of a donor (component A), thawed in a water bath and washed from a DMSO cryopreserved patient PC LC with mobilized proprietary HSCs (component B) with 0.9% physiological NaCl solution (RF) or (and) heterogeneous biopolymer matrix (GBPM) (component C).
Соотношение компонентов в одной биодозе БМКП (А:Б:В) объемом не более 2-х мл составляет: компонент А - 4,5×105 - 1,5×106 клеток линии донорских ГСК (CD34+), совместимых по группе крови и иммунофенотипу с пациентом, компонент Б - 6,25×105 - 1×106 CD34+ мононуклеарных клеток (МНК) аутологичного ЛК ПК с содержанием собственных мобилизованных ГСК (СD34+) от 1 до 2% (6,25х103 - 1х104 CD34+ ГСК), компонент В - 2-3 мл ФР или с 1-2 мл ГБПМ (Г) до нужного количества (Quantum satis).The ratio of components in the audio biodozy BMKP (A: B: C) of not more than 2 ml amounts: Component A - 4,5 × 10 May - 1,5 × 10 6 cells lines donor HSCs (CD34 +), compatible blood group and immunophenotype with the patient, component B - 6.25 × 10 5 - 1 × 10 6 CD34 + mononuclear cells (MNCs) of autologous PC LK with the content of their own mobilized HSCs (CD34 +) from 1 to 2% (6.25x10 3 - 1x10 4 CD34 + HSC), component B - 2-3 ml of RF or with 1-2 ml of GBPM (G) to the desired amount (Quantum satis).
ГСК выделяют из свежего донорского биоматериала костного мозга (БКМ) или ЛК ПК с использованием технологии иммуносепарации в магнитном поле (Miltenyi Biotec, Germany), с помощью которой выделяют обогащенную суспензию клеток CD133+ и CD34+. В дальнейшем в течение 7-9 суток наращивают количество ГСК в 10-20 раз путем культивирования выделенных ГСК в среде, блокирующей их дифференцировку, отмывают 2-кратным центрифугированием с 0,9% ФРНХ от культуральной жидкости, делят на аликвоты по 1х106 ГСК и криоконсервируют и хранят при –196 °С.HSCs are isolated from fresh bone marrow donor biomaterial (BKM) or PK LK using magnetic field immunoseparation technology (Miltenyi Biotec, Germany), using which enriched cell suspension of CD133 + and CD34 + is isolated. Subsequently, within 7–9 days, the amount of HSCs is increased by 10–20 times by culturing the isolated HSCs in a medium that blocks their differentiation, washed by centrifugation 2 times with 0.9% NGF from the culture fluid, divided into aliquots of 1 × 10 6 HSCs and cryopreserved and stored at –196 ° С.
ЛК ПК донора и пациента производят путем лейкоцитофереза с использованием подкожного введения Г-КСФ в течение 4-х дней. Аллогенный БКМ получают во время операции, проводимой под спинальной или эпидуральной анестезией путем трепанбиопсии костного мозга из грудины и подвздошных костей биосовместимого донора. В последующем из БКМ или ЛК ПК методом градиентного центрифугирования фракционируют общую массу клеток, получают суспензию мононуклеарных клеток, проводят анализ количества клеточных элементов, содержащихся в них, и иммунофенотипирование ГСК, стандартизацию и сертификацию полученного ЛК, криоконсервируют в жидком азоте с ДМСО в программном замораживателе и хранят при температуре – 196 °С.The LC of the PC of the donor and the patient is produced by leukocytheresis using subcutaneous administration of G-CSF for 4 days. Allogeneic BKM is obtained during surgery under spinal or epidural anesthesia by trepanbiopsy of the bone marrow from the sternum and ilium of a biocompatible donor. Subsequently, the total mass of cells is fractionated by BKM or LK PK by gradient centrifugation, a suspension of mononuclear cells is obtained, the number of cell elements contained in them is analyzed, HSC immunophenotyping, standardization and certification of the obtained LK are cryopreserved in liquid nitrogen with DMSO in a program freezer and stored at a temperature of 196 ° C.
Получение и криоконсервация компонента «А» БМКП.Obtaining and cryopreservation of component "A" BMKP.
Основной проблемой культивирования высокопластичных недифференцированных стволовых клеток (СК) с маркерами CD34+CD133+Lin- является их быстрый выход в дифференцировку, т.к. необходимо накопление, увеличение количества этих клеток без развития колоний дифференцированных клеток, при этом способность к последующей дифференцировке у таких культивируемых клеток должна быть сохранена по возможности в первоначальном виде. Ключевой задачей создания этого компонента является метод увеличения количества гемопоэтических недифференцированных стволовых клеток (СК) пациента ex vivo путем их выделения из крови или костного мозга пациента и культивирования в ростовой среде, содержащей смесь цитокинов, состоящей из фактора роста СК (SCF), лиганда тирозин киназы 3 из фетальной печени (Flt3L) и тромбопоэтина (ТРО), при этом указанная выше смесь цитокинов дополнительно содержит иономицин при следующем соотношении компонентов: SCF (50-150)·103 нг, ТРО (50-150)·103 нг, Flt3L (10-50)·103 нг, Иономицин (10-100)·103 нг на 1 мл ростовой среды.The main problem in the cultivation of highly plastic undifferentiated stem cells (SCs) with markers CD34 + CD133 + Lin- is their rapid access to differentiation, because it is necessary to accumulate, increase the number of these cells without developing colonies of differentiated cells, while the ability to subsequent differentiation in such cultured cells should be preserved in its original form, if possible. The key task of creating this component is a method for increasing the number of hematopoietic undifferentiated stem cells (SC) of a patient ex vivo by isolating them from the patient’s blood or bone marrow and culturing in a growth medium containing a mixture of cytokines consisting of SC growth factor, tyrosine kinase ligand 3 from fetal liver (Flt3L) and thrombopoietin (TPO), while the above mixture of cytokines additionally contains ionomycin in the following ratio of components: SCF (50-150) · 10 3 ng, TPO (50-150) · 10 3 ng, Flt3L (10-50) 10 3 ng, Ion ching (10-100) 10 3 ng per 1 ml of growth medium.
Иономицин использован в качестве стимулирующего агента роста недифференцированных стволовых клеток в условиях ех vivo. Фактор роста СК (SCF) стимулирует пролиферацию СК, взаимодействуя со специфическим рецептором (протоонкогенный c-kit), обладающим тирозин-киназной активностью, индуцирует активацию киназы и трансфосфорилирование цепей рецептора. Flt3-лиганд (Flt3L) стимулирует пролиферацию гемопоэтических СК как и SCF. Flt3 представляет собой III класс рецептора тирозин киназы, экспрессированного на ранних предшественниках гемопоэтических СК. Тромбопоэтин (ТРО) - это гликопротеиновый гормон, который регулирует продукцию тромбоцитов стволовыми клетками костного мозга. В суспензионной культуре ТРО в комбинации с SCF стимулирует пролиферацию мультипотентных СК и повышает их количество.Ionomycin was used as a stimulating agent for the growth of undifferentiated stem cells under ex vivo conditions. SC growth factor (SCF) stimulates SC proliferation by interacting with a specific receptor (proto-oncogenic c-kit) with tyrosine kinase activity and induces kinase activation and transphosphorylation of receptor chains. Flt3 ligand (Flt3L) stimulates the proliferation of hematopoietic SC as well as SCF. Flt3 is a class III tyrosine kinase receptor expressed on early hematopoietic SC precursors. Thrombopoietin (TPO) is a glycoprotein hormone that regulates platelet production by bone marrow stem cells. In suspension culture, TPO in combination with SCF stimulates the proliferation of multipotent SCs and increases their number.
Таким образом, ГСК человека выделяют из аллогенного костного мозга или мобилизованной периферической крови, или как вариант из крови, выделенной из пуповинной вены. Методом фракционирования в градиенте фикола из общей массы клеток получают суспензию мононуклеарных клеток, из которых выделяют обогащенную суспензию клеток CD133+ и CD34+. Полученную суспензию культивируют в среде Dulbecco M (IMDM) с добавлением инсулина и трансферрина, а также фактора роста стволовых клеток (SCF), лиганда тирозин киназы 3 из фетальной печени (Flt3L), тромбопоэтина (ТРО) и иономицина (Са2+ ionophore). Через 7-10 дней культивирования в выращенной клеточной суспензии содержится 80-92% клеток CD34+. Методика позволяет за короткий период времени вырастить 10-15-кратно увеличенное количество низкодифференцированных ГСК, которые могут быть использованы как компонент А биопрепарата.Thus, human HSCs are isolated from allogeneic bone marrow or mobilized peripheral blood, or alternatively from blood isolated from the umbilical cord vein. Using a ficol gradient fractionation method, a suspension of mononuclear cells is obtained from the total cell mass, from which an enriched suspension of CD133 + and CD34 + cells is isolated. The resulting suspension was cultured in Dulbecco M medium (IMDM) supplemented with insulin and transferrin, as well as stem cell growth factor (SCF), tyrosine kinase 3 ligand from the fetal liver (Flt3L), thrombopoietin (TPO) and ionomycin (Ca2 + ionophore). After 7-10 days of cultivation, the grown cell suspension contains 80-92% of CD34 + cells. The technique allows for a short period of time to grow a 10-15-fold increase in the number of low-differentiated HSCs, which can be used as component A of a biological product.
Выделение и культивирование CD34+. Все процедуры проводятся в ламинарных шкафах класса II, расположенных в стерильном блоке с подачей воздуха по регламенту GMP, с использованием стерильной одноразовой пластиковой посуды и стерильных реагентов.Isolation and cultivation of CD34 +. All procedures are carried out in class II laminar cabinets located in a sterile unit with air supply in accordance with GMP regulations, using sterile disposable plastic dishes and sterile reagents.
