RU2485972C1 - Способ получения антигена для ретроспективной диагностики хламидиозов животных - Google Patents
Способ получения антигена для ретроспективной диагностики хламидиозов животных Download PDFInfo
- Publication number
- RU2485972C1 RU2485972C1 RU2011146392/10A RU2011146392A RU2485972C1 RU 2485972 C1 RU2485972 C1 RU 2485972C1 RU 2011146392/10 A RU2011146392/10 A RU 2011146392/10A RU 2011146392 A RU2011146392 A RU 2011146392A RU 2485972 C1 RU2485972 C1 RU 2485972C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antigen
- chlamydia
- suspension
- chlamydial
- ether
- Prior art date
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Изобретение относится к ветеринарной микробиологии. Способ включает инфицирование желточных мешков эмбрионов кур, приготовление из них хламидиосодержащей суспензии и добавление к ней смеси детергентов - додецилсульфата натрия и 96,5%-ного этилового спирта до конечной концентрации их, равной соответственно 0,1 и 2%. Затем суспензию выдерживают в течение 96 часов при температуре 37°С с последующей обработкой суспензии эфиром в соотношении 1:5 соответственно при периодическом перемешивании. Дальнейшую выдержку суспензии проводят в течение 24 часов под вытяжной системой при комнатной температуре. Способ позволяет повысить активность и специфичность антигена, а также исключает использование ядовитых веществ. 3 табл.
Description
Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к средствам лабораторной диагностики хламидиозов животных.
Хламидиозы - это группа контагиозных заболеваний животных, птиц и человека, вызываемых антигеннородственными и морфологически идентичными микроорганизмами - хламидиями, поражающими практически все системы и органы. Заболевание характеризуется разнообразными клиническими проявлениями: пневмонии, конъюнктивиты, артриты, менингоэнцефалиты, аборты и многое другое.
В настоящее время в ветеринарии для диагностики хламидиоза животных используют реакцию связывания комплемента (РСК), в которой выявляют наличие специфических хламидийных антител с помощью специфического хламидийного антигена. Для постановки РСК используют антиген хламидий, общий для всего семейства Хламидиалес.
Однако недостатком всех известных способов получения антигена является низкая активность и специфичность, приводящая к малоэффективной диагностике хламидиоза в РСК и невозможности ее использования в более чувствительных тестах, например в иммуноферментном анализе (ИФА), кроме того, использование 2-меркаптанола, относящегося к группе сильнодействующих ядовитых веществ, наносит вред здоровью людей и требует специальных условий производства.
При создании изобретения ставилась задача получения хламидийного антигена с высокой активностью и специфичностью, позволяющей проводить диагностику хламидиоза не только в РСК, но и в ИФА, и кроме того, простого, доступного и экологически чистого, при производстве которого не используется вредных для здоровья человека и окружающей среды веществ.
Поставленная задача решается тем, что в способе получения антигена для диагностики хламидиоза животных, включающей инфицирование желточных мешков эмбрионов кур, приготовление из них хламидиосодержащей суспензии, добавление к ней смеси детергентов - додецисульфата натрия и 96,5%-ного этилового спирта до конечной концентрации их, равной соответственно 0,1 и 2%, с последующей выдержкой в течение 96 часов при температуре 37°С, с последующей обработкой суспензии эфиром в соотношении 1:5, соответственно, при периодическом перемешивании, с дальнейшей выдержкой суспензии в течение 24 часов под вытяжной системой при комнатной температуре.
Предложенный способ позволяет повысить активность и специфичность антигена, за счет того что экстракцию антигена эфиром производят не из цельной микробной клетки, а предварительно обработанной, т.е. разрушенной детергентами, где клеточную структуру разрушает додецилсульфат натрия, а этиловый спирт выступает в качестве фиксатора, т.е. предупреждает разрушение данного антигенного комплекса, что улучшает доступность антигена для экстракции эфиром и приводит к повышению степени чистоты и активности полученного антигена. Кроме того, способ получения антигена не включает использование ядовитых веществ, не требует специальных условий производства, т.е. является простым, доступным и экологически чистым.
Способ получения антигена для ретроспективной диагностики хламидиоза животных состоит из нескольких последовательных этапов: получение биомассы хламидий на развивающихся эмбрионах кур; получение полуфабриката антигена, обработка полуфабриката додецилсульфатом натрия и 96,5%-ным этиловым спиртом и экстракция антигена эфиром.
