RU2459585C2 - Method of predicting risk of development of occupational bronchopulmonary pathology - Google Patents
Method of predicting risk of development of occupational bronchopulmonary pathology Download PDFInfo
- Publication number
- RU2459585C2 RU2459585C2 RU2010134590/14A RU2010134590A RU2459585C2 RU 2459585 C2 RU2459585 C2 RU 2459585C2 RU 2010134590/14 A RU2010134590/14 A RU 2010134590/14A RU 2010134590 A RU2010134590 A RU 2010134590A RU 2459585 C2 RU2459585 C2 RU 2459585C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- nucleotide sequence
- risk
- chain reaction
- pathology
- polymerase chain
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине и может быть использовано для прогнозирования риска развития профессиональной бронхолегочной патологии при воздействии на организм вредных производственных факторов.The invention relates to medicine and can be used to predict the risk of developing professional bronchopulmonary pathology when exposed to harmful production factors.
Известен способ прогнозирования риска развития бронхолегочной патологии, включающий забор венозной крови, выделение генетического материала, проведение полимеразной цепной реакции со специфическими праймерами, определение нуклеотидной последовательности на основании этого определение полиморфных вариантов гена (см. Веселовская М.В. Роль полиморфных вариантов генов-кандидатов хронической обструктивной болезни легких в особенностях течения заболевания автореферат. Автореферат диссертации к.м.н., Москва, 2007 г., с.11-12).There is a method for predicting the risk of developing bronchopulmonary pathology, including venous blood sampling, isolation of genetic material, polymerase chain reaction with specific primers, determination of the nucleotide sequence based on this determination of polymorphic variants of a gene (see Veselovskaya M.V. Role of polymorphic variants of chronic candidate genes obstructive pulmonary disease in the characteristics of the course of the disease abstract. Abstract of the dissertation Ph.D., Moscow, 2007, pp. 11-12).
Однако данный способ имеет низкую пропускную способность ввиду невысокой скорости проведения обследования пациентов, что затрудняет прогнозирование риска развития бронхолегочной патологии, например, при проведении диспансеризации или периодических медицинских осмотров большого количества работающих во вредных и/или опасных условиях труда за короткие (сжатые) сроки времени. Задачей настоящего изобретения является повышение достоверности прогнозирования риска развития профессиональной бронхолегочной патологии, например, при проведении диспансеризации или периодических медицинских осмотров большого количества работающих во вредных и/или опасных условиях труда за короткие (сжатые) сроки времени.However, this method has a low throughput due to the low speed of the examination of patients, which makes it difficult to predict the risk of developing bronchopulmonary pathology, for example, during medical examinations or periodic medical examinations of a large number of people working in harmful and / or dangerous working conditions for short (short) periods of time. The objective of the present invention is to increase the reliability of predicting the risk of developing professional bronchopulmonary pathology, for example, during medical examinations or periodic medical examinations of a large number of people working in harmful and / or dangerous working conditions for short (short) periods of time.
Техническим результатом изобретения является повышение скорости проведения прогнозирования риска развития профессиональной бронхолегочной патологии.The technical result of the invention is to increase the speed of predicting the risk of developing professional bronchopulmonary pathology.
Указанная задача достигается тем, что в известном способе прогнозирования риска развития профессиональной бронхолегочной патологии, включающем забор венозной крови, выделение генетического материала, проведение полимеразной цепной реакции со специфическими праймерами, определение нуклеотидной последовательности и на основании этого определение полиморфных вариантов гена матриксной металлопротеиназы 1 - полиморфизм 1607delG, при проведении полимеразной цепной реакции используют специфические праймеры MP1-F 138F BIOTIN - GCG ТСA AGA CTG ATA TCT TAC TCA TAA АСА ATA и MP1-R 138R АСА TgT TAT gCC ACT TAg ATg Agg AAA, а после проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) проводят реакцию пиросеквенирования в режиме реального времени с использованием специфического праймера MP1-S 138S gTA gTT AAA TAA TTA gAA Ag и детекцию нуклеотидной последовательности с помощью хемилюминисцентного сигнала, далее производят сравнение полученной нуклеотидной последовательности с референсными последовательностями и по полученной пирограмме определяют, какой вариант полиморфизма 1607delG имеет место в нуклеотидной последовательности, причем при выявлении отсутствия инсерций/делеций гуанина - прогнозируют риск развития профессиональной бронхолегочной патологии менее 20%, при воздействии на организм вредных производственных факторов, при выявлении гиперсекреторного гетерозиготного варианта 1G мутации в нуклеотидной последовательности прогнозируют риск развития профессиональной бронхолегочной патологии (30÷50)%, при воздействии на организм вредных производственных факторов, а при выявлении гиперсекреторного гомозиготного варианта 2G мутации в нуклеотидной последовательности, прогнозируют риск развития профессиональной бронхолегочной патологии (60÷80)%, при воздействии на организм вредных производственных факторов.This task is achieved by the fact that in the known method for predicting the risk of developing professional bronchopulmonary pathology, including venous blood sampling, isolation of genetic material, polymerase chain reaction with specific primers, determination of the nucleotide sequence and based on this determination of polymorphic variants of the matrix metalloproteinase 1 gene - 1607delG polymorphism , when carrying out the polymerase chain reaction using specific primers MP1-F 138F BIOTIN - GCG TCA AGA CTG ATA TCT TAC TCA TAA CA ATA and MP1-R 138R ACA TgT TAT gCC ACT TAg ATg Agg AAA, and after polymerase chain reaction (PCR), a real-time pyrosequencing reaction is carried out using a specific primer MP1-S 138S gTA gTT AAA TAA TTA gAA Ag and detection nucleotide sequence using a chemiluminescent signal, then the obtained nucleotide sequence is compared with reference sequences and the resulting pyrogram determines which version of 1607delG polymorphism occurs in the nucleotide sequence, and the absence of guanine insertions / deletions - they predict a risk of developing professional bronchopulmonary pathology of less than 20%, when exposed to harmful production factors, when hypersecretory heterozygous variant 1G is detected, mutations in the nucleotide sequence predict a risk of developing professional bronchopulmonary pathology (30 ÷ 50)%, when exposed harmful production factors, and when a hypersecretory homozygous variant 2G mutation in the nucleotide sequence is detected, predicting the risk of developing professional bronchopulmonary pathology (60 ÷ 80)%, when exposed to harmful production factors on the body.