1. Транспортировку мешков с клетками костного мозга, мобилизованной крови или пуповинной крови осуществляют в термоконтейнерах ТермоКонт при комнатной температуре (18-25°С).1. Transportation of bags with cells of bone marrow, mobilized blood or umbilical cord blood is carried out in ThermoCont thermal containers at room temperature (18-25 ° C).
2. Забор клеток из мешка с мобилизованной кровью производят в ламинарном шкафу класса II, расположенном в стерильном блоке.2. Cells are taken from the bag with mobilized blood in a class II laminar cabinet located in a sterile unit.
2.1. Клеточную взвесь забирают шприцем, прокалывая мембрану соединительной трубочки на мешке.2.1. The cell suspension is taken with a syringe, piercing the membrane of the connecting tube on the bag.
3. Получение фракции мононуклеарных клеток (МНК): клеточную взвесь, взятую шприцем, разводят в соотношении 1:4 фосфатным буферным раствором (PBS) без ионов кальция и магния (PBS Ca2+Mg2+ free) и затем наслаивают на градиентный раствор (d=1,077 г/мл, MP Biomedicals) в 50 мл пробирках.3. Obtaining a fraction of mononuclear cells (MNCs): the cell suspension taken with a syringe is diluted 1: 4 with phosphate buffer solution (PBS) without calcium and magnesium ions (PBS Ca2 + Mg2 + free) and then layered onto a gradient solution (d = 1,077 g / ml, MP Biomedicals) in 50 ml tubes.
3.1. Пробирки центрифугируют при 400g в течение 30 мин при 20°С.3.1. The tubes are centrifuged at 400g for 30 min at 20 ° C.
3.2. В результате градиентного центрифугирования эритроциты и гранулоциты опускаются на дно пробирки, а фракция мононуклеаров в виде плотного кольца концентрируется между двумя слоями, на поверхности градиента.3.2. As a result of gradient centrifugation, red blood cells and granulocytes are lowered to the bottom of the tube, and the fraction of mononuclear cells in the form of a dense ring is concentrated between two layers, on the surface of the gradient.
3.3. Фракцию МНК отбирают пипеткой, разводят в свежем PBS и три раза отмывают центрифугированием в течение 10 мин при 300g и температуре 10°С.3.3. The MNC fraction was pipetted, diluted in fresh PBS and washed three times by centrifugation for 10 min at 300 g and a temperature of 10 ° C.
4. Подсчет клеток и фенотипический анализ мононуклеарной фракции.4. Cell counting and phenotypic analysis of the mononuclear fraction.
4.1. Для определения количества живых МНК к 20 мкл клеточной суспензии добавляют 20 мкл трипанового синего (Gibco). Подсчет клеток производят в гемоцитометре, пропорция живых клеток не должна быть ниже 95%.4.1. To determine the amount of live MNCs, 20 μl of trypan blue (Gibco) is added to 20 μl of the cell suspension. Cell counting is carried out in a hemocytometer, the proportion of living cells should not be lower than 95%.
4.2. Для оценки количества клеток CD34+ и CD133+ мононуклеарной фракции 0,1 мл клеточной суспензии окрашивают соответствующими антителами и определяют пропорцию ГСК в исходной клеточной взвеси на приборе FACSCalibur (Beckton Dickinson).4.2. To estimate the number of CD34 + and CD133 + cells of the mononuclear fraction, 0.1 ml of the cell suspension is stained with the appropriate antibodies and the proportion of HSC in the initial cell suspension is determined on a FACSCalibur instrument (Beckton Dickinson).
Пример 1. Данные фенотипического анализа мононуклеарных клеток в одном показательном эксперименте, проведенном на клетках донорского костного мозга (А), мобилизованной крови (Б) и пуповинной крови (В). Пропорция клеток СD34+ донора составляла 0,9% в костном мозге (А), 0,4% в мобилизованной периферической крови (Б) и 0,7% в пуповинной крови (В). Ко-экспрессия маркеров CD133 и CD34 наблюдается в 0,7% общей взвеси МНК костного мозга в 0,3% МНК периферической мобилизованной крови и в 0,3% МНК пуповинной крови.Example 1. Data phenotypic analysis of mononuclear cells in one representative experiment conducted on cells of donor bone marrow (A), mobilized blood (B) and umbilical cord blood (C). The proportion of donor CD34 + cells was 0.9% in bone marrow (A), 0.4% in mobilized peripheral blood (B), and 0.7% in cord blood (C). Co-expression of CD133 and CD34 markers is observed in 0.7% of the total suspension of bone marrow MNCs in 0.3% peripheral mobilized blood MNCs and in 0.3% cord blood MNCs.
5. Сепарация клеток CD133+ или CD34+ на колонках в магнитном поле по методике производителя (Myltenyi Biotec, Germany).5. Separation of CD133 + or CD34 + cells on columns in a magnetic field according to the manufacturer's method (Myltenyi Biotec, Germany).
5.1. 0,5⋅109 МНК суспендируют в объеме 2,5 мл буфера, содержащего 0,5% бычьего сывороточного альбумина и 5% раствора антикоагулянтного цитрата декстрозы в растворе PBS (ACD-A буфер).5.1. 0.5 × 10 9 MNCs are suspended in a volume of 2.5 ml of a buffer containing 0.5% bovine serum albumin and 5% dextrose anticoagulant citrate solution in PBS solution (ACD-A buffer).
5.2. В суспензию клеток добавляют 500 мкл реагента, блокирующего Fc рецептор, и инкубируют в течение 5 мин при 4°С.5.2. 500 μl of the Fc receptor blocking reagent is added to the cell suspension and incubated for 5 min at 4 ° C.
5.3. Затем в суспензию добавляют 500 мкл коллоидальных суперпарамагнитных микрошариков, конъюгированных с моноклональным мышиным античеловеческим антителом АС133.1 или анти-CD34+, и инкубируют в течение 25 мин при 4°С.5.3. Then, 500 μl of colloidal superparamagnetic microspheres conjugated with AC133.1 monoclonal mouse anti-human antibody or anti-CD34 + are added to the suspension and incubated for 25 min at 4 ° C.
5.4. После инкубации в клетки добавляют 10 мл ACD-A буфера и центрифугируют при 400 g в течение 10 мин при температуре 4°С.5.4. After incubation, 10 ml of ACD-A buffer is added to the cells and centrifuged at 400 g for 10 min at 4 ° C.
5.5. Надосадочную жидкость удаляют и осадок ресуспензируют в 5 мл ACD-A буфера и наносят на охлажденную колонку для позитивной селекции, которая находится в магнитном поле.5.5. The supernatant is removed and the precipitate is resuspended in 5 ml of ACD-A buffer and applied to a chilled column for positive selection, which is in a magnetic field.
5.6. Колонку четыре раза промывают 2 мл охлажденного буфера ACD-A, удаляют из магнитного поля и поршнем выдавливают клетки CD133+ или CD34+ в стерильную пробирку.5.6. The column is washed four times with 2 ml of chilled ACD-A buffer, removed from the magnetic field and squeezed CD133 + or CD34 + cells into a sterile tube with a piston.
5.7. Селекцию на колонке повторяют и подсчитывают количество клеток. Часть клеток (0,1 мл) отбирают для фенотипирования.5.7. Column selection is repeated and the number of cells counted. Part of the cells (0.1 ml) were selected for phenotyping.
6. Оценка чистоты клеточной суспензии после выделения СК из трех источников: костного мозга, мобилизованной периферической крови и пуповинной крови показала, что в среднем степень очистки клеток CD133+ костного мозга в магнитном поле составляла 88,1±0,9% (n12), в мобилизованной крови равнялась 87,2±4,0% (n18) и в пуповинной крови оценивалась как 76,1±2,8% (n22). Соответственно процентное содержание клеток CD34+ после сепарации клеток костного мозга в магнитном поле составило 98,9±1,1%, клеток мобилизованной крови - 96,1±2,8%, клеток пуповинной крови - 97,1±1,2%.6. Evaluation of the purity of the cell suspension after isolation of SC from three sources: bone marrow, mobilized peripheral blood and umbilical cord blood showed that, on average, the degree of purification of CD133 + bone marrow cells in a magnetic field was 88.1 ± 0.9% (n12), in the mobilized blood was 87.2 ± 4.0% (n18) and in cord blood was estimated as 76.1 ± 2.8% (n22). Accordingly, the percentage of CD34 + cells after separation of bone marrow cells in a magnetic field was 98.9 ± 1.1%, mobilized blood cells - 96.1 ± 2.8%, cord blood cells - 97.1 ± 1.2%.
Пример 2. Данные другого показательного эксперимента, где был проведен фенотипический анализ выделенных в магнитном поле клеток CD133+ и CD34+ из МНК костного мозга, мобилизованной крови и пуповинной крови. Общее количество CD34+ клеток после магнитной селекции, выделенных из костного мозга, составило 95,3%, из периферической крови 98,4% и из пуповинной крови 98,3%. Пропорция клеток CD34+, которые ко-экспрессируют CD133+, в клетках костного мозга составила 92,1%, в клетках мобилизованной периферической крови - 87,2%, а в клетках пуповинной крови 72,8%.Example 2. Data from another representative experiment, where a phenotypic analysis of the CD133 + and CD34 + cells isolated from the magnetic field of bone marrow, mobilized blood and umbilical cord blood was isolated. The total number of CD34 + cells after magnetic selection isolated from bone marrow was 95.3%, from peripheral blood 98.4% and from umbilical cord blood 98.3%. The proportion of CD34 + cells that co-express CD133 + in the bone marrow cells was 92.1%, in the cells of mobilized peripheral blood - 87.2%, and in the cells of umbilical cord blood 72.8%.
