RU2382077C1 - Method for recovery and cultivation of autologous dermal fibroblasts for stimulation of regenerative processes and replacement therapy - Google Patents
Method for recovery and cultivation of autologous dermal fibroblasts for stimulation of regenerative processes and replacement therapy Download PDFInfo
- Publication number
- RU2382077C1 RU2382077C1 RU2008127284/13A RU2008127284A RU2382077C1 RU 2382077 C1 RU2382077 C1 RU 2382077C1 RU 2008127284/13 A RU2008127284/13 A RU 2008127284/13A RU 2008127284 A RU2008127284 A RU 2008127284A RU 2382077 C1 RU2382077 C1 RU 2382077C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- fibroblasts
- cultivation
- culture
- poly
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии получения культур фибробластов, предназначенных для использования в качестве средства для регенеративной терапии в косметологии и эстетической медицине.The invention relates to biotechnology, in particular to a technology for producing cultures of fibroblasts intended for use as a means for regenerative therapy in cosmetology and aesthetic medicine.
Методики клеточной терапии, использующие для восстановления и биостимуляции кожи внутрикожные клеточные инъекции, в последнее время получили широкое распространение [1]. Первоначально для клеточной терапии предлагалось применение линий эмбриональных клеток человека, фибробластов, выделенных из пуповинной крови, а также линейных диплоидных фибробластов легкого эмбриона человека. Однако введение (аллогенных) эмбриональных клеток, помимо этических вопросов, возникающих в связи с использованием эмбрионов человека, столкнулось с проблемой проявления побочных эффектов в виде иммунной реакции в организме пациента.Cell therapy techniques, using intradermal cell injections for restoration and biostimulation of the skin, have recently become widespread [1]. Initially, the use of human embryonic cell lines, fibroblasts isolated from umbilical cord blood, and linear diploid fibroblasts of the human lung embryo was proposed for cell therapy. However, the introduction of (allogeneic) embryonic cells, in addition to ethical issues arising in connection with the use of human embryos, was faced with the problem of side effects in the form of an immune reaction in the patient's body.
В настоящее время в косметологии и регенеративной медицине разрабатываются подходы к использованию аутологичных недифференцированных мезенхимальных клеток, а также аутологичных дермальных фибробластов. В результате исследований по культивированию фибробластов было достаточно убедительно показано, что аутологичные фибробласты, выращенные in vitro, способны при поддержании их в определенных условиях полностью сохранять свои физиологические функции. В частности, нами было установлено [2], что дермальные фибробласты, выделяемые из кожных биоптатов человека, имеют высокий уровень секреторной активности и продуцируют компоненты адгезивной системы клетки (рецептор гиалуроновой кислоты - CD44) и внеклеточного матрикса, участвующие в поддержании тургора и эластичности кожи (проколлаген I типа, коллаген IV типа, фибронектин и тропоэластин). Эти факты определили принципиальную возможность применения культур дермальных фибробластов в практической медицине и косметологии. Однако следует обратить внимание на то, что далеко не всегда попытки использования клеточной терапии приводят к желаемому результату. При этом причиной во многих случаях является недостаточно высокое качество клеточной культуры, которое может быть следствием применения к клеткам излишне «жестких» условий, а также длительности процедуры выделения и культивирования. В связи с этим не вызывает сомнений необходимость дальнейшего совершенствования способов культивирования фибробластов, предназначенных для целей регенеративной медицины и косметологии, в направлении, обеспечивающем сокращение сроков получения клеток и повышение качества получаемых культур.Currently, approaches to the use of autologous undifferentiated mesenchymal cells, as well as autologous dermal fibroblasts, are being developed in cosmetology and regenerative medicine. As a result of studies on the cultivation of fibroblasts, it has been quite convincingly shown that autologous in vitro fibroblasts are capable of maintaining their physiological functions while maintaining them under certain conditions. In particular, we found [2] that dermal fibroblasts secreted from human skin biopsies have a high level of secretory activity and produce components of the cell’s adhesive system (hyaluronic acid receptor - CD44) and extracellular matrix, which are involved in maintaining turgor and skin elasticity ( type I procollagen, type IV collagen, fibronectin and tropoelastin). These facts have determined the fundamental possibility of using cultures of dermal fibroblasts in practical medicine and cosmetology. However, attention should be paid to the fact that not always attempts to use cell therapy lead to the desired result. Moreover, the reason in many cases is the insufficiently high quality of the cell culture, which may be a consequence of applying unnecessarily “harsh” conditions to the cells, as well as the duration of the isolation and cultivation procedure. In this regard, there is no doubt the need to further improve the methods of cultivation of fibroblasts intended for the purposes of regenerative medicine and cosmetology, in the direction that ensures a reduction in the time for obtaining cells and improving the quality of the resulting cultures.
Уровень техникиState of the art
Наиболее близким к предлагаемому способу по технической сущности и достигаемому результату является способ культивирования фибробластов для заместительной терапии, описанный в патенте RU №2320720 [12]. Этот способ заключается в том, что биоптат кожи инкубируют в растворе ферментов диспазы и коллагеназы I типа на основе среды культивирования DMEM с добавлением 5% эмбриональной бычьей сыворотки (ЭБС) в течение 1,5 часов при постоянном помешивании и пипетировании. Получаемую суспензию клеток далее центрифугируют, осадок клеток ресуспендируют в стандартной среде для фибробластов (DMEM/10% ЭСБ /100 ед./мл пенициллина, 100 ед./мл стрептомицина, 100 ед./мл фунгизона) и высевают на чашки Петри. После прикрепления клетки переводят на длительное культивирование в среде, содержащей собственную сыворотку крови пациента (ССКП): DMEM/10% ССКП /100 ед./мл пенициллина, 100 ед./мл стрептомицина, 100 ед./мл фунгизона.Closest to the proposed method according to the technical nature and the achieved result is a method of culturing fibroblasts for replacement therapy, described in patent RU No. 2320720 [12]. This method consists in the fact that a skin biopsy is incubated in a solution of the dispase and collagenase type I enzymes on the basis of DMEM cultivation medium with the addition of 5% fetal bovine serum (EBS) for 1.5 hours with constant stirring and pipetting. The resulting cell suspension is then centrifuged, the cell pellet is resuspended in standard fibroblast medium (DMEM / 10% ESB / 100 units / ml penicillin, 100 units / ml streptomycin, 100 units / ml fungicone) and plated on Petri dishes. After attachment, the cells are transferred to long-term cultivation in a medium containing the patient’s own blood serum (SSCP): DMEM / 10% SSCP / 100 units / ml penicillin, 100 units / ml streptomycin, 100 units / ml fungizon.
В целом данный способ благодаря применению на стадии культивирования клеток ССКП вместо фетальных сывороток животных улучшает показатели получаемой культуры поскольку культивирование без использования сывороток животных снижает риски инфицирования культуры и дальнейшего иммунного ответа при введении в кожу пациента.In general, this method, due to the use of SCKP cells at the stage of culturing instead of fetal animal sera, improves the performance of the resulting culture, since cultivation without the use of animal sera reduces the risk of infection of the culture and further immune response when introduced into the patient’s skin.
