RU2460769C1 - Способ витрификации биологических объектов - Google Patents
Способ витрификации биологических объектов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2460769C1 RU2460769C1 RU2011110548/10A RU2011110548A RU2460769C1 RU 2460769 C1 RU2460769 C1 RU 2460769C1 RU 2011110548/10 A RU2011110548/10 A RU 2011110548/10A RU 2011110548 A RU2011110548 A RU 2011110548A RU 2460769 C1 RU2460769 C1 RU 2460769C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- pipette
- sealed
- dropper
- biological objects
- objects
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биологии и медицины, в частности к витрификации гамет и эмбрионов. Способ включает в себя витрификацию биологических объектов, предпочтительно гамет и эмбрионов, в гибкую поликарбонатную пипетку для денудации и переноса гамет и эмбрионов и кумулюсооцитарных комплексов диаметром 130-600 микрометров и размораживание. В пипетку набирают небольшой объем витрифицированного раствора без биологических объектов. Затем в пипетку набирают витрифицированный раствор с биологическими объектами, после чего осуществляют добавление витрифицированного раствора так, чтобы биологические объекты были размещены на расстоянии не менее чем 10 мм от дистального конца гибкой поликарбонатной пипетки. Затем осуществляют последующее запаивание пипетки с дистального конца ее и проверку герметичности шва посредством стриппетора, запаивают проксимальный конец пипетки. После чего погружают ее в жидкий азот не менее 20 сек и упаковывают в наружную соломину-кожух объемом не менее 0,25 мл со смещенным центром тяжести для вертикального ориентирования и запаиванием наружной соломины-кожуха. Размораживание осуществляют путем вскрытия наружной соломины-кожуха, извлечения из нее запаянной пипетки с объектами, помещения пипетки в водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия. Затем вскрывают пипетку с обеих запаянных концов и осуществляют выпускание витрифицированных биологических объектов в раствор для размораживания с помощью груши, надетой на широкую часть пипетки. Изобретение обеспечивает уменьшение себестоимости процесса витрификации и снижение расхода растворов для замораживания и размораживания биологических объектов. 6 ил.
Description
Предложение относится к области биологии и медицины, в частности к витрификации гамет и эмбрионов.
В настоящее время известен способ, в котором носитель для витрификации состоит из внутренней соломины объемом 0,25 мл, один из концов которой заполнен витрификационным раствором с витрифицируемыми объектами, и внешней соломины-кожуха объемом 0,5 мл, запаиваемой с обоих концов металлическими шариками и погружаемой затем в жидкий азот.(Aseptic technology of vitrification of human pronuclear oocytes using open-pulled straws, V. Isachenko et al. Hum. Reprod. (February 2005) 20(2); 492-496.) Размораживание объектов в данной системе осуществляется после вскрытия внешней соломины и извлечения внутренней соломины немедленным помещением заполненного витрификационным раствором с объектами конца внутренней соломины в раствор для размораживания.
Наиболее близким к патентуемому образцу является способ замораживания, при котором объекты помещаются в гибкую поликарбонатную предварительно укороченную пипетку для переноса гамет и эмбрионов, после чего пипетка помещается в запаянную с одного конца наружную соломину-кожух, которая затем запаивается с другого конца и погружается в жидкий азот; размораживание в данной системе осуществляется погружением конца пипетки с объектами в раствор для размораживания после вскрытия внешней соломины ножницами. (MicroSecure Vitrification (µ-S-VTF) Procedure: Optimum simplicity, security, cost-savings and effectiveness combining FDA-approved products, Mitchel C.Schiewe, The Journal of Clinical Embryology, Volume 13, Issue 2, 33-40).
Недостатками прототипа являются: сниженная скорость охлаждения объектов, возможность примерзания внутренней пипетки с эмбрионами к одному из концов наружной соломины за счет того, что пипетка не запаивается, необходимость использования большого (около 5 мл) объема раствора для размораживания.
Технической задачей и технологическим результатом способа является уменьшение себестоимости процедуры витрификации в сочетании с повышением скорости охлаждения объектов для оптимизации условий замораживания и обеспечением стопроцентной извлекаемости и безопасности хранения объектов за счет асептичности носителя.
