RU2465592C1 - METHOD FOR ASSESSING CYTOTOXICITY OF Burcholderia pseudomallei antigens in vitro - Google Patents
METHOD FOR ASSESSING CYTOTOXICITY OF Burcholderia pseudomallei antigens in vitro Download PDFInfo
- Publication number
- RU2465592C1 RU2465592C1 RU2011122855/10A RU2011122855A RU2465592C1 RU 2465592 C1 RU2465592 C1 RU 2465592C1 RU 2011122855/10 A RU2011122855/10 A RU 2011122855/10A RU 2011122855 A RU2011122855 A RU 2011122855A RU 2465592 C1 RU2465592 C1 RU 2465592C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- antigens
- wells
- cytotoxicity
- monolayer
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области микробиологии и иммунологии и касается применения клеточной модели для оценки цитотоксичности антигенов возбудителя мелиоидоза in vitro, позволяющей получить объективные данные о токсических свойствах ряда антигенов Burkholderia pseudomallei с помощью реакции цитотоксичности, выполняемой на перевиваемых монослойных клеточных линиях мышиных фибробластов L929 или клеток яичника китайского хомячка СНО-К1.The invention relates to the field of microbiology and immunology, and relates to the use of a cell model for assessing the cytotoxicity of antigens of the causative agent of melioidosis in vitro, which allows obtaining objective data on the toxic properties of a number of Burkholderia pseudomallei antigens using a cytotoxicity reaction performed on transplantable monolayer cell lines of Chinese L929 murine fibroblasts or egg cells hamster СНО-К1.
Известны различные способы оценки токсичности. Традиционные методы определения потенциально токсических химических и биологических веществ на биомоделях трудоемки, длительны и дорогостоящи. Альтернативой им являются методы оценки токсических свойств различных соединений на модели перевиваемых клеточных культур. Объем информации о преимуществах этих методов как наиболее технологичных, объективных, точных и удовлетворяющих требования биоэтики растет с каждым годом. Одно из важных преимуществ моделей in vitro заключается в возможности работы с коллекционными перевиваемыми линиями клеток с известными свойствами. Их применяют для изучения токсинов холерного микроба (Сальникова О.И. Тестирование и изучение токсинов холерного вибриона в культуре монослойных клеток. Дисс.канд. биол. наук, Ростов-на-Дону, 1994 г.), дифтерийного токсина (Дмитриева М.Н., Грубер И.М., Гаврилова Н.А., Титова Н.Г., Яковлева И.В., Свиридов В.В. Оценка количества дифтерийного токсина и его активности разными тестами в динамике культивирования Corynebacterium diphtheria PWB // Журн. микробиол., 1999, №2. С.32-35).Various methods for assessing toxicity are known. Traditional methods for determining potentially toxic chemical and biological substances on biomodels are laborious, time consuming and expensive. An alternative to them are methods for assessing the toxic properties of various compounds on a model of transplantable cell cultures. The amount of information about the benefits of these methods as the most technologically advanced, objective, accurate and satisfying bioethical requirements is growing every year. One of the important advantages of in vitro models is the ability to work with collectible transplantable cell lines with known properties. They are used to study cholera microbial toxins (Salnikova OI Testing and study of cholera vibrio toxins in a monolayer cell culture. Diss. Candidate of Biological Sciences, Rostov-on-Don, 1994), diphtheria toxin (Dmitrieva M.N. ., Gruber I.M., Gavrilova N.A., Titova N.G., Yakovleva I.V., Sviridov V.V. Estimation of the amount of diphtheria toxin and its activity by different tests in the dynamics of cultivation of Corynebacterium diphtheria PWB // Zh. microbiol., 1999, No. 2. P.32-35).
