RU2471185C1

RU2471185C1 - Method for preparing test object of chicken embyo's corneal cells for assessing drug cytotoxicity

Info

Publication number: RU2471185C1
Application number: RU2011138429/15A
Authority: RU
Inventors: Юрий Геннадьевич Суховей; Сергей Анатольевич Петров; Елена Геннадьевна Костоломова; Теа Нодаровна Тезелашвили; Анна Алексеевна Шуман; Гузель Минханивовна Гизатулина; Владимир Анатольевич Васильев
Original assignee: Учреждение Российской академии наук Тюменский научный центр Сибирского отделения РАН (ТюмНЦ СО РАН); Сергей Анатольевич Петров; Юрий Геннадьевич Суховей
Priority date: 2011-09-19
Filing date: 2011-09-19
Publication date: 2012-12-27

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention describes a method for preparing a test object for assessing drug cytotoxicity involving the use of chicken embryo's cornea and cell technology with cornea taken from 7-14 days chicken embryos to be thereafter ground and frozen in liquid nitrogen vapours at -180°C; when assessing drug cytotoxicity, the frozen material is slowly unfrozen, transferred into a centrifuge tube and washed in 0.9% NaCl for three times; the cell elements are thereafter ground to prepare a homogenous cell suspension; stroma is deposited in a centrifuge; a supernatant containing the corneal cells is transferred in a sterile test tube, and the cells are deposited again; the supernatant is removed; the deposition containing the corneal cells is added with 0.9% NaCl 1 ml and resuspended; the prepared suspension is analysed for cytosis; the cell viability is determined by staining in DNA fluorochromes in a flow cytofluorometer; then 0.9% NaCl is used to reduce the corneal cell suspension to the concentration of 5.0*10⁵ cells in 1 ml and transferred in culture bottles and added with the analysed preparations; for control, one of the bottles is added with 0.9% NaCl; it is followed by incubation in the culture flasks in a CO₂ incubator for one day; further the cell suspensions are transferred into the centrifuge tubes, centrifuged for cell deposition, and the suspension 1 ml is sampled of each sample for cytotoxicity analyses by cell staining in DNA fluorochromes; cytotoxicity of the analysed substances is assessed in the flow cytofluorometer.

EFFECT: invention is characterised by high sensitivity and specificity of the cytotoxicity analysis; objective result interpretation enables using the declared method of a wide range of the preparations.

3 tbl, 1 dwg

Description

Изобретение относится к медицине, точнее к клеточным технологиям оценки цитотоксичности, и может быть использовано для оценки качества лекарственных средств для местного лечения с целью исключения возможности использования цитотоксичных и фальсифицированных материалов, а также предупреждения вредных последствий их воздействия на организм.The invention relates to medicine, more specifically to cellular technologies for assessing cytotoxicity, and can be used to assess the quality of drugs for local treatment in order to exclude the possibility of using cytotoxic and falsified materials, as well as to prevent the harmful effects of their effects on the body.

Важнейшие требования при разработке и создании новых лекарственных препаратов - анализ и изучение их токсичности. Это - первый и необходимый этап доклинических исследований и скрининга синтезированных соединений. Исследование токсичности проводят как на подопытных животных, так и с использованием первично трипсинизированных или перевиваемых культур клеток и тканей человека, животных и микроорганизмов.The most important requirements for the development and creation of new drugs are the analysis and study of their toxicity. This is the first and necessary stage of preclinical studies and screening of synthesized compounds. The study of toxicity is carried out both in experimental animals, and using primarily trypsinized or transplanted cultures of cells and tissues of humans, animals and microorganisms.

Требование этичности эксперимента стало обязательным условием проведения опытов на животных. Проблеме замены животных на альтернативные модели уделяется очень большое внимание. Проводится активная научно-исследовательская работа по созданию альтернативных методов, повышающих точность, экономичность, уменьшению времени продолжительности опытов.The requirement of the ethics of the experiment became a prerequisite for conducting experiments on animals. The problem of replacing animals with alternative models is receiving a lot of attention. Active research work is underway to create alternative methods that increase accuracy, efficiency, and reduce the duration of experiments.