Получение биомассы хламидий на развивающихся эмбрионах кур
Для получения исходного сырья при производстве антигена используют развивающиеся эмбрионы кур, которые заражают в 6-дневном возрасте в желточный мешок суспензией возбудителя хламидиоза (штамм «Ростиново -70») с инфекционным титром 10-5,5-6,5 ЭЛД50 в 0,3 мл в предварительно разведенной до 10-4. Далее зараженные эмбрионы инкубируют при 37-38°С. Исходным сырьем для изготовления антигена служат желточные мешки куриных эмбрионов, павших на 5-7 день после инфицирования, которые отбирают в стеклянные флаконы. От каждого эмбриона отбирают 1-2 г хорион-аллантоисной и желточной оболочек вместе с сопутствующим желтком. Хламидиосодержащий материал до использования хранят в замороженном состоянии при минус 20-30°С, во время хранения его подвергают термолизису путем трехкратного замораживания и оттаивания для лучшего отделения тканевого содержимого от элементарных телец хламидий.
Приготовление полуфабриката антигена
Для получения полуфабриката антигена из хламидиосодержащего материала готовят 20%-ную исходную суспензию на 0,2 М фосфатно-буферном физиологическом растворе (ФБР) рН 7,2-7,4 с содержанием 0,5% фенола, для инактивации возбудителя, следующим образом: хламидиосодержащие оболочки быстро размораживают, взвешивают и суспендируют до 20%-ной концентрации на коллоидной мельнице, добавив расчетное количество ФБР. Суспензию центрифугируют при 3000 об/мин в течение 60 минут. В процессе центрифугирования суспензия расслаивается на 3 слоя. Верхний слой желток, нижний слой фрагменты тканей желточного мешка и средний слой собственно суспензия, содержащая элементарные тельца хламидий. После центрифугирования отсасывают средний слой центрифугата - взвесь хламидий. Осадок тканей и верхний желточный слой утилизируют. Для приготовления промышленных объемов антигена целесообразно использовать рефрижераторные центрифуги, рассчитанные на большой объем. Из отечественных моделей наиболее удобной является ЦР6-04 производства ОАО «Завод биофизической аппаратуры» (г.Москва) позволяющая центрифугировать одновременно до 11,0 л суспензии.
Для осаждения хламидий очищенную суспензию центрифугируют при 18-20 тыс. оборотов в минуту в течение 60 минут на высокоскоростных центрифугах. Для центрифугирования больших объемов удобно использовать центрифуги с проточным ротором. Из отечественных центрифуг можно использовать ОТР-101К-01. В процессе центрифугирования хламидии собираются на стенках проточного ротора или на дне стаканов в зависимости от типа центрифуги.
Осадок хламидий ресуспендируется в 0,2 М ФБР из расчета получения первоначального объема. Например, если при производстве первоначально было взято 2,0 кг биомассы, то осадок ресуспендируется в 2,0 л ФБР.
Для обработки полуфабриката антигена используют:
- додецилсульфокислоты натриевую соль (додецилсульфат натрия) C12H25O4NaS, ТУ 6-09-64-75 в классификации ч. (чистый);
- спирт этиловый ректификованный (C2H5OH) 96,5%-ной концентрации, ГОСТ Р 51652-2000;
- эфир диэтиловый, ч.д.а., (C4H10O) ТУ 2600-001-43852015-10.
Приготовление реагентов.
В полуфабрикате антигена концентрация додецилсульфата натрия и 96,5%-ного этилового спирта должна составлять 0,1% и 2% соответственно, поэтому сначала готовят исходную смесь этих реагентов. Для этого 1,0 г додецилсульфата растворяют в 80 мл дистиллированной воды (для лучшего растворения можно проводить процесс в водяной бане при температуре 40-50°С) и добавляют 20 мл этанола и получают 100 мл смеси, содержащей 1% и 20% реагентов соответственно. Смесь реагентов готовят непосредственно перед использованием.
Эфир используют в готовом виде.
Смесь реагентов добавляют к полуфабрикату антигена, разбавляя в 10 раз, чтобы получить нужную концентрацию реагента. Например, на 900 мл антигена добавляют 100 мл готовой смеси реагентов. Обработку ведут в стеклянных бутылях с герметичными пробками в термостате при 37°С в течение 96 часов, периодически, 2-3 раза в сутки, перемешивая бутыль.
