RU2496870C2 - Method to produce epithelioid cells of light foetus of buffalo cow for cultivation of viruses - Google Patents
Method to produce epithelioid cells of light foetus of buffalo cow for cultivation of viruses Download PDFInfo
- Publication number
- RU2496870C2 RU2496870C2 RU2011105713/10A RU2011105713A RU2496870C2 RU 2496870 C2 RU2496870 C2 RU 2496870C2 RU 2011105713/10 A RU2011105713/10 A RU 2011105713/10A RU 2011105713 A RU2011105713 A RU 2011105713A RU 2496870 C2 RU2496870 C2 RU 2496870C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- culture
- cultivation
- viruses
- medium
- Prior art date
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии получения культур клеток, и может быть использовано в ветеринарной вирусологии при диагностике вирусных инфекций крупного рогатого скота.The invention relates to biotechnology, in particular to a technology for producing cell cultures, and can be used in veterinary virology in the diagnosis of viral infections of cattle.
В настоящее время накоплено много материалов, свидетельствующих о том, что оптимальными клеточными системами при получении вирусных препаратов и для экспериментальных целей являются культуры диплоидных клеток. Диплоидные культуры имеют ряд преимуществ перед первичными и постоянными (стабильными) культурами, так как они способны длительно размножаться in vitro с сохранением исходных свойств, однородны по клеточному составу и свободны от контаминантов [2, 4].Currently, a lot of material has been accumulated indicating that the optimal cell systems for obtaining viral preparations and for experimental purposes are diploid cell cultures. Diploid cultures have a number of advantages over primary and permanent (stable) cultures, since they are able to multiply in vitro for a long time with the preservation of the initial properties, are homogeneous in cellular composition and are free from contaminants [2, 4].
Известны диплоидные культуры клеток, полученные из различных тканей: почек, кожи, легкого, сердца, селезенки, гимуса, щиговидной железы и других органов разных видов животных и человека [1-7].Known diploid cell cultures obtained from various tissues: kidneys, skin, lung, heart, spleen, gimus, thyroid gland and other organs of different species of animals and humans [1-7].
Недостатком известных способов является их сложность, которая заключается в ферментативной и механической обработке исходного материала, что требует много времени, вызывает потери клеток, а использование химических реагентов нарушает функции клеток. Кроме того, культуры, полученные по прототипам ферментативной дезагрегации ткани, были фибробластоподобного тина. Известно, что диплоидные клеточные культуры фибробластоподобного типа имеют ограниченный срок жизни при культивировании in vitro и чувствительность их к вирусам ниже, чем к клеткам эпителиоподобного типа.A disadvantage of the known methods is their complexity, which consists in the enzymatic and mechanical processing of the starting material, which requires a lot of time, causes cell loss, and the use of chemical reagents disrupts the functions of the cells. In addition, cultures obtained from prototypes of enzymatic tissue disaggregation were fibroblast-like tina. It is known that diploid cell cultures of the fibroblast-like type have a limited lifespan when cultured in vitro and their sensitivity to viruses is lower than to cells of the epithelial-like type.
Наиболее близким к предлагаемому способу по технической сущности и достигаемому результату является способ культивирования фибробластов для заместительной терапии, описанной в патенте RU 2320720 [6]. В данном способе предлагается вводить охарактеризованную культуру фибробластов, предназначенную в качестве средства для регенеративной терапии и косметологии. Недостатком способа является «жесткая» обработка первичного материала (инкубация с протеазами животного происхождения при постоянном перемешивании и пипетировании), которая является травматичной для клеток процедурой, снижающей общее количество жизнеспособных клеток в получаемой суспензии дермальных фибробластов, а также приводящей к нарушениям адгезивной и рецепторной систем у части сохранивших жизнеспособность клеток.Closest to the proposed method according to the technical nature and the achieved result is a method of culturing fibroblasts for replacement therapy, described in patent RU 2320720 [6]. In this method, it is proposed to introduce a characterized fibroblast culture intended as a means for regenerative therapy and cosmetology. The disadvantage of this method is the "hard" processing of the primary material (incubation with proteases of animal origin with constant stirring and pipetting), which is a traumatic procedure for the cells, reducing the total number of viable cells in the resulting suspension of dermal fibroblasts, as well as leading to impaired adhesive and receptor systems parts of viable cells.