Проведенные исследования по патентным и научно-техническим информационным источникам показали, что предлагаемый способ неизвестен и не следует явным образом из изученного уровня техники, т.е. соответствует критериям "новизна" и "изобретательский уровень".Studies on patent and scientific and technical information sources have shown that the proposed method is unknown and does not follow explicitly from the studied prior art, i.e. meets the criteria of "novelty" and "inventive step".
Предлагаемый способ может быть применен в клинических, биохимических, молекулярно-генетических лабораториях, укомплектованных оборудованием, выпускаемым отечественной или зарубежной промышленностью.The proposed method can be applied in clinical, biochemical, molecular genetic laboratories equipped with equipment manufactured by domestic or foreign industry.
Следовательно, заявленный способ является доступным, и, следовательно, практически применимым.Therefore, the claimed method is affordable, and, therefore, practically applicable.
Таким образом, предложена совокупность приемов, позволяющих обеспечить повышение скорости проведения прогнозирования риска развития профессиональной бронхолегочной патологии при воздействии на организм вредных производственных факторов, что, в свою очередь, повышает достоверность прогнозирования риска развития профессиональной бронхолегочной патологии, например, при проведении диспансеризации или периодических медицинских осмотров большого количества работающих во вредных и/или опасных условиях труда за короткие (сжатые) сроки времениThus, a set of techniques has been proposed to increase the rate of predicting the risk of developing professional bronchopulmonary pathology when exposed to harmful production factors, which, in turn, increases the reliability of predicting the risk of developing professional bronchopulmonary pathology, for example, during medical examinations or periodic medical examinations a large number of workers in harmful and / or hazardous working conditions for short (tight) periods time
На фиг.1 изображена пирограмма с вариантом гомозиготного генотипа по определяемому аллельному варианту не имеющему инсерций/делеций гуанина G/G в нуклеотидной последовательности - соответствует норме (пример 1). На фиг.2 изображена пирограмма с вариантом гетерозиготного генотипа по определяемому аллельному варианту, имеющему инсерцию гуанина G/-(1G) (пример 2). На фиг.3 изображена пирограмма с вариантом гомозиготного генотипа по определяемому аллельному варианту, имеющему делецию гуанина в исследуемой области гена -/-(2G) (пример 3).Figure 1 shows a pyrogram with a variant of the homozygous genotype according to the determined allelic variant without insertions / deletions of guanine G / G in the nucleotide sequence - corresponds to the norm (example 1). Figure 2 shows a pyrogram with a variant of the heterozygous genotype for a defined allelic variant having an insertion of guanine G / - (1G) (example 2). Figure 3 shows a pyrogram with a variant of the homozygous genotype for a determined allelic variant having a deletion of guanine in the studied region of the gene - / - (2G) (example 3).
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.The proposed method is as follows.
Предлагаемый способ основан на исследовании комплекса диагностических тестов.The proposed method is based on the study of a set of diagnostic tests.
У пациентов осуществляют забор венозной крови. Кровь исследуют заявленным образом: из 100 мкл цельной крови выделяют ДНК- сорбент однопробирочным методом с использованием комплекта для выделения "ДНК-сорб-В"(ТУ9398-071-01897593-2008), в соответствии с инструкцией к используемому комплекту.Venous blood sampling is performed in patients. Blood is examined in the claimed way: from 100 μl of whole blood, the DNA sorbent is isolated by a single-tube method using the DNA-sorb-B isolation kit (TU9398-071-01897593-2008), in accordance with the instructions for the kit used.
Из полученного препарата ДНК (объемом 50 мкл) готовят серии разведений в ТЕ-буфере до конечной концентрации 1-3 нг/мкл, добавляют 10 мг конечного раствора ДНК в пробирку для осуществления полимеразной цепной реакции со специфическими праймерами.From the obtained DNA preparation (50 μl), a series of dilutions is prepared in TE buffer to a final concentration of 1-3 ng / μl, 10 mg of the final DNA solution is added to the tube for polymerase chain reaction with specific primers.
Объем Полимерной цепной реакции - 25 мкл, при этом используют реагенты производства ЦНИИ Эпидемиологии: «ПЦР-смесь-2-blue», смесь десоксинуклеотидтрифосфатов «dNTPs (T)», «Воск для ПЦР», «Минеральное масло для ПЦР». Для амплификации исследуемого генетического локуса используют специфические олигонуклеотидные праймеры «MP1-F» и «MP1-R», один из которых мечен биотином. Количество праймеров «MP1-F» и «MP1-R» в полимеразной цепной реакции - 10 пмоль.The volume of the Polymer Chain Reaction is 25 μl, using reagents manufactured by the Central Research Institute of Epidemiology: PCR-2-blue PCB, dNTPs (T) desoxynucleotide triphosphates, PCR Wax, and PCR Mineral Oil. To amplify the studied genetic locus, specific oligonucleotide primers MP1-F and MP1-R are used, one of which is labeled with biotin. The number of primers "MP1-F" and "MP1-R" in the polymerase chain reaction is 10 pmol.