Наиболее близким аналогом является «Способ оценки токсичности бактериальных антигенов» (патент №2281507, зарегистрированный в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 10 августа 2006 г.), предложенный для оценки токсичности антигенов возбудителя мелиоидоза на модели одноклеточных организмов: на инфузорях Paramecium caudatum. Основными ограничениями широкого использования данного способа в условиях конкретной лаборатории являются трудности стандартизации самих мишеней (инфузорий), а также условий выполнения всех этапов экспериментов. Преимущества клеточных линий связаны прежде всего с тем, что они паспортизированы и не теряют своих свойств при криоконсервировании в течение любых по длительности сроков хранения.The closest analogue is the “Method for assessing the toxicity of bacterial antigens” (patent No. 2281507, registered in the State register of inventions of the Russian Federation on August 10, 2006), proposed for evaluating the toxicity of antigens of the causative agent of melioidosis in a model of unicellular organisms: on ciliates Paramecium caudatum. The main limitations of the widespread use of this method in a specific laboratory are the difficulties in standardizing the targets themselves (ciliates), as well as the conditions for performing all stages of the experiments. The advantages of cell lines are associated primarily with the fact that they are certified and do not lose their properties during cryopreservation during any storage periods of any length.
Цель изобретения - выбор клеточной модели для определения токсических свойств антигенов возбудителя мелиоидоза in vitro и разработка оптимизированных условий постановки теста микроцитотоксичности, предназначенного для выявления in vitro токсичных компонентов в биологически активных комплексах, изолированных из микробных клеток возбудителя мелиоидоза.The purpose of the invention is the selection of a cell model for determining the toxic properties of antigens of the melioidosis pathogen in vitro and the development of optimized conditions for the production of a microcytotoxicity test designed to detect in vitro toxic components in biologically active complexes isolated from microbial cells of the melioidosis pathogen.
Предлагаемый способ включает себя следующие этапы:The proposed method includes the following steps:
1) подготовительный - размораживание клеточных линий и их адаптацию к условиям выполнения экспериментов,1) preparatory - thawing of cell lines and their adaptation to the conditions of the experiments,
2) постановка микроварианта теста цитотоксичности испытуемых образцов антигенов,2) formulation of the microvariant test of cytotoxicity of the tested antigen samples,
3) ежедневный учет результатов воздействия антигенов на клетки-мишени в течение 3 сут после формирования монослоя.3) daily recording of the effects of antigens on target cells for 3 days after the formation of the monolayer.
Поставленная цель достигается тем, что используют две коллекционные перевиваемые линии клеток с известными свойствами в качестве индикаторных культур, которые до начала основных экспериментов выводят из криоконсервированного состояния, помещая ампулы с клетками мышиных фибробластов L929 и клеток яичника китайского хомячка СНО-К1 в водяную баню с температурой 37°С на 2-3 мин, затем их отмывают в среде 199, центрифугируют, ресуспендируют в полной среде выращивания, высевают в лунки 6-луночных культуральных пластин для адаптации к условиям культивирования и восстановления пролиферативной активности, пластины помещают в СО2-инкубатор с концентрацией СО2 5-7% и температурой 37°С для наращивания клеточной массы с обязательными пересевами клеток каждые 3-4 дня, сменой среды выращивания в эти же дни и контролем темпов формирования монослоя клеток каждой линии, их морфологии и функционального состояния по показателю адгезивности к пластику, параллельно готовят стерильные образцы исследуемых антигенов возбудителя мелиоидоза, изолированных из различных структурных элементов бактериальной клетки, охарактеризованных по химическому составу, после чего осуществляют постановку микроварианта теста, для которого используют 48-луночные пластины, в лунки которых вносят свежую трипсинизированную культуру клеток двух линий по 6×104 клеток в лунку в объеме 0,25 мл, через сутки культивирования в СО2-инкубаторе регистрируют формирование монослоя клеток, плотно прилегающих друг к другу, с характерной морфологией. Затем в опытные лунки вносят стерильные образцы тестируемых антигенов, по 20 мкл, оставляя на каждой пластине по 2 лунки с интактной культурой (контроль).This goal is achieved by using two collection transplantable cell lines with known properties as indicator cultures, which, prior to the start of the main experiments, are removed from the cryopreserved state by placing ampoules with L929 murine fibroblast cells and Chinese hamster ovary cells CHO-K1 in a water bath with temperature 37 ° C for 2-3 minutes, then they are washed in medium 199, centrifuged, resuspended in a complete growth medium, seeded in the wells of 6-well culture plates to adapt to culture conditions To stimulate and restore proliferative activity, the plates are placed in a CO 2 incubator with a CO 2 concentration of 5-7% and a temperature of 37 ° C to increase the cell mass with obligatory cell reseeding every 3-4 days, change the growth medium on the same days and control the rates the formation of a monolayer of cells of each line, their morphology and functional state in terms of adhesion to plastic, sterile samples of the studied antigens of the melioidosis causative agent isolated from various structural elements of bacterium are prepared in parallel cial cells, characterized by their chemical composition, after which the test is carried out mikrovarianta formulation for which use 48-well plates, the wells which make fresh culture cells were trypsinized two lines of 6 × 10 4 cells per well in a volume of 0.25 ml, in a day cultivation in a CO 2 incubator, the formation of a monolayer of cells tightly adjacent to each other with a characteristic morphology is recorded. Then, sterile samples of the test antigens are added to the test wells, 20 μl each, leaving 2 wells with an intact culture on each plate (control).