Настоящее изобретение представляет собой разработку, в которой предпринята попьлка получения эшпелиобластов из легочною экспланта плода буйволицы, чувствительных к респираторным вирусам КРС, с использованием технологии получения культуры клеток, не требующей ферментативной и механической обработки исходного материала и культивирования клеток без пересева.The present invention is a development in which the attempt is made to obtain espelioblasts from a pulmonary explorer of a buffalo fetus sensitive to cattle respiratory viruses using a cell culture technology that does not require enzymatic and mechanical processing of the starting material and cell culture without reseeding.
Целью изобретения является получение эпителиоподобных клеток легкого плода буйволицы (ЛПБ), чувствительных к широкому спектру респираторных вирусов крупного рогатого скота (КРС).The aim of the invention is to obtain epithelial-like cells of the lungs of buffalo fetus (LPS), sensitive to a wide range of respiratory viruses in cattle (cattle).
Технический результат, достигаемый предлагаемым способом, заключается в упрощении получения клеток эпителиоподобного типа, обладающих интенсивным размножением и чувствительностью к респираторным вирусам КРС.The technical result achieved by the proposed method is to simplify the production of epithelial-like cells with intensive reproduction and sensitivity to cattle respiratory viruses.
Для достижения указанного технического результата в способе получения эпителиоподобных клеток, включающем получение эксплантов, инкубирование в питательной среде и выделение эпителиобластов, осуществляют из ткани легкого без ферментативной и механической обработки. Для этого ткань легкого после получения в стерильных условиях разрезали на кусочки 3…5 мм3 и промывали до полного просветления надосадочной жидкости. Полученные экспланты, промытые стерильным раствором Хенкса с антибиотиками, помещали во флаконы Карреля, заливали питательной средой, состоящей из равных объемов 0,5%-ной среды гидролизат лактальбумина (0,5% ГЛА) со средой 199 с 10% сыворотки КРС и инкубировали при температуре 37°С. Через 48-72 ч с начала культивирования проводили смену среды. На 6-8 дни культивирования механически удаляли экспланты, а клетки из очагов роста снимали со стекла 0,02%-ным раствором версена, подогретого до 35-37°С и пересевали в соотношении 1:1. В дальнейшем культивировали клетки без пересева в течение трех недель, причем, через каждые 4-5 суток проводили смену среды на 30-50% с добавлением 0,5%-ного глутамина.To achieve the specified technical result in a method for producing epithelial cells, including obtaining explants, incubation in a nutrient medium and isolation of epithelioblasts, is carried out from lung tissue without enzymatic and mechanical processing. For this, the lung tissue, after receiving under sterile conditions, was cut into pieces of 3 ... 5 mm 3 and washed until the supernatant was completely clear. The obtained explants, washed with sterile Hanks solution with antibiotics, were placed in Carrel bottles, filled with a nutrient medium consisting of equal volumes of 0.5% medium lactalbumin hydrolyzate (0.5% GLA) with 199 medium with 10% cattle serum and incubated with temperature 37 ° С. After 48-72 hours from the beginning of cultivation, a change of medium was carried out. On 6-8 days of cultivation, explants were mechanically removed, and cells from the foci of growth were removed from the glass with a 0.02% solution of versene, heated to 35-37 ° C and reseeded in a ratio of 1: 1. Subsequently, cells were cultured without reseeding for three weeks, and every 4-5 days, the medium was changed by 30-50% with the addition of 0.5% glutamine.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУDESCRIPTION OF THE INVENTION TO THE PATENT
Эпителиоподобные клетки ЛПБ получали следующим образом.Epithelial-like LPS cells were prepared as follows.