Вместе с тем, описанный выше способ, как и большинство других аналогов, предполагает достаточно «жесткую» обработку первичного материала (биоптата кожи), а именно инкубацию с протеазами животного происхождения при постоянном перемешивании и пипетировании, которая является травматичной для клеток процедурой, снижающей общее количество жизнеспособных клеток в получаемой суспензии дермальных фибробластов, а также приводящей к нарушениям адгезивной и рецепторной систем у части сохранивших жизнеспособность клеток. При использовании предлагаемых в способе-прототипе условий обработки биоптата кожи значительная часть клеток гибнет на начальном этапе, а получение необходимого количества клеток достигается в результате длительного наращивания клеточной массы из исходно небольшого количества клеток. Вследствие этого клетки в получаемой культуре приближаются к лимиту Хейфлика, характерному для стареющих клеток [9]. После описанных процедур выделенные клетки адаптируются к новым условиям, по меньшей мере, 2-3 недели. Известно, что длительное культивирование приводит к увеличению доли апоптотических клеток, снижению пролиферативной активности клеток [9], нарушению митотического деления, утрате основных функций или жировому перерождению клеток, поэтому используемые в прототипе сроки культивирования существенно повышают вероятность гибели клеток и появления клеток с измененным генотипом, а также с морфологическими и функциональными нарушениями, что недопустимо применительно к материалу, который предназначается для последующей трансплантации.However, the method described above, like most other analogues, involves a rather “tough” treatment of the primary material (skin biopsy), namely incubation with proteases of animal origin with constant mixing and pipetting, which is a traumatic procedure for cells that reduces the total amount viable cells in the resulting suspension of dermal fibroblasts, as well as leading to impaired adhesive and receptor systems in some cells that have remained viable. When using the skin biopsy treatment conditions proposed in the prototype method, a significant part of the cells die at the initial stage, and the required number of cells is obtained as a result of prolonged increase in cell mass from an initially small number of cells. As a result, the cells in the resulting culture approach the Hayflick limit, which is characteristic of aging cells [9]. After the procedures described, the selected cells adapt to new conditions for at least 2-3 weeks. It is known that long-term cultivation leads to an increase in the proportion of apoptotic cells, a decrease in the proliferative activity of cells [9], impaired mitotic division, loss of basic functions or fatty degeneration of cells; therefore, the cultivation time used in the prototype significantly increases the likelihood of cell death and the appearance of cells with a modified genotype, as well as with morphological and functional disorders, which is unacceptable in relation to material that is intended for subsequent transplantation.
Настоящее изобретение представляет собой разработку, в которой предпринята попытка повысить эффективность и качество получаемой для последующей трансплантации культуры аутологичных фибробластов за счет использования технологии получения культуры клеток из кожного экспланта, не требующей дополнительных механических воздействий и применения протеаз для обработки первичного материала, а также за счет сокращения общих сроков культивирования.The present invention is a development in which an attempt is made to improve the efficiency and quality of a culture of autologous fibroblasts obtained for subsequent transplantation by using a technology for obtaining a cell culture from a skin explant that does not require additional mechanical stresses and the use of proteases for processing primary material, as well as by reducing general terms of cultivation.
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Разработан способ получения культуры аутологичных дермальных фибробластов, предназначенной для регенеративной терапии, который основан на изолировании клеток за счет их спонтанной миграции из биоптата кожи пациента с помощью усовершенствованной методики, предусматривающей его инкубацию на подложке под покровным стеклом в оптимальных для осуществления этого процесса условиях, и последующем культивировании фибробластов на подложке в питательной среде, содержащей собственную сыворотку крови пациента, где в качестве внеклеточного матрикса, покрывающего подложку, на обеих стадиях используется поли-D-лизин.A method has been developed for producing a culture of autologous dermal fibroblasts intended for regenerative therapy, which is based on the isolation of cells due to their spontaneous migration from a biopsy specimen of a patient’s skin using an improved technique, which involves incubating it on a substrate under a coverslip under optimal conditions for this process and subsequent culturing fibroblasts on a substrate in a nutrient medium containing the patient’s own blood serum, where as extracellular ma the trix covering the substrate, poly-D-lysine is used in both steps.
Технический результат, достигаемый при осуществлении настоящего способа по изобретению, заключается в повышении качества получаемой культуры, выражающемся в увеличении жизнеспособности клеток и в сокращении сроков получения достаточного для проведения соответствующей медицинской или косметической процедуры количества жизнеспособных клеток.The technical result achieved by the implementation of the present method according to the invention is to improve the quality of the resulting culture, which is expressed in increasing cell viability and reducing the time required to obtain sufficient viable cells for the corresponding medical or cosmetic procedure.
Указанный технический результат достигается, главным образом, за счет применения более мягких физиологических условий первичной обработки экспланта, исключающих использование протеаз животного происхождения и грубых механических воздействий и предусматривающих дополнительную защиту его от неблагоприятных воздействий путем помещения под покровное стекло, а также благодаря использованию при инкубировании биоптата (на первой стадии способа) и полученных из него клеток (на второй стадии способа) подложек, покрытых синтетическим аналогом внеклеточного матрикса поли-D-лизином, который, как было установлено, обеспечивает максимальную скорость миграции и пролиферации выделяемых фибробластов в предлагаемых условиях. В качестве дополнительного результата можно отметить, что исключение из процедуры ферментов животного происхождения существенно снижает риск контаминации культивируемых клеток различными инфекциями, а также иммунного ответа при введении в кожу пациента.The specified technical result is achieved mainly due to the use of milder physiological conditions for the primary processing of the explant, which exclude the use of proteases of animal origin and rough mechanical effects and provide additional protection against adverse effects by placing under a coverslip, as well as through the use of a biopsy specimen during incubation ( at the first stage of the method) and cells obtained from it (at the second stage of the method) of substrates coated with synthetic analog extracellular matrix homo-poly-D-lysine, which has been found to provide the maximum rate of migration and proliferation of secreted fibroblasts under the proposed conditions. As an additional result, it can be noted that the exclusion of enzymes of animal origin from the procedure significantly reduces the risk of contamination of cultured cells with various infections, as well as the immune response when introduced into the patient’s skin.
Способы получения культуры кератиноцитов или фибробластов из кожного экспланта без ферментативной обработки применялись и ранее [7, 8]. Однако в известных способах кожный эксплант заключался в трехмерный гель, содержащий коллаген животного происхождения. Метод же культивирования кожного экспланта на подложке под стеклом, применяемый в данном изобретении, в научно-технической и патентной литературе не описан. Кроме того, имеющиеся в литературе данные свидетельствуют о том, что матриксами, в наибольшей степени стимулирующими адгезию фибробластов человека, являются коллаген, ламинин и фибронектин. Считается, что выживаемость клеток в культурах с использованием этих матриксов примерно на 15% выше, чем при использовании поли-L-лизина, а способность клеток, культивируемых в стандартных условиях, к адгезии на поли-D-лизине еще ниже, чем на поли-L-лизине [11]. Таким образом, при осуществлении изобретения был получен «неожиданный эффект», заключающийся в том, что в условиях предлагаемого способа именно использование поли-D-лизина в качестве внеклеточного матрикса дало наилучшие результаты в плане стимуляции миграции и пролиферации аутологичных фибробластов из кожного экспланта и при последующем культивировании выделенных клеток с использованием ССКП.Methods for obtaining a culture of keratinocytes or fibroblasts from a skin explant without enzymatic treatment have been used previously [7, 8]. However, in the known methods, the skin explant consisted of a three-dimensional gel containing collagen of animal origin. The method of culturing a skin explant on a substrate under glass, used in this invention, is not described in the scientific, technical and patent literature. In addition, the data available in the literature indicate that the matrices most stimulating the adhesion of human fibroblasts are collagen, laminin and fibronectin. It is believed that cell survival in cultures using these matrices is approximately 15% higher than when using poly-L-lysine, and the ability of cells cultured under standard conditions to adhere to poly-D-lysine is even lower than on poly- L-lysine [11]. Thus, when carrying out the invention, an “unexpected effect” was obtained, namely, that under the conditions of the proposed method, it was the use of poly-D-lysine as an extracellular matrix that gave the best results in terms of stimulating the migration and proliferation of autologous fibroblasts from the skin explant and subsequent culturing isolated cells using SSCP.