Реакцию амплификации проводят по следующей программе с использованием приборов: «Терцик» - температура достигнет 95° (режим паузы), ставят пробирки в ячейки амплификатора и продолжают программу: 95° - 5 мин; далее 45 циклов 95° - 10 с, 65° - 10 с, 72° - 10 с, в конце 72° - 2 мин; или «Gradient Palm Cyclen» («MAXYGEN»), «GeneAmp PCR System 2700», «PalmCyclen» температура достигнет 95° (режим паузы), ставят пробирки в ячейки амплификатора и продолжают программу: 95°- 5 мин; далее 45 циклов 95° - 15 с, 65° - 15 с, 72° - 20 с, в конце 95° - 2 мин.The amplification reaction is carried out according to the following program using instruments: “Tertsik” - the temperature reaches 95 ° (pause mode), put the tubes in the cells of the amplifier and continue the program: 95 ° - 5 min; then 45 cycles of 95 ° - 10 s, 65 ° - 10 s, 72 ° - 10 s, at the end of 72 ° - 2 min; or “Gradient Palm Cyclen” (“MAXYGEN”), “GeneAmp PCR System 2700”, “PalmCyclen” the temperature reaches 95 ° (pause mode), put the tubes in the amplifier cells and continue the program: 95 ° - 5 min; then 45 cycles 95 ° - 15 s, 65 ° - 15 s, 72 ° - 20 s, at the end of 95 ° - 2 minutes.
После проведения амплификации осуществляют пробоподготовку образцов для секвенирования. После амплификации ПЦР-фрагмент связывается с частицами сефарозы, покрытыми стрептавидином, за счет образования комплекса биотин-стрептавидин, очищается от свободных компонентов реакционной смеси с помощью серии отмывок и проходит стадию щелочной денатурации. В результате остается амплифицированный с биотинилированного праймера одноцепочечный ПЦР-фрагмент, который используют в качестве матрицы в реакции секвенирующего синтеза.After amplification, samples are prepared for sequencing. After amplification, the PCR fragment binds to streptavidin-coated sepharose particles due to the formation of a biotin-streptavidin complex, is purified from the free components of the reaction mixture by a series of washes, and goes through an alkaline denaturation step. As a result, a single-chain PCR fragment amplified from the biotinylated primer remains, which is used as a matrix in the sequencing synthesis reaction.
На одноцепочечный ПЦР-ампликлон, выступающий в качестве матрицы, гибридизуется секвенирующий праймер «MP1-S» в концентрации 0,3 пМ, разведенный в буфере для отжига.The MP1-S sequencing primer at a concentration of 0.3 pM diluted in the annealing buffer hybridizes to a single-chain PCR amplicon acting as a template.
После проведения полимеразной цепной реакции проводят реакцию пиросеквенирования в режиме реального времени с использованием специфического праймера MP1-S 138S gTA gTT AAA TAA TTA gAA Ag и детекцию нуклеотидной последовательности с помощью хемилюминисцентного сигнала.After carrying out the polymerase chain reaction, a real-time pyrosequencing reaction is carried out using a specific primer MP1-S 138S gTA gTT AAA TAA TTA gAA Ag and nucleotide sequence detection using a chemiluminescent signal.
С помощью прибора пиросеквенатора, например, «PyroMаrk Q96 MD» или «PyroMаrk Q24» (Германия), проводят пиросеквенирование (фиг.1).Using a pyrosequencer device, for example, PyroMark Q96 MD or PyroMark Q24 (Germany), pyrosequencing is carried out (Fig. 1).
Принципиальная схема метода представлена на фиг.2.A schematic diagram of the method is presented in figure 2.
На данной стадии в ходе секвенирования комплементарной к матричному фрагменту цепи высвобождающийся пирофосфат проходит серию ферментативных превращений, в результате чего регистрируется хемилюминесцентный сигнал (фиг.3). Проводят инкубацию исследуемого иммобилизированного фрагмента ДНК в присутствии четырех ферментов (сульфурилазы, люциферазы, апиразы, Taq-полимеразы) и субстратов (аденозин-5-фосфосульфата (APS) и люцеферина) для преобразования высвобождающегося пирофосфата в хемилюминисцентный сигнал. Реакция пиросеквенирования включает следующие стадии:At this stage, during sequencing of the chain complementary to the matrix fragment, the released pyrophosphate undergoes a series of enzymatic transformations, as a result of which a chemiluminescent signal is recorded (Fig. 3). The immobilized DNA fragment under study was incubated in the presence of four enzymes (sulfurylase, luciferase, apyrase, Taq polymerase) and substrates (adenosine 5-phosphosulfate (APS) and luciferin) to convert the released pyrophosphate into a chemiluminescent signal. The pyrosequencing reaction includes the following steps:
- Добавляют один из четырех дезоксинуклеотид-3-фосфатов (dNTP) в реакционную смесь. В том случае, если добавленный нуклеотид комплементарен матричной цепи ДНК, происходит встраивание в растущую цепь, катализируемое ферментом ДНК-полимеразой. Каждый акт включения нуклеотида в цепь ДНК сопровождается высвобождением пирофосфата (PPi) в эквимолярном количестве.- Add one of four deoxynucleotide-3-phosphates (dNTP) to the reaction mixture. In the event that the added nucleotide is complementary to the DNA template strand, insertion into the growing strand catalyzed by the DNA polymerase enzyme takes place. Each act of incorporation of a nucleotide into a DNA strand is accompanied by the release of pyrophosphate (PPi) in an equimolar amount.
- Фермент сульфурилаза катализирует процесс образования молекулы АТФ-аденозин 3 фосфат из высвободившегося пирофосфата и присутствующего в реакционной смеси аденозин-5-фосфосульфата (APS).- The enzyme sulfurylase catalyzes the formation of the ATP-adenosine 3 phosphate molecule from the released pyrophosphate and adenosine 5-phosphosulfate (APS) present in the reaction mixture.
- Созданная молекула АТФ-аденозин-3-фосфат (АТР) запускает процесс превращения люциферина в оксилюциферин, катализируемого ферментом люциферазой, в результате чего генерируется хемилюминесцентный сигнал, величина которого пропорциональна количеству АТР.- The created molecule ATP-adenosine-3-phosphate (ATP) starts the process of converting luciferin to oxyluciferin catalyzed by the enzyme luciferase, resulting in a chemiluminescent signal that is proportional to the amount of ATP.