В качестве исходной ткани использовали легкое плода буйволицы на 3…5-м месяцах развития, доставленное не позднее 2-3 ч после убоя животного. В стерильном боксе у плода извлекали легкое и промывали стерильным раствором Хенкса с антибиотиками (200 ед./мл пенициллина и 200 мкг/мл стрептомицина). При обработке органа удаляли плевру, трахею, бронхи, крупные кровеносные сосуды, разрезали ткань на кусочки 3…5 мм3 и промывали до полного просветления надосадочной жидкости.As the initial tissue, the buffalo fetus lung was used at 3 ... 5 months of development, delivered no later than 2-3 hours after slaughter of the animal. In a sterile box, the fetus was removed and washed with a sterile Hanks solution with antibiotics (200 units / ml penicillin and 200 μg / ml streptomycin). When processing the organ, the pleura, trachea, bronchi, large blood vessels were removed, the tissue was cut into pieces of 3 ... 5 mm 3 and washed until the supernatant was completely clarified.
Кусочки предварительно измельченной ткани, промытой стерильным раствором Хенкса с антибиотиками, помещали в маленькие культуральные флаконы Карреля, на расстоянии 1-1,5 см друг от друга. Заливали флаконы питательной средой, состоящей из равных объемов 0,5% ГЛА со средой 199 с 10% сыворотки КРС, с помощью 10 мл пипетки так, чтобы экспланты были покрыты средой. Флаконы помещали при 37°С для выращивания в термостате.Pieces of pre-shredded tissue, washed with Hanks sterile antibiotic solution, were placed in Carrel’s small culture bottles at a distance of 1-1.5 cm from each other. The vials were poured with a nutrient medium consisting of equal volumes of 0.5% GLA with medium 199 with 10% serum of cattle, using a 10 ml pipette so that the explants were covered with medium. Vials were placed at 37 ° C for growth in a thermostat.
У эксплантов через 24-48 ч отмечали очаги роста клеток, которые постепенно увеличивались. Колонии растущих клеток от эксплантатов были смешанного (энителиоподобного и фибробластоподобного) типа. Смену среды проводили через 48-72 ч с начала культивирования. В дальнейшем поступали с культурой следующим образом.In explants, foci of cell growth were noted after 24-48 h, which gradually increased. The colonies of the growing cells from the explants were of a mixed (enithelial-like and fibroblast-like) type. The change of medium was carried out after 48-72 hours from the start of cultivation. Subsequently, they acted with culture as follows.
После того, как во флаконе появились очаги роста эпителиоподобных клеток (на 6-8 дни), механически удаляли экспланты, а клетки из очагов роста снимали со стекла 0,02%-ным раствором версена, подогретого до 35-37°С и пересевали в соотношении 1:1. Посевная концентрация клеток 300-350 тыс./мл. На 5-е сутки культивирования получали однородную культуру, состоящую преимущественно (с преобладанием 70-80%) из клеток эпителиоподобного типа. Такую культуру использовали в дальнейших экспериментах по выращиванию субкультур или эпителиоподобных культур того же типа.After the foci of growth of epithelium-like cells appeared on the vial (for 6–8 days), explants were mechanically removed and the cells from the foci of growth were removed from the glass with a 0.02% versene solution, heated to 35-37 ° C and reseeded 1: 1 ratio. Sowing cell concentration of 300-350 thousand / ml. On the 5th day of cultivation, a homogeneous culture was obtained, consisting predominantly (with a predominance of 70-80%) of epithelial-like cells. Such a culture was used in further experiments to grow subcultures or epithelial-like cultures of the same type.
В дальнейшем культивировали клетки без пересева в течение трех недель, причем, через каждые 4-5 суток проводили смену среды на 30-50% с добавлением 0,5%-ного глутамина.Subsequently, cells were cultured without reseeding for three weeks, and every 4-5 days, the medium was changed by 30-50% with the addition of 0.5% glutamine.
В результате культивирования без пересева наблюдали постепенное отмирание оставшихся в культуре клеток фибробластоподобного типа и во флаконах оставались клетки эпителиоподобного типа, которые формировали колонии однородных клеток. В первых пассажах размножение клеток в колониях происходило медленно, и накопление клеток было достаточным для пересева в том же флаконе 1:1. Последующие пересевы делали в соотношении 1:2, концентрация клеток составляла 200-250 тыс. кл/мл.As a result of cultivation without reseeding, gradual death of the fibroblast-like cells remaining in the culture was observed, and epithelial-like cells remained in the vials, which formed colonies of homogeneous cells. In the first passages, cell reproduction in the colonies was slow, and cell accumulation was sufficient for reseeding in the same 1: 1 vial. Subsequent transfers were made in a ratio of 1: 2, the cell concentration was 200-250 thousand cells / ml.