При осуществлении изобретения культуру аутологичных дермальных фибробластов получают в стерильных условиях из биоптатов кожи пациента. Используя питательную среду DMEM с добавлением 2% ФБС (фетальная бычья сыворотка) и раствора антибиотика-антимикотика, биоптат кожи помещают на чашки Петри, покрытые синтетическим аналогом внеклеточного матрикса поли-D-лизином, и располагают под стерильным покровным стеклом. Экспланты культивируют в инкубаторе при 37°С при 5%-ном содержании СО2. При таких условиях культивирования отдельные фибробласты мигрируют из экспланта и начинают пролиферировать уже на 3-4 день после начала культивирования (фиг.1), в то время как после ферментативной обработки биоптатов кожи начало пролиферации наблюдается лишь через 12-15 дней. При достижении конфлюэнтного монослоя (фиг.1В) клетки пассируют, используя для снятия клеток с подложки обработку синтетическим аналогом трипсина (раствором HyQ®Tase™). Далее клетки культивируют до 3-4 пассажа в среде DMEM с добавлением 10% ССКП.When carrying out the invention, a culture of autologous dermal fibroblasts is obtained under sterile conditions from biopsy samples of the patient’s skin. Using DMEM culture medium supplemented with 2% PBS (fetal bovine serum) and an antibiotic-antimycotic solution, the skin biopsy is placed on Petri dishes coated with a synthetic analogue of the extracellular matrix poly-D-lysine and placed under a sterile coverslip. Explants are cultured in an incubator at 37 ° C at 5% CO 2 . Under such cultivation conditions, individual fibroblasts migrate from the explant and begin to proliferate already 3-4 days after the start of cultivation (Fig. 1), while after the enzymatic treatment of skin biopsy samples, proliferation begins only after 12-15 days. Upon reaching the confluent monolayer (Fig. 1B), the cells are passaged using a synthetic trypsin analog (HyQ®Tase ™ solution) to remove cells from the substrate. Then the cells are cultured up to 3-4 passages in DMEM medium with the addition of 10% SSCP.
Для введения в кожу пациентам аутологичные дермальные фибробласты, выращенные данным способом, отмывают от среды культивирования в буфере Хэнкса, снимают с подложки и ресуспендируют в новой порции раствора Хэнкса в концентрации 1 миллион клеток в 1 мл.For introduction into the skin of patients, autologous dermal fibroblasts grown by this method are washed from the culture medium in Hanks buffer, removed from the substrate and resuspended in a new portion of Hanks solution at a concentration of 1 million cells in 1 ml.
Общая длительность предлагаемой процедуры получения культуры фибробластов составляет примерно 3-4 недели против 5-6 недель в способе-прототипе. Помимо повышения уровня сохранности клеток (числа исходно получаемых из экспланта кожи жизнеспособных клеток), на сокращение сроков культивирования в предлагаемом способе влияет оптимальный выбор внеклеточного матрикса, в качестве которого был применен поли-D-лизин, отобранный нами по результатам прямого сравнительного анализа шести наиболее широко используемых в практике вариантов (см. пример 2).The total duration of the proposed procedure for obtaining a culture of fibroblasts is approximately 3-4 weeks against 5-6 weeks in the prototype method. In addition to increasing the level of preservation of cells (the number of viable cells originally obtained from the skin explant), the optimal method of extracellular matrix, which was used as a poly-D-lysine, which we selected from the results of direct comparative analysis of the six most widely the options used in practice (see example 2).
Указанное сокращение сроков культивирования снижает вероятность появления таких признаков «старения» клеток, как полиплоидия или многоядерность. В культуре фибробластов, полученной предлагаемым методом, указанных аномалий обнаружено не было ни в одном из экспериментов. Не было выявлено и изменений морфологии клеток или признаков нарушения митотического деления (патологических митозов, наличия микроядер). На всем протяжении культивирования фибробластов сохранялось контактное торможение деления клеток, характерное для нормальных нетрансформированных фибробластов: при достижении монослоя клеток пролиферативная активность фибробластов резко падала.The indicated reduction in cultivation time reduces the likelihood of the appearance of such signs of cell “aging” as polyploidy or multicore. In the fibroblast culture obtained by the proposed method, these abnormalities were not found in any of the experiments. There were no changes in cell morphology or signs of mitotic division disorders (pathological mitoses, micronuclei). Throughout the cultivation of fibroblasts, contact inhibition of cell division, characteristic of normal non-transformed fibroblasts, continued: upon reaching the monolayer of cells, the proliferative activity of fibroblasts dropped sharply.
С целью более полной характеристики полученной предлагаемым способом культуры фибробластов была проведена оценка митотического и апоптотического индекса при культивировании клеток в среде с ССКП, а также анализ их генетической стабильности в указанных условиях. Для сравнения использовали клетки, культивируемые в среде без сыворотки или в среде с содержанием 10% ФБС, которая стандартно используется для культивирования большинства клеток.In order to more fully characterize the fibroblast culture obtained by the proposed method, the mitotic and apoptotic index was evaluated during cell cultivation in an environment with SSCP, as well as an analysis of their genetic stability under the indicated conditions. For comparison, cells cultured in serum-free medium or in medium containing 10% PBS, which is standardly used for the cultivation of most cells, were used.
По результатам статистической обработки данных определения митотического индекса установлено, что через 48 часов происходит увеличение митотической активности фибробластов, культивированных в условиях, предусмотренных предлагаемым способом (культивирование на чашках Петри, покрытых поли-D-лизином, с использованием 10% аутологичной сыворотки крови пациента), которое достоверно больше наблюдаемого для клеток, культивируемых в тех же условиях, но в среде, не содержащей сыворотки. При этом митотическая активность фибробластов, культивированных с 10% ССКП, и митотическая активность клеток, культивированных с 10% ФБС, были сопоставимы (фиг.2), что свидетельствует о столь же высокой способности ССКП стимулировать рост клеток в предлагаемых условиях получения культуры, как и в случае традиционно используемой ФБС.According to the results of statistical processing of the mitotic index determination data, it was found that after 48 hours there is an increase in the mitotic activity of fibroblasts cultured under the conditions provided by the proposed method (cultivation on Petri dishes coated with poly-D-lysine using 10% autologous patient blood serum), which is significantly greater than that observed for cells cultured under the same conditions, but in a serum-free medium. In this case, the mitotic activity of fibroblasts cultured with 10% SSCP and the mitotic activity of cells cultured with 10% PBS were comparable (Fig. 2), which indicates the high ability of SSCP to stimulate cell growth under the proposed culture conditions as in the case of the traditionally used FBS.
Оценка апоптотического индекса показала, что культивирование, осуществляемое согласно предлагаемому способу, не вызывает увеличения доли апоптотических фибробластов в отличие от эксперимента с заменой ССКП на ФБС, где несмотря на высокий митотический индекс (см. выше) увеличение доли апоптотических клеток более чем в 3 раза, превышает этот показатель, измеренный у фибробластов, культивированных с использованием ССКП (фиг.3).Evaluation of the apoptotic index showed that cultivation carried out according to the proposed method does not cause an increase in the proportion of apoptotic fibroblasts, in contrast to the experiment with replacing SSC with FBS, where despite the high mitotic index (see above), the proportion of apoptotic cells is more than 3 times exceeds this indicator measured in fibroblasts cultured using SSCP (figure 3).
