RU2477635C1

RU2477635C1 - Способ получения инцистерола

Info

Publication number: RU2477635C1
Application number: RU2012104911/15A
Authority: RU
Inventors: Глеб Иванович Кирьянов; Валерий Павлович Герасименя; Сергей Викторович Захаров; Вадим Неронович Ташлицкий; Лия Нодарьевна Кинцурашвили; Владимир Юрьевич Поляков
Original assignee: Глеб Иванович Кирьянов
Priority date: 2012-02-14
Filing date: 2012-02-14
Publication date: 2013-03-20

Abstract

Изобретение относится к области органической химии, а именно к области получения производных стерола, и может быть использовано при получении 4-hydroxy-17R-methylincisterol из эргостерола с использованием фотоизомеризации. При реализации способа растворяют навеску эргостерола в слабополярном растворителе при освещении раствора оптическим излучением в диапазоне ближнего УФ. Полученный раствор разделяют хроматографически. Собирают фракцию, обладающую цитотоксичностью для раковых клеток линии HeLa и клеток миелоидного лейкоза человека. Доводят величину pH до нейтрального значения и упаривают до появления опалесценции раствора. Добавляют слабополярный растворитель, экстрагируют и органический слой отделяют на делительной воронке. Органический слой упаривают и растворяют, полученный раствор разделяют с использованием аналитической ВЭЖХ с последующей очисткой и выделением инцистерола. Изобретение обеспечивает возможность получения препарата 4-hydroxy-17R-methylincisterol способом химического синтеза. 9 з.п. ф-лы.

Description

Изобретение относится к области органической химии, а именно - к области получения производных стерола, и может быть использовано при получении 4-hydroxy-17R-methylincisterol из эргостерола с использованием фотоизомеризации.

Известен (RU, патент 2435599) способ приготовления препарата, влияющего на тканевой обмен, включающий глубинное культивирование гриба Pleurotus 1137 (ВКПМ, F-819) с последующим отделением мицелия от культуральной жидкости и выделением из мицелия экстракцией этанолом при кислом значении pH среды низкомолекулярных от 100 до 500 дальтон биологически активных веществ с последующим выделением из них дихлорметаном производной стерола 4-hydroxy-17R-methylincisterol с установленным молекулярным весом 332,2452 и брутто-формулой C₂₁H₃₂O₃.

Недостатком известного способа следует признать сложность выделения целевого продукта из культуральной жидкости культивирования гриба Pleurotus 1137 (ВКПМ, F-819).

В ходе проведения патентно-информационного поиска не выделен источник информации, который мог бы быть использован в качестве ближайшего аналога.

Техническая задача, решаемая в ходе настоящей работы, состоит в разработке способа синтеза препарата инцистерола (4-hydroxy-17R-methylincisterol).

Технический результат, получаемый при реализации разработанного способа, состоит в обеспечении возможности получения препарата 4-hydroxy-17R-methylincisterol способом химического синтеза.

Для достижения указанного технического результата предложено использовать разработанный способ химического синтеза препарата 4-hydroxy-17R-methylincisterol. Согласно разработанному способу растворяют навеску эргостерола в слабополярном растворителе при освещении раствора оптическим излучением в диапазоне ближнего УФ, полученный раствор разделяют хроматографически, собирают фракцию, обладающую цитотоксичностью для раковых клеток линии HeLa и клеток миелоидного лейкоза человека, доводят величину pH до нейтрального значения и упаривают до появления опалесценции раствора, к оставшемуся раствору добавляют слабополярный растворитель, экстрагируют и органический слой отделяют на делительной воронке, органический слой упаривают и растворяют, полученный раствор разделяют с использованием аналитической ВЭЖХ с последующей очисткой и выделением инцистерола (4-hydroxy-17R-methylincisterol).

Предпочтительно раствор освещают оптическим излучением с длиной волны 210-350 нм при мощности оптического излучения 250 Ватт.