Пластину инкубируют в СО2-инкубаторе при 37°С и насыщении атмосферы 5-7% СО2 в течение 3 сут, ежедневно просматривают лунки культуральных пластин, оценивая наличие или отсутствие изменений морфологии и функционального состояния клеток-мишеней по сравнению с контролем. Учету подлежат время контакта биологически активного вещества с клетками, концентрации вносимых веществ в лунку, морфологические изменения и адгезивные свойства клеток.The plate is incubated in a CO 2 incubator at 37 ° C and atmospheric saturation of 5-7% CO 2 for 3 days, the wells of culture plates are examined daily, assessing the presence or absence of changes in the morphology and functional state of target cells compared to the control. The time of contact of the biologically active substance with the cells, the concentration of the introduced substances in the well, the morphological changes and the adhesive properties of the cells are subject to accounting.
В случаях токсического воздействия исследуемых антигенов на монослой клеток индикаторных культур изменяется их форма (удлиненные, округлые, увеличенные в объеме, полигональные), появляются внутриклеточные включения, разрушенные клетки и их тени, детрит в межклеточных пространствах, участки свободной поверхности пластика, площадь которых при нарастании числа погибших клеток увеличивается. Массовая гибель клеток является признаком острого цитотоксического воздействия антигенов на клетки.In cases of toxic effects of the studied antigens on the monolayer of cells of indicator cultures, their shape changes (elongated, roundish, increased in volume, polygonal), intracellular inclusions, destroyed cells and their shadows appear, detritus in intercellular spaces, sections of the free surface of the plastic, the area of which grows the number of dead cells is increasing. Mass cell death is a sign of acute cytotoxic effects of antigens on cells.
При выполнении микроварианта теста цитотоксичности исследуемых биополимеров получают объективные данные о характере морфологических изменений и функционального состояния клеток-мишеней вследствие контакта с тем или иным антигеном.When performing the microvariant of the cytotoxicity test of the studied biopolymers, objective data are obtained on the nature of the morphological changes and the functional state of the target cells due to contact with one or another antigen.
Пример 1. Подготовка клеточных линий L929 и СНО-К1 к выполнению микроварианта теста определения цитотоксичности различных антигеновExample 1. Preparation of cell lines L929 and CHO-K1 to perform a microvariant test for determining the cytotoxicity of various antigens
Подготовительный этап выполняют с целью выведения перевиваемых клеточных линий L929 и СНО-К1 из криоконсервированного состояния и их адаптации к конкретным условиям культивирования, используемым при выполнения основных опытов.The preparatory stage is carried out with the aim of removing the transplantable cell lines L929 and CHO-K1 from the cryopreserved state and their adaptation to the specific culturing conditions used to perform the main experiments.
Работу проводят на двух монослойных клеточных линиях млекопитающих: L929 (мышиных фибробластах) и СНО-К1 (клетках яичника китайского хомячка), получаемых из Российской коллекции клеточных культур позвоночных института цитологии РАН (г.Санкт-Петербург). Эти коллекционные культуры клеток вне периода постановки опытов сохраняют в пластиковых ампулах с защитной средой, помещенных в биохранилище для криоконсервирования в жидком азоте при -196°С.The work is carried out on two monolayer cell lines of mammals: L929 (mouse fibroblasts) and CHO-K1 (Chinese hamster ovary cells), obtained from the Russian collection of vertebrate cell cultures of the Institute of Cytology RAS (St. Petersburg). These collection cell cultures outside the experimental setup period are stored in plastic ampoules with a protective medium placed in a bio-storage for cryopreservation in liquid nitrogen at -196 ° C.
