RU2496110C1 - Method for prediction of smouldering form of chronic lympholeukaemia - Google Patents
Method for prediction of smouldering form of chronic lympholeukaemia Download PDFInfo
- Publication number
- RU2496110C1 RU2496110C1 RU2012128305/15A RU2012128305A RU2496110C1 RU 2496110 C1 RU2496110 C1 RU 2496110C1 RU 2012128305/15 A RU2012128305/15 A RU 2012128305/15A RU 2012128305 A RU2012128305 A RU 2012128305A RU 2496110 C1 RU2496110 C1 RU 2496110C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cll
- smoldering
- patients
- gene
- chronic lymphocytic
- Prior art date
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, может быть использовано для прогнозирования развития «тлеющей» формы хронического лимфолейкоза.The invention relates to medicine, namely to hematology, can be used to predict the development of a "smoldering" form of chronic lymphocytic leukemia.
Хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) - наиболее распространенный вид лейкоза в странах Европы и Северной Америки. В этих странах на его долю приходится 30% от всех лейкозов (Волкова М.А., 1998). Ежегодная заболеваемость составляет 3,0-3,5 на 100 тыс. населения, а для лиц старше 60 лет - до 20 на 100 тыс.населения (Cheson BD et al, 1996, S.C. Finch et al., 1969). Выживаемость больных ХЛЛ варьирует от 2 до 20 лет и более.Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most common type of leukemia in Europe and North America. In these countries, it accounts for 30% of all leukemia (Volkova MA, 1998). The annual incidence is 3.0-3.5 per 100 thousand people, and for people over 60 years old - up to 20 per 100 thousand people (Cheson BD et al, 1996, S.C. Finch et al., 1969). The survival of patients with CLL varies from 2 to 20 years or more.
Индивидуальные различия в патогенезе и течении гемобластозов могут быть установлены через изменчивость генного полиморфизма. Ряд генов вовлечены в патогенез различных онкозаболеваний и выступают в качестве факторов риска при различных заболеваниях, связанных с неблагоприятным действием факторов внешней среды.Individual differences in the pathogenesis and course of hemoblastoses can be established through the variability of gene polymorphism. A number of genes are involved in the pathogenesis of various oncological diseases and act as risk factors for various diseases associated with the adverse effects of environmental factors.
Особое внимание уделяют в последние годы разным формам ХЛЛ. У некоторых больных ХЛЛ может протекать без прогрессии годами и десятилетиями. Такой вариант В-ХЛЛ называется «тлеющим» (по аналогии с «тлеющей» миеломой). Критерии диагностики «тлеющего» хронического лимфолейкоза предложены профессором E.Montserrat в 1993 году: это стадия по Binet - «А», тип инфильтрации в костном мозге - не диффузный, время удвоения лимфоцитов больше 12 месяцев, уровень гемоглобина больше или равен 130 г/л. Если пациент удовлетворяет всем перечисленным признакам, то ожидаемая продолжительность жизни составляет около 20 лет. Также Montserrat E (1993) выделяет эту группу больных ХЛЛ по следующим параметрам: отсутствие увеличенных лимфоузлов и селезенки или минимальное их увеличение, нормальный уровень гемоглобина и тромбоцитов, уровень лейкоцитов меньше 30×109/л, фаза плато лимфоцитоза в течение 3 лет.In recent years, particular attention has been paid to various forms of CLL. In some patients, CLL can progress without progression for years and decades. This variant of B-CLL is called “smoldering” (by analogy with “smoldering” myeloma). Diagnosis criteria for “smoldering” chronic lymphocytic leukemia were proposed by Professor E. Montserrat in 1993: this is the Binet stage “A”, the type of bone marrow infiltration is not diffuse, the lymphocyte doubling time is more than 12 months, the hemoglobin level is greater than or equal to 130 g / l . If the patient satisfies all of the listed symptoms, then the expected life expectancy is about 20 years. Montserrat E (1993) also distinguishes this group of CLL patients by the following parameters: the absence of enlarged lymph nodes and spleen or their minimal increase, normal hemoglobin and platelet count, leukocyte level less than 30 × 10 9 / L, and the phase of the platelet lymphocytosis for 3 years.