7. Фенотипические характеристики клеток. Клетки CD133+ ко-экспрессируют поверхностные маркеры стволовых клеток: CD34+ (98,6%±0,9%), CD38+ (85,1±4,8%). Клетки CD34+ ко-экспрессируют CD+ (86,8±0,1%), CD38+ (90,8±5,2%), CD117+ (33,6%±0,3).7. Phenotypic characteristics of cells. CD133 + cells co-express surface stem cell markers: CD34 + (98.6% ± 0.9%), CD38 + (85.1 ± 4.8%). CD34 + cells co-express CD + (86.8 ± 0.1%), CD38 + (90.8 ± 5.2%), CD117 + (33.6% ± 0.3).
Культивирование. Cultivation.
Пример 1-3. Жидкая культуральная система состоит из среды Искова в модификации Дульбекко (Iscove's modified Dulbecco's Medium IMDM, Gibco, UK) с добавлением 0,5 г/л бычьего сывороточного альбумина (Sigma Aldrich), 0,39 мкг/мл человеческого инсулина и 60 мкг/мл трансферрина (Gibco). В культуральную среду добавляют фактор роста стволовых клеток SCF, другое название c-Kit-ligand (c-KitL, R&D Systems), в концентрации 100 нг/мл, а также Flt3-ligand (Flt3L) в концентрации 20 нг/мл, (R&D Systems) и иономицин (Sigma Aldrich) в концентрации 0.1 мкМ/мл.Example 1-3. The liquid culture system consists of Iscov’s medium in a Dulbecco modification (Iscove's modified Dulbecco's Medium IMDM, Gibco, UK) supplemented with 0.5 g / L bovine serum albumin (Sigma Aldrich), 0.39 μg / ml human insulin and 60 μg / ml transferrin (Gibco). SCF stem cell growth factor, another name c-Kit-ligand (c-KitL, R&D Systems), at a concentration of 100 ng / ml, and Flt3-ligand (Flt3L) at a concentration of 20 ng / ml, (R&D Systems) and ionomycin (Sigma Aldrich) at a concentration of 0.1 μM / ml.
Способ культивирования. The method of cultivation.
Пример 4-5. Клетки культивируют при 37°С во влажной атмосфере с притоком 5% CO2. Свежую среду и цитокины добавляют каждый третий день. Время культивирования составляет 5-7 дней. Использованные факторы роста способствуют пролиферации стволовых клеток, при этом не нужно добавлять агенты, подавляющие дифференцировку. Получаемые суспензии стволовых клеток любого индивидуума могут быть сохранены в замороженном виде либо могут быть введены в БМКП непосредственно после культивирования и применены больным.Example 4-5. Cells were cultured at 37 ° C in a humid atmosphere with an influx of 5% CO 2 . Fresh medium and cytokines are added every third day. The cultivation time is 5-7 days. Used growth factors contribute to the proliferation of stem cells, with no need to add agents that inhibit differentiation. The resulting suspension of stem cells of any individual can be stored frozen or can be introduced into BMKP immediately after cultivation and used by the patient.
Получение, стандартизация и криоконсервация компонента «Б» БМКП.Obtaining, standardization and cryopreservation of component “B” BMKP.
Процедуру условно разделяют на две части.The procedure is conditionally divided into two parts.
Мобилизация стволовых клеток в периферическую кровь.Stem cell mobilization in peripheral blood.
Для увеличения количества СК в периферической крови донор или пациент получает 8 инъекций Г-КСФ подкожно с интервалом в 10-12 часов в течение 4 дней. В первые три дня доза препарата составляет 2,5 мкг/кг, в последний день доза удваивается. Ежедневно производят общий анализ крови и на 4-5 день делается УЗИ брюшной полости.To increase the amount of SC in the peripheral blood, the donor or patient receives 8 injections of G-CSF subcutaneously with an interval of 10-12 hours for 4 days. In the first three days, the dose of the drug is 2.5 mcg / kg, on the last day the dose doubles. A general blood test is performed daily and an abdominal ultrasound is done on day 4-5.
Сбор ГСК и клеток-предшественников гемопоэза.Collection of HSCs and hematopoietic progenitor cells.
Проводят на 5 день от начала стимуляции Г-КСФ на сепараторе крови СОВЕ-Spectra с использованием одноразовой системы для сепарации и стандартных растворов. Длительность процедуры 3-4 часа в зависимости от веса донора, параметров анализа крови и т.п. Процедура включает забор крови из одной вены, обработку ее внутри сепаратора, забор определенного объема стволовых клеток и возврат остальных компонентов крови донору через другую вену. Венозный доступ осуществляется путем пункции 2-х периферических вен или через 2-просветный центральный катетер, установленный в подключичную вену на время проведения сеанса. Средний объем собранного материала 300-400 мл. Его оценивают по общему количеству ядерных клеток (ЯК) в сепарате и по количеству СD34+ клеток на килограмм веса больного. ЯК в сепарате определяют подсчетом в камере Горяева до проведения каких-либо манипуляций. Процент СD34+ клеток в клеточной суспензии, полученной в ходе цитофереза, определяют методом проточной цитофлуориметрии.Spend on day 5 from the beginning of stimulation of G-CSF on a blood separator COBE-Spectra using a disposable separation system and standard solutions. The duration of the procedure is 3-4 hours, depending on the weight of the donor, blood test parameters, etc. The procedure involves blood sampling from one vein, processing it inside the separator, taking a certain volume of stem cells and returning the remaining blood components to the donor through another vein. Venous access is performed by puncture of 2 peripheral veins or through a 2-lumen central catheter inserted into the subclavian vein for the duration of the session. The average volume of collected material is 300-400 ml. It is estimated by the total number of nuclear cells (UC) in the separat and by the number of CD34 + cells per kilogram of patient weight. UC in the separatum is determined by counting in the Goryaev chamber before any manipulations. The percentage of CD34 + cells in the cell suspension obtained by cytopheresis is determined by flow cytometry.
Определение ГСК и клеток – прогениторов гемопоэза.Determination of HSC and hematopoietic progenitor cells.
Установление субпопуляционного состава CD34+ клеток проводят цитофлуориметрически, с применением метода тройной метки (одновременная окраска клеток антителами к 3 разным антигенам, нагруженными различными флуорохромными красителями).The subpopulation composition of CD34 + cells is determined cytofluorimetrically using the triple label method (simultaneous staining of cells with antibodies to 3 different antigens loaded with various fluorochrome dyes).
Cтандартизация компонента «А» препарата.Standardization of component "A" of the drug.
Определение количества клеток-предшественниц проводят цитофлуориметрически, в прямой реакции иммунофлуоресценции (РИФ).The determination of the number of progenitor cells is carried out cytofluorimetrically, in a direct immunofluorescence reaction (RIF).
Проводится метод двойной метки, с одновременным окрашиванием клеточного субстрата моноклональными антителами к антигену CD34 + как основному маркеру клеток пула АМКС ПГ и к молекуле CD45- лейкоцитарному антигену, определяющему ГСК. Это позволяет сразу рассчитать соотношение количества CD34+ клеток и всех ГСК (CD45+) в материале. Для оценки уровней неспецифического связывания часть клеток окрашивают изотипическими контролями. В качестве изотипических контролей стандартно применяются мышиные иммуноглобулины IgG1 изотипа (IgG1), меченные красителями, аналогичными метке используемых моноклональных антител (PE, FITC, PerCP).A double-label method is carried out, while staining the cell substrate with monoclonal antibodies to the CD34 + antigen as the main marker of cells in the AMKS PG pool and to the CD45 leukocyte antigen molecule that defines HSCs. This allows you to immediately calculate the ratio of the number of CD34 + cells and all HSCs (CD45 +) in the material. To assess non-specific binding levels, some cells are stained with isotypic controls. As isotypic controls, mouse IgG1 isotype immunoglobulins (IgG1) labeled with dyes similar to the label of the monoclonal antibodies used (PE, FITC, PerCP) are standardly used.
Подготовка клеточных проб. Перед постановкой реакции клетки ПК и цитаферезного продукта освобождают от примеси эритроцитов стандартной процедурой лизиса и последующей отмывкой в ЗФР-БСА и центрифугированием (5 минут) при 1000g. ЗФР-БСА можно заменить средой Хенкса или 199.Preparation of cell samples. Before staging the reaction, PK cells and the cytapheresis product are freed from red blood cell impurities by a standard lysis procedure and subsequent washing in PBS-BSA and centrifugation (5 minutes) at 1000 g. PBS-BSA can be replaced with Hanks or 199.
С выделенными клетками проводят прямую РИФ в 96-луночном планшете, при этом для определения количества клеток в любом материале используется панель из 3-х лунок: неокрашенные клетки; клетки, окрашенные изотипическими контролями с меткой, соответствующей метке использованных моноклональных антител (МКА); клетки, окрашенные одновременно МКА к антигенам CD34 и CD45.Direct RIFs are performed with the isolated cells in a 96-well plate, and a panel of 3 wells is used to determine the number of cells in any material: unpainted cells; cells stained with isotypic controls with a label corresponding to the label of used monoclonal antibodies (MCA); cells stained simultaneously with MCA antigens CD34 and CD45.
Для определения количества CD34+ клеток оптимальными являются антитела к антигену CD34 клона HPCA-2 (8G12), изотипа IgG1.To determine the number of CD34 + cells, antibodies to the CD34 antigen of the HPCA-2 clone (8G12), IgG1 isotype, are optimal.
Таким образом, стандартная панель имеет вид:Thus, the standard panel has the form:
контроль IgG1 PE+ контроль IgG1FITC;IgG1 PE control + IgG1FITC control;
контроль IgG1 PE+ МКА к CD45 FITC;IgG1 PE + MCA control for CD45 FITC;
МКА к CD34 PE (HPCA-2) + МКА к CD45 FITC.MCA for CD34 PE (HPCA-2) + MCA for CD45 FITC.