В большинстве вариантов реализации способа в качестве растворителя эргостерола используют хлористый метилен, хлороформ, метанол, этанол. Однако приведенный перечень не исчерпывает возможные варианты выбора растворителя.

Предпочтительно навеску эргостерола растворяют в слабополярном растворителе и облучают ближним УФ с длиной волны при постоянном перемешивании на магнитной мешалке или при пробулькивании воздухом при температуре 6-8°C в течение 5-10 часов с последующим упариванием раствора на роторном испарителе без подогрева и растворением полученного остатка в 96% этаноле.

В некоторых вариантах реализации хроматографическое разделение облученного раствора эргостерола проводят на полупрепаративной ВЭЖХ-системе Gilson, состоящей из 2-х насосов с головками 25SC, манометрического модуля, смесителя, инжектора с петлей 500 мкл, колоночного термостата и делителя потока (1:10), УФ-детектора с переменной длиной волны и управляющей программы.

Обычно для продолжения синтеза отбирают фракцию, обладающую цитотоксичностью для раковых клеток линии HeLa и клеток миелоидного лейкоза человека, выражающуюся в индукции апоптоза в концентрациях 1-100 мкг/мл среды инкубации.

В некоторых вариантах реализации упаривание отобранной фракции с нейтральным pH проводят на роторном испарителе при температуре 45-55°C на 2/3 по объему.

В большинстве вариантов реализации разработанного способа органический слой после делительной воронки упаривают на роторном испарителе без нагревания и остаток растворяют в 96% этанола.

Предпочтительно полученный раствор инцистерола разделяют с использованием аналитической ВЭЖХ на системе Agalint 1100, состоящей из четырехканального насоса с дегазатором, колоночного термостата, автосамплера, диодно-матричного УФ-детектора и управляющей программы ChemStstion.

В большинстве вариантов реализации на стадии выделения и очистки фракцию, содержащую инцистерол, собирают и упаривают на роторном испарителе при температуре 45-55°C на 2/3 по объему до появления опалесценции раствора, к оставшемуся раствору добавляют объем хлористого метилена, экстрагируют и органический слой отделяют на делительной воронке, органический слой упаривают на роторном испарителе без нагревания с последующим растворяют в хлористом метилене и сушке в эксикаторе.

На практике способ реализуют следующим образом.

1 г эргостерола растворяют в 100 мл хлористого метилена (или хлороформа, или этанола) и облучают УФ-светом с длиной волны 210-350 нм при постоянном перемешивании на магнитной мешалке, или при пробулькивании воздухом при температуре 6-8°C в течение 5-10 часов. Затем раствор упаривают на роторном испарителе без подогрева. Остаток растворяют в 96% этаноле в концентрации 100 мг/мл.

Полученный раствор (аликвоты по 400 мкл) разделяют хроматографически на полупрепаративной ВЭЖХ-системе Gilson, состоящей из 2-х насосов с головками 25SC, манометрического модуля, смесителя, инжектора с петлей 500 мкл, колоночного термостата и делительного потока (1:10), УФ-детектора с переменной длиной волны и управляющей программы. Используется полупрепаративная колонка 24×250 мм с сорбентом Диасорб С16Т (10 мкм). Состав подвижной фазы: 96% этанол: 0.1% ТФУ в воде / 60:40, при скорости потока 10 мл/мин и температуре 30°C. Возможно использование аналогичной хроматографической системы и аналогичной обращенно-фазной колонки. Время анализа - 40 мин, детектирование при длине волны 230 нм, интересующий пик имеет время удерживания 20-25 мин.