Известен способ оценки токсичности средств, проводимый на лабораторных животных. Испытуемый препарат вводят в конъюнктивальную полость бодрствующего поросенка. Повреждение тканей оценивают по изменению температуры глаза. Температуру измеряют с помощью тепловизора. Измерение температуры начинают до введения лекарств. Лекарство вводят однократно в конъюнктивальную полость в минимальной дозе, после чего освобождают веки, которые затем повторно разводят через каждую минуту для повторного измерения температуры, а при развитии гиперемии промывают конъюнктивальную полость теплым изотоническим раствором NaCl 0,9%, закапывают в нее каплю раствора 1% лидокаина гидрохлорида и выдают заключение о токсичности лекарства и о возможности повреждения эпителия конъюнктивы (RU 2396562 С1).A known method for assessing the toxicity of drugs, carried out in laboratory animals. The test drug is injected into the conjunctival cavity of an awake pig. Tissue damage is assessed by changes in eye temperature. The temperature is measured using a thermal imager. Temperature measurement begins before the introduction of drugs. The medicine is injected once into the conjunctival cavity in the minimum dose, after which the eyelids are released, which are then re-diluted every minute to re-measure the temperature, and when hyperemia develops, the conjunctival cavity is washed with 0.9% warm isotonic NaCl solution, a drop of 1% solution is instilled into it. lidocaine hydrochloride and give a conclusion on the toxicity of the drug and on the possibility of damage to the conjunctival epithelium (RU 2396562 C1).

Недостатком этого метода является, во-первых, его неэтичность, т.к. испытания проводят на подопытных животных. Кроме того, разность пола, линий, возраста, массы используемых животных может приводить к ошибочным результатам.The disadvantage of this method is, firstly, its unethical, because tests are carried out on experimental animals. In addition, the difference in gender, lines, age, and weight of animals used can lead to erroneous results.

Известен также способ оценки раздражающего действия и активности природных, синтетических субстанций и готовых препаратов на куриных эмбрионах методом ультразвуковой доплерографии (ХЕТ-КАМ тест). Недостаток этого способа заключается в том, что оценивается только раздражающее действие препарата по сужению сосудов без остановки или с временной остановкой крови в отдельных капиллярах, замедление и/или остановка кровотока, гиперемия, тромбоз сосудов, появление кровоизлияний и их распространенность, коагуляция белков хориоаллантоисной оболочки (нарушение прозрачности). Определяется местнораздражающая токсичность препарата на сосуды эмбриона без оценки цитотоксичности препарата (RU 2383888 С1).There is also a method of evaluating the irritating effect and activity of natural, synthetic substances and finished preparations on chicken embryos using ultrasound dopplerography (HET-KAM test). The disadvantage of this method is that it evaluates only the irritating effect of the drug on vasoconstriction without stopping or temporarily stopping blood in individual capillaries, slowing down and / or stopping blood flow, hyperemia, vascular thrombosis, the appearance of hemorrhages and their prevalence, coagulation of the proteins of the chorioallantoic membrane ( violation of transparency). Determines the locally irritating toxicity of the drug to the vessels of the embryo without assessing the cytotoxicity of the drug (RU 2383888 C1).