Исторически терапия ХЛЛ была основана на применении алкилирующего препарата - хлорбутина или его сочетания с глюкокортикоидными гормонами. Обычно применяют хлорбутин в дозе 0,1-0,2 мг/кг массы тела. Он весьма эффективно понижает лейкоцитоз у 70-75% больных, и с его помощью удается надежно контролировать заболевание в течение многих лет, несмотря на изменение дозы или полную отмену препарата. С появлением новых препаратов и схем лечения ХЛЛ, терапия хлорбутином отошла на задний план. Несмотря на это пациентам, у которых ХЛЛ протекает в «тлеющей» форме, применение хлорбутина вполне оправдано, в связи с тем, что причинами летального исхода таких пациентов являются осложнения от проводимой химиотерапии. Также благодаря непроведению химиотерапии у таких пациентов, возможна экономическая выгода, так как лечение ХЛЛ одно из самых дорогостоящих.Historically, CLL therapy has been based on the use of an alkylating drug - chlorobutin or its combination with glucocorticoid hormones. Chlorobutin is usually used in a dose of 0.1-0.2 mg / kg body weight. It very effectively lowers leukocytosis in 70-75% of patients, and with its help it is possible to reliably control the disease for many years, despite a dose change or complete discontinuation of the drug. With the advent of new drugs and treatment regimens for CLL, chlorbutin therapy has faded into the background. Despite this, in patients with CLL in a “smoldering” form, the use of chlorobutin is quite justified, due to the fact that the causes of death of such patients are complications from chemotherapy. Also, due to the lack of chemotherapy in such patients, economic benefits are possible, since CLL treatment is one of the most expensive.
Существует много предложений по прогнозированию различных форм ХЛЛ на основе данных биохимического, иммунохимического, цитологического и молекулярно-генетического обследования. Так, Т.П. Загоскиной, В.И. Шардаковым, Е.Л. Назаровой, М.М. Куликовой, И.М. Земцовой предложен способ дифференциальной диагностики доброкачественной и прогрессирующей формы хронического лимфолейкоза, включающий определение β2-микроглобулина в сыворотке крови с помощью радиоиммунологического метода с I125 в дебюте заболевания, на ранних стадиях опухолевого процесса, при этом доброкачественную форму ХЛЛ определяют уровнем β2-микроглобулина <5 мг/л; а прогрессирующую >5 мг/л [патент RU 2242004, 2004 г.]. Однако данный метод остается достаточно трудоемким и дорогостоящим. Также его недостатком, на который указывают авторы является прогнозирование формы заболевание лишь в его дебюте.There are many suggestions for predicting various forms of CLL based on biochemical, immunochemical, cytological, and molecular genetic studies. So, T.P. Zagoskina, V.I. Shardakov, E.L. Nazarova, M.M. Kulikova, I.M. Zemtsova proposed a method for differential diagnosis of benign and progressive forms of chronic lymphocytic leukemia, including the determination of β 2 -microglobulin in blood serum using the radioimmunological method with I 125 in the onset of the disease, in the early stages of the tumor process, while the benign form of CLL is determined by the level of β 2 -microglobulin < 5 mg / l; and progressive> 5 mg / l [patent RU 2242004, 2004]. However, this method remains quite time-consuming and expensive. Also, its drawback, which the authors point to, is the prediction of the form of the disease only in its debut.
Известен способ дифференциальной диагностики развернутой и терминальной стадии ХЛЛ, характеризующийся тем, что в крови больного определяют способность эритроцитов сорбировать витальные красители. При значении сорбционной способности эритроцитов менее 44,5% судят о развернутой стадии, при ее значении более 44,5% - о терминальной стадии ХЛЛ [патент RU 2138808, 1998 г.]. Существенным недостатком этого способа является отсутствие ранней диагностики ХЛЛ.There is a method of differential diagnosis of the expanded and terminal stages of CLL, characterized in that the ability of red blood cells to absorb vital dyes is determined in the patient’s blood. When the sorption capacity of red blood cells is less than 44.5%, the developed stage is judged, when its value is more than 44.5%, the terminal stage of CLL is judged [patent RU 2138808, 1998]. A significant disadvantage of this method is the lack of early diagnosis of CLL.
Известен способ диагностики форм ХЛЛ, заключающийся в том, что в лимфоцитах периферической крови больного определяют количество ядрышковых организаторов на клетку путем импрегнации серебром и при значении их 1,0-1,39 диагностируют прогрессирующий вариант ХЛЛ, а при значении - 1,4-1,7 диагностируют опухолевую форму заболевания [патент RU 2068995, 1996 г.]. Способ позволяет упростить диагностику форм ХЛЛ и повысить ее точность. Недостатком данного способа является отсутствие диагностики «тлеющей» формы заболевания.A known method for the diagnosis of CLL forms is that in the patient’s peripheral blood lymphocytes the number of nucleolar organizers per cell is determined by impregnation with silver and, with a value of 1.0-1.39, a progressive version of CLL is diagnosed, and with a value of 1.4-1 , 7 diagnose a tumor form of the disease [patent RU 2068995, 1996]. The method allows to simplify the diagnosis of CLL forms and increase its accuracy. The disadvantage of this method is the lack of diagnosis of "smoldering" forms of the disease.