Первые 3-4 пассажа монослой в культуре формировался в течение 2-3 недель. В это время каждые 4-5 дней проводили частичную смену среды на 30-50%. Культура стабилизировалась на 5-м пассаже. Последующие пассажи осуществляли по мере формирования монослоя, с помощью 0,25%-ного раствора трипсина и 0,02%-ного раствора версена, в соотношении 1:9 безцентрифужным способом.The first 3-4 passages a monolayer in the culture was formed within 2-3 weeks. At this time, every 4-5 days, a partial change of medium was carried out by 30-50%. Culture stabilized at passage 5. Subsequent passages were carried out as the monolayer was formed, using a 0.25% trypsin solution and a 0.02% versene solution, in a 1: 9 ratio, by the centrifugeless method.
Полученная культура подвергалась субкультивированию много раз и к настоящему времени она представлена исключительно эпителиоподобными клетками. Культура прошла более 44 пассажей.The resulting culture was subcultured many times and to date, it is represented exclusively by epithelial-like cells. The culture went through more than 44 passages.
Морфологическая характеристика. Культура обладает интенсивным ростом. Через 6-8 ч культивирования отмечался активный рост однородных по составу клеток, которые росли в один слой без напластования. К 60-72 ч формируется монослой. Коэффициент пересева- 1:2.Morphological characteristics. The culture has an intensive growth. After 6-8 hours of cultivation, there was an active growth of cells of uniform composition that grew in one layer without bedding. By 60-72 h, a monolayer is formed. Reseeding coefficient - 1: 2.
Питоморфологический анализ препаратов на уровне 10, 20, 30 и 40 пассажей показал, что культура ЛЭБ представлена в монослое клетками эпителиоподобного типа. На окрашенных препаратах клетки имели полигональную форму, границы плотно примыкали друг к другу. Ядро клеток - крупное, округлой формы, с 3-5 ядрышками. Структура ядра имела мелкосетчатую гранулярную структуру.A pitomorphological analysis of the preparations at the levels of 10, 20, 30, and 40 passages showed that the LEB culture is represented in a monolayer by epithelial-like cells. On stained preparations, the cells had a polygonal shape, the borders were tightly adjacent to each other. The cell nucleus is large, rounded in shape, with 3-5 nucleoli. The core structure had a fine mesh granular structure.
При кариологическом анализе клеток штамма модальный класс хромосом составлял 2n=50.In the karyological analysis of strain cells, the modal class of chromosomes was 2n = 50.
Сведения о контаминантах. Бактерии, грибы и микоплазмы при бактериологическом, радиоавтографическом, цитологическом исследованиях с применением флюорохрома-оливомицина не обнаружены.Information about the contaminants. Bacteria, fungi and mycoplasmas during bacteriological, radioautographic, cytological studies using fluorochrome-olivomycin were not found.
Культуральные свойства. Границы клеток хорошо выражены и культура хорошо пассируется. В качестве ростовой среды использовали: среду 199, 0,5% ГЛА + 199 или 0,5% ГЛА + Игла в равных соотношениях с добавлением 10% сыворотки КРС, инактивированной при 56°C в течение 30 мин и антибиотиков (100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина).Cultural properties. Cell boundaries are well defined and the culture is well passaged. As the growth medium used: medium 199, 0.5% GLA + 199 or 0.5% GLA + Needle in equal proportions with the addition of 10% cattle serum inactivated at 56 ° C for 30 min and antibiotics (100 units / ml of penicillin and 100 μg / ml streptomycin).
Монослой клеток ЛЭБ сохранялся в термостате при 36-37°С на среде без сыворотки - 12-15 дней, без признаков дегенерации.The monolayer of LEB cells was stored in a thermostat at 36-37 ° C on a medium without serum - 12-15 days, without signs of degeneration.
Эпителиоподобная культура клеток ЛПБ нашла применение в работе при изучении вирусных респираторных инфекций КРС.An epithelial-like culture of LPS cells has found application in the study of viral respiratory infections of cattle.