Для культивирования линий СНО-К1 и L929 в качестве основной среды используют полусинтетическую питательную среду F12, на этапах отмывания клеток - среду 199, для снятия монослоя клеток с поверхности пластика применяют коммерческие растворы трипсина и версена (все среды коммерческие, производитель - ФГУП «Предприятие по производству бактерийных и вирусных препаратов» института полиомиелита и вирусных энцефалитов им.М.П.Чумакова. РАМН).Semi-synthetic nutrient medium F12 is used as the main medium for the cultivation of CHO-K1 and L929 lines, medium 199 is used at the cell washing stages, commercial trypsin and versene solutions are used to remove the cell monolayer from the plastic surface (all media are commercial, manufacturer - FSUE Enterprise on the production of bacterial and viral drugs ”Institute of Polio and Viral Encephalitis named after MP Chumakov. RAMS).
Для этапа криоконсервирования культур готовят среду для замораживания клеточных линий (основная среда F12 плюс 20% эмбриональной телячьей сыворотки и 7% ДМСО), для культивирования клеточных линий - полную среду (основная среда F12 плюс 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глютамина, 4 мМ пирувата натрия, пенициллина 100 ЕД/мл, стрептомицина 100 мкг/мл).For the stage of cryopreservation of cultures, a medium is prepared for freezing cell lines (basic medium F12 plus 20% fetal calf serum and 7% DMSO); for culturing cell lines, complete medium (basic medium F12 plus 10% embryonic calf serum, 2 mM glutamine, 4 mM sodium pyruvate, penicillin 100 IU / ml, streptomycin 100 μg / ml).
Перед началом проверки антигенов на цитотоксичность ампулы с клетками достают из биохранилища и размораживают при температуре 37°С, выдерживая ампулу на водяной бане в течение 2-3 мин. С помощью теста прижизненной окраски клеток трипановым голубым определяют относительные показатели (%) их жизнеспособности. Суспензию клеток переносят в пробирку со средой 199 для проведения процедуры отмывания от примесей защитной среды. Пробирку центрифугируют при 800 об/мин в течение 15 мин, супернатант удаляют, осадок ресуспендируют в полний среде выращивания, рН 7,1-7,2.Before testing the antigens for cytotoxicity, the ampoules with cells are removed from the bio-storage and thawed at a temperature of 37 ° C, keeping the ampoule in a water bath for 2-3 minutes. Using the test of intravital staining of cells with trypan blue, the relative indices (%) of their viability are determined. The cell suspension is transferred into a test tube with medium 199 for the washing procedure from impurities of the protective medium. The tube is centrifuged at 800 rpm for 15 minutes, the supernatant is removed, the pellet is resuspended in complete growth medium, pH 7.1-7.2.
Клетки высевают в лунки 6-л пластин или малые чашки Петри, по 6·104 на 1 см. Культивирование проводят в СО2-инкубаторе при температуре 37°С и концентрации СО2 5-7%, с периодичностью пересевов каждые 2-3 сут в течение 2 недель.Cells are seeded in the wells of 6-l plates or small Petri dishes, 6 · 10 4 per 1 cm. Cultivation is carried out in a CO 2 incubator at a temperature of 37 ° C and a concentration of CO 2 5-7%, with a frequency of reseeding every 2-3 day for 2 weeks.