Известен способ прогнозирования прогрессирования хронического лимфолейкоза, заключающийся в определении количественного содержания ядрышкового белка В23/нуклеофозмина в иммуноблотах лизатов клеток, повышенный уровень которого является наиболее ранним предвестником прогрессирования заболевания [патент RU 2310201, 2007 г.].A known method for predicting the progression of chronic lymphocytic leukemia is to determine the quantitative content of the nucleolar protein B23 / nucleofosmin in the immunoblots of cell lysates, an increased level of which is the earliest harbinger of disease progression [patent RU 2310201, 2007].
Прототипом данного изобретения является метод, описанный O. Moshynska и др. (Molecular detection of the G(-248)A BAX promoter nucleotide change in В cell chronic lymphocytic leukaemia. O. Moshynska, K. Sankaran, A. Saxena, Mol Pathol. 2003 August; 56(4): 205-209.), включающий генотипирование методом ПЦР полиморфизма гена ВАХ с последующими амплификацией и рестрикцией, повышение частоты полиморфизма гена ВАХ у больных ХЛЛ по сравнению с контрольной группой. На основании полученных данных авторы сделали заключение о вовлечении продукта гена ВАХ в патогенез ХЛЛ.The prototype of this invention is the method described by O. Moshynska et al. (Molecular detection of the G (-248) A BAX promoter nucleotide change in B cell chronic lymphocytic leukaemia. O. Moshynska, K. Sankaran, A. Saxena, Mol Pathol. 2003 August; 56 (4): 205-209.), Including PCR genotyping of IVC gene polymorphism followed by amplification and restriction, an increase in the frequency of the IVC gene polymorphism in patients with CLL compared with the control group. Based on the data obtained, the authors concluded that the IVC gene product is involved in the pathogenesis of CLL.
Недостатками данных методов является следующее.The disadvantages of these methods is the following.
1. Отсутствие данных о полиморфизме указанных генов при ХЛЛ в зависимости от форм заболевания.1. The lack of data on the polymorphism of these genes for CLL, depending on the forms of the disease.
2. Малая выборка больных ХЛЛ.2. A small sample of patients with CLL.
Техническим результатом изобретения является повышение точности прогнозирования «тлеющей» формы ХЛЛ на самых ранних стадиях развития заболевания.The technical result of the invention is to increase the accuracy of prediction of the "smoldering" form of CLL at the very early stages of the development of the disease.
Указанный технический результат достигается тем, что в способе прогнозирования течения хронического лимфолейкоза, включающем выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, генотипирование методом ПЦР полиморфизма гена ВАХ с последующими амплификацией и рестрикцией, согласно изобретению проводят генотипирование полиморфного локуса -248G>A гена Bcl-2 ассоциированного X белка (ВАХ -248G>A) и при выявлении у больного генотипа GG прогнозируют высокую вероятность развития «тлеющей» формы хронического лимфолейкоза.The specified technical result is achieved by the fact that in the method for predicting the course of chronic lymphocytic leukemia, including DNA extraction from peripheral venous blood lymphocytes, PCR polymorphism genotyping by the CVC gene followed by amplification and restriction, according to the invention, the polymorphic locus -248G> A of the Bcl-2 gene of the associated X protein (IVC -248G> A) and, when the patient has the GG genotype, a high probability of developing a “smoldering” form of chronic lymphocytic leukemia is predicted.
Предлагаемый способ прогнозирования осуществляется следующим образом.The proposed forecasting method is as follows.
ДНК выделяют из лимфоцитов периферической крови. В качестве консерванта используют раствор следующего состава: 0.48% лимонной кислоты, 1.32% цитрата натрия, 1.47% глюкозы. При заборе крови к 1 мл консерванта добавляют 4 мл крови и хорошо перемешивают.DNA is isolated from peripheral blood lymphocytes. As a preservative, a solution of the following composition is used: 0.48% citric acid, 1.32% sodium citrate, 1.47% glucose. During blood sampling, 4 ml of blood is added to 1 ml of preservative and mixed well.