Постановка РИФ.RIF staging.
В лунки вносятся клетки в количестве не менее 500 000 на лунку.At least 500,000 cells per well are introduced into the wells.
Далее в каждую лунку вносят коктейль антител в соответствии с панелью и аккуратно ресуспендируют пипеткой. Каждое МКА берут в количестве 10 мкл на лунку, суммарный объем МКА в лунке – 20 мкл.Next, a cocktail of antibodies is added to each well in accordance with the panel and gently resuspended with a pipette. Each MCA was taken in an amount of 10 μl per well; the total volume of MCA in the well was 20 μl.
Клетки инкубируют с антителами в течение 30 минут при 4 °С (нижняя полка обычного холодильника).Cells are incubated with antibodies for 30 minutes at 4 ° C (lower shelf of a conventional refrigerator).
По окончании времени инкубации клетки дважды отмывают от несвязавшихся антител путем центрифугирования в течение 10-20 минут при 300g.At the end of the incubation time, the cells are washed twice from unbound antibodies by centrifugation for 10-20 minutes at 300g.
Клетки переносят в специальные пластиковые пробирки для анализа на проточном цитометре.Cells are transferred to special plastic tubes for analysis on a flow cytometer.
Объем клеточной суспензии в каждой пробирке доводят до 200-500 мкл путем добавления к клеткам ЗФР-БСА.The volume of cell suspension in each tube was adjusted to 200-500 μl by adding PBS-BSA to the cells.
Анализ должен быть осуществлен сразу после постановки реакции.The analysis should be carried out immediately after the formulation of the reaction.
Анализ и запись на проточном цитофлуориметре.Analysis and recording on a flow cytometer.
Оценку реакции выполняют на проточном, 5-параметровом, цитометре. CD34+ клетки в периферической крови представляют собой малую клеточную популяцию. Даже в условиях предварительной стимуляции кроветворения максимальная доля данных клеток составляет 1.0-3.0%. Поэтому при их подсчете в каждой анализируемой пробе накапливают не менее 20.000 клеточных событий.Assessment of the reaction is performed on a flow, 5-parameter, cytometer. CD34 + cells in peripheral blood represent a small cell population. Even in conditions of preliminary stimulation of hematopoiesis, the maximum proportion of these cells is 1.0-3.0%. Therefore, when they are counted, at least 20,000 cell events are accumulated in each analyzed sample.
Сбор и анализ клеток осуществляется в гейте CD45+ клеток, который включает все гемопоэтические клетки. В данном контексте гейт подразумевает область накопления событий, ограниченную определенными параметрами. Подсчет абсолютного числа CD45+клеток в мкл крови и цитоконцентрата проводят на основании числа лейкоцитов в гемограмме на день исследования.The collection and analysis of cells is carried out in the gate of CD45 + cells, which includes all hematopoietic cells. In this context, a gate implies an event accumulation region limited by certain parameters. The absolute number of CD45 + cells in μl of blood and cytoconcentrate are calculated based on the number of leukocytes in the hemogram on the day of the study.
Криоконсервирование СК крови и клеток предшественников гемопоэза.Cryopreservation of blood SC and hematopoietic progenitor cells.
Традиционный метод криоконсервирования заключается в добавлении криопротектора к клеточной суспензии в конечной концентрации 10% и процедуры стандартного замораживания на 1 град./мин до – 80 °С или –120 °С с использованием стандартных программ электронного программного замораживателя и хранением в жидком азоте или его парах.The traditional cryopreservation method consists in adding a cryoprotectant to the cell suspension at a final concentration of 10% and a standard freezing procedure of 1 deg./min to –80 ° C or –120 ° C using standard electronic program freezer programs and storing in liquid nitrogen or its vapor .
Выделяют периферические клетки-предшественники гемопоэза. Сепарированные клетки концентрируют путем центрифугирования при скорости вращения центрифуги 2000 оборотов в минуту в течение 10 мин при +18 °С. С помощью ручного плазмоэкстрактора из контейнера максимально удаляется плазма, клетки остаются в объеме 40-60 мл.Peripheral hematopoietic progenitor cells are isolated. The separated cells are concentrated by centrifugation at a centrifuge speed of 2000 rpm for 10 min at +18 ° C. Using a manual plasma extractor, plasma is removed from the container as much as possible, the cells remain in a volume of 40-60 ml.
В качестве криопротектора кроветворных клеток используют высокоочищенный диметилсульфоксид (ДМСО). К полученным клеткам добавляют при постоянном перемешивании равный объем полиглюкина с ДМСО. Смешивание ДМСО с полиглюкином происходит по типу экзотермической реакции с выделением умеренного количества тепла. Концентрация ДМСО в полиглюкине — 10-12%. Таким образом, его конечная концентрация в замораживаемом материале составит 5-6%. Применение полиглюкина позволило снизить количество ДМСО вдвое, до 5-6% конечной концентрации, так как полиглюкин обладает следующими свойствами: во-первых, способностью дезагрегировать клетки и тем самым улучшать проникновение криофилактика в клетки, во-вторых, полиглюкин (6% декстран) сам по себе является криофилактиком.Highly purified dimethyl sulfoxide (DMSO) is used as a cryoprotector of hematopoietic cells. To the obtained cells, an equal volume of polyglucin with DMSO is added with constant stirring. The mixing of DMSO with polyglucin occurs as an exothermic reaction with the release of a moderate amount of heat. The concentration of DMSO in polyglucin is 10-12%. Thus, its final concentration in the frozen material will be 5-6%. The use of polyglucin allowed to reduce the amount of DMSO by half, to 5-6% of the final concentration, since polyglucin has the following properties: firstly, the ability to disaggregate cells and thereby improve the penetration of cryophylaxis into cells, and secondly, polyglucin (6% dextran) itself in itself is a cryophylactic.
На следующем этапе обязательно производят подсчет ядросодержащих клеток, а также CD 34+клеток, подлежащих заморозке.At the next stage, nucleus-containing cells, as well as CD 34 + cells to be frozen, are counted.
Оптимальная концентрация замораживаемых клеток составляет 40-100х106 клеток в мл.The optimal concentration of frozen cells is 40-100x10 6 cells per ml.
В зависимости от конечного объема замораживаемого материала выбирается количество полимерных ампул (20 - 25) для глубокого программного замораживания. Далее клеточную взвесь переводят в эти термостойкие пластиковые пробирки.Depending on the final volume of the material to be frozen, the number of polymer ampoules (20 - 25) for deep program freezing is selected. The cell suspension is then transferred to these heat-resistant plastic tubes.
После завершения цикла программного электронного замораживания пробирки с замороженным материалом переносят в хранилище для длительного хранения. Затем пробирки с замораживаемым материалом помещают в пары жидкого азота при температуре –165°-170°С, где они будут находиться до использования.After completion of the programmed electronic freezing cycle, tubes with frozen material are transferred to storage for long-term storage. Then the tubes with frozen material are placed in a pair of liquid nitrogen at a temperature of –165 ° -170 ° C, where they will remain until use.
Эта методика реализует основные требования, предъявляемые к биоматериалу, подвергнутому криоконсервированию, а именно: максимальное сохранение жизнеспособности стволовых клеток; минимальный объем (100-120 мл) замораживаемого материала при максимальном количестве содержащихся клеток (до 100х106/мл), для ПК минимальный объем 50-60 мл; минимальное количество объема аутотрансплантата.This technique implements the basic requirements for biomaterial subjected to cryopreservation, namely: maximum preservation of stem cell viability; the minimum volume (100-120 ml) of the material to be frozen with the maximum number of cells contained (up to 100x10 6 / ml), for PC, the minimum volume is 50-60 ml; minimum amount of autograft volume.
Получение компонента «В» БМКП.Obtaining component "B" BMKP.
В качестве биологической стабильной стерильной среды для получения БМКП используют стерильный 0,9% раствор NaCl, приготовленный в заводских условиях в ампулах по 10 мл или стерильный раствор во флаконе объемом 200 или 400 мл. Этот тип биологически стабильной стерильной среды применяют при изготовлении БМКП для цитотранфузий. Для получения формы БМКП, предназначенной для имплантаций, применяют гетерогенный биодеградируемый полимерный матрикс (ГБДМ), например разработанный нами (см. RU № 2249462) биополимерный матрикс, являющийся официальным медицинским изделием и разрешенный к клиническому применению в РФ или его аналог.A sterile 0.9% NaCl solution prepared in the factory in 10 ml ampoules or a sterile solution in a 200 or 400 ml vial is used as a biologically stable sterile medium for obtaining BMP. This type of biologically stable sterile medium is used in the manufacture of BMKP for cytotransfusion. A heterogeneous biodegradable polymer matrix (HDBM) is used to obtain a BMCC form intended for implantation, for example, a biopolymer matrix developed by us (see RU No. 2249462), which is an official medical device and approved for clinical use in the Russian Federation or its analogue.
Подготовка к применению и применение БМКП.Preparation for use and application of BMKP.
Подготовка БМКП к трансфузии и его применение.Preparation of BMKP for transfusion and its use.
Осуществляют размораживание компонентов А,Б и В непосредственно перед использованием на водяной бане при температуре 37-40°С до момента перехода замороженного материала в жидкую фазу. Далее каждый используемый компонент центрифугированием при 1500 об/мин осаждают на дно центрифужной пробирки, удаляют надосадочную жидкость и заливают 1 мл 0,9% физиологического раствора NaCl или трансфузируют в гетерогенный биополимерный коллагеновый матрикс. Процедуру повторяют дважды. Каждый компонент препарата в после разморозки пригоден для использования в течение 6 ч после приготовления, после чего он подлежит утилизации.Thawing of components A, B and C is carried out immediately before use in a water bath at a temperature of 37-40 ° C until the frozen material passes into the liquid phase. Next, each component used by centrifugation at 1500 rpm is precipitated to the bottom of the centrifuge tube, the supernatant is removed, and 1 ml of 0.9% physiological saline NaCl solution is added or transfused into a heterogeneous biopolymer collagen matrix. The procedure is repeated twice. After defrosting, each component of the drug is suitable for use within 6 hours after preparation, after which it must be disposed of.