Для выполнения пересевов необходимо снять монослой клеток с поверхности пластика. Для этого используют рабочие растворы трипсина с версеном: для овариальных клеток китайского хомячка соотношение объемов трипсин : версен составляет 1:1, для линии мышиных фибробластов L929-1:3 (в соответствии с паспортными данными используемых линий клеток). С поверхности монослоя клеток удаляют среду выращивания и наносят первую порцию смеси трипсин : версен в объеме 3-5 мл. Контакт клеток с раствором длится не более 3-5 мин при легком покачивании пластин, после чего жидкость удаляют и вносят на поверхность клеток вторую порцию смеси трипсин : версен (по 2 мл/лунку). Клетки начинают постепенно округляться и через 3-5 мин полностью открепляются от поверхности пластика. Открепившиеся от поверхности пластика клетки собирают и отмывают от присутствия трипсин:версена при центрифугировании. Осадок суспендируют в полной среде и высевают в лунки 6-л пластин или в малые чашки Петри.To perform reseeding, it is necessary to remove the monolayer of cells from the surface of the plastic. For this, trypsin working solutions with versene are used: for the Chinese hamster ovarian cells, the ratio of trypsin: versene volumes is 1: 1, for the murine fibroblast line L929-1: 3 (in accordance with the data sheet of the used cell lines). The growth medium is removed from the surface of the cell monolayer and the first portion of the trypsin: versene mixture is applied in a volume of 3-5 ml. The contact of the cells with the solution lasts no more than 3-5 minutes with slight swaying of the plates, after which the liquid is removed and a second portion of the trypsin: versene mixture (2 ml / well) is added to the cell surface. Cells begin to gradually round up and after 3-5 minutes they completely detach from the surface of the plastic. Cells detached from the surface of the plastic are collected and washed from the presence of trypsin: versene by centrifugation. The precipitate was suspended in complete medium and plated in the wells of 6-L plates or in small Petri dishes.
Через 2 недели клетки полностью адаптируются к выбранным условиям, восстанавливают пролиферативную активность и активно размножаются, что позволяет провести масштабирование популяций в количествах, необходимых для выполнения тестов по определению цитотоксичности различных антигенов.After 2 weeks, the cells fully adapt to the selected conditions, restore proliferative activity and actively multiply, which allows the scaling of populations in the quantities necessary to perform tests to determine the cytotoxicity of various antigens.
В процессе тиражирования клеточной популяции ежедневно визуально с помощью инвертированного микроскопа оценивают их морфологию и функциональное состояние в части способности прикрепляться к поверхности пластика и формировать монослой. Формирование монослоя завершается через сутки. Типичная морфология интактных клеток в монослойной культуре представлена на рисунке 1.In the process of replicating the cell population, their morphology and functional state are visually assessed daily using an inverted microscope in terms of the ability to attach to the plastic surface and form a monolayer. The formation of a monolayer is completed in a day. A typical morphology of intact cells in a monolayer culture is shown in Figure 1.
Клетки мышиных фибробластов, линия L929. Веретенообразные удлиненные клетки, плотно прилегающие друг к другу, с четко очерченной клеточной стенкой; незначительное количество округлых неприкрепившихся к пластику клеток над монослоем.Mouse fibroblast cells, line L929. Spindle-shaped elongated cells, tightly adjacent to each other, with a clearly defined cell wall; a small number of rounded cells not attached to the plastic over the monolayer.
Клетки яичника китайского хомячка СНО-К1. Овально-веретенообразные клетки, с более тонкой очерченностью клеточной стенки.Chinese hamster ovary cells CHO-K1. Oval-spindle-shaped cells with a finer outline of the cell wall.
Пример 2. Подготовка образцов антигенов для проверки в тесте цитотоксичностиExample 2. Preparation of antigen samples for verification in a cytotoxicity test
В работе использовали комплексные антигены B.pseudomallei:The complex antigens of B. pseudomallei were used in the work:
1) растворимые антигены В. pseudomallei;1) soluble B. pseudomallei antigens;
2) антигены, изолированные из капсулы В. pseudomallei, относящиеся к группе факторов вирулентности возбудителя мелиоидоза (гликопротеин, Аг 8, и фракции кислого экзополисахарида);2) antigens isolated from the capsule of B. pseudomallei, belonging to the group of factors of virulence of the causative agent of melioidosis (glycoprotein, Ag 8, and fractions of acidic exopolysaccharide);
3) антигены клеточной стенки В. pseudomallei (липополисахарид, О-полисахарид, липид А, кор-Аг и антиген «6+d»).3) antigens of the cell wall of B. pseudomallei (lipopolysaccharide, O-polysaccharide, lipid A, core-Ag and antigen "6 + d").