Для изучения генетического полиморфизма в полученных культурах дермальных фибробластов был использован метод RAPD-PCR анализа ДНК с применением ряда случайных праймеров (447, Р29, R45). Данное исследование позволяет контролировать генетическую изменчивость фибробластов и возможное возникновение мутаций при длительном культивировании и пассировании клеток в условиях in vitro [4, 5, 6], где изменение подвижности тех или иных фрагментов ДНК рассматривают как следствие геномных перестроек или мутаций, затрагивающих участки комплементарного связывания ДНК с олигонуклеотидными праймерами. При исследовании образцов ДНК культур фибробластов визуально определимые отличия в RAPD-PCR спектрах образцов ДНК были обнаружены только при использовании праймера 447 (пример 4). В эксперименте анализировали ДНК, выделенную из аутологичных дермальных фибробластов линий, полученных от нескольких здоровых волонтеров, после культивирования либо в условиях согласно способу по изобретению (культивирование на чашках Петри, покрытых поли-D-лизином, с использованием 10% ССКП), либо в аналогичных условиях, но с 10% ФБС. При этом было показано, что фибробласты, культивируемые в условиях нового способа, проявляют большую генетическую стабильность, чем при культивировании в тех же условиях, но в присутствии 10% ФБС, которая используется в большинстве протоколов для культивирования клеток различного происхождения.To study genetic polymorphism in the obtained cultures of dermal fibroblasts, the RAPD-PCR method of DNA analysis using a number of random primers was used (447, P29, R45). This study allows us to control the genetic variability of fibroblasts and the possible occurrence of mutations during prolonged cultivation and passivation of cells in vitro [4, 5, 6], where changes in the mobility of certain DNA fragments are considered as a result of genomic rearrangements or mutations affecting areas of complementary DNA binding with oligonucleotide primers. In the study of DNA samples of fibroblast cultures, visually detectable differences in the RAPD-PCR spectra of DNA samples were detected only when using primer 447 (example 4). In the experiment, DNA isolated from autologous dermal fibroblasts of lines obtained from several healthy volunteers was analyzed after cultivation either under the conditions according to the method of the invention (cultivation on Petri dishes coated with poly-D-lysine using 10% SSCP) or similar conditions, but with 10% FBS. It was shown that fibroblasts cultured under the conditions of the new method exhibit greater genetic stability than when cultured under the same conditions, but in the presence of 10% FBS, which is used in most protocols for culturing cells of various origins.
К сожалению, сравнение культуры фибробластов, получаемой новым способом и способом-прототипом, по трем названным выше показателям, которые объективно свидетельствуют о высоком качестве культуры по изобретению, не представляется возможным, поскольку в отношении культуры, описанной в патенте RU №2320720, эти показатели не анализировались.Unfortunately, comparing the culture of fibroblasts obtained by the new method and the prototype method according to the three indicators mentioned above, which objectively testify to the high quality of the culture according to the invention, is not possible, as for the culture described in RU patent No. 2320720, these indicators are not were analyzed.
Из проведенных при осуществлении изобретения исследований с очевидностью следует, что высокое качество получаемой культуры аутологичных фибробластов и сокращение сроков процедуры культивирования определяются комплексом применяемых для осуществления предлагаемого способа условий: применением «мягкой» обработки исходного материала; среды, содержащей ССКП, и поли-D-лизина в качестве внеклеточного матрикса.From the studies carried out during the implementation of the invention, it obviously follows that the high quality of the resulting culture of autologous fibroblasts and the reduction of the cultivation time are determined by the set of conditions used to implement the proposed method: the use of "soft" processing of the source material; medium containing SSCP, and poly-D-lysine as an extracellular matrix.
Таким образом, объектом настоящего изобретения является способ выделения и культивирования аутологичных дермальных фибробластов для стимуляции регенеративных процессов и заместительной терапии, включающий получение клеток из экспланта кожи пациента и инкубацию их в питательной среде DMEM/раствор антибиотика-антимикотика, содержащей 10%-ную собственную сыворотку крови пациента (ССКП), отличающийся тем, что изолированные клетки получают из биоптата путем размещения его под стерильным покровным стеклом на чашке Петри, покрытой синтетическим аналогом внеклеточного матрикса поли-D-лизином, и инкубирования в питательной среде DMEM/раствор антибиотика-антимикотика, содержащей 2% фетальную бычью сыворотку, после образования монослоя клетки снимают раствором, содержащим синтетический аналог трипсина, и проводят их культивирование в питательной среде с ССКП на чашке Петри, покрытой поли-D-лизином.Thus, an object of the present invention is a method for the isolation and cultivation of autologous dermal fibroblasts to stimulate regenerative processes and replacement therapy, including obtaining cells from an explant of a patient’s skin and incubating them in DMEM / antibiotic-antimycotic solution containing 10% intrinsic blood serum patient (SSCP), characterized in that the isolated cells are obtained from the biopsy specimen by placing it under a sterile coverslip on a synthetic Petri dish by analogy with the extracellular matrix poly-D-lysine, and incubation in a DMEM nutrient medium / antibiotic-antimycotic solution containing 2% fetal bovine serum, after the monolayer is formed, the cells are removed with a solution containing a synthetic trypsin analog and cultured in a nutrient medium with SSCP on a Petri dish coated with poly-D-lysine.
Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings
Фиг.1. Фазово-контрастное изображение миграции фибробластов из экспланта кожи и формирования клетками монослоя. А - мигрирующие фибробласты (4 день культивирования). Б - начало формирования монослоя фибробластов. В - сформированный монослой фибробластов (10-12 день культивирования). Ядра докрашены DAPI.Figure 1. Phase-contrast image of the migration of fibroblasts from the skin explant and the formation of a monolayer by cells. A - migratory fibroblasts (4th day of cultivation). B - the beginning of the formation of a monolayer of fibroblasts. B - formed monolayer of fibroblasts (10-12 days of cultivation). The kernels are repainted with DAPI.
Фиг.2. Определение митотического индекса клеток в получаемой культуре аутологичных фибробластов.Figure 2. Determination of mitotic cell index in the resulting culture of autologous fibroblasts.
Фиг.3. Определение апоптотического индекса клеток в получаемой культуре аутологичных фибробластов.Figure 3. Determination of apoptotic cell index in the resulting culture of autologous fibroblasts.
Фиг.4. Метод RAPD-PCR анализа геномной ДНК клеток полученной культуры с применением праймера 447. Профили амплификации образцов ДНК клеточных линий, полученных от различных индивидуумов, обозначены номерами #11, #14 и #20. Номера дорожек внутри образца (1, 5, 10) соответствуют номеру пассажа данной линии фибробластов, культивированных с использованием 10% ФБС. Дорожка 10* соответствует 10 пассажу линии фибробластов того же образца при культивировании с использованием 10% ССКП.Figure 4. The RAPD-PCR method for analyzing the genomic DNA of cells of the obtained culture using primer 447. The amplification profiles of DNA samples of cell lines obtained from various individuals are indicated by numbers # 11, # 14 and # 20. The track numbers inside the sample (1, 5, 10) correspond to the passage number of this line of fibroblasts cultured using 10% FBS.
Осуществление изобретенияThe implementation of the invention
При осуществлении изобретения, помимо методов, подробно раскрытых в нижеследующих примерах, были использованы хорошо известные специалистам методики по культивированию клеток, описанные также в цитированных источниках.When carrying out the invention, in addition to the methods described in detail in the following examples, well-known cell culture techniques were used, which are also described in the cited sources.