Фракцию, содержащую интересующий пик, собирают, добавляют 305 раствор аммиака до нейтрального значения pH 6-8 и упаривают на роторном испарителе при температуре 45-55°C на 2/3 по объему до появления опалесценции раствора. К оставшемуся раствору добавляют равный объем хлористого метилена, экстрагируют и органический слой отделяют на делительной воронке. Органический слой упаривают на роторном испарителе без нагревания и растворяют в 1 мл 96% этанола. Полученный раствор (аликвоты по 100 мкл) разделяют с помощью аналитической ВЭЖХ на системе Agalint 1100, состоящей из четырехканального насоса с дегазатором, колоночного термостата, автосамплера, диодно-матричного УФ-детектора и управляющей программы ChemStstion. Была использована аналитическая колонка 4.6×250 мм с сорбентом Luna C18(2) (5 мкм). Возможно использование аналогичной хроматографической системы и аналогичной обращенно-фазной колонки.

Состав подвижной фазы: ацетонирил: вода / 79:21, при скорости потока 1 мл/мин и температуре 25°C. Время анализа - 21 мин, детектирование при длине волны 230 нм, интересующий пик имеет время удержания 15-18 мин. Фракцию, содержащую интересующий пик, собирают и упаривают на роторном испарителе при температуре 45-55°C на 2/3 по объему до появления опалесценции раствора. К оставшемуся раствору добавляют равный объем хлористого метилена. Экстрагируют и органический слой отделяют на делительной воронке. Органический слой упаривают на роторном испарителе без нагревания. Растворяют в 1 мл хлористого метилена и сушат в эксикаторе. Выход составляет 1-2 мг инцистерола.

Claims

1. Способ получения инцистерола, характеризуемый тем, что растворяют навеску эргостерола в слабополярном растворителе при освещении раствора оптическим излучением в диапазоне ближнего УФ, полученный раствор разделяют хроматографически, собирают фракцию, обладающую цитотоксичностью для раковых клеток линии HeLa и клеток миелоидного лейкоза человека, доводят величину pH до нейтрального значения и упаривают до появления опалесценции раствора, к оставшемуся раствору добавляют слабополярный растворитель, экстрагируют и органический слой отделяют на делительной воронке, органический слой упаривают и растворяют, полученный раствор разделяют с использованием аналитической ВЭЖХ с последующей очисткой и выделением инцистерола.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что раствор освещают оптическим излучением с длиной волны 210-350 нм.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве растворителя используют хлористый метилен, хлороформ, метанол, этанол.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что навеску эргостерола растворяют в слабополярном растворителе и облучают ближним УФ с длиной волны при постоянном перемешивании на магнитной мешалке или при пробулькивании воздухом при температуре 6-8°C в течение 5-10 ч с последующим упариванием раствора на роторном испарителе без подогрева и растворением полученного остатка в 96% этаноле.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что хроматографическое разделение раствора эргостерола проводят на полупрепаративной ВЭЖХ-системе Gilson, состоящей из 2-х насосов с головками 25SC, манометрического модуля, смесителя, инжектора с петлей 500 мкл, колоночного термостата и делительного потока (1:10), УФ-детектора с переменной длиной волны и управляющей программы.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что отбирают фракцию, обладающую цитотоксичностью для раковых клеток линии HeLa и клеток миелоидного лейкоза человека, выражающейся в индукции апоптоза в концентрациях 1-100 мкг/мл среды инкубации.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что упаривание фракции с нейтральным pH проводят на роторном испарителе при температуре 45-55°C на 2/3 по объему.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что органический слой упаривают на роторном испарителе без нагревания и остаток растворяют в 96% растворе этанола.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что полученный раствор инцистерола разделяют с использованием аналитической ВЭЖХ на системе Agalint 1100, состоящей из четырехканального насоса с дегазатором, колоночного термостата, автосамплера, диодно-матричного УФ-детектора и управляющей программы ChemStstion.

10. Способ по п.1, отличающийся тем, что на стадии выделения и очистки фракцию, содержащую инцистерол, собирают и упаривают на роторном испарителе при температуре 45-55°C на 2/3 по объему до появления опалесценции раствора, к оставшемуся раствору добавляют объем хлористого метилена, экстрагируют и органический слой отделяют на делительной воронке, органический слой упаривают на роторном испарителе без нагревания с последующим растворением в хлористом метилене и сушкой в эксикаторе.