Все исследуемые образцы антигенов проверяют потенциометрически для определения рН растворов; данный показатель не должен отклоняться от значений 7,0±0,1. Обязательным условием является также повторная стерилизация подготовленных к работе образцов с помощью мембранных фильтров с величиной пор 0,22 мкм.All test samples of antigens are checked potentiometrically to determine the pH of the solutions; this indicator should not deviate from the values of 7.0 ± 0.1. A prerequisite is also the re-sterilization of prepared for work samples using membrane filters with a pore size of 0.22 μm.
Пример 3. Множественный скрининг антигенов возбудителя мелиоидоза в микроварианте теста цитотоксичностиExample 3. Multiple screening of antigens of the causative agent of melioidosis in the microvariant of the cytotoxicity test
При всех постановках опытов используют две линии клеток, выращенных в полной среде, и культуральные пластины одной и той же серии, подобранные на этапе подготовки к основным опытам, что сводит к минимуму ошибки при тестировании влияния биополимеров на клетки-мишени, обеспечивает почти идентичные результаты в лунках дублирующих пластин.For all experimental designs, two lines of cells grown in complete medium are used, and culture plates of the same series, selected at the stage of preparation for the main experiments, which minimizes errors in testing the effect of biopolymers on target cells, provides almost identical results in wells of duplicate plates.
При регистрации результатов учитывают факторы времени контакта биологически активного вещества с клетками и концентрации вносимых веществ в среде выращивания клеток-мишеней.When registering the results, the contact time factors of the biologically active substance with the cells and the concentration of the introduced substances in the target cell growth medium are taken into account.
Для постановки опыта используют свежую трипсинизированную культуру клеток двух линий. В лунки 48-луночных пластин для культивирования клеток (ф. Costar, США) вносят по 6×104 клеток в лунку в объеме 0,25 мл. Через сутки проводят визуальный контроль образования монослоя. Затем в опытные лунки, с постоянной концентрацией клеток, вносят стерильные образцы тестируемых антигенов, по 20 мкл (день начала эксперимента - 0 день). Две лунки на каждой пластине с интактной культурой являются контролями.To set up an experiment, a fresh trypsinized cell culture of two lines is used. In the wells of 48-well plates for cell cultivation (F. Costar, USA) contribute 6 × 10 4 cells per well in a volume of 0.25 ml. After a day, visual monitoring of the formation of a monolayer is carried out. Then, in experimental wells, with a constant concentration of cells, sterile samples of the tested antigens are added, 20 μl each (experiment start day is 0 day). Two wells on each intact culture plate are controls.
Пластину инкубируют в СО2-инкубаторе при 37°С и насыщении атмосферы 5-7% СО2 в течение 3 сут. Ежедневно просматривают лунки культуральных пластин, оценивая морфологию и функциональное состояние клеток-мишеней. Просмотр пластины всегда начинают с контроля.The plate is incubated in a CO 2 incubator at 37 ° C and saturation of the atmosphere with 5-7% CO 2 for 3 days. Daily view the wells of the culture plates, evaluating the morphology and functional state of the target cells. Viewing plates always begin with control.
При проведении множественного скрининга антигенов возбудителя мелиоидоза в микроварианте теста цитотоксичности регистрируют качественные показатели наличия/отсутствия изменения морфологии клеток и утраты адгезивных свойств. Антигены с выраженной токсичностью вызывают множественные изменения в монослое в отличие от контроля: нарушение типичной структуры клеток, появление зон лизиса в монослое, появление теней клеток, внутриклеточных включений, детрита в межклеточном пространстве, у части клеток появляется утрата связи с поверхностью пластика, нарастающая в течение срока наблюдения (3 сут). Для острого цитотоксического воздействия характерна массовая гибель клеток-мишеней, которую можно зарегистрировать через сутки после внесения антигена. При минимальном цитопатогенном потенциале антигенной фракции изменения, происходящие в монослое, незначительны и касаются прежде всего формы клеток.When conducting multiple screening of antigens of the causative agent of melioidosis in the microvariant of the cytotoxicity test, qualitative indicators of the presence / absence of changes in cell morphology and loss of adhesive properties are recorded. Antigens with pronounced toxicity cause multiple changes in the monolayer, in contrast to the control: violation of the typical cell structure, the appearance of lysis zones in the monolayer, the appearance of shadows of cells, intracellular inclusions, detritus in the intercellular space, in some cells there is a loss of connection with the plastic surface, which grows during observation period (3 days). Acute cytotoxic effects are characterized by massive death of target cells, which can be detected one day after the introduction of antigen. With minimal cytopathogenic potential of the antigenic fraction, the changes occurring in the monolayer are insignificant and relate primarily to the shape of the cells.