Поставленная задача решается за счет того, что замораживание витрифицируемых биологических объектов осуществляется в гибкую поликарбонатную пипетку для переноса гамет, эмбрионов и кумулюсооцитарных комплексов диаметром 130-600 мкм; сначала в пипетку набирают небольшой объем витрификационного раствора без биологических объектов, затем в пипетку набирают витрификационный раствор с биологическими объектами, после чего осуществляют добавление витрификационного раствора так, чтобы биологические объекты были размещены на расстоянии не менее чем 10 мм от дистального конца поликарбонатной пипетки, после чего производят запаивание с дистального конца пипетки и проверку герметичности шва посредством стриппетора, далее запаивают проксимальный конец пипетки и погружают ее в азот на время, равное не менее 20 сек, после чего пипетку с витрифицированными объектами упаковывают в соломину-кожух объемом не менее 0,25 мл, содержащую металлический стержень с одного из концов, который предварительно герметично запаивают для смещения центра тяжести носителя, после помещения пипетки в соломину последнюю запаивают.
Способ поясняется прилагаемым графическим материалом, где:
на фиг.1 представлена внешняя соломина с хлопковым фильтром без внутреннего металлического стержня;
на фиг.2 - внешняя соломина с металлическим стержнем внутри, смещенным внутренним хлопковым фильтром, запаянная с дистального конца;
на фиг.3 - витрифицируемый биологический объект, находящийся внутри гибкой поликарбонатной пипетки, надетой на стриппетор;
на фиг.4 - запаянная с обоих концов гибкая поликарбонатная пипетка с находящимися внутри объектами;
на фиг.5 - запаянная поликарбонатная пипетка с находящимися внутри объектами и внешняя соломина погружены в жидкий азот;
на фиг.6 - запаянная поликарбонатная пипетка с витрифицированными объектами помещена и запаяна в наружную соломину.
Для реализации способа используют:
1 - внешнюю соломину-кожух, содержащую
2 - хлопковый фильтр и
3 - металлический стержень, смещающий центр тяжести соломины, которую предварительно
4 - запаивают. С помощью
5 - стриппетора в
6 - гибкую поликарбонатную пипетку набирают
7 - витрифицируемые объекты, затем
8 - пипетку запаивают и погружают в
9 - жидкий азот. Далее пипетку упаковывают в наружную соломину, которую затем герметично запаивают.
Загрузка замораживаемых объектов в пипетку и ее запаивание ультразвуковым или термическим запаивателем осуществляются следующим образом: сначала в пипетку набирают небольшой объем витрификационного раствора без замораживаемых объектов, далее набирают витрификационный раствор с объектами, затем витрификационный раствор, при этом необходимо, чтобы объекты располагались не менее чем на расстоянии 10 мм от дистального конца пипетки, что контролируется визуально в стереомикроскопе, для предотвращения их возможного повреждения при запаивании; после заполнения пипетки дистальный ее конец (через который загружались объекты) запаивается, герметичность образовавшегося шва контролируется следующим образом - на поршень стриппетора, с которым соединена пипетка осуществляются надавливания и в это время визуально контролируется перемещение мениска раствора внутри пипетки или истечение его наружу через место шва, в случае если имеется движение мениска или истечение раствора через несостоятельный шов, необходимо перезапаять пипетку выше первоначального уровня. После запаивания дистального конца пипетки ее снимают со стриппетора и запаивают противоположный уже запаянному конец.
После этого пипетка сразу же погружается в жидкий азот не менее чем на 20 секунд, затем она перемещается в предварительно маркированную наружную соломину-кожух со смещенным центром тяжести, причем утяжеленный конец внешней соломины находится в жидком азоте, а противоположный конец находится над его поверхностью, через него осуществляется загрузка пипетки в соломину. После загрузки пипетки в наружную соломину последнюю запаивают ультразвуковым или термическим запаивателем, не вынимая из жидкого азота, причем так, чтобы верхний конец расположенной внутри пипетки с замораживаемыми объектами не был запаян вместе с наружной соломиной в одном шве.