Внутривенная или внутриартериальная трансфузия БМКП.Intravenous or intraarterial transfusion of BMKP.
Внутривенное или внутриартериальное введение БМКП производят стандартным медленным болюсным введением от одной до 20 биодоз.Intravenous or intra-arterial administration of BMPP is carried out by standard slow bolus administration of one to 20 biodoses.
Интратекальное введение БМКП.Intrathecal administration of BMKP.
Интратекальное введение препарата должно производиться только в условиях реанимационного отделения. Трансфузия препарата осуществляется через люмбальный прокол, выполненный в типичном месте (в L3-L4 промежутке) под местной анестезией 1% раствора лидокаина. Затем забирают 3 мл ликвора и смешивают с одной или 2-мя биодозами клеточного препарата (максимальный объем до 3 мл), ресуспензируют клеточный препарат в ликворе и медленно вводят в субарахноидальное пространство. Накладывают асептическую повязку. При необходимости повторяют интратекальные трансфузии препарата, но не ранее чем через 7 дней после цитотранфузии. Для коррекции возможных аллергических реакций с профилактической целью делается однократное внутримышечное введение кортикостероидных препаратов (4 мг дексаметазона).Intrathecal administration of the drug should be carried out only in the intensive care unit. Transfusion of the drug is carried out through a lumbar puncture, performed in a typical place (in the L3-L4 gap) under local anesthesia of a 1% lidocaine solution. Then 3 ml of cerebrospinal fluid are taken and mixed with one or 2 biodoses of the cell preparation (maximum volume up to 3 ml), the cell preparation is resuspended in the cerebrospinal fluid and slowly introduced into the subarachnoid space. Apply an aseptic dressing. If necessary, repeat intrathecal transfusion of the drug, but not earlier than 7 days after cytotransfusion. For the correction of possible allergic reactions as a preventive measure, a single intramuscular injection of corticosteroid drugs (4 mg of dexamethasone) is done.
Основными критериями эффективности проведенного вмешательства является улучшение клинической симптоматики. Срок ожидаемого результата крайне индивидуален для каждого пациента и зависит от объема повреждения органа, давности травмы, степени компенсации нарушенных функций. Эффективность терапии варьирует от 1-3 дней до 12-16 месяцев после трансфузии, и оценивается клиническими шкалами и электрофизиологическими методами исследования (ЭКГ, церебральным картированием ЭЭГ, транскраниальной магнитной стимуляцией, соматосенсорными вызванными потенциалами и электонейромиографией, а также комплексным уродинамическим исследованием и т.д.).The main criteria for the effectiveness of the intervention is the improvement of clinical symptoms. The term of the expected result is extremely individual for each patient and depends on the amount of organ damage, the duration of the injury, the degree of compensation of impaired functions. The effectiveness of therapy varies from 1-3 days to 12-16 months after transfusion, and is evaluated by clinical scales and electrophysiological research methods (ECG, cerebral mapping of EEG, transcranial magnetic stimulation, somatosensory evoked potentials and electroneuromyography, as well as complex urodynamic research, etc. .).
Возможные осложнения и способы их устранения.Possible complications and methods for their elimination.
Нами не выявлен ни один факт осложнения, связанного с инфузиями БМКП в кровь и ликвор пациентов, что связано с применением аутологичного биоматериала и иммуносовместимого аллогенного материала, подобранного по иммунофенотипу крови. Однако теоретически возможны аллергические реакции на криопрофилактик ДМСО в случае недостаточной его отмывки перед употреблением. Способы устранения подобных аллергических реакций являются стандартными. Для профилактики возможных аллергических реакций пациента на трансфузию препарата целесообразно за 20 минут до манипуляции произвести однократное внутримышечное введение препарата «Дексаметазон» в дозе 4 мг/мл. Наличие возможных осложнений данного метода заставляет проводить интратекальные и интравентрикулярные трансфузии только в условиях реанимации стационарного отделения.We have not revealed a single fact of complication associated with BMPC infusion into the blood and cerebrospinal fluid of patients, which is associated with the use of autologous biomaterial and immunocompatible allogeneic material, selected according to the immunophenotype of the blood. However, allergic reactions to DMSO cryoprophylaxis are theoretically possible in case of insufficient washing before use. Ways to eliminate such allergic reactions are standard. To prevent possible allergic reactions of the patient to transfusion of the drug, it is advisable to make a single intramuscular injection of the drug “Dexamethasone” at a dose of 4 mg / ml 20 minutes before the manipulation. The presence of possible complications of this method forces to conduct intrathecal and intraventricular transfusions only in the conditions of resuscitation of the inpatient unit.
Оценка эффективности и безопасности БМКП.Assessment of the effectiveness and safety of BMKP.
Выявлена высокая эффективность применения БМПК при реабилитации онкологических больных после лучевой и химиотерапии, а также применении у ослабленных и геронтологических пациентов. Экономическая эффективность применения БМКП пациентам по сравнению только аутологичных ГСК в лейкоконцентрате мобилизованных мононуклеаров костного мозга очевидна и не вызывает сомнения. Возвращение пациентов после повреждений головного и спинного мозга к нормальной общественно-социальной деятельности, реабилитация онкологических больных после лучевой и химиотерапии, улучшение качества жизни ослабленных и геронтологических больных, даже при небольшом улучшении качества их жизни несет в себе большую экономическую целесообразность и социальную обоснованность как с учетом возобновления трудовой деятельности, так и с учетом уменьшения затрат на длительное и малоэффективное фармакологическое лечение и только физическую реабилитацию. Иллюстрацией этого положения могут стать примеры экспериментального применения изобретения в клинике.High efficacy of BMPK was revealed in the rehabilitation of cancer patients after radiation and chemotherapy, as well as in weak and gerontological patients. The cost-effectiveness of using BMD in patients compared to only autologous HSCs in the leukoconcentrate of mobilized bone marrow mononuclear cells is obvious and not in doubt. The return of patients after injuries of the brain and spinal cord to normal social and social activities, the rehabilitation of cancer patients after radiation and chemotherapy, the improvement of the quality of life of weakened and gerontological patients, even with a slight improvement in the quality of their life, carries with it great economic feasibility and social justification, taking into account the resumption of work, and taking into account the reduction in the cost of long-term and ineffective pharmacological treatment and only physically th rehabilitation. An example of this position can be examples of the experimental application of the invention in a clinic.
Пример 1. Больной Б., 82 года поступил 15.05.10 в стационар с диагнозом «Периферический рак левого легкого Т2 Мо Nо», где диагноз злокачественного онкологического заболевания был подтвержден данными клинического обследования и параклинического исследования. При лучевой диагностике: на рентгенограммах легких от 19.05.10 г. в S6 нижней доле левого легкого фокус уплотнения легочной ткани размером около 4 см диаметром, который в прямой проекции наслаивается на корень легкого. Увеличения лимфоузлов не определялось. Слева также определялась плевродиафрагмальная шварта. Ширина срединной тени на уровне передних отрезков 3 ребер 7,3 см, выпота в плевральных полостях нет. В правом легком без патологии, КТ легких 20.05.10 – в S6 левого легкого определяется опухолевый узел 3,5 см в диаметре с лучистыми контурами – КТ картина периферического рака S6, КТ головного мозга от 24.05.2010 - выраженные проявления сосудистой энцефалопатии. Метастатических очаговых изменений не выявлено. УЗИ органов брюшной полости от 20.05.2010 – диффузные изменения печени и поджелудочной железы, жировая инфильтрация. Парапельвикальные кисты почек. Атеросклероз брюшной аорты. Атеросклероз, окклюзия левой ВСА. Радиоизотопное исследование костной системы от 25.05.2010 - на обзорных сцинтиграммах определяются очаги гиперфиксации РПФ в области передних отрезков 5,6 ребер справа, проксимального отдела правой плечевой кости, более характерные для травматических изменений в области позвоночника, в крупных суставах определяются признаки грубых дистрофических изменений. В других отделах скелета без изменений. ПЭТ от 27.05.2010 г. накопление РФП в S6 сегменте левого легкого, в других отделах скелета накопления РФП не выявлено. 26.05.10 проведена бронхоскопия – опухолевой патологии не выявлено, получено 10 стекол аспирата из S6 слева, при цитологическом исследовании которого от 26.05.10 выявлена аденокарцинома, БДУ умеренно дифференцированная. Спирометрия от 10.05.2010. Умеренное снижение 1 ст. легочных объемов. Умеренные обструкции, выраженное (2 ст.) снижение резервов вентиляции. РЭА (Раковый Эмбриональный Антиген) 2.2 мкг/л. В 10.00 час 5.06.2010 г. больной взят в операционную для резекции опухолевого узла нижней доли левого легкого, где после проведения мультимодальной комбинированной анестезии у больного в стерильных условиях из правой подвздошной кости взят аспират костного мозга в объеме 5мл и помещен в стерильный вакутаймер. Произведена нижняя лобэктомия слева. Из удаленной доли левого легкого в операционной произведена резекция опухолевого узла в 11 час 10 мин. Также интраоперационно проведено цитологическое исследование ткани части доли удаленного легкого, при котором диагноз аденокарциномы легких подтвержден. Часть опухолевого узла легкого взята на иммунохимическое и гистологическое исследование, другая часть изъята для изготовления персонифицированного противоопухолевого препарата (ППОП). Больной удовлетворительно перенес циторедуктивную операцию и переведен в отделение реанимации в 13 часов 5.06.2010 г. Через 3 суток для дальнейшего лечения в удовлетворительном состоянии был переведен из отделения реанимации в хирургическое отделение. Перед операцией пациента у его практически здорового родного сына (гаплоиндентичного по HLA, 46 лет) была произведена мобилизация гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) с использованием колониестимулирующего фактора препарата «Граноцит» в течение 4 дней и 3.06.2010 