Наиболее близким к заявляемому является метод определения цитотоксичности различных лекарственных средств в органной культуре роговицы (Мальханов В.Б., Азнабаев М.Т. Органные культуры. - Уфа: Полиграфкомбинат, 1998. - 192 с.: с ил.). Суть способа заключается в том, что при внесении испытуемых препаратов в органную культуру роговицы в случае содержания в препарате токсичных примесей происходит изменение способности клеток к размножению и дегенерация. Недостатком этого способа является односторонность оценки воздействия препарата на чувствительную культуру только по эффекту дегенерации, что не обеспечивает учета полноты реакции клеток на препарат. Метод не стандартизован также по используемым для целей контроля органным культурам. Недостатками указанного метода являются также не только отсутствие контроля за процессом деления клеток in vitro и появлением любых антигенов, несущих признаки генетически чужеродной информации вследствие естественных мутаций и появления атипичных недифференцированных клеток, но и трудоемкость получения, наличие культуральной среды (наличие токсических веществ в среде, высокий риск микробного заражения и сдвиг рН, предусматривающий проверку на цитотоксичность и периодическую смену среды).Closest to the claimed is a method for determining the cytotoxicity of various drugs in the organ culture of the cornea (Malkhanov VB, Aznabaev MT Organ cultures. - Ufa: Polygraph factory, 1998. - 192 pp., Ill.). The essence of the method lies in the fact that when the test preparations are introduced into the organ culture of the cornea, if toxic impurities are contained in the preparation, the ability of the cells to reproduce and degenerate changes. The disadvantage of this method is the one-sided assessment of the effect of the drug on a sensitive culture only by the effect of degeneration, which does not allow taking into account the completeness of cell response to the drug. The method is not standardized also for organ cultures used for control purposes. The disadvantages of this method are not only the lack of control over the process of cell division in vitro and the appearance of any antigens bearing signs of genetically foreign information due to natural mutations and the appearance of atypical undifferentiated cells, but also the complexity of obtaining, the presence of a culture medium (the presence of toxic substances in the medium, high risk of microbial infection and pH shift, which includes testing for cytotoxicity and periodic change of medium).

Задача, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, состоит в создании нового высокоэффективного тест-объекта для оценки цитотоксичности лекарственных препаратов, повышающего точность и объективность результатов исследования, универсальность применения для широкого круга препаратов, стандартность проводимой оценки.The problem to which the invention is directed, is to create a new highly effective test object for assessing the cytotoxicity of drugs, increasing the accuracy and objectivity of the results of the study, the universality of use for a wide range of drugs, the standard of the assessment.

Указанный результат достигается тем, что в качестве тест-объекта предлагаются эмбриональные клетки роговицы цыплят 7-14 дней гестации, обладающие стабильностью культуральных и морфологических свойств. А предлагаемый способ получения тест-объекта для определения цитотоксичности лекарственных препаратов включает в себя использование современных методов клеточной технологии и приборов, таких как проточный цитофлюориметр и программы Cell Quest Pro и др., которые дают возможность определения пролиферативных характеристик культуры и позволяют оценить степень задержки и/или повреждения общефизиологических процессов в клетках роговицы. Морфологические исследования способствуют оценке направленности цитотоксичности исследуемого объекта при определении изменений морфологии клеток, митотической активности, в частности состояние клеточного цикла.This result is achieved by the fact that, as a test object, embryonic cells of the cornea of chickens of 7-14 days of gestation with stable cultural and morphological properties are proposed. And the proposed method of obtaining a test object for determining the cytotoxicity of drugs includes the use of modern methods of cell technology and devices, such as a flow cytometer and Cell Quest Pro and others, which make it possible to determine the proliferative characteristics of the culture and allow to evaluate the degree of delay and / or damage to general physiological processes in the cells of the cornea. Morphological studies contribute to assessing the orientation of the cytotoxicity of the studied object when determining changes in cell morphology, mitotic activity, in particular the state of the cell cycle.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Получают культуру клеток роговицы из эмбрионов цыплят на 7-14 день гестации. Эмбрионы цыплят тщательно обрабатывают антисептическим раствором и отмывают дистиллированной водой. Забирают для исследования роговицу глаза, которую затем измельчают. Проверенный на стерильность материал помещают в криопробирки емкостью 2 мл (Costar) с раствором для замораживания (Эмбриональная телячья сыворотка 90% + Диметилсульфоксида 10% + криопротектор (90% Fetal Bovine Serum + 10% DMSO)). Замораживание проводят в парах жидкого азота до -180°С со скоростью заморозки 1°С в минуту с использованием программного биологического замораживателя Кrуо 560-16 (Planer, Великобритания). Затем криопробирки с материалом помещают в жидкий азот (t=-180°С) в сосуды Дюара (СДС-35М ОАО «НПО ГЕЛИЙМАШ», г.Москва).The proposed method is as follows. A corneal cell culture is obtained from chick embryos on days 7-14 of gestation. Chicken embryos are thoroughly treated with an antiseptic solution and washed with distilled water. The cornea of the eye is taken for examination, which is then crushed. The sterility-tested material is placed in a 2 ml cryovial (Costar) with a solution for freezing (Fetal calf serum 90% + Dimethyl sulfoxide 10% + cryoprotectant (90% Fetal Bovine Serum + 10% DMSO)). Freezing is carried out in liquid nitrogen vapors up to -180 ° C with a freezing rate of 1 ° C per minute using the Kruo 560-16 biological program freezer (Planer, UK). Then cryovials with the material are placed in liquid nitrogen (t = -180 ° C) in Dewar vessels (SDS-35M OJSC NPO GELIYMASH, Moscow).