Предлагаемый вариант тестирования удобен для одномоментной проверки большого числа различных антигенных фракций при их минимальном расходе.The proposed test option is convenient for simultaneous verification of a large number of different antigenic fractions at their minimum consumption.
Результаты острого токсического воздействия фракций экзополисахарида В. pseudomallei (антигены №4 и №5) на клетки-мишени представлены на рисунках 2-5.The results of the acute toxic effects of fractions of exopolysaccharide B. pseudomallei (antigens No. 4 and No. 5) on target cells are shown in Figures 2-5.
Предлагаемый способ определения цитотоксичности антигенов in vitro имеет ряд преимуществ, универсален, воспроизводим, относительно прост в исполнении, пригоден для проведения множественного скрининга антигенов В. pseudomallei. Получаемые данные значимы в тех случаях, когда работу проводят с образцами экспериментальных химических вакцин, а также антигенным материалом, используемым для иммунизации животных на этапах получения высокоактивных сывороток для производственных целей.The proposed method for determining the cytotoxicity of antigens in vitro has several advantages, it is versatile, reproducible, relatively simple to implement, suitable for multiple screening of B. pseudomallei antigens. The data obtained are significant in cases where work is carried out with samples of experimental chemical vaccines, as well as antigenic material used to immunize animals at the stages of obtaining highly active serums for production purposes.
Он может найти применение в качестве дополнительного метода оценки:It may find application as an additional assessment method:
1) экспериментальных химических комплексных вакцин,1) experimental chemical complex vaccines,
2) корректного выбора антигенного материала для воспроизведения различных схем иммунизации животных-продуцентов гипериммунных сывороток,2) the correct choice of antigenic material for reproducing various immunization schemes of animal producers of hyperimmune sera,
3) динамики накопления токсичных метаболитов в жидких питательных средах выращивания штаммов В. pseudomallei с различной вирулентностью для биомоделей,3) the dynamics of the accumulation of toxic metabolites in liquid culture media for growing strains of B. pseudomallei with different virulence for biomodels,
4) при отборе штаммов-продуцентов токсичных биополимеров В. pseudomallei.4) in the selection of strains producing toxic biopolymers of B. pseudomallei.
Результаты теста микроцитотоксичности в случаях выявления токсичных для клеток компонентов в составе сложных антигенных смесей могут служить основанием для введения дополнительного этапа очистки в технологическую схему подготовки антигенного материала для иммунизации животных: проведения предварительного истощения этого материала с целью удаления выявленного токсичного компонента из смеси антигенов.The results of the microcytotoxicity test in cases of detecting components toxic to cells in complex antigenic mixtures may serve as the basis for introducing an additional purification step into the technological scheme for preparing antigenic material for animal immunization: preliminary depletion of this material in order to remove the detected toxic component from the antigen mixture.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011122855/10A RU2465592C1 (en) | 2011-06-06 | 2011-06-06 | METHOD FOR ASSESSING CYTOTOXICITY OF Burcholderia pseudomallei antigens in vitro |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011122855/10A RU2465592C1 (en) | 2011-06-06 | 2011-06-06 | METHOD FOR ASSESSING CYTOTOXICITY OF Burcholderia pseudomallei antigens in vitro |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2465592C1 true RU2465592C1 (en) | 2012-10-27 |
Family
ID=47147571
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011122855/10A RU2465592C1 (en) | 2011-06-06 | 2011-06-06 | METHOD FOR ASSESSING CYTOTOXICITY OF Burcholderia pseudomallei antigens in vitro |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2465592C1 (en) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6174690B1 (en) * | 1993-04-12 | 2001-01-16 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Cell bioassay of neurotoxins |