По истечении этого периода к обработанному полуфабрикату добавляют эфир из расчета 1:5 соответственно. На 1000 мл полуфабриката антигена добавляют 5000 мл эфира, герметично закрывают, тщательно перемешивают и оставляют еще на 24 часа под принудительной вытяжной системой при комнатной температуре, периодически перемешивая.
В процессе обработки эфиром полуфабрикат расслаивается на 3 слоя:
- нижний слой: вода (ФБР), содержащий реагенты додецилсульфат и этанол;
- средний слой: клеточный дебрис и балластные вещества;
- верхний слой: эфир с растворенным в нем специфическим хламидийным антигеном.
Через 24 часа верхний слой (эфир) осторожно отсасывают, добавляют к нему ФБР, по объему равный первоначальному объему полуфабриката антигена (1000 мл), и испаряют эфир под принудительной вытяжной системой. В процессе испарения эфира липополисахаридный комплекс (антиген) постепенно полностью переходит в ФБР, в результате чего раствор приобретает белый цвет. Активность и специфичность антигена проверяют в РСК путем его титрования против контрольной положительной и отрицательной сывороток крови животных. Антиген должен реагировать с контрольной хламидийной сывороткой крови и не реагировать с отрицательной сывороткой крови.
Ниже, в таблице №1, приведены результаты испытаний трех серий антигенов, приготовленных по предлагаемому способу. По мере изготовления серий антигенов они исследовались на специфичность и активность и использовались для ретроспективной диагностики хламидиоза у животных.
Для определения специфичности и активности антигенов использовали заведомо отрицательные и положительные сыворотки крови овец, входящие в состав «Набора антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиозов сельскохозяйственных животных» производства ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (Рег.№ПВР-12.7/02109; Сертификат соответствия №РОСС RU.ФВ01.Н21898; ТУ 9388-020-00492374-2007).
Таблица№1 | ||
Результаты исследования антигена на специфичность и активность | ||
Номер серии антигена | Наименование сывороток | Титр антигена в РСК |
1 | хламидийная | 1:256 |
отрицательная | 0 | |
2 | хламидийная | 1:512 |
отрицательная | 0 | |
3 | хламидийная | 1:512 |
отрицательная | 0 |
Как видно из таблицы, антиген реагировал с положительной хламидийной и не реагировал с отрицательной сыворотками крови овец, что говорит о его специфичности. Также видно, что титр антигена, изготовленного по предлагаемому способу, со специфической хламидийной сывороткой был в пределах 1:256 - 1:512, что говорит о высокой активности антигена, изготовленного по предлагаемому способу.
Были проведены испытания предлагаемого антигена для диагностики хламидиоза у сельскохозяйственных животных. Для этого использовали сыворотки крови крупного рогатого скота из неблагополучного по хламидийной инфекции хозяйства, где диагноз на хламидиоз был подтвержден выделением возбудителя. Также в опыте использовали сыворотки крови овец, вакцинированных против хламидиоза.
В результате проведенных исследований было установлено, что все испытуемые и контрольные сыворотки, а также антиген, не обладали антикомплементарностью.
Отрицательная контрольная сыворотка не реагировала с антигеном. Титр контрольной хламидийной сыворотки с предлагаемым антигенами был 1:40.
Полученные результаты контролей свидетельствовали о специфичности проведенной реакции с использованием предлагаемого антигена.
Результаты исследований сывороток крови КРС и овец обобщены и представлены в таблице №2.