Наружная соломина-кожух изготавливается из коммерчески доступной соломины для медленного замораживания гамет и эмбрионов объемом не менее 0,25 мл, содержащей с одного из концов хлопковую пробку. Металлический стержень, соответствующий по диаметру внутреннему диаметру соломины, длиной 1-1,5 см вводится в соломину со стороны конца, на котором находится хлопковая пробка, таким образом, чтобы стержень сместил пробку кнутри и наружным концом углублялся на не менее чем 5 мм внутрь соломины. После введения стержня производится запаивание соломины, чтобы герметизировать ее и препятствовать выпадению металлического стержня. Данный стержень смещает центр тяжести носителя и препятствует всплытию того конца его, ближе к которому находятся витрифицированные объекты, что является дополнительным фактором температурной стабильности хранения и защиты от девитрификации.
Размораживание объектов, хранящихся в представленном носителе, осуществляется следующим образом: наружная соломина-кожух вскрывается при помощи приспособления для очистки проводов от обмотки таким образом, чтобы была нарушена целостность внешней соломины и не нарушена целостность внутренней пипетки. При этом большая часть носителя находится в жидком азоте и возвышается над его поверхностью только минимально необходимая часть для вскрытия. Далее откушенный фрагмент наружной соломины снимается и внутренняя пипетка извлекается за широкий запаянный конец, после чего она немедленно помещается в водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия на 5-7 секунд. Затем пипетку обрабатывают 70% раствором этилового спирта и приступают к вскрытию с помощью острого лезвия либо стерильных острых ножниц. Частным случаем приспособления для вскрытия является бритвенное лезвие, фиксированное в хирургическом зажиме. Вскрытие осуществляется следующим образом: сначала отрезается запаянный конец пипетки с той ее стороны, где нет витрифицированных объектов, затем тотчас за местом запаивания отрезается конец, где находятся объекты. После вскрытия пипетки с обоих концов на широкий ее конец надевают грушу и, слегка надавливая на нее, выпускают объекты в раствор для размораживания. Далее порядок манипуляции с объектами соответствует инструкции к используемым растворам.
Таким образом, положительным результатом применения данного способа является уменьшение себестоимости носителя для витрификации и снижение расхода растворов для замораживания и размораживания, что в итоге выливается в уменьшение себестоимости всей процедуры. При этом обеспечивается стопроцентная извлекаемость объектов и высокая безопасность хранения за счет асептичности носителя.
Claims (1)
- Способ витрификации биологических объектов, включающий помещение витрифицируемых биологических объектов в гибкую поликарбонатную пипетку для переноса гамет, эмбрионов и кумулюсооцитарных комплексов диаметром 130-600 мкм и размораживание, отличающийся тем, что в пипетку набирают небольшой объем витрификационного раствора без биологических объектов, затем в пипетку набирают витрификационный раствор с биологическими объектами, после чего осуществляют добавление витрификационного раствора так, чтобы биологические объекты были размещены не менее чем 10 милиметров от дистального конца гибкой поликарбонатной пипетки, после чего производят запаивание дистального конца пипетки и проверку герметичности шва посредством стриппетора, далее осуществляют запаивание проксимального конца пипетки, затем пипетку погружают в жидкий азот на время, равное не менее 20 с, после чего ее упаковывают в соломину-кожух объемом не менее 0,25 мл, и содержащую для смещения центра тяжести носителя металлический стержень, размещенный у одного из концов соломины-кожуха, который предварительно герметично запаивают, после помещения пипетки в соломину-кожух последнюю запаивают, а размораживание объектов осуществляют путем вскрытия внешней соломины-кожуха на конце, противоположном тому, на котором находятся витрифицированные биологические объекты, так, чтобы не нарушить целостность внутренней гибкой поликарбонатной пипетки, пипетку вынимают и помещают в водяную баню 37°С, после чего ее последовательно вскрывают сначала с широкого, а затем с узкого конца, затем с помощью груши, надетой на широкий конец пипетки, витрифицированные биологические объекты выпускают в среду для размораживания.