Для получения ДНК необходимой степени чистоты и достаточного молекулярного веса используется метод выделения ДНК из крови фенольно-хлороформной экстракцией, описанный Мэтью (Mathew C.C. The isolation of high molecular weight eucariotic DNA // Methods in Molecular Biology. / Ed. Walker J.M., N.Y., L.: Human Press.; - 1984. - V.2. - P.31-34).To obtain DNA of the required degree of purity and sufficient molecular weight, the method of DNA isolation from blood by phenol-chloroform extraction, described by Matthew (Mathew CC The isolation of high molecular weight eucariotic DNA // Methods in Molecular Biology. / Ed. Walker JM, NY, L, is used .: Human Press .; - 1984. - V.2. - P.31-34).
1. Кровь в пробирке с консервантом тщательно перемешивается и переливается в центрифужный стакан на 100 мл, туда же добавляли 50 мл охлажденного лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% раствор тритона X-100, 5 мМ MgCl2, 10 мМ трис HCl (pH 7,6).1. Blood in a test tube with a preservative is thoroughly mixed and poured into a 100 ml centrifuge glass, 50 ml of chilled lysis buffer containing 320 mM sucrose, 1% Triton X-100 solution, 5 mM MgCl 2 , 10 mM Tris HCl are added thereto ( pH 7.6).
2. Смесь центрифугируется 20 мин. при 4000 об./мин.2. The mixture is centrifuged for 20 minutes. at 4000 rpm
3. Надосадочную жидкость сливают, к получившемуся осадку приливают 8 мл 25 мМ ЭДТА, pH 8.0, суспендируют.3. The supernatant is drained, 8 ml of 25 mM EDTA, pH 8.0 are poured onto the resulting precipitate, and suspended.
4. К суспензии добавляют 0,8 мл 10% SDS и протеиназу К (концентрация - 10 мг/мл). Смесь для лизиса оставляют на ночь в термостате при температуре 38°C.4. To the suspension add 0.8 ml of 10% SDS and proteinase K (concentration - 10 mg / ml). The lysis mixture is left overnight in an incubator at a temperature of 38 ° C.
Экстракцию ДНК осуществляют в следующем порядке.DNA extraction is carried out in the following order.
1. Для депротеинизации к лизату добавляют 0,5мл 5М перхлората натрия и 8 мл фенола, насыщенного 1 М трис HCl до pH 7.8.1. For deproteinization, 0.5 ml of 5M sodium perchlorate and 8 ml of phenol saturated with 1 M Tris HCl to pH 7.8 are added to the lysate.
2. Смесь центрифугируют при 3000 об./мин. в течение 10 мин.2. The mixture is centrifuged at 3000 rpm. within 10 minutes
3. Отбирают водную фазу, содержащую ДНК, РНК и неденатурированные белки.3. Select the aqueous phase containing DNA, RNA and undenatured proteins.
4. Отобранную фазу обрабатывают смесью фенол-хлороформа (1:1), а затем - хлороформом.4. The selected phase is treated with a mixture of phenol-chloroform (1: 1), and then with chloroform.
5. Препараты осаждают двумя объемами 96% этанола.5. The preparations are precipitated with two volumes of 96% ethanol.
6. Образовавшийся осадок ДНК растворяют в 1,5мл деионизированной H2O; раствор хранят при -20°C.6. The resulting DNA precipitate is dissolved in 1.5 ml of deionized H 2 O; the solution is stored at -20 ° C.