- Хемилюминисцентный сигнал регистрируют CCD-камерой, он отображается в виде пика на пирограмме. В течение всей реакции фермент апираза деградирует невстроившиеся нуклеотиды и избыток АТР таким образом, что новый нуклеотид добавляется в цепь ДНК только при полной деградации не встроившихся дезоксинуклеотид-3-фосфатов. Последовательное добавление dNTP обеспечивает появление пиков на пирограмме, составляющих нуклеотидную последовательность исследуемого генетического локуса (фиг.3).- The chemiluminescent signal is recorded by a CCD camera, it is displayed as a peak on the pyrogram. Throughout the reaction, the apyrase enzyme degrades the non-integrated nucleotides and excess ATP so that the new nucleotide is added to the DNA chain only when the non-integrated deoxynucleotide-3-phosphates are completely degraded. The sequential addition of dNTP ensures the appearance of peaks in the pyrogram constituting the nucleotide sequence of the studied genetic locus (figure 3).
Далее проводят сравнение полученной нуклеотидной последовательности с референсными последовательностями и по полученной пирограмме определяют какой вариант мутации имеет место в нуклеотидной последовательности.Next, a comparison is made of the obtained nucleotide sequence with reference sequences and the resulting pyrogram determines which variant of the mutation takes place in the nucleotide sequence.
При воздействии на организм вредных производственных факторов и выявлении отсутствия инсерций/делеций гуанина - прогнозируют риск развития профессиональной бронхолегочной патологии менее 20%, при воздействии на организм вредных производственных факторов, при выявлении гиперсекреторного гетерозиготного варианта 1G мутации в нуклеотидной последовательности прогнозируют риск развития профессиональной бронхолегочной патологии (30÷50)%, при воздействии на организм вредных производственных факторов, а при выявлении гиперсекреторного гомозиготного варианта 2G мутации в нуклеотидной последовательности, прогнозируют риск развития профессиональной бронхолегочной патологии (60÷80)%, при воздействии на организм вредных производственных факторов.When exposed to harmful production factors and the absence of guanine insertions / deletions, the risk of developing a professional bronchopulmonary pathology is predicted to be less than 20%, when exposed to harmful production factors, when a hypersecretory heterozygous variant 1G is detected, mutations in the nucleotide sequence predict a risk of developing professional bronchopulmonary pathology ( 30 ÷ 50)%, when exposed to harmful production factors, and when hypersecretory homo is detected zygotic variant 2G mutations in the nucleotide sequence, predict the risk of developing professional bronchopulmonary pathology (60 ÷ 80)%, when exposed to harmful production factors on the body.
Пример 1. Больной В., 52 годаExample 1. Patient C., 52 years old
Кровь исследовали заявленным образом: из 100 мкл цельной крови выделяли суммарную ДНК однопробирочным методом с использованием комплекта для выделения "ДНК-сорб-В" (ТУ9398-071-01897593-2008), в соответствии с инструкцией к используемому комплекту.Blood was examined in the claimed way: from 100 μl of whole blood the total DNA was isolated by a single-tube method using the DNA-sorb-B isolation kit (TU9398-071-01897593-2008), in accordance with the instructions for the kit used.
Из полученного препарата ДНК (объемом 50 мкл) готовили серии разведений в ТЕ-буфере до конечной концентрации 1-3 нг/мкл, добавляли 10 мг конечного раствора ДНК в пробирку для полимеразной цепной реакции. Объем Полимерной цепной реакции - 25 мкл, использовали реагенты производства ЦНИИ Эпидемиологии: «ПЦР-смесь-2-blue», смесь десоксинуклеотидтрифосфатов «dNTPs (T)», «Воск для ПЦР», «Минеральное масло для ПЦР». Для амплификации исследуемого генетического локуса использовали специфические олигонуклеотидные праймеры «MP1-F» и «МР1-R», один из которых мечен биотином. Количество праймеров «MP1-F» и «MP1-R» в полимеразной цепной реакции - 10 пмоль.From the obtained DNA preparation (50 μl), a series of dilutions was prepared in TE buffer to a final concentration of 1-3 ng / μl, 10 mg of the final DNA solution was added to the tube for polymerase chain reaction. The volume of the Polymer Chain Reaction was 25 μl; reagents manufactured by the Central Research Institute of Epidemiology were used: PCR-mixture-2-blue, mixture of desoxynucleotide triphosphates dNTPs (T), Wax for PCR, and Mineral oil for PCR. To amplify the studied genetic locus, specific oligonucleotide primers MP1-F and MP1-R were used, one of which was labeled with biotin. The number of primers "MP1-F" and "MP1-R" in the polymerase chain reaction is 10 pmol.
Реакцию амплификации проводят по следующей программе с использованием приборов: «Терцик» - температура достигнет 95° (режим паузы), ставят пробирки в ячейки амплификатора и продолжают программу: 95° - 5 мин; далее 45 циклов 95° - 10 с, 65° - 10 с, 72° - 10 с, в конце 72° - 2 мин; или «Gradient Palm Cycler» («MAXYGEN»), «GeneAmp PCR System 2700», «PalmCycler» температура достигнет 95° (режим паузы), ставят пробирки в ячейки амплификатора и продолжают программу: 95° - 5 мин; далее 45 циклов 95° - 15 с, 65° - 15 с, 72° - 20 с, в конце 95° - 2 мин.The amplification reaction is carried out according to the following program using instruments: “Tertsik” - the temperature reaches 95 ° (pause mode), put the tubes in the cells of the amplifier and continue the program: 95 ° - 5 min; then 45 cycles of 95 ° - 10 s, 65 ° - 10 s, 72 ° - 10 s, at the end of 72 ° - 2 min; or “Gradient Palm Cycler” (“MAXYGEN”), “GeneAmp PCR System 2700”, “PalmCycler” temperature reaches 95 ° (pause mode), put the tubes in the cells of the amplifier and continue the program: 95 ° - 5 min; then 45 cycles 95 ° - 15 s, 65 ° - 15 s, 72 ° - 20 s, at the end of 95 ° - 2 minutes.