Через 24 часа хранения при температуре -180°С замороженный материал для сохранения высокой жизнеспособности клеток подвергают медленному размораживанию в парах жидкого азота со скоростью +1°С в минуту с использованием программного биологического замораживателя Кrуо 560-16 (Planer, Великобритания). Размороженный материал переносят в стерильную стеклянную центрифужную пробирку и трехкратно отмывают в растворе NaCl 0,9%. Затем измельчают клеточные элементы в Medimashine (Becton Dichinson, Cod 79300, maximal volume 1 ml, нож BD medicors) до получения гомогенной клеточной суспензии. Осаждают строму в центрифуге при 1500 об/мин в течение 10 минут. Надосадок, содержащий клетки роговицы, переносят в стерильную пробирку и вновь осаждают клетки. Супернатант удаляют, а к осадку, содержащему роговичные клетки, добавляют 1 мл раствора NaCl 0,9% и ресуспендируют. В полученной суспензии определяют жизнеспособность клеток и считают цитоз. Далее раствором NaCl 0,9% суспензию клеток роговицы доводят до концентрации 5,0·10⁵ клеток в 1 мл и переносят в культуральные флаконы.After 24 hours of storage at a temperature of -180 ° C, the frozen material is slowly thawed in liquid nitrogen vapor at a rate of + 1 ° C per minute to maintain high cell viability using Kruo 560-16 biological program freezer (Planer, UK). Thawed material is transferred to a sterile glass centrifuge tube and washed three times with 0.9% NaCl solution. Cell elements are then ground in Medimashine (Becton Dichinson, Cod 79300, maximal volume 1 ml, BD medicors knife) to obtain a homogeneous cell suspension. Precipitate the stroma in a centrifuge at 1,500 rpm for 10 minutes. The supernatant containing corneal cells is transferred to a sterile tube and the cells are pelleted again. The supernatant is removed, and 1 ml of 0.9% NaCl solution is added to the pellet containing corneal cells and resuspended. In the resulting suspension, cell viability is determined and cytosis is counted. Then, with a NaCl solution of 0.9%, a suspension of corneal cells was adjusted to a concentration of 5.0 · 10 ⁵ cells in 1 ml and transferred to culture bottles.