В дальнейшем полученную ДНК используют в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции (ПЦР). Последовательность олигонуклеотидных праймеров для полиморфного локуса -248G>A гена ВАХ F: 5′-CATTAGAGCTGCGATTGGACCG-3′, R: 5′-GCTCCCTCGGGAGGTTTGGT-3′. Состав реакционной смеси для ПЦР был следующим: 0.1-1 мкг геномной ДНК, 0.25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата (Promega, USA) помещали в 25 мкл однократного буфера для ПЦР следующего состава: 67 mM Tris-HCl, pH 8.8, 6.7 mM MgCl2, 16,6 mM (NH4)2SO4, 0.01% Tween-20. Полученную смесь прогревают 2 минуты при 94°C, добавляют 5 единиц термофильной ДНК-полимеразы, 20-30 мкл минерального масла. Режим амплификации: 30 циклов со следующими параметрами: 94°C - 45 секунд, 55°C - 45 секунд, 72°C - 45 секунд. После 30-го цикла проводили инкубацию при 72°C в течение 7 минут.Subsequently, the obtained DNA is used as a template for polymerase chain reaction (PCR). The sequence of oligonucleotide primers for the -248G> A polymorphic locus of the BAX gene F: 5′-CATTAGAGCTGCGATTGGACCG-3 ′, R: 5′-GCTCCCTCGGGAGGTTTGGT-3 ′. The composition of the reaction mixture for PCR was as follows: 0.1-1 μg of genomic DNA, 0.25 μM of each oligoprimer, 250 μM of each deoxynucleoside triphosphate (Promega, USA) were placed in 25 μl of a single PCR buffer of the following composition: 67 mM Tris-HCl, pH 8.8, 6.7 mM MgCl 2 , 16.6 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.01% Tween-20. The resulting mixture is heated for 2 minutes at 94 ° C, add 5 units of thermophilic DNA polymerase, 20-30 μl of mineral oil. Amplification mode: 30 cycles with the following parameters: 94 ° C - 45 seconds, 55 ° C - 45 seconds, 72 ° C - 45 seconds. After the 30th cycle, incubation was performed at 72 ° C for 7 minutes.
Нуклеотидную замену G→A в положении -248 гена ВАХ выявляют при помощи рестрикционного анализа. Для этого 7 мкл амплификата смешивают с 5 ед. эндонуклеазы рестрикции MspI, смесь выдерживают при 37°C в течение 10-12 часов в термостате. Затем проводят электрофорез в вертикальном 7% полиакриламидном геле. В качестве электролита для электрофореза применяют IX боратный буфер (0,089М трис HCl pH=7,8; 0,089 М борная кислота, 0,002 М ЭДТА с pH=8,0).The nucleotide substitution G → A at position -248 of the I – V characteristic is detected by restriction analysis. For this, 7 μl of the amplification is mixed with 5 units. restriction endonucleases MspI, the mixture is kept at 37 ° C for 10-12 hours in a thermostat. Then electrophoresis is carried out in a vertical 7% polyacrylamide gel. As an electrolyte for electrophoresis, IX borate buffer (0.089 M Tris HCl pH = 7.8; 0.089 M boric acid, 0.002 M EDTA with pH = 8.0) is used.
Перед нанесением на вертикальный электрофорез пробы смешивают в соотношении 1:5 с краской, содержащей 0,25% бромфенолового синего, 0,25%) ксиленцианола, 15% фикола. Электрофорез проводят при постоянном напряжении 10 вольт/см после 15-минутного преэлектрофореза. Детекцию результатов проводят путем окрашивания полиакриламидного геля бромистым этидием в течение 10 минут с последующей визуализацией в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе. Генотипы полиморфного локуса -248G>A гена ВАХ типируются по критерию присутствия или отсутствия сайта рестрикции и соответствующего фрагмента на электрофорезе так, что при наличии фрагмента размером 96 пар нуклеотидов (пн) идентифируется аллель G и гомозиготный генотип GG, при наличии двух фрагментов размером 96 и 76 пн идентифицируется гетерозиготный генотип GA, при наличии фрагмента размером 76 пн идентифицируется гомозиготный по редкому аллелю генотип АА. При выявлении у больного генотипа GG прогнозируют высокую вероятность развития «тлеющей» формы хронического лимфолейкоза.Before applying to vertical electrophoresis, the samples are mixed in a 1: 5 ratio with paint containing 0.25% bromophenol blue, 0.25%) xylencyanol, 15% ficol. Electrophoresis is carried out at a constant voltage of 10 volts / cm after a 15-minute pre-electrophoresis. The results are detected by staining the polyacrylamide gel with ethidium bromide for 10 minutes, followed by visualization in ultraviolet light on a transilluminator. The genotypes of the -248G> A polymorphic locus of the I – V characteristic are typed according to the presence or absence of a restriction site and the corresponding fragment on electrophoresis so that in the presence of a fragment of size 96 nucleotide pairs (mon), the G allele and homozygous genotype GG are identified, in the presence of two fragments of size 96 and The heterozygous GA genotype is identified at 76 bp; in the presence of a 76 bp fragment, the AA genotype homozygous for the rare allele is identified. If the patient reveals the GG genotype, a high probability of developing a "smoldering" form of chronic lymphocytic leukemia is predicted.