Пример 1Example 1
Для получения культуры дермальных фибробластов использовали биоптаты кожи человека размером 2×3×4 мм. Работа с биоптатом проводилась стерильными инструментами.To obtain a culture of dermal fibroblasts, human skin biopsy samples of 2 × 3 × 4 mm in size were used. Work with the biopsy was carried out with sterile instruments.
После выделения биоптат помещали в одноразовую пробирку с питательной средой HyQ® DMEM RS™ (Hyclone) (без добавления сыворотки), содержащей раствор антибиотика/антимикотика (HyQ Antibiotic/Antimycotic Solution, Нуclone). Следует отметить, что в качестве питательной среды и раствора антибиотика/антимикотика могут быть использованы не только продукты избранной нами фирмы, но и аналогичные продукты любых других фирм-производителей. Затем в стерильных условиях культурального бокса биоптат переносили в раствор HyQ® DMEM/F12-RS™ (Нуclone) с добавлением 2% ФБС (фетальная бычья сыворотка), раствора антибиотика-антимикотика (Hyclone) и помещали на чашки Петри CELLCOAT, покрытые внеклеточным матриксом (выбор его оптимального варианта описан в примере 2), располагая кусочек кожи под стерильным покровным стеклом. Эксплант кожи культивировали в инкубаторе при 37°С при 5%-ном содержании CO2. Уже на 2-3 день из кожного экспланта наблюдали начало миграции фибробластов из кожного экспланта, на 4 день - деление клеток и постепенное формирование монослоя на поверхности чашки Петри (фиг.1). При достижении конфлюэнтного монослоя, образующегося примерно на 10 день (фиг.2), клетки пассировали.After isolation, the biopsy sample was placed in a disposable tube with HyQ ® DMEM RS ™ nutrient medium (Hyclone) (without serum) containing an antibiotic / antimycotic solution (HyQ Antibiotic / Antimycotic Solution, Nucone). It should be noted that as a nutrient medium and a solution of antibiotic / antimycotics can be used not only the products of our chosen company, but also similar products of any other manufacturing companies. Then, under sterile conditions of the culture box, the biopsy was transferred to a HyQ ® DMEM / F12-RS ™ solution (Huclone) with the addition of 2% PBS (fetal bovine serum), an antibiotic-antimycotic solution (Hyclone) and placed on CELLCOAT Petri dishes coated with an extracellular matrix ( the choice of its optimal option is described in example 2), placing a piece of skin under a sterile coverslip. The skin explant was cultured in an incubator at 37 ° C. at 5% CO 2 . Already on day 2-3 from the skin explant, the onset of fibroblast migration from the skin explant was observed, on day 4, cell division and the gradual formation of a monolayer on the surface of the Petri dish (Fig. 1). Upon reaching the confluent monolayer formed on approximately 10 days (Fig.2), the cells were passaged.
Для снятия с подложки монослой клеток обрабатывали раствором HyQ®Tase™ (Hyclone), который является синтетическим аналогом трипсина, не содержащим добавок животного или бактериального происхождения. Снятые с подложки клетки рассаживали в соотношении 1:3. Далее клетки культивировали до 3-4 пассажа в среде HyQ® DMEM/F12-RS™ (Hyclone) с добавлением 10% ССКП (собственной сыворотки крови пациента).For removal from the substrate, the monolayer of cells was treated with a HyQ®Tase ™ solution (Hyclone), which is a synthetic trypsin analogue that does not contain additives of animal or bacterial origin. Cells removed from the substrate were seated in a 1: 3 ratio. Then, the cells were cultured until passage 3-4 in HyQ ® DMEM / F12-RS ™ medium (Hyclone) supplemented with 10% SSCP (patient's own blood serum).
Для использования в процедуре трансплантации аутологические дермальные фибробласты, выращенные на аутологической сыворотке, отмывали от среды культивирования в буфере Хэнкса (Hank's Balanced Salt Solution, HyQ HBSS, Hyclone), обрабатывали раствором Версена для снятия клеток с подложки в течение 15 мин и центрифугировали в течение 5 мин при 200 g. Супернатант сливали, а клетки ресуспендировали в новой порции раствора Хэнкса в концентрации 1 миллион клеток в 1 мл. Полученная суспензия аутологических фибробластов в растворе Хэнкса пригодна для введения фибробластов в кожу человека.For use in the transplantation procedure, autologous dermal fibroblasts grown on autologous serum were washed from Hank's Balanced Salt Solution, HyQ HBSS, Hyclone), treated with Versene solution to remove cells from the substrate for 15 min and centrifuged for 5 min at 200 g. The supernatant was discarded, and the cells were resuspended in a new portion of Hanks' solution at a concentration of 1 million cells in 1 ml. The resulting suspension of autologous fibroblasts in Hanks solution is suitable for introducing fibroblasts into human skin.
В случае необходимости длительного хранения культивированных фибробластов клетки замораживали в среде культивирования с добавлением 15-20% ССКП и 10% ДМСО в качестве криопротектора.If necessary, long-term storage of cultured fibroblasts, the cells were frozen in the culture medium with the addition of 15-20% SSCP and 10% DMSO as a cryoprotectant.
Пример 2Example 2
Для подбора наиболее благоприятного субстрата для выделения и культивирования дермальных фибробластов было протестировано несколько видов культурального пластика, покрытого разными типами внеклеточного матрикса или без него. Были использованы: 1) чашки Петри CELLCOAT®, покрытые коллагеном I типа (Greiner bio-one) 2) чашки Петри CELLCOAT®, покрытые синтетическим аналогом внеклеточного матрикса поли-D-лизином (Greiner bio-one) 3) чашки Петри CELLCOAT®, покрытые фибронектином человека (Greiner bio-one) 4) чашки Петри CELLCOAT® покрытые ламинином (Greiner bio-one) 5) стандартные без покрытия полистириновые чашки Петри Corning®, предназначенные для культивирования клеток (Corning Incorporated) 6) стандартные без покрытия полистириновые чашки Петри Corning®, покрытые 0,2% желатином.To select the most favorable substrate for the isolation and cultivation of dermal fibroblasts, several types of culture plastic, coated with or without different types of extracellular matrix, were tested. The following were used: 1) CELLCOAT ® Petri dishes coated with type I collagen (Greiner bio-one) 2) CELLCOAT ® Petri dishes coated with synthetic extracellular matrix analog poly-D-lysine (Greiner bio-one) 3) CELLCOAT ® Petri dishes, human fibronectin-coated (Greiner bio-one) 4) CELLCOAT ® Petri dishes laminin-coated (Greiner bio-one) 5) standard uncoated Corning ® Petri dishes intended for cell culture (Corning Incorporated) 6) standard uncoated polystyrene Petri dishes Corning ® coated with 0.2% gelatin.
Биоптат делили на 6 фрагментов и помещали в каждую из указанных типов чашек, добавляя по 4 мл среды HyQ® DMEM/F12-RS™ (Hyclone)/20% ФБС (Hyclone). Было обнаружено, что оптимальным типом внеклеточного матрикса для стимуляции миграции и пролиферации дермальных фибробластов в условиях in vitro является поли-D-лизин. На чашках Петри CELLCOAT®, покрытых синтетическим аналогом внеклеточного матрикса поли-D-лизином (Greiner bio-one), одиночные фибробласты мигрируют из биоптата уже на 3-4 сутки, а через 7-10 дней формируют монослой. При использовании всех других типов внеклеточного матрикса миграция отдельных фибробластов из биоптата происходит не ранее, чем на 5-7 сутки, а монослой формируется не ранее, чем через 12-14 дней. Таким образом, использование культурального пластика, покрытого поли-D-лизином, позволяет существенно ускорить процедуру выделения и выращивания клеток из кожного экспланта.The biopsy was divided into 6 fragments and placed in each of these types of plates, adding 4 ml of HyQ ® DMEM / F12-RS ™ (Hyclone) / 20% PBS (Hyclone) medium. It was found that the optimal type of extracellular matrix for stimulating the migration and proliferation of dermal fibroblasts in vitro is poly-D-lysine. On CELLCOAT ® Petri dishes coated with a synthetic analog of the extracellular matrix poly-D-lysine (Greiner bio-one), single fibroblasts migrate from the biopsy specimen already for 3-4 days, and after 7-10 days form a monolayer. When using all other types of extracellular matrix, the migration of individual fibroblasts from the biopsy occurs no earlier than 5-7 days, and the monolayer is formed no earlier than 12-14 days. Thus, the use of culture plastic coated with poly-D-lysine can significantly accelerate the procedure for isolation and growth of cells from the skin explant.