В суспензию клеток роговицы концентрации 5,0·10⁵ добавляют исследуемые препараты и для контроля в один из флаконов вносят NaCl 0,9%. Дальнейшую инкубацию проводят в культуральных флаконах в СО₂ инкубаторе (Sanyo СО₂ INCUBATOR, Япония) при температуре +37°C в атмосфере с 5% СО₂ в течение суток. Затем суспензии переносят в стерильные стеклянные центрифужные пробирки. Для осаждения клеток центрифугируют 10 минут при 1500 об/мин. Отбирают по 1 мл суспензии каждого опыта в стерильные пробирки для исследования цитотоксичности. Цитотоксичность определяется по окрашиванию клеток флуоресцентными красителями, обладающими способностью избирательно окрашивать двухспиральные нуклеиновые кислоты одним из известных ДНК-флуорохромов. В данных исследованиях использовался внутриклеточный краситель 7-АДД (7-аминоактиномицин-Д) в объеме 20 мкл. Далее рассчитывают в процентах соотношение количества апоптотических клеток к их общему количеству. Цитотоксичность исследуемых веществ оценивают на проточном цитофлюориметре с помощью программы Cell Quest Pro. Полученные данные обрабатывают на ПЭВМ IBM/PC при помощи стандартных статистических пакетов «SPSS 11,5 for Windows».Test preparations are added to a suspension of corneal cells of a concentration of 5.0 · 10 ⁵ and, for control, 0.9% NaCl is added to one of the vials. Further incubation is carried out in culture bottles in a CO ₂ incubator (Sanyo CO ₂ INCUBATOR, Japan) at a temperature of + 37 ° C in an atmosphere with 5% CO ₂ during the day. The suspensions are then transferred to sterile glass centrifuge tubes. To pellet the cells, centrifuged for 10 minutes at 1500 rpm. Take 1 ml of suspension of each experiment in sterile tubes for cytotoxicity studies. Cytotoxicity is determined by staining cells with fluorescent dyes, which are capable of selectively staining double-stranded nucleic acids with one of the known DNA fluorochromes. In these studies, the intracellular dye 7-ADD (7-aminoactinomycin-D) was used in a volume of 20 μl. Next, calculate the percentage ratio of the number of apoptotic cells to their total number. The cytotoxicity of the test substances is evaluated on a flow cytometer using the Cell Quest Pro program. The data obtained is processed on an IBM / PC computer using the standard statistical packages “SPSS 11.5 for Windows”.

Предлагаемый способ апробирован на препаратах, применяемых в офтальмологии: Корнерегель, MEDgel 0,3% и MEDgel 0,1%.The proposed method was tested on preparations used in ophthalmology: Korneregel, MEDgel 0.3% and MEDgel 0.1%.

Результаты проведенных исследований по приведенному выше способу свидетельствуют о том, что после добавления в изучаемый тест-объект «Корнерегель» через 1 сутки наблюдается снижение абсолютного и относительного количества клеток ниже контрольной группы, а при добавлении «MEDgel» 0,3% и 0,1% количество клеток повышалось (табл.1-3).The results of studies by the above method indicate that after adding to the studied test object "Korneregel" after 1 day there is a decrease in the absolute and relative number of cells below the control group, and when adding "MEDgel" 0.3% and 0.1 % the number of cells increased (table 1-3).

В табл.1-3 и гистограмме (рис.1) также приведены результаты исследования возможности использования клеток роговицы эмбрионов более ранней гестации, в частности 7-дневной, и сравнение их с чувствительностью 14-дневной.Table 1-3 and the histogram (Fig. 1) also show the results of a study of the possibility of using corneal cells of embryos of earlier gestation, in particular a 7-day one, and their comparison with a sensitivity of 14-day.

Таблица 1Table 1 Абсолютное количество клеток роговицыThe absolute number of corneal cells ПоказательIndicator КонтрольThe control КорнерегельCorn Rig MEDgel, 0,3%MEDgel, 0.3% MEDgel, 0,1%MEDgel, 0.1% Клетки роговицы 14 дней гестации (n=8)Corneal cells 14 days of gestation (n = 8) 310420,0±998,44310 420.0 ± 998.44 6290,0±582,96^∗∗ 6290.0 ± 582.96 ^∗∗ 564466,67±21254,09^∗∗ 564466.67 ± 21254.09 ^∗∗ 352450,0±2744,02^∗∗ 352450.0 ± 2744.02 ^∗∗ Абсолютное количествоAbsolute amount Сигмальное отклонениеSigmal deviation 19794,5719794.57 1648,861648.86 52061,6852061,68 55711,2555711.25 Клетки роговицы 7 дней гестации (n=6)Corneal cells 7 days of gestation (n = 6) Абсолютное количествоAbsolute amount 163780,0±30585,21#163780.0 ± 30585.21 # 6000,0±1024,92^∗∗ 6000.0 ± 1024.92 ^∗∗ 670033,33±51782,88^∗∗ 670033.33 ± 51782.88 ^∗∗ 300556,67±39366,7^∗ 300556.67 ± 39366.7 ^∗ Сигмальное отклонениеSigmal deviation 74918,1774,918.17 2510,522510.52 126841,64126841.64 96428,3396,428.33 Примечание: ^∗ - достоверность различия с контролем (^∗ - р<0,01; ^∗∗ - р<0,001); # - достоверность различия с клетками роговицы 14 дней гестации (# - р<0,001).Note: ^∗ - significance of differences with control ( ^∗ - p <0.01; ^∗∗ - p <0.001);# - significance of differences with corneal cells of 14 days of gestation (# - p <0.001).