Обследовано 133 больных ХЛЛ, находившихся на стационарном лечении в гематологическом отделении Республиканской клинической больнице. Средний возраст обследованных пациентов, отобранных случайным образом, составил 49,57±1,42 лет. Половое соотношение мужчин к женщинам - 56,4% (75) к 43,6% (58). Клиническое обследование больных проводилось врачами больницы и включало в себя обязательные и дополнительные методы исследования. В группу с «тлеющим» течением хронического лимфолейкоза включено 30 больных в возрасте от 65 до 85 лет (средний возраст 68,23±0,41). В момент диагностики больные предъявляли жалобы на слабость, потливость, незначительное увеличение лимфатических узлов, без увеличения печени и селезенки. Клинико-гематологическая характеристика представлена в таблицах 1-2.A total of 133 CLL patients who were hospitalized in the hematology department of the Republican Clinical Hospital were examined. The average age of the examined patients, randomly selected, was 49.57 ± 1.42 years. The sex ratio of men to women is 56.4% (75) to 43.6% (58). Clinical examination of patients was carried out by hospital doctors and included mandatory and additional research methods. The group with a “smoldering” course of chronic lymphocytic leukemia included 30 patients aged 65 to 85 years (mean age 68.23 ± 0.41). At the time of diagnosis, patients complained of weakness, sweating, a slight increase in lymph nodes, without an increase in the liver and spleen. Clinical and hematological characteristics are presented in tables 1-2.
Как видно из данных таблиц, в анализах крови больных наблюдается лейкоцитоз (18,7±1,4×10(9)/л), лимфоцитоз (76,5±5,5%), нейтропения (16,7±2,7%). Количество тромбоцитов было в пределах нормы и составило 228,2±1,3×10(9)/л, гемоглобина - 127,0±5,8 г/л.As can be seen from the tables, leukocytosis (18.7 ± 1.4 × 10 (9) / L), lymphocytosis (76.5 ± 5.5%), neutropenia (16.7 ± 2.7 %). The platelet count was within normal limits and amounted to 228.2 ± 1.3 × 10 (9) / l, hemoglobin - 127.0 ± 5.8 g / l.
Больные наблюдались в амбулаторных условиях. Длительность наблюдения с момента установления заболевания более двух лет. В анализах крови наблюдалось увеличение лимфоцитов - 75-80%, клетки Боткина-Гумпрехта 1-2 в поле зрения. Данной группе больных при появлении прогрессии заболевания была назначена терапия хлорбутином в режиме монотерапии, в дозе 0,5мг/кг в 1-й и 15-й день цикла терапии, каждые 28 дней. Медиана продолжительности терапии в данной группе составила 6 месяцев (5-12 мес). Общая частота достижения эффекта от терапии составила - 42%, полная ремиссия - 3%.Patients were observed on an outpatient basis. The duration of observation since the establishment of the disease is more than two years. In blood tests, an increase in lymphocytes was observed - 75-80%, Botkin-Gumprecht cells 1-2 in the field of view. In this group of patients with the onset of disease progression, chlorobutin therapy was prescribed in monotherapy, at a dose of 0.5 mg / kg on the 1st and 15th day of the treatment cycle, every 28 days. The median duration of therapy in this group was 6 months (5-12 months). The total frequency of achieving the effect of therapy was 42%, complete remission was 3%.
С целью выявления клинико-генетических особенностей течения ХЛЛ проведено исследование полиморфного локуса гена ВАХ между группой с «тлеющей» формой и другими формами хронического лимфолейкоза (таблица 3).In order to identify the clinical and genetic features of the course of CLL, a study was made of the polymorphic locus of the IVC gene between the group with a “smoldering” form and other forms of chronic lymphocytic leukemia (table 3).
Сравнение общей выборки больных с «тлеющим» течением ХЛЛ с другой группой выявило статистически достоверные различия в распределении частот генотипов между группами. Гомозиготный генотип -248*GG достоверно чаще встречался в группе больных с «тлеющим» течением ХЛЛ (73,33%), тогда как в другой группе частота его составила 45,74% (χ2=5,878, p=0,016, OR=2,45, 95% CI 1,41-4,26). Наличие гетерозиготного генотипа GA было связано с другими формами течения ХЛЛ, но уровня статистически значимых различий достигнуто не было. Также показано, что аллель G чаще встречался в группе больных с «тлеющим» течением ХЛЛ (85,00%), против 67,55%), а в другой группе 67,70% (χ2=6,000; p=0,015) и являлся фактором говорящем о «тлеющем» течении (OR=2,722; 95% CI 1,258-5,889).Comparison of the total sample of patients with a “smoldering” course of CLL with another group revealed statistically significant differences in the distribution of genotype frequencies between groups. The homozygous genotype -248 * GG was significantly more common in the group of patients with a "smoldering" course of CLL (73.33%), while in the other group its frequency was 45.74% (χ 2 = 5.878, p = 0.016, OR = 2 45, 95% CI 1.41-4.26). The presence of the GA heterozygous genotype was associated with other forms of the course of CLL, but no statistically significant differences were achieved. It was also shown that the G allele was more common in the group of patients with a “smoldering” course of CLL (85.00%), versus 67.55%), and in the other group 67.70% (χ 2 = 6,000; p = 0.015) and was a factor talking about the "smoldering" course (OR = 2.722; 95% CI 1.258-5.889).