Описанный метод позволил надежно получить эпителнеподобную культуру клеток из ткани легкого плода буйволицы.The described method made it possible to reliably obtain an epithelium-like cell culture from tissue of the lung of the buffalo fetus.
Пример 1. Культуру клеток ЛЭБ культивировали на среде 199 с 0,5% ГЛА в соотношении 1:1, с добавлением 10% сыворотки КРС и антибиотиков (100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина). При пересеве клетки снимали со стекла 0,25%-ным раствором трипсина и 0,02%-ным раствором версена в соотношении (1:9), подогретым до 36°С. После подсчета клеток суспензию разбавляли до посевной концентрации питательной средой 200-250 тыс. кл/мл.Example 1. An LEB cell culture was cultured on medium 199 with 0.5% GLA in a ratio of 1: 1, with the addition of 10% serum of cattle and antibiotics (100 units / ml penicillin and 100 μg / ml streptomycin). When reseeding, the cells were removed from the glass with a 0.25% trypsin solution and a 0.02% versene solution in the ratio (1: 9), heated to 36 ° C. After cell counting, the suspension was diluted to a seed concentration of 200-250 thousand cells / ml with culture medium.
Культуральные матрасы помещали в термостат при 37°С. Монослой формировался через 48-72 ч. Культуру с выросшим монослоем использовали для заражения вирусом инфекционного ринотрахеита (ИРТ).Culture mattresses were placed in a thermostat at 37 ° C. A monolayer was formed after 48-72 hours. A culture with a grown monolayer was used to infect the infectious rhinotracheitis virus (RTI).
Пример 2. Культуру клеток ЛЭБ культивировали на среде Игла с 0,5% ГЛА в соотношении 1:1, с добавлением 10% сыворотки КРС. После формирования монослоя через 48-72 ч культуру использовали для заражения вирусом парагриппа-3 (ПГ-3).Example 2. An LEB cell culture was cultured on Eagle’s medium with 0.5% GLA in a ratio of 1: 1, with the addition of 10% cattle serum. After the monolayer was formed after 48-72 h, the culture was used to infect parainfluenza-3 virus (PG-3).
Пример 3. Культуру клеток ЛЭБ культивировали на среде 199, с добавлением 10% сыворотки КРС. После формирования монослоя через 48-72 ч культуру использовали для заражения вирусом вирусной диареи-болезни слизистых оболочек (ВД-БС).Example 3. The cell culture of LEB was cultured on medium 199, with the addition of 10% serum of cattle. After the monolayer was formed after 48-72 hours, the culture was used to infect the virus with viral diarrhea-mucosal disease (VD-BS).
Пример 4. Культуру клеток ЛЭБ культивировали на среде 199 с 0,5% ГЛА в соотношении 1:1 с добавлением 10% сыворотки КРС. После формирования монослоя через 48-72 ч культуру использовали для заражения вирусом аденовирусной инфекции крупного рогатого скота (АДВИ).Example 4. An LEB cell culture was cultured on medium 199 with 0.5% GLA in a 1: 1 ratio with the addition of 10% cattle serum. After the monolayer was formed after 48-72 h, the culture was used to infect the cattle with an adenovirus infection virus (ADVI).