После проведения амплификации осуществляли пробоподготовку образцов для секвенирования. Для пиросеквенирования использовали приборы и станцию для пробоподготовки фирмы «Qiagen», Германия.After amplification, samples were prepared for sequencing. For pyrosequencing, we used instruments and a sample preparation station from Qiagen, Germany.
Проводили отжиг секвенирующего праймера, далее пробы подвергали пиросеквенированию на приборе «PyroMark Q96 MD» (Германия).The sequencing primer was annealed, then the samples were pyrosequenced using a PyroMark Q96 MD instrument (Germany).
При анализе результатов был выявлен гомозиготный вариант полиморфизма 1607delG, не имеющий инсерций/делеций гуанина G/G - соответствует нормальному содержанию фермента ММП-1 (фиг.1).When analyzing the results, a homozygous variant of 1607delG polymorphism was revealed that does not have the insertions / deletions of guanine G / G - which corresponds to the normal content of the MMP-1 enzyme (Fig. 1).
При анализе анамнеза и проф. маршрута пациента было выявлено, что больной В. работал газорезчиком, а течение 22 лет на предприятии асбестоцементных изделий, подвергаясь воздействию асбестоцементной пыли (величина пылевой нагрузки - менее 100 грамм за весь период работы), неблагоприятных микроклиматических условий, труд был связан с физическим напряжением. По результатам обследования был поставлен диагноз нейроциркуляторная дистония по гипертоническому типу.In the analysis of history and prof. It was revealed that patient V. worked as a gas cutter, and for 22 years at the enterprise of asbestos-cement products, exposed to asbestos-cement dust (dust load - less than 100 grams for the entire period of work), adverse microclimatic conditions, work was associated with physical stress. According to the results of the examination, the diagnosis of neurocirculatory dystonia of the hypertonic type was made.
По данным биохимических исследований: нормальное содержания про-ММП-1 и нейтрофильной эластазы, повышение ТИМП-1.According to biochemical studies: the normal content of pro-MMP-1 and neutrophilic elastase, increased TIMP-1.
Вывод: у больного В. был выявлен гомозиготный вариант полиморфизма 1607delG, не имеющий инсерций/делеций гуанина G/G - соответствует нормальному содержанию фермента ММП-1. Профессиональной бронхолегочной патологии не наблюдается. Риск развития профессиональной бронхолегочной патологии - менее 20%.Conclusion: in patient B., a homozygous variant of 1607delG polymorphism was revealed that does not have the insertions / deletions of guanine G / G - corresponds to the normal content of the MMP-1 enzyme. Professional bronchopulmonary pathology is not observed. The risk of developing professional bronchopulmonary pathology is less than 20%.
Пример 2. Больной И., 42Example 2. Patient I., 42
Кровь исследовали заявленным образом: из 100 мкл цельной крови выделяли суммарную ДНК однопробирочным методом с использованием комплекта для выделения "ДНК-сорб-В"(ТУ9398-071-01897593-2008), в соответствии с инструкцией к используемому комплекту.Blood was examined in the claimed way: from 100 μl of whole blood the total DNA was isolated by a single-tube method using the DNA-sorb-B isolation kit (TU9398-071-01897593-2008), in accordance with the instructions for the kit used.
Из полученного препарата ДНК (объемом 50 мкл) готовили серии разведений в ТЕ-буфере до конечной концентрации 1-3 нг/мкл, добавляли 10 мг конечного раствора ДНК в пробирку для полимеразной цепной реакции. Объем полимерной цепной реакции - 25 мкл, использовали реагенты производства ЦНИИ Эпидемиологии: «ПЦР-смесь-2-blue», смесь десоксинуклеотидтрифосфатов «dNTPs (T)», «Воск для ПЦР», «Минеральное масло для ПЦР». Для амплификации исследуемого генетического локуса использовали специфические олигонуклеотидные праймеры «MP1-F» и «МР1-R», один из которых мечен биотином. Количество праймеров «MP1-F» и «MP1-R» в полимеразной цепной реакции - 10 пмоль.From the obtained DNA preparation (50 μl), a series of dilutions was prepared in TE buffer to a final concentration of 1-3 ng / μl, 10 mg of the final DNA solution was added to the tube for polymerase chain reaction. The volume of the polymer chain reaction was 25 μl; reagents manufactured by the Central Research Institute of Epidemiology were used: PCR-mixture-2-blue, a mixture of desnoxynucleotide triphosphates dNTPs (T), Wax for PCR, and Mineral oil for PCR. To amplify the studied genetic locus, specific oligonucleotide primers MP1-F and MP1-R were used, one of which was labeled with biotin. The number of primers "MP1-F" and "MP1-R" in the polymerase chain reaction is 10 pmol.
Реакцию амплификации проводят по следующей программе с использованием приборов: «Терцик» - температура достигнет 95° (режим паузы), ставят пробирки в ячейки амплификатора и продолжают программу: 95° - 5 мин; далее 45 циклов 95° - 10 с, 65° - 10 с, 72° - 10 с, в конце 72° - 2 мин; или «Gradient Palm Cycler» («MAXYGEN»), «GeneAmp PCR System 2700», «PalmCycler» температура достигнет 95° (режим паузы), ставят пробирки в ячейки амплификатора и продолжают программу: 95° - 5 мин; далее 45 циклов 95° - 15 с, 65° - 15 с, 72° - 20 с, в конце 95° - 2 мин.The amplification reaction is carried out according to the following program using instruments: “Tertsik” - the temperature reaches 95 ° (pause mode), put the tubes in the cells of the amplifier and continue the program: 95 ° - 5 min; then 45 cycles of 95 ° - 10 s, 65 ° - 10 s, 72 ° - 10 s, at the end of 72 ° - 2 min; or “Gradient Palm Cycler” (“MAXYGEN”), “GeneAmp PCR System 2700”, “PalmCycler” temperature reaches 95 ° (pause mode), put the tubes in the cells of the amplifier and continue the program: 95 ° - 5 min; then 45 cycles 95 ° - 15 s, 65 ° - 15 s, 72 ° - 20 s, at the end of 95 ° - 2 minutes.