Таблица №2 | ||
Результаты сравнительного исследования в РСК на хламидиоз сывороток крови с двумя специфическими хламидийными антигенами. | ||
Наименование групп сывороток | Номер пробы | Результат исследования (титр) в РСК предлагаемым с антигеном |
Сыворотки крови крупного рогатого скота, принадлежащие ОАО «им. Токарликова» Альметьевского района Республики Татарстан |
1 | 1:20 |
2 | 1:10 | |
3 | 1:5 | |
4 | - | |
5 | - | |
6 | - | |
7 | - | |
8 | 1:10 | |
9 | - | |
10 | - | |
11 | 1:10 | |
12 | - | |
13 | 1:10 | |
14 | 1:10 | |
15 | 1:10 | |
16 | 1:10 | |
17 | - | |
18 | - | |
19 | 1:20 | |
20 | - | |
21 | 1:10 | |
22 | 1:5 | |
23 | 1:20 | |
24 | 1:20 | |
25 | 1:20 | |
26 | 1:5 | |
27 | - | |
28 | 1:20 | |
29 | - | |
30 | 1:10 | |
31 | 1:5 | |
32 | - | |
33 | 1:5 | |
Итого реагировало проб: | 20 | |
Средний титр антител: | 1:11,7 | |
Сыворотки крови овец | 1 вакц. | 1:320 |
2 вакц. | 1:320 | |
3 вакц. | 1:160 | |
4 не вакц. | - | |
Средний титр антител: | 1:266 | |
SS | 1:40 | |
SN | - |
Из таблицы №2 видно, что из 33 сывороток в титре 1:5 и выше с предлагаемым антигеном реагировало 20 (60%) проб. При этом следует отметить, что титры антител были 1:5-1:20, что соответствует диагностическому уровню. Средний титр антител с предлагаемым антигеном составил 1:11,7.
Сыворотки крови иммунизированных против хламидиоза овец реагировали с предлагаемым антигеном в титрах 1:320, 1:320 и 1:160 соответственно. Средний титр антител у вакцинированных против хламидиоза овец с предлагаемым антигеном был 1:266.
Сыворотка крови овцы, не вакцинированной против хламидиоза, в РСК с хламидийными антигенами не реагировала.
Нами была исследована 141 сыворотка крови различных половозрастных групп крупного рогатого скота из 6 неблагополучных по хламидиозу хозяйств РТ и РФ, полученные данные сведены в таблицу 3.
Таблица №3 | ||||
Результаты исследования в РСК на хламидиоз сывороток крови с предлагаемым специфическим хламидийным антигеном | ||||
№ п/п | Наименование хозяйств | Исследовано проб | Положительно реагировало в РСК с антигеном | |
известный | предлагаемым | |||
1 | OOO «Нур-Агро», Ютазинский район РТ | 25 | 5 | 14 |
2 | OOO а/ф «Сирази», Чистопольский район, нетели | 16 | 4 | 7 |
3 | ИП «Сулейманов А.И.» Кукморский район | 7 | 2 | 5 |
4 | OOO «Намус», Кукморский район, вакцинированные | 18 | 10 | 19 |
5 | «Актай», Мамадышский район РТ | 38 | 8 | 19 |
6 | OOO «Сергеевское», Саратовская область, Каменский район | 37 | 9 | 18 |
Итого по хозяйствам | 141 | 38 (27%) | 82 (58%) | |
Средний титр проб (М±м): | 7,3±0,43 | 10,9±0,35 |
Как видно из таблицы, с предлагаемым антигеном реагировало положительно 82 (58%).
Таким образом, полученный антиген специфичен, обладает высокой чувствительностью и активностью в РСК.
Claims (1)
- Способ получения антигена для ретроспективной диагностики хламидиоза животных, включающий инфицирование желточных мешков эмбрионов кур, приготовление из них хламидиосодержащей суспензии, добавление к ней смеси детергентов - додецилсульфата натрия и 96,5%-ого этилового спирта до их конечной концентрации, равной соответственно 0,1 и 2%, с последующей выдержкой в течение 96 ч при температуре 37°С, с последующей обработкой суспензии эфиром в соотношении 1:5 соответственно при периодическом перемешивании, с дальнейшей выдержкой суспензии в течение 24 ч под вытяжной системой при комнатной температуре.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2011146392/10A RU2485972C1 (ru) | 2011-11-15 | 2011-11-15 | Способ получения антигена для ретроспективной диагностики хламидиозов животных |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2011146392/10A RU2485972C1 (ru) | 2011-11-15 | 2011-11-15 | Способ получения антигена для ретроспективной диагностики хламидиозов животных |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2011146392A RU2011146392A (ru) | 2013-05-20 |
RU2485972C1 true RU2485972C1 (ru) | 2013-06-27 |
Family
ID=48702095