Пример 3Example 3
Для оценки скорости роста и апоптотического индекса фибробластов кожи в культуре, полученной описанным в примере 1 способом, клетки высаживали на чашки Петри, покрытые поли-D-лизином в концентрации 100 тыс. клеток/мл. Через сутки клетки депревировали в течение 24 часов. Для проведения эксперимента клетки помещали в среду DMEM HyQ® DMEM/F12-RS™ (Hyclone) с антибиотиком-антимикотиком, содержащую разные концентрации сыворотки: 0%, 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС) или 10% собственной сыворотки крови пациента (ССКП). Клетки фиксировали 4% нейтральным формалином через 48 часов и окрашивали гематоксилином.To assess the growth rate and apoptotic index of skin fibroblasts in the culture obtained by the method described in Example 1, the cells were planted on Petri dishes coated with poly-D-lysine at a concentration of 100 thousand cells / ml. After a day, the cells were depreted for 24 hours. For the experiment, the cells were placed in DMEM HyQ ® DMEM / F12-RS ™ (Hyclone) with an antibiotic-antimycotic containing different concentrations of serum: 0%, 10% fetal bovine serum (FBS) or 10% of the patient's own blood serum (SSCP) . Cells were fixed with 4% neutral formalin after 48 hours and stained with hematoxylin.
На препаратах оценивали число митотических (фиг.2) и апоптотических (фиг.3) клеток на 1000 клеток. Статистическая обработка полученных результатов показала, что через 48 часов происходит достоверное увеличение митотической активности фибробластов, культивируемых в среде, содержащей 10% аутологичной сыворотки (по сравнению со средой, не содержащей сыворотки). При этом митотическая активность клеток, культивированных в присутствии 10% ФБС и 10% ССКП, сопоставима, что свидетельствует о том, что ССКП способна так же эффективно, как и ФСБ, считающаяся у специалистов оптимальной, стимулировать рост клеток в культуре. Существенно, однако, что использование ССКП позволяет избежать риска заражения культуры клеток инфекциями, которые потенциально могут присутствовать в сыворотках животных, и с этой точки зрения оно является предпочтительным.The number of mitotic (FIG. 2) and apoptotic (FIG. 3) cells per 1000 cells was evaluated on the preparations. Statistical processing of the results showed that after 48 hours there is a significant increase in the mitotic activity of fibroblasts cultured in a medium containing 10% autologous serum (compared with a medium containing no serum). At the same time, the mitotic activity of cells cultured in the presence of 10% PBS and 10% SSCP is comparable, which indicates that SSCP is capable of stimulating cell growth in culture as effectively as the PSC, which is considered optimal among specialists. It is significant, however, that the use of SSCP avoids the risk of infection of the cell culture with infections that could potentially be present in animal sera, and from this point of view it is preferred.
Оценка апоптотического индекса показала, что культивирование полученных предлагаемым методом фибробластов в среде с собственной сывороткой крови пациента не вызывает достоверного увеличения доли апоптотических клеток через 48 часов (фиг.3). Следует отметить, что при использовании среды культивирования, содержащей 10% ФБС, рост доли апоптотических клеток за то же время более чем в 3 раза превышает показатель для фибробластов, культивированных с использованием ССКП.Evaluation of the apoptotic index showed that culturing the fibroblasts obtained by the proposed method in a medium with the patient’s own blood serum does not cause a significant increase in the proportion of apoptotic cells after 48 hours (Fig. 3). It should be noted that when using a culture medium containing 10% PBS, the increase in the proportion of apoptotic cells at the same time is more than 3 times higher than for fibroblasts cultured using SSCP.
Пример 4Example 4
Безопасность трансплантации фибробластов в значительной мере связана с сохранением клетками нормального (исходного) генетического статуса. В связи с этим полученная способом по изобретению культура была исследована на предмет возможной трансформации фибробластов в процессе культивирования. Для этого использовали фибробласты, полученные от 8 здоровых доноров, на 1, 5 и 10 пассажах культивирования в среде HyQ® DMEM/F12-RS™ (Hyclone) с добавлением 10% ССКП; для сравнения использовались фибробласты, полученные от тех же пациентов, но культивированные в среде HyQ® DMEM/F12-RS™ (Hyclone) с добавлением 10% или 20% ФБС (Hyclone).The safety of fibroblast transplantation is largely associated with the preservation of normal (initial) genetic status by cells. In this regard, the culture obtained by the method according to the invention was examined for the possible transformation of fibroblasts during cultivation. To do this, we used fibroblasts obtained from 8 healthy donors in the 1st, 5th and 10th passages of cultivation in HyQ ® DMEM / F12-RS ™ medium (Hyclone) with the addition of 10% SSCP; for comparison, fibroblasts obtained from the same patients, but cultured in HyQ ® DMEM / F12-RS ™ (Hyclone) medium with the addition of 10% or 20% PBS (Hyclone) were used.
Из культур клеток фибробластов выделяли ДНК при помощи стандартной фенольно-хлороформной методики с применением протеиназы К [3]. Затем проводили PCR-амплификацию на четырехканальном ДНК-амплификаторе «Терцик» (ТП4-ПЦР-01), используя в качестве матрицы 100 нг геномной ДНК (в объеме 20 мкл) и набор «GenePak PCR Core» («Лаборатория Изоген»). Продукты амплификации фракционировали в 2% агарозном геле в течение 18 часов при температуре 4°С в 1х трис-боратном (ТБЕ) буфере: 89 mM трис-борат, 89 mM борная кислота, 2 mM ЭДТА, pH 8.0, с последующей визуализацией с использованием раствора бромистого этидия 50 мкг/л. В качестве маркеров молекулярного веса использовали 100 bp Ladder + (Fermentas) и Ladder 1kb (Fermentas).DNA was isolated from fibroblast cell cultures using a standard phenol-chloroform technique using proteinase K [3]. Then, PCR amplification was performed on a Tertsik four-channel DNA amplifier (TP4-PCR-01) using 100 ng of genomic DNA (in a volume of 20 μl) and a GenePak PCR Core kit (Isogen Laboratory) as a template. The amplification products were fractionated on a 2% agarose gel for 18 hours at 4 ° C in 1x Tris-borate (TBE) buffer: 89 mM Tris-borate, 89 mM boric acid, 2 mM EDTA, pH 8.0, followed by visualization using ethidium bromide solution 50 μg / l. 100 bp Ladder + (Fermentas) and Ladder 1kb (Fermentas) were used as molecular weight markers.