После проведения амплификации осуществляли пробоподготовку образцов для секвенирования. Для пиросеквенирования использовали приборы и станцию для пробоподготовки фирмы «Qiagen», Германия.After amplification, samples were prepared for sequencing. For pyrosequencing, we used instruments and a sample preparation station from Qiagen, Germany.
Проводили отжиг секвенирующего праймера, далее пробы подвергали пиросеквенированию на приборе «PyroMark Q96 MD».The sequencing primer was annealed, then the samples were pyrosequenced using a PyroMark Q96 MD instrument.
При анализе результатов был выявлен гетерозиготный вариант полиморфизма 1607delG, имеющий инерцию гуанина G/-(1G) (фиг.2).When analyzing the results, a heterozygous variant of 1607delG polymorphism was found to have inertia guanine G / - (1G) (Fig. 2).
При анализе анамнеза и профмаршрута пациента было выявлено, что больной И. в течение 8 лет работал на Тульском заводе точного машиностроения формовщиком и заливщиком металла в контакте с повышенными концентрациями кварцсодержащей пыли; в течение 4 лет - котлочистом в контакте с повышенными концентрациями угольной пыли. Через 7 лет после начала работы был поставлен диагноз пневмокониоз. При обследовании в НИИ МТ РАМН диагноз был подтвержден и уточнен: Силикоз. Эмфизема легких. Очаговый туберкулез легких.When analyzing the patient’s history and professional route, it was revealed that patient I. worked for 8 years at the Tula Precision Mechanical Engineering Plant as a shaper and grinder in contact with elevated concentrations of quartz-containing dust; for 4 years - with a clean boiler in contact with elevated concentrations of coal dust. 7 years after the start of work, pneumoconiosis was diagnosed. When examined at the Research Institute of MT RAMS, the diagnosis was confirmed and specified: Silicosis. Emphysema. Focal pulmonary tuberculosis.
По данным биохимических исследований: снижение содержания про-ММП-1 и повышение содержания ММП-2,8; нейтрофильной эластазы и ТИМП-1According to biochemical studies: a decrease in the content of pro-MMP-1 and an increase in the content of MMP-2.8; neutrophilic elastase and TIMP-1
Вывод: у больного И. был выявлен гетерозиготный вариант полиморфизма 1607delG, имеющий инерцию гуанина G/-(1G), свидетельствующий о повышении уровней фермента, что и явилось причиной развития профессионального бронхолегочного заболевания, при воздействии вредных производственных факторов.Conclusion: Patient I. was found to have a heterozygous variant of 1607delG polymorphism with inertia of guanine G / - (1G), indicating an increase in enzyme levels, which was the reason for the development of occupational bronchopulmonary disease when exposed to harmful production factors.
Пример 3. Больной Н., 65 летExample 3. Patient N., 65 years old
Кровь исследовали заявленным образом: из 100 мкл цельной крови выделяли суммарную ДНК однопробирочным методом с использованием комплекта для выделения "ДНК-сорб-В"(ТУ9398-071-01897593-2008), в соответствии с инструкцией к используемому комплекту.Blood was examined in the claimed way: from 100 μl of whole blood the total DNA was isolated by a single-tube method using the DNA-sorb-B isolation kit (TU9398-071-01897593-2008), in accordance with the instructions for the kit used.
Из полученного препарата ДНК (объемом 50 мкл) готовили серии разведений в ТЕ-буфере до конечной концентрации 1-3 нг/мкл, добавляли 10 мг конечного раствора ДНК в пробирку для полимеразной цепной реакции. Объем Полимерной цепной реакции - 25 мкл, использовали реагенты производства ЦНИИ Эпидемиологии: «ПЦР-смесь-2-blue», смесь десоксинуклеотидтрифосфатов «dNTPs (T)», «Воск для ПЦР», «Минеральное масло для ПЦР». Для амплификации исследуемого генетического локуса использовали специфические олигонуклеотидные праймеры «MP1-F» и «МР1-R», один из которых мечен биотином. Количество праймеров «MP1-F» и «MP1-R» в полимеразной цепной реакции - 10 пмоль.From the obtained DNA preparation (50 μl), a series of dilutions was prepared in TE buffer to a final concentration of 1-3 ng / μl, 10 mg of the final DNA solution was added to the tube for polymerase chain reaction. The volume of the Polymer Chain Reaction was 25 μl; reagents manufactured by the Central Research Institute of Epidemiology were used: PCR-mixture-2-blue, mixture of desoxynucleotide triphosphates dNTPs (T), Wax for PCR, and Mineral oil for PCR. To amplify the studied genetic locus, specific oligonucleotide primers MP1-F and MP1-R were used, one of which was labeled with biotin. The number of primers "MP1-F" and "MP1-R" in the polymerase chain reaction is 10 pmol.
Реакцию амплификации проводят по следующей программе с использованием приборов: «Терцик» - температура достигнет 95° (режим паузы), ставят пробирки в ячейки амплификатора и продолжают программу: 95° - 5 мин; далее 45 циклов 95° - 10 с, 65° - 10 с, 72° - 10 с, в конце 72° - 2 мин; или «Gradient Palm Cycler» («MAXYGEN»), «GeneAmp PCR System 2700», «PalmCycler» температура достигнет 95° (режим паузы), ставят пробирки в ячейки амплификатора и продолжают программу: 95° - 5 мин; далее 45 циклов 95° - 15 с, 65° - 15 с, 72° - 20 с, в конце 95° - 2 мин.The amplification reaction is carried out according to the following program using instruments: “Tertsik” - the temperature reaches 95 ° (pause mode), put the tubes in the cells of the amplifier and continue the program: 95 ° - 5 min; then 45 cycles of 95 ° - 10 s, 65 ° - 10 s, 72 ° - 10 s, at the end of 72 ° - 2 min; or “Gradient Palm Cycler” (“MAXYGEN”), “GeneAmp PCR System 2700”, “PalmCycler” temperature reaches 95 ° (pause mode), put the tubes in the cells of the amplifier and continue the program: 95 ° - 5 min; then 45 cycles 95 ° - 15 s, 65 ° - 15 s, 72 ° - 20 s, at the end of 95 ° - 2 minutes.