На основании полученных результатов можно сделать вывод об ассоциации генотипа GG полиморфного локуса -248G>A гена ВАХ с «тлеющей» формой ХЛЛ.Based on the results obtained, it can be concluded that the GG genotype of the -248G> A polymorphic locus of the IVC gene is associated with a “smoldering” form of CLL.
Изобретение иллюстрируется следующим клиническим примером.The invention is illustrated by the following clinical example.
Больной К., 1967 года рождения, город Салават, Республика Башкортостан. Диагноз ХЛЛ установлен в апреле 2007 года, подтвержден стернальной пункцией, костный мозг богат клеточными элементами, представлен зрелыми лимфоцитами 79%. Химиотерапию не получал. В настоящее время диагноз ХЛЛ, стадия по K. Rai II. При молекулярно-генетическом тестировании у больного было взято 8 мл венозной крови с последующим выделением ДНК и амплификацией полиморфных участков генов и в реакционной смеси, содержащей примерно 0.1 мкг геномной ДНК, 1 ед. Taq-полимеразы, 0.25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25 мкл однократного буфера для ГЩР. После рестрикции амплифицированных ПЦР-продуктов эндонуклеазой провели электрофорез фрагментов при постоянном напряжении 250 вольт после 15-минутного преэлектрофореза. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе. Исследование полиморфного локуса -248G>A гена ВАХ выявило у больного генотип GG, что позволило прогнозировать «тлеющую» форму ХЛЛ, что было подтверждено в результате трехлетнего наблюдения за пациентом, прогрессирование заболевания не наступило.Patient K., born in 1967, the city of Salavat, Republic of Bashkortostan. The diagnosis of CLL was made in April 2007, confirmed by sternal puncture, the bone marrow is rich in cellular elements, represented by mature lymphocytes 79%. I did not receive chemotherapy. Currently diagnosed with CLL, stage by K. Rai II. During molecular genetic testing, 8 ml of venous blood was taken from the patient, followed by DNA extraction and amplification of polymorphic regions of genes and 1 unit in a reaction mixture containing about 0.1 μg of genomic DNA. Taq polymerase, 0.25 μM of each oligoprimer, 250 μM of each deoxynucleoside triphosphate in 25 μl of a single buffer for GPR. After restriction of the amplified PCR products with endonuclease, electrophoresis of the fragments was carried out at a constant voltage of 250 volts after a 15-minute pre-electrophoresis. After electrophoresis, the gel was stained with a solution of ethidium bromide for 10 minutes and analyzed under ultraviolet light on a transilluminator. The study of the -248G> A polymorphic locus of the CVC gene revealed the GG genotype in the patient, which made it possible to predict the “smoldering” form of CLL, which was confirmed by a three-year observation of the patient; disease progression did not occur.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012128305/15A RU2496110C1 (en) | 2012-07-04 | 2012-07-04 | Method for prediction of smouldering form of chronic lympholeukaemia |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012128305/15A RU2496110C1 (en) | 2012-07-04 | 2012-07-04 | Method for prediction of smouldering form of chronic lympholeukaemia |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2496110C1 true RU2496110C1 (en) | 2013-10-20 |
Family
ID=49357271
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012128305/15A RU2496110C1 (en) | 2012-07-04 | 2012-07-04 | Method for prediction of smouldering form of chronic lympholeukaemia |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2496110C1 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2248574C1 (en) * | 2003-07-22 | 2005-03-20 | Государственное учреждение "Уфимский научно-исследовательский институт медицины труда и экологии человека Министерства здравоохранения Российской Федерации" | Method for predicting the development and flow of chronic lympholeukosis |
| RU2400753C1 (en) * | 2009-04-21 | 2010-09-27 | Федеральное государственное учреждение науки "Уфимский научно-исследовательский институт медицины труда и экологии человека" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН УфНИИ МТ ЭЧ Роспотребнадзора) | Method of predicting course of chronic lympholuekemia |