у него осуществлен сбор мобилизованных ГСК. Биоматериал из опухоли и костного мозга пациента был направлен в течение 2-х часов после забора у пациента в культуральную лабораторию для исследований, где опухолевая ткань легкого в дальнейшем была ресуспендирована трипсином на клетки и проведена идентификация раковых стволовых клеток с маркером СD133+ и их иммуномагнитосепарация из культуральной взвеси опухолевых клеток. Из эксфузата костного мозга пациента иммуносепарацией на магнитных шариках выделяли СК с маркером СD34+ и СD133+. Выделенные РСК из опухоли легких и гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) из костного мозга культивировались и из них готовились лизаты с использованием раствора Lysis Buffer 16 (1х107 клеток/мл) с протеазными ингибиторами. В дальнейшем в лаборатории онкопротеомики ФГБУ РОНЦ РАМН проведена масс-спектроскопия лизатов здоровых ГСК и РСК выделенных из клеток аденокарциномы легких. Результаты протеомного анализа ГСК и РСК были оценены с позиций теории управления систем и было установлено количество подобных белков ко всем картированным белкам МСК и РСК, выделенных из аденокарциномы (всего 5,8%). Данные сравнительного протеомного анализа были переданы в Департамент информационных исследований специализированного вычислительного центра для проведения математического моделирования. Путем анализа полученной матрицы подобия белков были установлены ключевые белки в протемном профиле РСК. С учетом крайне высоких показателей ключевых белков (КБ) в протемном профиле гаплоидентичных ГСК сына пациента было решено применить для создания регуляторных клеточных систем метод инверсии показателей КБ. Был проведен полный транскриптомный анализ ГСК пациента и в базе данных компании Affimetrix (USA) найден комплекс веществ «фактор роста фибробластов и преднизолон», которые способны выступить в качестве химического ремоделирующего агента и максимально ингибировать экспрессию ключевых белков в траснкриптомном профиле донора, при экспозиции ГСК с ними. В результате обработки ГСК был модифицирован протемный профиль гаплоидентичных ГСК путем инверсии ключевых белков в нем. Кокультивирование культуры клеток опухоли легкого больного с протеом-модифицированными ГСК сына пациента показало эффективность подавления опухолевого роста за неделю на +++ по сравнению с контролем (ГСК пациента). Осуществлена стандартная процедура криоконсервации клеток ГСК пациента и его сына, а также РСК опухоли пациента. 27.06.2010 г. больной в удовлетворительном состоянии был выписан из стационара под динамическое наблюдение онколога по месту жительства. При амбулаторном обследовании у онколога по месту жительства было решено 29.06.2010 выполнить ПЭТ пациента на предмет оценки эффективности проведенной циторедуктивной терапии, при котором было выявлено стойкое накопление РФП в зоне операционного рубца, других очагов накопления РФП выявлено не было. Учитывая старческий возраст, нестабильность системной гемодинамики и его выраженную соматическую ослабленность, специалистами онкологами были выставлены противопоказания к применению лучевой и химиотерапии. Больной был включен в программу экспериментальной персонифицированной противоопухолевой терапии (ППОТ). Было начато проведение внутривенного введения протеом-модифицированных ГСК, полученных от сына пациента. Трансфузии этих клеточных систем проводили внутривенно каждые в 2-3 недели в дозе 5х106 клеток. Проведено 20 внутривенных трансфузий ППОП.Example 1. Patient B., 82 years old, was admitted on 05.15.10 to a hospital with a diagnosis of peripheral cancer of the left lung T2 Mo No, where the diagnosis of malignant cancer was confirmed by clinical examination and paraclinical studies. For radiation diagnostics: on X-ray of the lungs dated 05/19/10 in the S6 of the lower lobe of the left lung, the focus of lung tissue compaction is about 4 cm in diameter, which in direct projection is layered on the root of the lung. No enlargement of the lymph nodes was detected. On the left, the pleurodiaphragmatic mooring was also defined. The width of the middle shadow at the level of the anterior segments of the 3 ribs is 7.3 cm; there is no effusion in the pleural cavities. In the right lung without pathology, CT of the lungs 05/20/10 - in the S6 of the left lung a tumor node 3.5 cm in diameter with radiant contours is determined - CT picture of peripheral cancer S6, CT of the brain from 05.24.2010 - pronounced manifestations of vascular encephalopathy. No metastatic focal changes. Ultrasound of the abdominal cavity from 05/20/2010 - diffuse changes in the liver and pancreas, fatty infiltration. Parapelvic cysts of the kidneys. Atherosclerosis of the abdominal aorta. Atherosclerosis, occlusion of the left ICA. Radioisotope study of the skeletal system from 05/25/2010 - on the scintigrams survey, foci of RPF hyperfixation are determined in the area of the anterior segments of 5.6 ribs on the right, the proximal part of the right humerus, more characteristic of traumatic changes in the spine, signs of gross dystrophic changes are detected in large joints. In other parts of the skeleton unchanged. PET from 05/27/2010, the accumulation of radiopharmaceuticals in the S6 segment of the left lung, in other parts of the skeleton of the accumulation of radiopharmaceuticals was not detected. Bronchoscopy was performed on 05/26/10 - no tumor pathology was detected, 10 glasses of aspirate from S6 on the left were obtained, with a cytological examination of which dated 05/26/10 an adenocarcinoma was detected, the NOS is moderately differentiated. Spirometry from 05/10/2010. Moderate reduction of 1 tbsp. pulmonary volumes. Moderate obstruction, pronounced (2 tbsp.) Reduction in ventilation reserves. CEA (Cancer Embryonic Antigen) 2.2 μg / L. At 10.00 a.m. on 5.06.2010, the patient was taken to the operating room for resection of the tumor node of the lower lobe of the left lung, where after multimodal combined anesthesia the patient under sterile conditions was taken from the right iliac bone marrow aspirate in a volume of 5 ml and placed in a sterile vacuum chamber. Produced lower lobectomy on the left. From the removed lobe of the left lung in the operating room, a tumor node was resected at 11 hours 10 minutes. A cytological examination of the tissue of part of the removed lung lobe was also performed intraoperatively, in which the diagnosis of lung adenocarcinoma was confirmed. Part of the tumor node of the lung was taken for immunochemical and histological examination, the other part was taken for the manufacture of a personalized antitumor drug (PEPO). The patient satisfactorily underwent cytoreductive surgery and was transferred to the intensive care unit at 13 hours on 06/05/2010. After 3 days for further treatment, he was transferred from the intensive care unit to the surgical department in satisfactory condition. Before the operation of the patient, his practically healthy natural son (HLA-identical for HLA, 46 years old) was mobilized with hematopoietic stem cells (HSCs) using the colony-stimulating factor of the drug “Granocyte” for 4 days and on 3.06.2010 he collected mobilized HSCs. The biomaterial from the patient’s tumor and bone marrow was sent within 2 hours after the patient had been taken to a culture laboratory for studies, where the tumor tissue of the lung was subsequently resuspended by trypsin onto the cells and cancer stem cells were identified with the marker CD133 + and immunomagnetoseparation from the culture suspensions of tumor cells. CK with marker CD34 + and CD133 + was isolated from magnetic bone marrow exfusate of the patient by immunoseparation. Isolated CSCs from a lung tumor and hematopoietic stem cells (HSCs) from bone marrow were cultured and lysates were prepared using Lysis Buffer 16 solution (1 × 10 7 cells / ml) with protease inhibitors. Subsequently, in the oncoproteomics laboratory of the FSBI RONC RAMS, mass spectroscopy of lysates of healthy HSCs and CSCs isolated from lung adenocarcinoma cells was performed. The results of the proteomic analysis of HSCs and CSCs were evaluated from the point of view of control theory of systems and the number of similar proteins was found for all mapped proteins of MSCs and CSCs isolated from adenocarcinoma (only 5.8%). Comparative proteomic analysis data was transferred to the Department of Information Research of a specialized computing center for mathematical modeling. By analyzing the obtained protein similarity matrix, key proteins were identified in the CKD protrusion profile. Given the extremely high rates of key proteins (KB) in the dark profile of haploidentical HSCs of the patient’s son, it was decided to use the method of inversion of KB indicators to create regulatory cell systems. A complete transcriptome analysis of the patient’s HSC was performed and a set of substances “fibroblast growth factor and prednisolone” was found in the Affimetrix (USA) database, which can act as a chemical remodeling agent and maximally inhibit the expression of key proteins in the donor transcriptome profile when exposed to HSC with them. As a result of HSC treatment, the protomeric profile of haploidentical HSCs was modified by inversion of key proteins in it. Co-cultivation of a tumor cell culture of a patient’s lung with proteome-modified HSCs of the patient’s son showed the suppression of tumor growth by +++ per week compared with the control (HSC of the patient). The standard procedure for cryopreservation of HSC cells of the patient and his son, as well as the CSC of the tumor of the patient, was carried out. 06/27/2010, the patient in satisfactory condition was discharged from the hospital under the dynamic supervision of an oncologist at the place of residence. During an outpatient examination by an oncologist at the place of residence, it was decided on June 29, 2010 to perform a patient’s PET to assess the effectiveness of the cytoreductive therapy, which revealed a persistent accumulation of radiopharmaceuticals in the area of the surgical scar, no other foci of radiopharmaceutical accumulation were detected. Given the senile age, the instability of systemic hemodynamics and its pronounced somatic weakness, oncologists have put up contraindications to the use of radiation and chemotherapy. The patient was included in the program of experimental personified antitumor therapy (PPOT). The intravenous administration of proteome-modified HSCs obtained from the patient’s son was started. Transfusions of these cell systems were carried out intravenously every 2-3 weeks at a dose of 5x10 6 cells. Conducted 20 intravenous transfusions of PPO.