После проведения амплификации осуществляли пробоподготовку образцов для секвенирования. Для пиросеквенирования использовали приборы и станцию для пробоподготовки фирмы «Qiagen», Германия.After amplification, samples were prepared for sequencing. For pyrosequencing, we used instruments and a sample preparation station from Qiagen, Germany.
Проводили отжиг секвенирующего праймера, далее пробы подвергали пиросеквенированию (на приборах «РyrоMark Q96 MD» или «PyroMark Q24», германия).The sequencing primer was annealed, then the samples were subjected to pyrosequencing (PyroMark Q96 MD or PyroMark Q24 devices, Germany).
При анализе результатов выявлен гомозиготный вариант полиморфизма 1607delG, имеющий делецию гуанина в исследуемой области гена -/- (2G) (фиг.3).When analyzing the results revealed a homozygous variant of 1607delG polymorphism having a deletion of guanine in the studied region of the gene - / - (2G) (figure 3).
При анализе анамнеза и профессионального маршрута пациента было выявлено, что больной Н. 2 года работал в литейном цехе АМО «ЗИЛ» заливщиком металла, 4 года - вагранщиком в литейном цехе АМО «ЗИЛ», 11 лет - вагранщиком в литейном цехе АМО «ЗИЛ», подвергаясь воздействию кварцсодержащей пыли, превышающей ПДК (2 мг/м3) 6,0 мг/м3 - 25,4 мг/м3; оксида углерода, в концентрациях, превышающих ПДК (20 мг/м3) до 34,63 мг/ м3 - 100 мг/м3; производственного шума; неблагоприятных микроклиматических условий. Через 1 год после начала работы в легких впервые были выявлены изменения, характер которых уточнен не был, больной продолжал работать. Через 15 лет после этого больного стала беспокоить одышка при ранее переносимой физической нагрузке, еще раньше появился сухой кашель, затем стала отделяться скудная мокрота, однако больной не придавал этому значения, к врачам обращался редко. С 1983 г. наблюдается по месту работы с диагнозом: Хронический бронхит. При детальном обследовании в клинике ГУ НИИ МТ РАМН был диагностирован пылевой бронхит 1 ст. Ретенционная киста правого легкого. ДН-1 ст, с 1991 г. является инвалидом 2 профессиональной группы. При повторных обследованиях в клинике (ежегодно с 1994 г.) было выявлено дальнейшее прогрессирование легочного процесса (за счет инфекционного компонента) в виде появления регионарного пневмосклероза нижней доли справа, бронхоэктазий, эмфиземы легких, нарастания дыхательной недостаточности и гипоксемии.When analyzing the patient’s medical history and professional route, it was revealed that patient N. worked for 2 years in the casting shop of AMO ZIL, 4 years as a cupola worker in the foundry of AMO ZIL, 11 years as a cupola worker in the foundry of AMO ZIL exposed to quartz-containing dust in excess of the MPC (2 mg / m 3 ) 6.0 mg / m 3 - 25.4 mg / m 3 ; carbon monoxide, in concentrations exceeding the MAC (20 mg / m 3 ) up to 34.63 mg / m 3 - 100 mg / m 3 ; production noise; adverse microclimatic conditions. 1 year after the start of work in the lungs, changes were first detected, the nature of which was not specified, the patient continued to work. Fifteen years after this, the patient became disturbed by shortness of breath with previously tolerated physical exertion, even earlier a dry cough appeared, then sputum began to separate, but the patient did not attach any importance to this, he rarely consulted doctors. Since 1983, it has been observed at the place of work with a diagnosis of Chronic bronchitis. With a detailed examination in the clinic of the Research Institute of MT MT RAMS, dust bronchitis of 1 st. Retention cyst of the right lung. DN-1 st, since 1991 is an invalid of 2 professional groups. Repeated examinations in the clinic (annually since 1994) revealed further progression of the pulmonary process (due to the infectious component) in the form of regional pneumosclerosis of the lower lobe on the right, bronchiectasis, emphysema, increased respiratory failure and hypoxemia.
По данным биохимических исследований: снижение содержания про-ММП-1, а также повышение нейтрофильной эластазы и ТИМП-1.According to biochemical studies: a decrease in the content of pro-MMP-1, as well as an increase in neutrophilic elastase and TIMP-1.
Вывод: у больного И. был выявлен гомозиготный вариант полиморфизма 1607delG, имеющий делецию гуанина в исследуемой области гена -/- (2G), свидетельствующий о повышении уровней фермента, что и явилось причиной развития профессионального бронхолегочного заболевания при воздействии вредных производственных факторов.Conclusion: in patient I., a homozygous variant of 1607delG polymorphism was detected, having a deletion of guanine in the studied region of the - / - (2G) gene, indicating an increase in enzyme levels, which was the reason for the development of professional bronchopulmonary disease when exposed to harmful production factors.