Для выявления генетической изменчивости применяли метод полимеразной цепной реакции RAPD-PCR со случайными праймерами. В данном случае использовали три праймера - Р92, R45, 447: Р92 5'-CATTCCGGCC-3', R45 5'-GCCGTCCGAG-3', 447 5'-AACGGTCACG-3', которые были отобраны на основании ранее полученных результатов [4, 5, 6]. Чувствительность данных праймеров позволяет использовать их для оценки внутривидовой специфичности, а также проводить геномную характеристику клеточных культур (заявка на патент №2008114535 от 16.04.2008 г.).To identify genetic variation, the RAPD-PCR polymerase chain reaction method with random primers was used. In this case, three primers were used - P92, R45, 447: P92 5'-CATTCCGGCC-3 ', R45 5'-GCCGTCCGAG-3', 447 5'-AACGGTCACG-3 ', which were selected based on previously obtained results [4 , 5, 6]. The sensitivity of these primers allows you to use them to assess the intraspecific specificity, as well as to carry out the genomic characteristics of cell cultures (patent application No. 2008114535 dated 04.16.2008).
При исследовании полученных образцов ДНК значительные отличия в RAPD-PCR спектрах были обнаружены только в случае использования праймера 447. Данные отличия выражались в изменении электрофоретической подвижности отдельных фрагментов, а также появлении или утрате фрагментов в спектрах ДНК, выделенных из фибробластов длительного пассирования. На фиг.4 представлены результаты амплификации с олигонуклеотидом 447, из которых видно, что RAPD спектры представлены в среднем 12 фрагментами в зоне электрофоретического фракционирования от 250 п.о. до 1500 п.о. Исходные профили амплификации образцов ДНК различных клеточных линий, полученных от разных доноров, были в целом идентичными, хотя имелись определенные индивидуальные различия (номера #11, #14 и #20 соответствуют номерам клеточных образцов). Обращает на себя внимание то, что в клетках, культивированных с использованием ФБС, иногда уже к 5 пассажу (образец #20), хотя в основном к 10 пассажу (образец #14, #11), проявлялись изменения RAPD спектров образцов ДНК. В частности, при культивировании клеток образца #14 с использованием ФБС нестабильность RAPD спектров образцов ДНК отмечалась к 10 пассажу (ср. дорожки 1, 5, 10), в то время как при культивировании клеток этого же образца с использованием ССКП RAPD спектры образцов ДНК на этот момент никаких изменений не обнаруживали (дорожка 10*).When studying the obtained DNA samples, significant differences in the RAPD-PCR spectra were found only in the case of using primer 447. These differences were expressed in the change in the electrophoretic mobility of individual fragments, as well as the appearance or loss of fragments in the DNA spectra isolated from long-lasting fibroblasts. Figure 4 presents the results of amplification with oligonucleotide 447, from which it can be seen that the RAPD spectra are represented by an average of 12 fragments in the area of electrophoretic fractionation from 250 bp up to 1500 bp The initial amplification profiles of DNA samples of various cell lines obtained from different donors were generally identical, although there were certain individual differences (numbers # 11, # 14 and # 20 correspond to the numbers of cell samples). It is noteworthy that in cells cultured using PBS, sometimes by the 5th passage (sample # 20), although mainly by the 10th passage (
По результатам применения метода RAPD-PCR анализа ДНК может быть сделан вывод о том, что культуры фибробластов по изобретению демонстрируют достаточно продолжительную генетическую стабильность клеток в условиях in vitro.Based on the results of applying the RAPD-PCR method of DNA analysis, it can be concluded that the fibroblast cultures of the invention exhibit a fairly long genetic stability of cells in vitro.
Совокупность всех исследованных при осуществлении изобретения показателей качества культуры аутологичных дермальных фибробластов, полученной предлагаемым способом («мягкие» условия на стадии выделения клеток, использование поли-D-лизина в качестве внеклеточного матрикса и включение ССКП в среду для культивирования), демонстрирует высокую жизнеспособность и пролиферативную активность, низкий апоптотический уровень и относительную генетическую стабильность, в связи с чем может быть рекомендована как безопасный препарат для клеточной терапии в эстетической медицине.The totality of all the quality indicators of the culture of autologous dermal fibroblasts obtained by the proposed method (“mild” conditions at the stage of cell isolation, use of poly-D-lysine as an extracellular matrix and the incorporation of SSCP into the culture medium) studied in the invention demonstrates high viability and proliferative activity, low apoptotic level and relative genetic stability, and therefore can be recommended as a safe preparation for cellular oh therapy in aesthetic medicine.
ЛитератураLiterature
1. Lim I.J., Phan T.T., Bay B.H., Qi R., Huynh H., Tan W.T., Lee S.T., Longaker M.T. Fibroblasts cocultured with keloid keratinocytes: normal fibroblasts secrete collagen in a keloidlike manner. Am J Physiol Cell Physiol. 2002, 283: C212-C222.1. Lim I.J., Phan T.T., Bay B.H., Qi R., Huynh H., Tan W.T., Lee S.T., Longaker M.T. Fibroblasts cocultured with keloid keratinocytes: normal fibroblasts secrete collagen in a keloidlike manner. Am J Physiol Cell Physiol. 2002,283: C212-C222.
2. Рубина К.А., Калинина Н.И., Сысоева В.Ю., Беренбейн М.Б., Парфенова Е.В. Фенотипическая и функциональная характеристика клеток, используемых для аутотрансплантации. Эстетическая Медицина. 2006. 5(3): 291-298.2. Rubina K.A., Kalinina N.I., Sysoeva V.Yu., Berenbein MB, Parfenova E.V. Phenotypic and functional characteristics of cells used for autotransplantation. Aesthetic Medicine. 2006.5 (3): 291-298.
3. Mathew, C.G.P. Methods in Molecular Biology, Walker J.M., Ed., New York: Human Press, 1984, Vol.2, pp.31-34.3. Mathew, C.G.P. Methods in Molecular Biology, Walker J.M., Ed., New York: Human Press, 1984, Vol. 2, pp. 31-34.
4. Alexandrova S.A., Shvemberg I.N. Genetic variability of the mouse hepatoma cells MH-22a revealed by RAPDPCR-fingerprinting under different conditions of cultivation.//Experimental Oncology. 2005. V. 27. (2). P.114-119.4. Alexandrova S.A., Shvemberg I.N. Genetic variability of the mouse hepatoma cells MH-22a revealed by RAPDPCR-fingerprinting under different conditions of cultivation.//Experimental Oncology. 2005.V. 27. (2). P.114-119.
5. Малышева Д.Н., Токарская О.Н., Петросян В.Г. и др. Генетическая дифференциация партеногенетических ящериц Darevskia rostombekowi (сем. Lacertidae) по данным ядерных и митохондриальных маркеров ДНК.// Докл. РАН. 2006. Т.410. №4. С.560-563.5. Malysheva D.N., Tokarskaya O.N., Petrosyan V.G. et al. Genetic differentiation of parthenogenetic lizards Darevskia rostombekowi (family Lacertidae) according to nuclear and mitochondrial DNA markers. // Dokl. RAS. 2006.V. 410. Number 4. S.560-563.
6. Бутовская П.В., Мартиросян И.А., Баранов B.C., Егорова А.А., Киселев А.В., Павлова Г.В., Корочкин Л.И. Выявление соматического мозаицизма у человека с помощью полимеразной цепной реакции со случайными праймерами.//Генетика. 2007. Т.43. №12. С.1-5.6. Butovskaya P.V., Martirosyan I.A., Baranov B.C., Egorova A.A., Kiselev A.V., Pavlova G.V., Korochkin L.I. Identification of somatic mosaicism in humans using polymerase chain reaction with random primers.// Genetics. 2007.V. 43. No. 12. S.1-5.