Применение технологии персонифицированного клеточного противоопухолевого препарата в лечении пациента в течение последующих 1.8 лет не выявило появление новых очагов опухоли или метастатического поражения. При ПЭТ исследовании легких зона накопления радиофармпрепарата осталась на прежнем уровне без существенной динамики.The use of the technology of a personalized cellular antitumor drug in the treatment of a patient over the next 1.8 years did not reveal the appearance of new tumor foci or metastatic lesions. During PET examination of the lungs, the accumulation zone of the radiopharmaceutical remained at the same level without significant dynamics.
Пример 2. Больной Г., 16 лет, госпитализирован в клинику 5.06.2011 г. для контрольного обследования. Диагноз: Рецидивирующая глиобластома левой теменно-затылочной области головного мозга. Жалоб не предъявляет. Из анамнеза. В мае 2004 г. в НИИ нейрохирургии им. Н.Н. Бурденко больному диагностирована глиобластома теменно-затылочной области слева. В этом же месяце 2004 г. осуществлена циторедуктивная нейрохирургическая операция, с последующим курсом рентгенохирургии и химиотерапии препаратом темодал по стандартной схеме. В течение 15 месяцев отмечалась ремиссия заболевания, но 13 августа 2005 г. при контрольной МРТ головного мозга выявлен рецидив глиобластомы в ложе удаленной опухоли. Произведена повторная резекция рецидива глиальной опухоли 25 августа 2005 г. Перед операцией пациента у его практически здоровой матери (гаплоиндентичной по HLA), 36 лет была произведена мобилизация (ГСК) с использованием колониестимулирующего фактора препарата «Граноцит» в течение 4 дней и осуществлен сбор мобилизованных ГСК. Биоматериал из глиальной опухоли и костного мозга пациента был направлен в течение 3-х часов после забора у пациента в культуральную лабораторию отдела фундаментальной нейробиологии ГНЦССП им В.П.Сербского. Опухолевая ткань из глиобластомы в дальнейшем была ресуспендирована трипсином на клетки и проведена идентификация раковых стволовых клеток с маркером СD133+ и их иммуномагнитосепарация из культуральной взвеси опухолевых клеток. Из эксфузата костного мозга пациента иммуносепарацией на магнитных шариках выделяли СК с маркером СD34+ и СD133+. Выделенные РСК из опухоли глиобластомы и гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) из костного мозга культивировались и из них готовились лизаты с использованием раствора Lysis Buffer 16 (1х107 клеток/мл) с протеазными ингибиторами. В дальнейшем в лаборатории онкопротеомики РОНЦ РАМН им Н.Н.Блохина проведена масс-спектроскопия лизатов здоровых ГСК и РСК выделенных из глиобластомы. По результатам протеомного анализа ГСК и РСК, был проведен полный протеомный и транскриптомный анализ генома ГСК пациента и глиомасфер, выделенных из опухоли пациента. Данные сравнительного транскриптомного и протеомного анализа показали, что только 31% белков опухоли глиомасферы были представлены неопластически измененными белками. Данные были переданы в лабораторию молекулярного конструирования лекарственных средств ФГБУ ФКНЦ ФМБА России для проведения математического моделирования и выделения внутриклеточных сигнальных путей (ВКСП) в глиомасфере, не подвергшихся неопластической трансформации, где после завершения математического этапа работы был определен наиболее хорошо функционирующий ВКСП значимый для глиомасферы путь, изготовлена регуляторная информационная матрица (РИМ), которая с помощью стандартных программных средств была суммирована с электромагнитными волнами крайне высокой частоты (длина волны 4.9 мм, частота 60.12 ГГц). Кокультивирование культуры клеток опухоли глиобластомы больного с индуцированными ГСК матери пациента показало эффективность подавления опухолевого роста за неделю на ++ по сравнению с контролем (ГСК пациента). Осуществлена стандартная процедура криоконсервации клеток ГСК пациента и его матери, а также РСК опухоли пациента. В последующем через 6 месяцев диагностирован повторный рецидив глиобластомы в феврале 2006 г. Больному проведен курс химиотерапии темодалом и иринотеканом по стандартной схеме, состояние стабилизировалось. В августе 2006 в ложе повторных резекций глиобластомы выявлен новый рецидив опухоли. Хирургическое лечение признано нецелесообразным, исчерпаны возможности лучевой терапии (суммарная доза облучения составила более 50 грэй на зону головного мозга) и химиотерапии. Все виды конвенциональной терапии глиобластом были исчерпаны. В августе 2006г. больному проведен экспериментальный курс лечения персонифицированным противоопухолевым препаратом (ППОП), который вводился интратекально в течение 40 раз каждые в недели в течение 2-х лет. Опухоль значительно регрессировала (смотри результаты МРТ и ПЭТ в динамике). С августа 2008 года терапия остановлена. 4-й рецидив опухоли отмечен 29 июля 2010 года. Больному проведен курс интратекального введения ППОП в дозе 1-1.3х106 в количестве 30 инфузий в течение 23 месяцев. На ПЭТ – исследовании головного мозга выявлены накопления РФП в зоне опухоли. В настоящее время пациент жив, опухоль значительно регрессировала но не исчезла. Больной учится в школе.Example 2. Patient G., 16 years old, was hospitalized in the clinic on 5.06.2011 for a follow-up examination. Diagnosis: Recurrent glioblastoma of the left parieto-occipital region of the brain. No complaints. From the anamnesis. In May 2004, at the Institute of Neurosurgery. N.N. Burdenko the patient was diagnosed with glioblastoma of the parieto-occipital region on the left. In the same month of 2004, a cytoreductive neurosurgical operation was performed, followed by a course of x-ray surgery and chemotherapy with Temodal according to the standard scheme. A disease remission was observed for 15 months, but on August 13, 2005, a control MRI of the brain revealed a relapse of glioblastoma in the bed of the removed tumor. A resection of the recurrence of a glial tumor was performed on August 25, 2005. Before the operation, the patient had a healthy mother (haploidentical according to HLA), 36 years old, was mobilized (HSC) using the colony-stimulating factor of the drug “Granocyte” for 4 days and the mobilized HSC was collected . The biomaterial from the patient’s glial tumor and bone marrow was sent within 3 hours after the patient had been taken to the cultural laboratory of the Department of Fundamental Neurobiology of the V.P. Serbsky State Scientific Center for Scientific and Technological Research. The tumor tissue from glioblastoma was subsequently resuspended by trypsin on the cells and cancer stem cells were identified with the marker CD133 + and their immunomagnetoseparation from the culture suspension of tumor cells. CK with marker CD34 + and CD133 + was isolated from magnetic bone marrow exfusate of the patient by immunoseparation. Isolated CSCs from a glioblastoma tumor and hematopoietic stem cells (HSCs) from bone marrow were cultured and lysates were prepared using Lysis Buffer 16 solution (1 × 10 7 cells / ml) with protease inhibitors. Subsequently, the mass spectroscopy of lysates of healthy HSCs and CSCs isolated from glioblastomas was performed at the oncoproteomics laboratory of the Russian Oncology Research Center RAMS named after N.N. Blokhin. According to the results of the proteomic analysis of HSCs and CSCs, a complete proteomic and transcriptome analysis of the patient’s HSC genome and gliomaspheres isolated from the patient’s tumor was performed. Comparative transcriptome and proteomic analysis data showed that only 31% of the gliomasphere tumor proteins were neoplastic modified proteins. The data were transferred to the laboratory for molecular design of drugs FSBI FKNC FMBA of Russia for mathematical modeling and isolation of intracellular signaling pathways (VCSP) in the gliomasphere, which did not undergo neoplastic transformation, where after the completion of the mathematical stage of work, the most well functioning VCSP pathway significant for the gliomassphere was determined a regulatory information matrix (ROM) was made, which was summed with an electron using standard software netic waves of extremely high frequency (wavelength 4.9 mm, the frequency of 60.12 GHz). Co-cultivation of a cell culture of a patient’s glioblastoma tumor with induced HSCs of the patient’s mother showed the effectiveness of suppressing tumor growth per week by ++ compared with the control (patient HSCs). The standard procedure for cryopreservation of HSC cells of the patient and his mother, as well as the CSC of the patient’s tumor, was carried out. Subsequently, after 6 months, a repeated relapse of glioblastoma was diagnosed in February 2006. The patient received chemotherapy with temodal and irinotecan according to the standard regimen, and his condition stabilized. In August 2006, a new tumor recurrence was revealed in the bed of repeated resections of glioblastoma. Surgical treatment was deemed inappropriate, the possibilities of radiation therapy (the total dose of radiation was more than 50 gray per brain area) and chemotherapy were exhausted. All types of conventional glioblastoma therapy have been exhausted. In August 2006 the patient underwent an experimental course of treatment with a personalized antitumor drug (PEPO), which was administered intrathecally for 40 times every week for 2 years. The tumor regressed significantly (see the results of MRI and PET dynamics). Since August 2008, therapy has been stopped. The 4th relapse of the tumor was observed on July 29, 2010. The patient received a course of intrathecal administration of PPO at a dose of 1-1.3x10 6 in the amount of 30 infusions for 23 months. On a PET study of the brain, accumulations of radiopharmaceuticals in the tumor zone were revealed. Currently, the patient is alive, the tumor regressed significantly but did not disappear. The patient is in school.