После добавления в изучаемый тест-объект исследуемых лекарственных веществ с заявленной производителями репаративной активностью через 1 сутки обнаружили снижение жизнеспособности эмбриональных клеток роговицы цыпленка как 14 дней гестации, так и 7 дней гестации. Однако абсолютное и относительное количество клеток через 1 сутки инкубации в тест-объекте эмбриональных клеток роговицы цыпленка 7 дней гестации было значительно меньше (р<0,001).After adding the studied medicinal substances with the reparative activity declared by the manufacturers to the test object studied, after 1 day, a decrease in the viability of chicken corneal embryonic cells was found to be both 14 days of gestation and 7 days of gestation. However, the absolute and relative number of cells after 1 day of incubation in the test object of chicken corneal embryonic cells for 7 days of gestation was significantly less (p <0.001).

Таблица 2table 2 Относительное количество клеток роговицыThe relative number of corneal cells ПоказательIndicator КонтрольThe control КорнерегельCorn Rig MEDgel, 0,3%MEDgel, 0.3% MEDgel, 0,1%MEDgel, 0.1% Клетки роговицы 14 дней гестации (n=8)Corneal cells 14 days of gestation (n = 8) Относительное количество, %The relative amount,% 62,08±1,462.08 ± 1.4 1,26±0,12 ^∗∗ 1.26 ± 0.12 ^∗∗ 112,89±4,25^∗∗ 112.89 ± 4.25 ^∗∗ 70,49±4,5570.49 ± 4.55 Сигмальное отклонениеSigmal deviation 3,963.96 0,330.33 10,4110.41 11,1411.14 Клетки роговицы 7 дней гестации (n=6)Corneal cells 7 days of gestation (n = 6) Относительное количество, %The relative amount,% 32,76±6,12#32.76 ± 6.12 # 1,2±0,2^∗∗ 1.2 ± 0.2 ^∗∗ 134,01±10,36^∗∗ 134.01 ± 10.36 ^∗∗ 60,11±7,87^∗ 60.11 ± 7.87 ^∗ Сигмальное отклонениеSigmal deviation 14,9814.98 0,50.5 25,3725.37 19,2919.29 Примечание: ^∗ - достоверность различия с контролем (^∗ - р<0,05; ^∗∗ - р<0,001); # - достоверность различия с клетками роговицы 14 дней гестации (# - р<0,001)Note: ^∗ - significance of differences with control ( ^∗ - p <0.05; ^∗∗ - p <0.001);# - significance of differences with corneal cells of 14 days of gestation (# - p <0.001)

Таблица 3Table 3 Жизнеспособность клеток роговицыCorneal cell viability ПоказательIndicator КонтрольThe control КорнерегельCorn Rig MEDgel, 0,3%MEDgel, 0.3% MEDgel, 0,1%MEDgel, 0.1% Клетки роговицы 14 дней гестации (n=8)Corneal cells 14 days of gestation (n = 8) Жизнеспособность, %Viability,% 91,5±1,1291.5 ± 1.12 87,95±2,4487.95 ± 2.44 94,0±1,3294.0 ± 1.32 94,33±0,76^∗ 94.33 ± 0.76 ^∗ Сигмальное отклонениеSigmal deviation 3,163.16 6,96.9 3,223.22 1,861.86 Клетки роговицы 7 дней гестации (n=6)Corneal cells 7 days of gestation (n = 6) Жизнеспособность, %Viability,% 89,67±0,7689.67 ± 0.76 85,67±1,17^∗∗ 85.67 ± 1.17 ^∗∗ 94,33±1,38^∗∗ 94.33 ± 1.38 ^∗∗ 95,0±0,37^∗∗∗ 95.0 ± 0.37 ^∗∗∗ Сигмальное отклонениеSigmal deviation 1,861.86 2,882.88 3,393.39 0,890.89 Примечание: ^∗ - достоверность различия с контролем (^∗ - р<0,05; ^∗∗ - р<0,01; ^∗∗∗ - р<0,001)Note: ^∗ - significance of differences with control ( ^∗ - p <0.05; ^∗∗ - p <0.01; ^∗∗∗ - p <0.001)