Для выявления чувствительности культуры к вирусам проведено пять последовательных пассажей вирусов. Установлено, что культура ЛЭБ чувствительна к указанным вирусам. Цитопатогенное действие (ЦПД) вируса ИРТ наступало через 30 ч после заражения и характеризовалось округлением клеток, разрыхлением и разрушением монослоя с последующим отторжением клеток от стекла. В зараженной культуре отмечали также маргинацию хроматина в ядрах, затем (через 25-30 ч) - формирование внутриядерных включений, характерных для вирусов группы герпеса. ЦПД вируса ПГ-3 наступало через 48-72 ч. Изменения в культуре, вызываемые вирусом, характеризовались появлением многоядерных клеток (симпластов) и постепенным, через 72-96 ч, разрушением монослоя. В цитоплазме клеток наблюдали окрашенные в розовый цвет цитоплазматические включения разной величины. Иногда они занимали почти всю цитоплазму, в ряде случаев в ядрах клеток выявляли мелкие розовые включения, окруженные светлой зоной. Титр вируса ИРТ достигал 105,5-7,0 ТЦД50/мл, вируса НГ-3 - 106,25-6,6 ТЦД50/мл.To identify the sensitivity of the culture to viruses, five consecutive passages of viruses were performed. It was established that the culture of the LEB is sensitive to these viruses. The cytopathogenic effect (CPP) of the IRT virus occurred 30 hours after infection and was characterized by rounding of the cells, loosening and destruction of the monolayer with subsequent tearing of the cells from the glass. In the infected culture, margin of chromatin in the nuclei was also noted, then (after 25-30 hours) the formation of intranuclear inclusions characteristic of the viruses of the herpes group was noted. PG-3 virus CPD occurred within 48-72 hours. Changes in the culture caused by the virus were characterized by the appearance of multinucleated cells (symplasts) and the gradual destruction of the monolayer after 72-96 hours. Pink colored cytoplasmic inclusions of different sizes were observed in the cytoplasm of the cells. Sometimes they occupied almost the entire cytoplasm; in some cases, small pink inclusions surrounded by a light zone were revealed in the nuclei of cells. The titer of the IRT virus reached 10 5.5-7.0 TCD 50 / ml, of the virus NG-3 - 10 6.25-6.6 TCD 50 / ml.
Культура клеток ЛЭБ также чувствительна к вирусам ВД-БС и АДВИ с характерным выражением ЦПД. Для вируса ВД-БС характерно появление в клетках околоядерных вакуолей, пикноз ядер и клеток, на протяжении всей инфекции - вакуолизация цитоплазмы. При заражении адсновирусом полная дегенерация монослоя сопровождалась симпластообразованием, которое наблюдалось через 36-48 часов. Титр вирусов ВД-БС и АДВИ в культуре достигал 104,75-5,4 ТЦД50/мл и 105,25-5,5 TЦД50/мл, соответственно.An LEB cell culture is also sensitive to VD-BS and ADVI viruses with a characteristic expression of CPD. VD-BS virus is characterized by the appearance of perinuclear vacuoles in the cells, pycnosis of nuclei and cells, and the vacuolization of the cytoplasm throughout the infection. When infected with adnsovirus, complete degeneration of the monolayer was accompanied by symplastogenesis, which was observed after 36-48 hours. The virus titer of VD-BS and ADVI in culture reached 10 4.75-5.4 TCD 50 / ml and 10 5.25-5.5 TCD 50 / ml, respectively.
При обследовании одной из вспышек респираторных инфекций КРС максимальное число выделенных вирусных агентов составило до 35% на первично-трипсинизированной культуре почки телят, а на культуре ЛЭБ - 42% по отношению к числу проб, использованных для исследования. Таким образом, культура также пригодна и для первичного выделения вирусов из патологического материала.When examining one of the outbreaks of cattle respiratory infections, the maximum number of isolated viral agents was up to 35% in the primary trypsinized calf kidney culture, and in the LEB culture - 42% in relation to the number of samples used for the study. Thus, the culture is also suitable for the primary isolation of viruses from pathological material.
Как видно из примеров, полученная эпителиоподобная культура клеток ЛЭБ чувствительна к респираторным вирусам КРС.As can be seen from the examples, the resulting epithelial-like culture of LEB cells is sensitive to cattle respiratory viruses.
В динамике культивирования проведена криогенизация в целях длительного сохранения клеток в криозащитной среде, состоящей из 50% сред 199 с 0,5% ГЛА в соотношении 1:1, 40% сыворотки КРС и 10% ДМСО. Проведено замораживание культуры на уровне 10, 20, 30-го пассажей. Через 15 и 30 дней храпения в жидком азоте (-196°С) культуры клеток ЛПБ провели ее размораживание и рекультивирование. Через 48-72 ч рекультивирования формировался монослой, представленный клетками эпителиоподобного типа, которые морфологически не отличались от исходной культуры.In the dynamics of cultivation, cryogenization was carried out in order to preserve the cells for a long time in a cryoprotective medium consisting of 50% 199 media with 0.5% GLA in a ratio of 1: 1, 40% cattle serum and 10% DMSO. Culture was frozen at the level of 10, 20, 30 passages. After 15 and 30 days of snoring in liquid nitrogen (-196 ° C), LPS cell cultures defrosted and reclaimed it. After 48-72 hours of reclamation, a monolayer was formed, represented by epithelial-like cells, which did not morphologically differ from the initial culture.