-
2012
- 2012-07-04 RU RU2012128305/15A patent/RU2496110C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2248574C1 (en) * | 2003-07-22 | 2005-03-20 | Государственное учреждение "Уфимский научно-исследовательский институт медицины труда и экологии человека Министерства здравоохранения Российской Федерации" | Method for predicting the development and flow of chronic lympholeukosis |
| RU2400753C1 (en) * | 2009-04-21 | 2010-09-27 | Федеральное государственное учреждение науки "Уфимский научно-исследовательский институт медицины труда и экологии человека" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН УфНИИ МТ ЭЧ Роспотребнадзора) | Method of predicting course of chronic lympholuekemia |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| MOSHYNSKA O. et al. Molecular detection of the G(-248)A ВАХ promoter nucleotide change in В cell chronic lymphocytic leukaemia. Mol Pathol. 2003 Aug; 56(4):205-9. * |
| PODHORECKA M. et al. Assessment of peripheral blood and bone marrow cells apoptosis caused by purine analogues in patients with chronic lymphocytic leukemia in correlation with parameters of disease progression. Acta Haematol. 2010; 123(3): 171-8. Epub 2010 Mar 11. Найдено в БД PubMed, PMID: 20224269. * |
| PODHORECKA M. et al. Assessment of peripheral blood and bone marrow cells apoptosis caused by purine analogues in patients with chronic lymphocytic leukemia in correlation with parameters of disease progression. Acta Haematol. 2010; 123(3): 171-8. Epub 2010 Mar 11. Найдено в БД PubMed, PMID: 20224269. БЯЛИК Т.Е. Биологические маркеры как прогностические факторы при хроническом лимфолейкозе. Автореф. дисс. к.м.н. - М., 2005, 115 с. * |
| БЯЛИК Т.Е. Биологические маркеры как прогностические факторы при хроническом лимфолейкозе. Автореф. дисс. к.м.н. - М., 2005, 115 с. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US12077803B2 (en) | MicroRNAs as biomarkers for endometriosis | |
| JP2022065095A (en) | Diagnosis of sepsis | |
| US20140155280A1 (en) | Method of diagnosing neoplasms | |
| US20140274788A1 (en) | Leukemia stem cell markers | |
| Kopkova et al. | Cerebrospinal fluid microRNAs as diagnostic biomarkers in brain tumors | |
| US20200332361A1 (en) | Method for assisting detection of alzheimer's disease or mild cognitive impairment | |
| Luo et al. | Plasma exosomal miR-450b-5p as a possible biomarker and therapeutic target for transient ischaemic attacks in rats | |
| JP2023109998A (en) | Detection of microsatellite instability | |
| EP4428251A2 (en) | Methods of detecting prostate cancer | |
| EP3372696A1 (en) | Methods and kits for assessing the risk of developing or diagnosing endometrial cancer | |
| Liao et al. | Microbial cell-free DNA in plasma of patients with sepsis: a potential diagnostic methodology | |
| CN108715893B (en) | SNP markers related to radioactive brain injury caused by radiotherapy and application thereof | |
| US20120237931A1 (en) | Identification and monitoring of circulating cancer stem cells | |
| EP4172370A1 (en) | Methods for detecting lung cancer | |
| RU2496110C1 (en) | Method for prediction of smouldering form of chronic lympholeukaemia | |
| RU2490642C1 (en) | Method for prediction of clinical form of chronic lympholeukaemia | |
| US20180328912A1 (en) | Methods of matching a urine sample to a subject and clinical uses thereof | |
| US20210222233A1 (en) | Compositions and methods for diagnosing and treating arrhythmias | |
| RU2282852C1 (en) | Method for predicting the flow of multiple myeloma | |
| RU2490638C1 (en) | Method for prediction of developing b cell and t cell non-hodgkin lymphomas | |
| CA3151627A1 (en) | Use of simultaneous marker detection for assessing difuse glioma and responsiveness to treatment | |
| RU2490641C1 (en) | Method for prediction of clinical course of non-hodgkin lymphomas | |
| US20200172975A1 (en) | Cell-Free microRNA Signatures of Pancreatic Islet Beta Cell Death | |
| CN107974502B (en) | Kit for simultaneously detecting NBPF10, TSFM, PRB2 and DIAPH1 gene mutation | |
| WO2020041561A1 (en) | Assessing microsatellite instability by liquid biopsy |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20140705 |