7. Duong H.S., Zhang Q., Kobi A., Le A., Messadi D.V.a Assessment of morphological and Immunohistological Alterations in Long-Term Keloid Skin Explants.//Cells Tissues Organs 2005. V.181: P.89-102.7. Duong HS, Zhang Q., Kobi A., Le A., Messadi DV a Assessment of morphological and Immunohistological Alterations in Long-Term Keloid Skin Explants.//Cells Tissues Organs 2005. V.181: P.89-102 .
8. Froget S., Barthelemy E., Guillot F., Soler C., Coudert M.C., Benbunan M., Dosquet C. Wound healing mediator production by human dermal fibroblasts grown within a collagen-GAG matrix for skin repair in humans. //Eur Cytokine Netw. 2003. V.14. P.60-64.8. Froget S., Barthelemy E., Guillot F., Soler C., Coudert M.C., Benbunan M., Dosquet C. Wound healing mediator production by human dermal fibroblasts grown within a collagen-GAG matrix for skin repair in humans. // Eur Cytokine Netw. 2003. V.14. P.60-64.
9. Hayflick L., Moorhead P.S. The serial cultivation of human diploid cell strains.//Exp Cell Res. 1961. 25. P.585-621.9. Hayflick L., Moorhead P.S. The serial cultivation of human diploid cell strains.//Exp Cell Res. 1961.25. P.585-621.
10. Asano Y., Ihn H., Yamane K., Jinnin M., Tamaki K. Increased Expression of Integrin αvβ5 Induces the Myofibroblastic Differentiation of Dermal Fibroblasts.// Am J Pathol. 2006. 168. P.499-510.10. Asano Y., Ihn H., Yamane K., Jinnin M., Tamaki K. Increased Expression of Integrin αvβ5 Induces the Myofibroblastic Differentiation of Dermal Fibroblasts.// Am J Pathol. 2006.168. P.499-510.
11. Baust M., Fowler A., Toner M. Effect of Cell Substrate Interactions on the Desiccation Behavior of Human Fibroblasts. //Cell Preservation Technology. 2004. V.2. P.188-197.11. Baust M., Fowler A., Toner M. Effect of Cell Substrate Interactions on the Desiccation Behavior of Human Fibroblasts. // Cell Preservation Technology. 2004. V.2. P.188-197.
12. Патент РФ №2320720 С2, 27.03.2008.12. RF patent No. 2320720 C2, 03/27/2008.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008127284/13A RU2382077C1 (en) | 2008-07-08 | 2008-07-08 | Method for recovery and cultivation of autologous dermal fibroblasts for stimulation of regenerative processes and replacement therapy |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008127284/13A RU2382077C1 (en) | 2008-07-08 | 2008-07-08 | Method for recovery and cultivation of autologous dermal fibroblasts for stimulation of regenerative processes and replacement therapy |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2382077C1 true RU2382077C1 (en) | 2010-02-20 |
Family
ID=42127029
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2008127284/13A RU2382077C1 (en) | 2008-07-08 | 2008-07-08 | Method for recovery and cultivation of autologous dermal fibroblasts for stimulation of regenerative processes and replacement therapy |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2382077C1 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2496870C2 (en) * | 2011-02-15 | 2013-10-27 | Государственное научное учреждение Прикаспийский зональный научно-исследовательский ветеринарный институт Российской академии сельскохозяйственных наук | Method to produce epithelioid cells of light foetus of buffalo cow for cultivation of viruses |
| RU2578804C1 (en) * | 2015-04-27 | 2016-03-27 | Екатерина Евгеньевна Фаустова | Method for rejuvenation patient's body |
| RU2617237C2 (en) * | 2015-06-23 | 2017-04-24 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Северный государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for production of isolated dermis cells preparations |
-
2008
- 2008-07-08 RU RU2008127284/13A patent/RU2382077C1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| BROAD Т.Е., НАМ R.G., Eur. J. Biochem, 135(1), 33-39, 1983. HUM. ET AL., J. Biomed. Master Res., 47(1), 79-84, 1999. TUAN Т. ET AL., Exp. Cell. Res., 223(1), 127-134, 1996. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2496870C2 (en) * | 2011-02-15 | 2013-10-27 | Государственное научное учреждение Прикаспийский зональный научно-исследовательский ветеринарный институт Российской академии сельскохозяйственных наук | Method to produce epithelioid cells of light foetus of buffalo cow for cultivation of viruses |
| RU2578804C1 (en) * | 2015-04-27 | 2016-03-27 | Екатерина Евгеньевна Фаустова | Method for rejuvenation patient's body |
| RU2617237C2 (en) * | 2015-06-23 | 2017-04-24 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Северный государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for production of isolated dermis cells preparations |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Grinnemo et al. | Human embryonic stem cells are immunogenic in allogeneic and xenogeneic settings | |
| Zhao et al. | Human amniotic epithelial stem cells promote wound healing by facilitating migration and proliferation of keratinocytes via ERK, JNK and AKT signaling pathways | |
| EP2814948B1 (en) | Feeder-free method for culture of bovine and porcine spermatogonial stem cells | |
| JP6921249B2 (en) | Improved umbilical cord-derived adherent stem cells, their production methods and their uses | |
| Chae et al. | Stromal vascular fraction shows robust wound healing through high chemotactic and epithelialization property | |
| US20040120932A1 (en) | In vitro-derived adult pluripotent stem cells and uses therefor | |
| EP3196298B1 (en) | Method for inducing three-dimensional osteogenic differentiation of stem cells using hydrogel | |
| EP3569699A1 (en) | Method for preparing pluripotent stem cells | |
| CN102449141A (en) | Isolation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells | |
| Mehrabani et al. | Growth kinetics, characterization, and plasticity of human menstrual blood stem cells | |
| Vymetalova et al. | Large-scale automated hollow-fiber bioreactor expansion of umbilical cord-derived human mesenchymal stromal cells for neurological disorders | |
| Bochkov et al. | Chromosome variability of human multipotent mesenchymal stromal cells | |
| Liu et al. | Mesenchymal stem cells from skin lesions of psoriasis patients promote proliferation and inhibit apoptosis of HaCaT cells | |
| JP6909154B2 (en) | Stem cell composition and methods of producing stem cells for therapeutic application | |
| Tumangelova-Yuzeir et al. | Mesenchymal stem cells derived and cultured from glioblastoma multiforme increase Tregs, downregulate Th17, and induce the tolerogenic phenotype of monocyte‐derived cells | |
| Sreekumar et al. | G Sharma T (2014) Isolation and Characterization of Buffalo Wharton’s Jelly Derived Mesenchymal Stem Cells | |
| CN108504625A (en) | A kind of l cell and application thereof | |
| RU2382077C1 (en) | Method for recovery and cultivation of autologous dermal fibroblasts for stimulation of regenerative processes and replacement therapy | |
| KR20120140197A (en) | Testicular somatic cell-derived multipotent stem cells, process for the preparation thereof, and pharmaceutical composition for treating erectile dysfunction comprising the same | |
| Wu et al. | hMSCs possess the potential to differentiate into DP cells in vivo and in vitro | |
| Bellu et al. | Isolating stem cells from skin: Designing a novel highly efficient non-enzymatic approach | |
| Mazurkevych et al. | Immunophenotypic characterisation and cytogenetic analysis of mesenchymal stem cells from equine bone marrow and foal umbilical cords during culture | |
| Wang et al. | Human embryonic stem cell-derived melanocytes exhibit limited immunogenicity | |
| Poljanskaya et al. | Creation, working principles, development of applied and fundamental scientific activities of the Collection of Cell Cultures of Vertebrates | |
| KR20180044760A (en) | Methods for improving proliferation of stem cell using chenodeoxycholic acid |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC43 | Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions |
Effective date: 20131025 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200709 |