ЛитератураLiterature
1. Авторское свидетельство СССР №1147748 от 30.03.1985.1. USSR Copyright Certificate No. 1147748 of March 30, 1985.
2. Дьяконов Л.Н., Ситьков В.И. Животная клетка в культуре (Методы и применение в биотехнологии). - М.: Компания Спутник+. - 2000. - 400 с.2. Dyakonov L.N., Sitkov V.I. Animal cell in culture (Methods and applications in biotechnology). - M.: Sputnik + Company. - 2000. - 400 p.
3. Лисок Т.П., Шитикова Г.С., Пономарева Н.П. и др. Получение и характеристика диплоидных линий фибробластов легкого эмбриона человека / Этиология и диагностика гриппа и других острых респираторных заболеваний // Сб. научных трудов. - Л. - 19Х2. - C.110-116.3. Liskov T.P., Shitikova G.S., Ponomareva N.P. et al. Obtaining and characterizing diploid lines of fibroblasts of a human lung embryo / Etiology and diagnosis of influenza and other acute respiratory diseases // Sat. scientific works. - L. - 19X2. - C.110-116.
4. Осидзе Д.Ф. Получение культур клеток из тканей животных и их использование в вирусологии. - М. - 1975. - 103 с.4. Osidze D.F. Obtaining cell cultures from animal tissues and their use in virology. - M. - 1975. - 103 p.
5. Панкова Г.Е., Сологуб В.К., Гололобова М.Т., Резова Т.И. Штамм диплоидных клеток легкого эмбриона лошади. Ветеринария. - 1978. - №3. - С.42-43.5. Pankova G.E., Sologub V.K., Gololobova M.T., Rezova T.I. The strain of diploid cells of a horse's lung embryo. Veterinary Medicine - 1978. - No. 3. - S. 42-43.
6. Патент РФ №2320720 от 27.03.2008. 7. Поздняков А.А., Юров К.П., Мутузкина З.П. и др. Методика получения диплоидного штамма клеток тестикулярной ткани жеребят и испытание его чувствительности к некоторым вирусам. Бюллетень ВИЭВ. - 1976. - Вып.24. - С.46-48.6. RF patent No. 2320720 dated 03/27/2008. 7. Pozdnyakov A.A., Yurov K.P., Mutuzkina Z.P. et al. Methods of obtaining a diploid strain of testicular tissue cells of foals and testing its sensitivity to certain viruses. Bulletin VIEV. - 1976. - Vol. 24. - S. 46-48.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011105713/10A RU2496870C2 (en) | 2011-02-15 | 2011-02-15 | Method to produce epithelioid cells of light foetus of buffalo cow for cultivation of viruses |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011105713/10A RU2496870C2 (en) | 2011-02-15 | 2011-02-15 | Method to produce epithelioid cells of light foetus of buffalo cow for cultivation of viruses |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2011105713A RU2011105713A (en) | 2013-01-20 |
| RU2496870C2 true RU2496870C2 (en) | 2013-10-27 |
Family
ID=48804890
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011105713/10A RU2496870C2 (en) | 2011-02-15 | 2011-02-15 | Method to produce epithelioid cells of light foetus of buffalo cow for cultivation of viruses |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2496870C2 (en) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2320720C2 (en) * | 2006-01-25 | 2008-03-27 | Елена Викторовна Парфенова | Method for culturing fibroblasts for substitution therapy |
| US20080112890A1 (en) * | 2006-10-11 | 2008-05-15 | Lelkes Peter I | Fetal pulmonary cells and uses thereof |
| RU2343194C2 (en) * | 2006-11-10 | 2009-01-10 | Федеральное государственное учреждение науки "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера" Роспотребнадзора | Line of duplex fibroblast cells of easy human embryo for allocation, identifications of viruses and obtaining of diagnostic and vaccinal preparations |
| RU2376370C2 (en) * | 2002-03-20 | 2009-12-20 | Мериал Лимитед | Lung cells of cotton rats for cultivation of viruses |
| RU2382077C1 (en) * | 2008-07-08 | 2010-02-20 | Государственное Учебно-Научное Учреждение Факультет Фундаментальной Медицины Московского Государственного Университета Имени М.В. Ломоносова | Method for recovery and cultivation of autologous dermal fibroblasts for stimulation of regenerative processes and replacement therapy |
-
2011