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2011110548/10A RU2460769C1 (ru) | 2011-03-22 | 2011-03-22 | Способ витрификации биологических объектов |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2011110548/10A RU2460769C1 (ru) | 2011-03-22 | 2011-03-22 | Способ витрификации биологических объектов |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2460769C1 true RU2460769C1 (ru) | 2012-09-10 |
Family
ID=46938920
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2011110548/10A RU2460769C1 (ru) | 2011-03-22 | 2011-03-22 | Способ витрификации биологических объектов |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2460769C1 (ru) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104255708A (zh) * | 2014-09-15 | 2015-01-07 | 上海交通大学 | 一种优化大花蕙兰类原球茎玻璃化超低温保存效果的方法 |
RU2584584C2 (ru) * | 2014-10-30 | 2016-05-20 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Центр экспериментальной эмбриологии и репродуктивных биотехнологий" (ФГБНУ ЦЭЭРБ) | Система и устройство (варианты) для криоконсервации группы ооцитов и эмбрионов млекопитающих по методу витрификации при использовании в качестве носителя полого волокна |
-
2011
- 2011-03-22 RU RU2011110548/10A patent/RU2460769C1/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Mitchel С.Schiew, «MicroSecure Vitrification (u-S-VTF) Procedure: Optimum simplicity, security, cost - savings and effectiveness combining FDS-approved products», The Journal of Clinical Embryology, Volume 13, Issue 2, p.33-40. V.Isachenko et al. Aseptic technology of vitrification of human pronucktar oocytes using open-pulled staws», Hum. Reprod. (Ftbruary 2005) 20(2), p.492-496. * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104255708A (zh) * | 2014-09-15 | 2015-01-07 | 上海交通大学 | 一种优化大花蕙兰类原球茎玻璃化超低温保存效果的方法 |
CN104255708B (zh) * | 2014-09-15 | 2016-04-06 | 上海交通大学 | 一种优化大花蕙兰类原球茎玻璃化超低温保存效果的方法 |
RU2584584C2 (ru) * | 2014-10-30 | 2016-05-20 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Центр экспериментальной эмбриологии и репродуктивных биотехнологий" (ФГБНУ ЦЭЭРБ) | Система и устройство (варианты) для криоконсервации группы ооцитов и эмбрионов млекопитающих по методу витрификации при использовании в качестве носителя полого волокна |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US10271543B2 (en) | Systems and methods for cryopreservation of cells | |
US8936905B2 (en) | Systems and methods for cryopreservation of cells | |
Almodin et al. | Embryo development and gestation using fresh and vitrified oocytes | |
JP5278978B2 (ja) | 動物の胚または卵子のガラス化保存用細管 | |
CA2656139C (en) | Systems and methods for cryopreservation of cells | |
EP2337449B1 (en) | Method and instrument for vitrification and storing of biological specimen | |
RU2460769C1 (ru) | Способ витрификации биологических объектов | |
JP2016067807A (ja) | ストロー管、並びに精液又は受精卵の凍結保存方法 | |
JP2007261973A (ja) | 胚のガラス化保存用具及びそれを用いた胚のガラス化保存方法 | |
JP2005040073A (ja) | 生殖細胞の凍結保存方法及び凍結保存容器 | |
CN106577632A (zh) | 一种人类卵巢组织液氮下冻存装置 | |
CN114071995B (zh) | 细胞或组织的冷冻保存用夹具 | |
JP6734524B2 (ja) | ガラス化した哺乳動物胚の保存および融解、希釈、移植用ストローとその使用方法 | |
VerMilyea et al. | Appendix D: Irvine Scientific® vitrification system | |
JP2021151209A (ja) | 凍結保存作業補助治具 | |
CA2647664C (en) | Systems and methods for cryopreservation of cells | |
WO2024085220A1 (ja) | ストロー管、ストロー、並びに精液又は受精卵の凍結保存方法 | |
Edgar et al. | Chapter 9 Slow Freezing and Thawing of Human Cleavage Stage Embryos | |
Tambwe et al. | Vitrification of human oocytes |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20140323 |