Предложенный способ изготовления и применения противоопухолевого клеточного препарата может быть рассмотрен как инновационное направление персонифицированной медицины в лечении опухолей человека и млекопитающих.The proposed method for the manufacture and use of an antitumor cell preparation can be considered as an innovative direction of personalized medicine in the treatment of human and mammalian tumors.
При этом составные части БМКП прошли длительную апробацию. Так, компонент «А» БМКП применяли с 2003 г. по 2005 г. при ограниченных клинических испытаниях, с 2005 г. по 2008 г. как официально разрешенная к клиническому применению медицинская технология. С 2009 г. по ноябрь 2013 года компонент «А» применяется разработчиками в совместных медицинских исследованиях с ФГБУ «Российский онкологический научный центр» им Н.Н.Блохина Минздрава РФ. За 9 лет экспериментального и клинического применения изолированного компонента «А» была оценена его эффективность, которая была основана на клиническом исследовании и ретроспективном многолетнем изучении 2780 историй болезни 458 пациентов с различными органическими заболеваниями центральной нервной системы (ЦНС), проходивших многолетнее стационарное экспериментальное лечение с сентября 2002 года по март 2016 года.At the same time, the components of BMKP underwent lengthy testing. So, component “A” BMPC was used from 2003 to 2005 with limited clinical trials, from 2005 to 2008 as a medical technology officially approved for clinical use. From 2009 to November 2013, component "A" is used by developers in joint medical research with the Federal State Budgetary Institution "Russian Cancer Research Center" named after N.N. Blokhin of the Ministry of Health of the Russian Federation. For 9 years of experimental and clinical use of the isolated component “A”, its effectiveness was evaluated, which was based on a clinical study and a long-term retrospective study of 2780 case histories of 458 patients with various organic diseases of the central nervous system (CNS) who underwent long-term in-patient experimental treatment since September 2002 to March 2016.
Для лечения разных типов повреждений нервной ткани ГМ и СМ применялись различные виды клеточных препаратов, в т.ч. используемых в составе заявленного БКМП: препарат мобилизованных из костного мозга гемопоэтических стволовых и прогенеторных (CD34+,CD45-) клеток (ГСК), нейральных стволовых клеток (CD 133+), выделенные из обонятельной выстилки пациента и мезенхимальные стромальные СК, выделенные из костного мозга пациента. Весь клеточный материал был стандартизирован и сертифицирован государственными научно-исследовательскими учреждениями.For the treatment of different types of damage to the nervous tissue of GM and SM, various types of cell preparations were used, including used as part of the claimed BCMP: a preparation of hematopoietic stem and progenitor (CD34 +, CD45-) cells (HSC) mobilized from bone marrow, neural stem cells (CD 133+) isolated from the patient’s olfactory lining and mesenchymal stromal SC isolated from the patient’s bone marrow . All cellular material has been standardized and certified by government research institutions.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017103692A RU2647429C1 (en) | 2017-02-06 | 2017-02-06 | Biomedical cell preparation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017103692A RU2647429C1 (en) | 2017-02-06 | 2017-02-06 | Biomedical cell preparation |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2647429C1 true RU2647429C1 (en) | 2018-03-15 |
Family
ID=61629390
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017103692A RU2647429C1 (en) | 2017-02-06 | 2017-02-06 | Biomedical cell preparation |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2647429C1 (en) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2741769C2 (en) * | 2018-12-21 | 2021-01-28 | Андрей Степанович БРЮХОВЕЦКИЙ | Biomedical cell product, method for its production and application |
| RU2757812C2 (en) * | 2018-12-28 | 2021-10-21 | Андрей Степанович БРЮХОВЕЦКИЙ | Antitumor target cell product, method for its production and its application |
| CN114196619A (en) * | 2021-12-27 | 2022-03-18 | 深圳博雅感知医疗科技有限公司 | Mobilized peripheral blood concentrated cell therapeutic agent for treating premature ovarian failure |
| RU2774350C2 (en) * | 2019-11-11 | 2022-06-17 | Андрей Степанович БРЮХОВЕЦКИЙ | Method for obtaining biomedical cell product for treatment of oncological, neurodegenerative and autoimmune diseases |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000050568A2 (en) * | 1999-02-24 | 2000-08-31 | Reneuron Limited | Transplantation of haematopoietic cells |
| RU2164240C2 (en) * | 1990-12-17 | 2001-03-20 | Риджентс оф дзе Юниверсити оф Мичиган | Method of cultivation, fibroblasts, method of cell separation |
| RU2283119C1 (en) * | 2005-03-29 | 2006-09-10 | Андрей Степанович БРЮХОВЕЦКИЙ | Autologic hemopoietic stem cells preparation and method for producing, cryogenic preserving and applying it in treating traumatic nervous system disease cases |
-
2017
- 2017-02-06 RU RU2017103692A patent/RU2647429C1/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2164240C2 (en) * | 1990-12-17 | 2001-03-20 | Риджентс оф дзе Юниверсити оф Мичиган | Method of cultivation, fibroblasts, method of cell separation |
| WO2000050568A2 (en) * | 1999-02-24 | 2000-08-31 | Reneuron Limited | Transplantation of haematopoietic cells |
| RU2283119C1 (en) * | 2005-03-29 | 2006-09-10 | Андрей Степанович БРЮХОВЕЦКИЙ | Autologic hemopoietic stem cells preparation and method for producing, cryogenic preserving and applying it in treating traumatic nervous system disease cases |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| CHOPP ET AL., ADULT BONE MARROW TRANSPLANTATION FOR TREATMENT OF STROKE IN ADULT MICE // SOCIETY FOR NEUROSCIENCE, (1999), vol. 25, page 528.2, . * |
| CHOPP ET AL., ADULT BONE MARROW TRANSPLANTATION FOR TREATMENT OF STROKE IN ADULT MICE // SOCIETY FOR NEUROSCIENCE, (1999), vol. 25, page 528.2, реферат. * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2741769C2 (en) * | 2018-12-21 | 2021-01-28 | Андрей Степанович БРЮХОВЕЦКИЙ | Biomedical cell product, method for its production and application |
| RU2757812C2 (en) * | 2018-12-28 | 2021-10-21 | Андрей Степанович БРЮХОВЕЦКИЙ | Antitumor target cell product, method for its production and its application |
| RU2774350C2 (en) * | 2019-11-11 | 2022-06-17 | Андрей Степанович БРЮХОВЕЦКИЙ | Method for obtaining biomedical cell product for treatment of oncological, neurodegenerative and autoimmune diseases |
| CN114196619A (en) * | 2021-12-27 | 2022-03-18 | 深圳博雅感知医疗科技有限公司 | Mobilized peripheral blood concentrated cell therapeutic agent for treating premature ovarian failure |
| CN114196619B (en) * | 2021-12-27 | 2023-11-07 | 深圳博雅感知医疗科技有限公司 | Mobilized peripheral blood concentrated cell therapeutic agent for treating premature ovarian failure |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Liesveld et al. | Stem cell homing: From physiology to therapeutics | |
| Cox Jr et al. | Autologous bone marrow mononuclear cell therapy for severe traumatic brain injury in children | |
| Nikeghbalian et al. | Autologous transplantation of bone marrow-derived mononuclear and CD133+ cells in patients with decompensated cirrhosis | |
| Bang et al. | Autologous mesenchymal stem cell transplantation in stroke patients | |
| Mansour et al. | COMPARE-AMI trial: comparison of intracoronary injection of CD133+ bone marrow stem cells to placebo in patients after acute myocardial infarction and left ventricular dysfunction: study rationale and design | |
| US20100303766A1 (en) | Cell population with enhanced transplantation activity | |
| Asiedu et al. | Bone marrow cell trafficking analyzed by 89Zr-oxine positron emission tomography in a murine transplantation model | |
| Cheng et al. | Mesenchymal stem cell administration in patients with chronic obstructive pulmonary disease: state of the science | |
| EP1771551B1 (en) | Novel cell populations and uses thereof | |
| RU2647429C1 (en) | Biomedical cell preparation | |
| Horak et al. | Evaluation of mesenchymal stem cell therapy for sepsis: a randomized controlled porcine study | |
| US20060193836A1 (en) | Method and composition for repairing heart tissue | |
| Saka et al. | Adipose‐derived stromal cells cultured in a low‐serum medium, but not bone marrow‐derived stromal cells, impede xenoantibody production | |
| JP2020535816A (en) | Proliferation of NK cell fractions and use of proliferating NK cell fractions | |
| Zhang et al. | Enhanced cytoprotection and angiogenesis by bone marrow cell transplantation may contribute to improved ischemic myocardial function | |
| Nishiwaki et al. | Efficacy and safety of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells for supporting hematopoiesis | |
| CN111918963A (en) | CD3 negative cell population expressing chemokine receptor and cell adhesion molecule and its use and preparation method | |
| Zanetti et al. | Suspension-expansion of bone marrow results in small mesenchymal stem cells exhibiting increased transpulmonary passage following intravenous administration | |
| Astori et al. | Bone marrow derived stem cells in regenerative medicine as advanced therapy medicinal products | |
| Qin et al. | Evaluation of ex vivo produced endothelial progenitor cells for autologous transplantation in primates | |
| Ismail et al. | The effect of in vivo mobilization of bone marrow stem cells on the pancreas of diabetic albino rats (a histological & immunohistochemical study) | |
| Sanchez-Petitto et al. | Umbilical cord blood transplantation: connecting its origin to its future | |
| US20210238549A1 (en) | Use of memory lymphocyte population in liver cancer treatment | |
| RU2360965C1 (en) | METHOD OF INCREASING NUMBER OF PATIENT'S HAEMOPOETIC UNDIFFERENTIATED STEM CELLS ex vivo | |
| Lee et al. | Effect of mesenchymal stem cell transplantation on the engraftment of human hematopoietic stem cells and leukemic cells in mice model |