- 2011-02-15 RU RU2011105713/10A patent/RU2496870C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2376370C2 (en) * | 2002-03-20 | 2009-12-20 | Мериал Лимитед | Lung cells of cotton rats for cultivation of viruses |
| RU2320720C2 (en) * | 2006-01-25 | 2008-03-27 | Елена Викторовна Парфенова | Method for culturing fibroblasts for substitution therapy |
| US20080112890A1 (en) * | 2006-10-11 | 2008-05-15 | Lelkes Peter I | Fetal pulmonary cells and uses thereof |
| RU2343194C2 (en) * | 2006-11-10 | 2009-01-10 | Федеральное государственное учреждение науки "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера" Роспотребнадзора | Line of duplex fibroblast cells of easy human embryo for allocation, identifications of viruses and obtaining of diagnostic and vaccinal preparations |
| RU2382077C1 (en) * | 2008-07-08 | 2010-02-20 | Государственное Учебно-Научное Учреждение Факультет Фундаментальной Медицины Московского Государственного Университета Имени М.В. Ломоносова | Method for recovery and cultivation of autologous dermal fibroblasts for stimulation of regenerative processes and replacement therapy |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2011105713A (en) | 2013-01-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111454878B (en) | Construction method and application of organoid virus infection model | |
| JP2011212020A (en) | Method for replicating influenza virus in cell culture and influenza virus obtained by the method | |
| JP2012016358A (en) | Animal cell and process for replication of influenza virus | |
| CN105907721A (en) | Pig intestinal endothelial cell line for stably expressing CaS9 protein | |
| CN104152403B (en) | A kind of method that establishing goose embryonic epithelium cell line and the goose embryonic epithelium cell line of foundation | |
| JP6110357B2 (en) | Methods for replicating viruses in suspension cultures of canine kidney cells | |
| CN102805862B (en) | Preparation method for SFTS bunyavirus purification and inactivation vaccines through VERO cell culture | |
| CN105121634A (en) | Cell strain having increased virus production ability and production method therefor | |
| Ahamed et al. | Adaptation of Newcastle disease virus (NDV) on Vero cell line | |
| CN109207422B (en) | European eel kidney cell line EK and application thereof | |
| RU2496870C2 (en) | Method to produce epithelioid cells of light foetus of buffalo cow for cultivation of viruses | |
| EA018438B1 (en) | Medium supplement for virus production | |
| CN107858322B (en) | Method for establishing primary hippocampal cell culture system | |
| CN113755438B (en) | Mandarin fish spinal cord tissue cell line and construction method and application thereof | |
| CN109402068A (en) | A method of preparing the remaining porcine pseudorabies virus of serum-free | |
| RU2488631C1 (en) | CELL LINE OF CALF KIDNEY Bos taurus RBT (Rene Bos Taurus) FOR REPRODUCTION OF ANIMAL VIRUSES | |
| JP2003510067A (en) | Avian blastoderm cell line | |
| CN112280740A (en) | Gobiocypris rarus brain cell line and application thereof | |
| CN110295137B (en) | Channa argus kidney cell line and construction method and application thereof | |
| RU2827170C1 (en) | Method for cultivation of pig fetal larynx cells for virology | |
| RU2343194C2 (en) | Line of duplex fibroblast cells of easy human embryo for allocation, identifications of viruses and obtaining of diagnostic and vaccinal preparations | |
| RU2506310C1 (en) | STRAIN OF DIPLOID CELLS OF SYNOVIAL MEMBRANE OF YOUNG PIG Sus scrofa, USED FOR VIROLOGY RESEARCH | |
| RU2201959C2 (en) | Strain of piglet kidney transplantable cell sus scrofa pk-15/b5 used for virology investigation | |
| CN114350601B (en) | Cherry valley duck fibroblast line and construction method and application thereof | |
| CN117402813B (en) | Establishment, suspension domestication and application of cat kidney CRFK adherent cell line |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20140216 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20151227 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20170216 |