При добавлении «Корнерегеля» жизнеспособность клеток роговицы цыпленка 7 дней гестации достоверно снижается (р<0,01), а при добавлении «MEDgel, 0,3%» и «MEDgel, 0,1%» повышается в среднем на 5%.With the addition of Korneregel, the viability of chicken corneal cells of 7 days of gestation significantly decreases (p <0.01), and with the addition of MEDgel, 0.3% and MEDgel, 0.1%, it increases by an average of 5%.

В результате проведенных исследований выяснилось, что для определения цитотоксичности лекарственных средств экспериментатор при необходимости может использовать эмбрионы цыплят от 7 до 14 дней гестации.As a result of the studies, it was found that to determine the cytotoxicity of drugs, the experimenter, if necessary, can use chick embryos from 7 to 14 days of gestation.

Таким образом новый тест-объект, полученный по предложенному способу, отличается высокой чувствительностью и специфичностью определения цитотоксичности лекарственных веществ, объективностью интерпретирования результатов исследования, универсальностью применения для широкого круга препаратов, быстротой получения результатов и соответствием современным этическим требованиям. Применение тест-объекта позволило стандартизировать исследование на цитотоксичность. И, кроме того, он соответствует требованиям этичности.Thus, the new test object obtained by the proposed method is characterized by high sensitivity and specificity for determining the cytotoxicity of drugs, objectivity in interpreting the results of the study, universality of use for a wide range of drugs, the speed of obtaining results, and compliance with modern ethical requirements. The use of a test object made it possible to standardize the study for cytotoxicity. And, in addition, it meets the requirements of ethics.

Заявителю неизвестны технические решения, обладающие указанными отличительными признаками, обеспечивающими в совокупности достижение заданного результата, поэтому авторы считают, что заявляемый способ соответствует критериям новизны, изобретательского уровня и промышленной применимости.The applicant is not aware of technical solutions that have the indicated distinguishing features, which together ensure the achievement of a given result, therefore, the authors believe that the claimed method meets the criteria of novelty, inventive step and industrial applicability.

Заявляемый способ может найти широкое применение в медицине, аллергологии и иммунологии, фармакологии, клинической фармакологии.The inventive method can be widely used in medicine, allergology and immunology, pharmacology, clinical pharmacology.

Claims

A method of obtaining a test object for assessing the cytotoxicity of drugs, including the use of the cornea of embryonic chickens and cell technology, characterized in that they isolate the cornea of the embryos of chickens 7-14 days of gestation, which is crushed and frozen in liquid nitrogen vapor to -180 ° C, when assessing cytotoxicity of drugs, the frozen material is subjected to slow defrosting, transferred to a centrifuge tube and washed three times in a 0.9% NaCl solution, and then the cell elements are ground until homo cell suspension, the stroma is precipitated in a centrifuge, the supernatant containing corneal cells is transferred to a sterile tube and the cells are pelleted again, the supernatant is removed, and 1 ml of a 0.9% NaCl solution is added to the sediment containing corneal cells and resuspended the resulting suspension is considered cytosis and the viability of the cells is determined by staining them with DNA fluorochromes on a flow cytometer, then with a 0.9% NaCl solution, the corneal cell suspension is adjusted to a concentration of 5.0 × 10 ⁵ cells in 1 ml and transferred to culture bottles and the studied preparations are added, 0.9% NaCl is added to one of the vials for control, further incubation is carried out in culture vials in a CO ₂ incubator for 24 hours, then the cell suspensions are transferred to centrifuge tubes, centrifuged to precipitate the cells and taken 1 ml of suspension of each experiment for the study of cytotoxicity by staining cells with DNA fluorochromes, the cytotoxicity of the test substances is evaluated on a flow cytometer.