RU2467330C1 - Method for prediction of risk of developing early occupational allergic dermatoses - Google Patents
Method for prediction of risk of developing early occupational allergic dermatoses Download PDFInfo
- Publication number
- RU2467330C1 RU2467330C1 RU2011133883/15A RU2011133883A RU2467330C1 RU 2467330 C1 RU2467330 C1 RU 2467330C1 RU 2011133883/15 A RU2011133883/15 A RU 2011133883/15A RU 2011133883 A RU2011133883 A RU 2011133883A RU 2467330 C1 RU2467330 C1 RU 2467330C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- risk
- occupational
- allergic dermatoses
- nucleotide sequence
- occupational allergic
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине и может быть использовано для прогнозирования риска раннего развития профессиональных аллергических дерматозов при воздействии на организм факторов раздражающего и сенсибилизирующего действия.The invention relates to medicine and can be used to predict the risk of early development of professional allergic dermatoses when exposed to factors of an irritating and sensitizing effect on the body.
Известен способ прогнозирования риска развития профессиональных аллергических дерматозов, включающий забор венозной крови, выделение генетического материала, проведение полимеразной цепной реакции со специфическими праймерами, определение нуклеотидной последовательности и на основании этого определение полиморфизного варианта A4889G цитохрома Р-450 1А1 (см. Лазарашвили Н.А., Роль системы «оксиданты-антиоксиданты» и генетического биохимического полиморфизма в патогенезе профессиональных аллергических дерматозов. Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук, М., 2006 г., с.48-87).A known method for predicting the risk of developing professional allergic dermatoses, including venous blood sampling, isolation of genetic material, polymerase chain reaction with specific primers, determination of the nucleotide sequence and based on this determination of the polymorphism variant of A4889G cytochrome P-450 1A1 (see N. Lazarashvili A.A. , The role of the oxidant-antioxidant system and genetic biochemical polymorphism in the pathogenesis of occupational allergic dermatoses. the scientific degree of a candidate of medical sciences, M., 2006, p. 48-87).
Однако данный способ имеет невысокую скорость проведения обследования пациентов ввиду сложности и трудоемкости используемых лабораторных технологий, являющихся вредными для медицинского персонала, проводящего их. Это затрудняет прогнозирование риска развития профессиональных аллергических дерматозов, например, при проведении диспансеризации или периодических медицинских осмотров большого количества работающих во вредных и/или опасных условиях труда за короткие (сжатые) сроки времени.However, this method has a low speed of examination of patients due to the complexity and complexity of the used laboratory technologies, which are harmful to the medical staff conducting them. This makes it difficult to predict the risk of developing professional allergic dermatoses, for example, during medical examinations or periodic medical examinations of a large number of workers in harmful and / or dangerous working conditions for short (short) periods of time.
Задачей настоящего изобретения является усовершенствование способа прогнозирования риска раннего развития (до 5 лет работы с вредными производственными факторами) профессиональных аллергических дерматозов при проведении диспансеризации или периодических медицинских осмотров большого количества работающих во вредных и/или опасных условиях труда за короткие (сжатые) сроки времени.The objective of the present invention is to improve the method for predicting the risk of early development (up to 5 years of work with harmful production factors) of professional allergic dermatoses during medical examinations or periodic medical examinations of a large number of people working in harmful and / or dangerous working conditions for short (short) periods of time.
Техническим результатом изобретения является повышение воспроизводимости и скорости проведения прогнозирования риска профессиональных аллергических дерматозов при воздействии на организм факторов раздражающего и сенсибилизирующего действия.The technical result of the invention is to increase the reproducibility and speed of predicting the risk of occupational allergic dermatoses when exposed to irritating and sensitizing factors on the body.