| RU2281507C2 (en) * | 2004-11-17 | 2006-08-10 | Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт | Method for evaluating toxicity of bacterial antigens |
| RU2281495C8 (en) * | 2005-08-22 | 2007-02-20 | Павел Евграфович Тулупов | Method of determining biological activity (toxicity) of solid metal components and action thereof on living organism specimens |
| UA40420U (en) * | 2008-10-20 | 2009-04-10 | Сумский Национальный Аграрный Университет | Method for determination of mycotoxins with use of culture of cell of pig intestines |
-
2011
- 2011-06-06 RU RU2011122855/10A patent/RU2465592C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6174690B1 (en) * | 1993-04-12 | 2001-01-16 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Cell bioassay of neurotoxins |
| RU2281507C2 (en) * | 2004-11-17 | 2006-08-10 | Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт | Method for evaluating toxicity of bacterial antigens |
| RU2281495C8 (en) * | 2005-08-22 | 2007-02-20 | Павел Евграфович Тулупов | Method of determining biological activity (toxicity) of solid metal components and action thereof on living organism specimens |
| UA40420U (en) * | 2008-10-20 | 2009-04-10 | Сумский Национальный Аграрный Университет | Method for determination of mycotoxins with use of culture of cell of pig intestines |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Cushion et al. | Growth and serial passage of Pneumocystis carinii in the A549 cell line | |
| CN110373388A (en) | A kind of culture medium and organoid cultural method for organoid culture | |
| RU2465592C1 (en) | METHOD FOR ASSESSING CYTOTOXICITY OF Burcholderia pseudomallei antigens in vitro | |
| CN109385381B (en) | A kind of Urogenital Mycoplasma biphasic culture | |
| Thicke et al. | Cultivation of poliomyelitis virus in tissue culture: I. Growth of the Lansing strain in human embryonic tissues | |
| US20200269230A1 (en) | Engineering novel enteroid models for understanding human enteric disease | |
| RU2595423C2 (en) | METHOD OF ESTIMATION OF ADHESIVE PROPERTIES OF CHOLERA VIBRIOS Vibrio cholerae El Tor AND Vibrio cholerae O139 ON CELL CULTURE HuTu-80 | |
| Farrell et al. | Cultivation of poliomyelitis virus in tissue culture: VI. Methods for quantity production of poliomyelitis viruses in cultures of monkey kidney | |
| EP3732300B1 (en) | A novel medium for growth and antibiotic susceptibility test of mycobacteria | |
| Diamond | A comparative study of 28 culture media for Trichomonas gallinae | |
| CN108118079B (en) | Drug hepatotoxicity evaluation method based on three-dimensional liver model of qualitative filter paper | |
| US3884758A (en) | Triglyceride-accumulating clonal cell line | |
| Sato et al. | Spheroplast induction and lysis of BCG strains by glycine and lysozyme | |
| RU2400746C2 (en) | Method of determining quantity of mesophilic aerobic and optionally-anaerobic microorganisms in food products | |
| US20120309046A1 (en) | Method and device for determining the viability of a plant sample | |
| CN109971821A (en) | A kind of safety detecting method of supplementary reproduction liquid reagent | |
| RU2328526C1 (en) | Method for revealing cattle tuberculosis mycobacteria | |
| Neales | The boron nutrition of the diatom, Cylindrotheca fusiformis, grown on agar, and the biological activity of some substituted phenylboronic acids | |
| CN106635800A (en) | Quick separation and culture method for mycobacteria | |
| RU2711954C1 (en) | Method for preliminary identification of non-tuberculosis mycobacteria using a universal chromogenic medium | |
| RU2042134C1 (en) | Method for identifying mycobacteria m. tuberculosis and m. bovis | |
| Wilkinson | A note on the use of Stuart's transport medium for the isolation of the Gonococcus | |
| RU1632037C (en) | Method of determination of growing properties of cattle serum | |
| RU2340675C2 (en) | Method of determination of specific accessory of micobacteria | |
| UA140217U (en) | METHOD OF STUDY OF SENSITIVITY OF M. TUBERCULOSIS TO SECONDARY METABOLITES OF STREPTOMYCETES |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20130607 |