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2011146392/10A RU2485972C1 (ru) | 2011-11-15 | 2011-11-15 | Способ получения антигена для ретроспективной диагностики хламидиозов животных |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2485972C1 (ru) |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA1186223A (en) * | 1981-03-03 | 1985-04-30 | Harlan D. Caldwell | Isolation of principal outer membrane protein and antigen of chlamydia trachomatis |
RU2042360C1 (ru) * | 1992-07-06 | 1995-08-27 | Биотехнологическая компания "Биосервис" | Набор для выявления хламидийной инфекции |
RU2242932C2 (ru) * | 2003-02-05 | 2004-12-27 | Ростовский научно-исследовательский онкологический институт | Способ лечения рака прямой кишки |
-
2011
- 2011-11-15 RU RU2011146392/10A patent/RU2485972C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA1186223A (en) * | 1981-03-03 | 1985-04-30 | Harlan D. Caldwell | Isolation of principal outer membrane protein and antigen of chlamydia trachomatis |
RU2042360C1 (ru) * | 1992-07-06 | 1995-08-27 | Биотехнологическая компания "Биосервис" | Набор для выявления хламидийной инфекции |
RU2242932C2 (ru) * | 2003-02-05 | 2004-12-27 | Ростовский научно-исследовательский онкологический институт | Способ лечения рака прямой кишки |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2011146392A (ru) | 2013-05-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Munhoz et al. | Avian IgY antibodies: characteristics and applications in immunodiagnostic | |
Cakir-Koc | Production of anti-SAG1 IgY antibody against Toxoplasma gondii parasites and evaluation of antibody activity by ELISA method | |
Esmailnejad et al. | Production, purification, and evaluation of quail immunoglobulin Y against Salmonella typhimurium and Salmonella enteritidis | |
He et al. | Chronobiological studies of chicken IgY: monitoring of infradian, circadian and ultradian rhythms of IgY in blood and yolk of chickens | |
RU2485972C1 (ru) | Способ получения антигена для ретроспективной диагностики хламидиозов животных | |
US20210025888A1 (en) | Crude native hapten-based indirect elisa assay kit and lyophilised controls for the confirmatory diagnosis of bovine brucellosis in blood serum and milk by animal and tank | |
CN110564699A (zh) | 一种新型番鸭腺病毒株、灭活疫苗及其制备方法 | |
Bentes et al. | Production and evaluation of chicken egg yolk immunoglobulin (IgY) against human and simian rotaviruses | |
CN110007077B (zh) | 一种猪流行性腹泻病毒琼扩抗原及其用于抗体检测的检测方法 | |
RU2640192C1 (ru) | Тест-система ИФА для серологической диагностики нодулярного дерматита крупного рогатого скота - Dermatitis nodularis bovum | |
RU2625031C1 (ru) | Иммуноферментная тест-система для серологической диагностики анаэробной энтеротоксемии животных и контроля напряженности поствакцинального иммунитета | |
RU2452512C2 (ru) | Вакцина ассоциированная против парвовирусной, реовирусной, герпесвирусной типа i инфекций и вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота инактивированная эмульсионная | |
RO129645B1 (ro) | PROCEDEU DE OBŢINERE A IMUNOGLO- BULINELOR IgY | |
CN110302376A (zh) | 一种禽流感疫苗佐剂及应用 | |
RU2301682C1 (ru) | Вакцина для специфической профилактики хламидиоза крупного и мелкого рогатого скота | |
RU2802251C1 (ru) | Вакцинная композиция для профилактики энзоотического аборта у овец | |
RU2167673C1 (ru) | Набор для определения антител к вирусу синдрома снижения яйценоскости-76 кур | |
Vaillant et al. | Immunogenicity studies of various experimental vaccines in chickens | |
RU2457859C1 (ru) | Вакцина против вирусной диареи крупного рогатого скота | |
RU2488117C2 (ru) | Иммуноферментная тест-система для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета | |
CN108607095B (zh) | 一种鹅细小病毒株及其应用 | |
Abo-Ghanema et al. | Production of Chicken Hyperimmune Hens' Egg for Immunological Purposes in Animals. | |
RU2798283C1 (ru) | Штамм Chlamydia abortus "Chlamydia VNITIBP-21" для производства иммунобиологических лекарственных препаратов | |
Ichshanova et al. | 602.68: 57.083 CSCITI 62.41. 3 OBTAINING OF THE POSITIVE SERUM TO AGENT CAUSING ENZOOTIC ABORTION OF EWES | |
CN110791479B (zh) | DEV gB蛋白单抗以及检测DEV抗体的阻断ELISA试剂盒 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20131116 |