Предлагаемый способ прогнозирования риска развития профессиональной бронхолегочной патологии позволяет повысить скорость проведения прогнозирования риска развития профессиональной бронхолегочной патологии, что, в свою очередь, повышает достоверность прогнозирования риска развития профессиональной бронхолегочной патологии, например, при проведении диспансеризации или периодических медицинских осмотров большого количества работающих во вредных и/или опасных условиях труда за короткие (сжатые) сроки времени. Он может быть применен в клинических, биохимических, молекулярно-генетических лабораториях, укомплектованных оборудованием, выпускаемым отечественной или зарубежной промышленностью.The proposed method for predicting the risk of developing professional bronchopulmonary pathology can increase the rate of predicting the risk of developing professional bronchopulmonary pathology, which, in turn, increases the reliability of predicting the risk of developing professional bronchopulmonary pathology, for example, during medical examinations or periodic medical examinations of a large number of people working in harmful and / or hazardous working conditions for short (short) periods of time. It can be used in clinical, biochemical, molecular genetic laboratories equipped with equipment manufactured by domestic or foreign industry.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010134590/14A RU2459585C2 (en) | 2010-08-19 | 2010-08-19 | Method of predicting risk of development of occupational bronchopulmonary pathology |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010134590/14A RU2459585C2 (en) | 2010-08-19 | 2010-08-19 | Method of predicting risk of development of occupational bronchopulmonary pathology |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2010134590A RU2010134590A (en) | 2012-02-27 |
| RU2459585C2 true RU2459585C2 (en) | 2012-08-27 |
Family
ID=45851682
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2010134590/14A RU2459585C2 (en) | 2010-08-19 | 2010-08-19 | Method of predicting risk of development of occupational bronchopulmonary pathology |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2459585C2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EA024837B1 (en) * | 2013-09-06 | 2016-10-31 | Российская Академия Медицинских Наук Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение "Научно-Исследовательский Институт Медицины Труда" Российской Академии Медицинских Наук (Фбгу "Нии Мт" Рамн) | Method for predicting risk of early development of professional allergodermatosis affected by chrome, nickel and cobalt |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2324937C1 (en) * | 2006-11-27 | 2008-05-20 | Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук (ИБГ УНЦ РАН) | Method of risk prediction of bronchial asthma |
-
2010
- 2010-08-19 RU RU2010134590/14A patent/RU2459585C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2324937C1 (en) * | 2006-11-27 | 2008-05-20 | Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук (ИБГ УНЦ РАН) | Method of risk prediction of bronchial asthma |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| LEI Z. et al. Meta Analysis of Association between Polymorphisms in Promoter Region of MMPs gene and Risk of Lung Cancer. Zhongguo Fei Ai Za Zhi. 2009 May 20; 12(5):381-6. [он-лайн], [найдено 02.08.2011], найдено из базы данных PubMed. ZHANG W.Q. et al. Association of MMP1 - 1607(1G>2G) single nucleotide polymorphism with susceptibility to lung cancer in Northwestern Chinese population of Han nationality. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. 2006 Jun; 23(3):313-5. [он-лайн], [найдено 02.08.2011], найдено из базы данных PubMed. XU E. et al. DHPLC analysis of the matrix metalloproteinase-1 promoter 1G/2G polymorphism that can be easily used to screen large population. J Biochem Biophys Methods. 2005 Jun 30; 63(3):222-7. [он-лайн], [найдено 02.08.2011], найдено из базы данных PubMed. * |
| ВЕСЕЛОВСКАЯ М.В. Роль полиморфных вариантов генов-кандидатов хронической обструктивной болезни легких в особенностях течения заболевания, Автореферат дисс. на соискан. учен. степен. канд. мед. наук. - М., 2007, с.11-12. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EA024837B1 (en) * | 2013-09-06 | 2016-10-31 | Российская Академия Медицинских Наук Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение "Научно-Исследовательский Институт Медицины Труда" Российской Академии Медицинских Наук (Фбгу "Нии Мт" Рамн) | Method for predicting risk of early development of professional allergodermatosis affected by chrome, nickel and cobalt |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2010134590A (en) | 2012-02-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20200208225A1 (en) | Systems for detecting dna orginating from different individuals | |
| US7078168B2 (en) | Method for determining allele frequencies | |
| US10167520B2 (en) | Universal or broad range assays and multi-tag sample specific diagnostic process using non-optical sequencing | |
| US20050084851A1 (en) | Method | |
| JP6302048B2 (en) | Noninvasive early detection of solid organ transplant rejection by quantitative analysis of mixtures by deep sequencing of HLA gene amplicons using next-generation systems | |
| WO1993023564A1 (en) | Method of sequencing dna | |
| EP1645640A3 (en) | Methods for amplifying and analyzing nucleic acids | |
| WO2008060090A1 (en) | Methods, primers and kits for quantitative detection of jak2 v617f mutants using pyrosequencing | |
| EP3008182A2 (en) | Improved ngs workflow | |
| CN113999901B (en) | Myocardial specific methylation markers | |
| RU2459585C2 (en) | Method of predicting risk of development of occupational bronchopulmonary pathology | |
| JP2022002539A (en) | Major histocompatibility complex single nucleotide polymorphisms | |
| WO2015189685A2 (en) | Improved ngs workflow | |
| CN105018490A (en) | Primer pairs, probes and kit for detecting polymorphism of human MTHFR gene | |
| RU2467330C1 (en) | Method for prediction of risk of developing early occupational allergic dermatoses | |
| Luhm et al. | Quantitative evaluation of post—bone marrow transplant engraftment status using fluorescent-labeled variable number of tandem repeats | |
| EP3006565A1 (en) | Selective detection of bordetella species | |
| Børsting et al. | Forensic genetic DNA typing with PCR-based methods | |
| Kaminiwa et al. | Vanadium accelerates polymerase chain reaction and expands the applicability of forensic DNA testing | |
| RU2497120C1 (en) | Method for prediction of population biotransformation disorders of foreign substances caused by exposure to man-induced chemical habitat factors | |
| Park et al. | Rapid Pyrosequencing Method for FMO3 Non-Synonymous Genetic Variant Evaluation in A Korean Population | |
| KR101716108B1 (en) | Forensic profiling by differential pre-amplification of STR loci | |
| US9127321B2 (en) | Method of detecting Coccidioides species | |
| CN117385013A (en) | Targeted sequencing kit and application method thereof | |
| JP2019180351A (en) | Quick gene detection methods of bovine leukemia virus using fluorescent lamp method |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20160820 |