Указанная задача достигается тем, что в известном способе прогнозирования риска раннего развития профессиональных аллергических дерматозов, включающем забор венозной крови, выделение генетического материала, проведение полимеразной цепной реакции со специфическими праймерами, определение нуклеотидной последовательности и на основании этого определение полиморфизного варианта A4889G цитохрома Р-450 1А1, при проведении полимеразной цепной реакции используют специфические праймерыThis task is achieved by the fact that in the known method for predicting the risk of early development of occupational allergic dermatoses, including venous blood sampling, isolation of genetic material, polymerase chain reaction with specific primers, determination of the nucleotide sequence and based on this determination of the polymorphism variant A4889G cytochrome P-450 1A1 when carrying out a polymerase chain reaction using specific primers
С1А1-F Biotin - ggT gTT Aag TgA gAA ggT gAT TC1A1-F Biotin - ggT gTT Aag TgA gAA ggT gAT T
C1A1-R Cag gAT AgC Cag gAA gAg AAA,C1A1-R Cag gAT AgC Cag gAA gAg AAA,
а после проведения полимеразной цепной реакции проводят реакцию пиросеквенирования в режиме реального времени с использованием специфического праймера C1A1-S ACC TCC Cag Cgg gCA A и детекцию нуклеотидной последовательности с помощью хемилюминисцентного сигнала, далее проводят сравнение полученной нуклеотидной последовательности в положении 4889 с референсными последовательностями, при выявлении на полученной пирограмме отсутствия замены аденина на гуанин и при воздействии на организм вредного производственного фактора раздражающего и сенсибилизирующего действия прогнозируют риск раннего развития профессиональных аллергических дерматозов менее 40%, при выявлении на полученной пирограмме гетерозиготного варианта Сур1А1*2С, обусловленного заменой аденина на гуанин в нуклеотидной последовательности в положении 4889, и при воздействии на организм вредного производственного фактора раздражающего и сенсибилизирующего действия прогнозируют 40-80% риска раннего развития профессиональных аллергических дерматозов.and after carrying out the polymerase chain reaction, a real-time pyrosequencing reaction is carried out using a specific primer C1A1-S ACC TCC Cag Cgg gCA A and the nucleotide sequence is detected using a chemiluminescent signal, then the obtained nucleotide sequence at position 4889 is compared with reference sequences, if any on the resulting pyrogram, the absence of the replacement of adenine with guanine and when the organism is exposed to a harmful production factor irritating and sensitizing with a lysing effect, the risk of early development of occupational allergic dermatoses is predicted to be less than 40%, if a heterozygous variant of Sur1A1 * 2C is detected on the resulting pyrogram due to the replacement of adenine by guanine in the nucleotide sequence at position 4889, and when exposed to an harmful production factor of irritating and sensitizing effect, they predict 40 -80% risk of early development of occupational allergic dermatoses.
Проведенные исследования по патентным и научно-техническим информационным источникам показали, что предлагаемый способ неизвестен и не следует явным образом из изученного уровня техники, т.е. соответствует критериям "новизна" и "изобретательский уровень".Studies on patent and scientific and technical information sources have shown that the proposed method is unknown and does not follow explicitly from the studied prior art, i.e. meets the criteria of "novelty" and "inventive step".
Предлагаемый способ может быть применен в клинических, биохимических, молекулярно-генетических лабораториях, укомплектованных широко используемым оборудованием, выпускаемым отечественной или зарубежной промышленностью.The proposed method can be applied in clinical, biochemical, molecular genetic laboratories equipped with widely used equipment manufactured by domestic or foreign industry.
Следовательно, заявленный способ является доступным и практически применимым.Therefore, the claimed method is affordable and practically applicable.
Таким образом, предложена совокупность приемов, позволяющих обеспечить повышение воспроизводимости и скорости проведения прогнозирования риска раннего развития профессиональных аллергических дерматозов, что, в свою очередь, позволяет повысить достоверность прогнозирования риска раннего развития профессиональных аллергических дерматозов при воздействии на организм вредных производственных факторов раздражающего и сенсибилизирующего действия, например, при проведении диспансеризации или периодических медицинских осмотров большого количества работающих во вредных и/или опасных условиях труда за короткие (сжатые) сроки времени.Thus, a set of techniques has been proposed to increase the reproducibility and speed of predicting the risk of early development of professional allergic dermatoses, which, in turn, allows to increase the reliability of predicting the risk of early development of professional allergic dermatoses when exposed to harmful production factors of irritating and sensitizing effects, for example, during medical examinations or periodic medical examinations, pain th number of working in harmful and / or dangerous conditions for short (short) periods of time.
Предлагаемый способ основан на исследовании комплекса диагностических тестов.The proposed method is based on the study of a set of diagnostic tests.
В таблице 1 представлена последовательность использованных праймеров (см. в конце описания).Table 1 presents the sequence of primers used (see the end of the description).
Предлагаемый способ пояснен на чертеже.The proposed method is illustrated in the drawing.
На фиг.1 изображен принцип действия прибора для пиросеквенирования. На фиг.2 изображена принципиальная схема предлагаемого способа при выявлении гетерозиготного варианта Сур1А1*2С в нуклеотидной последовательности. На фиг.3 изображен световой сигнал, регистрируемый при ферментопосредованном превращении высвобождающегося пирофосфата. На фиг.4 изображена пирограмма с вариантом гомозиготного генотипа по определяемому аллельному варианту, не имеющему замены аденина на гуанин в положении 4889 (А/А) в нуклеотидной последовательности - соответствует норме (пример 1). На фиг.5 изображена пирограмма с вариантом гетерозиготного генотипа по определяемому аллельному варианту, имеющему замены аденина на гуанин в положении 4889 (A/G) (пример 2).Figure 1 shows the principle of operation of the device for pyrosequencing. Figure 2 shows a schematic diagram of the proposed method for identifying a heterozygous variant of Sur1A1 * 2C in the nucleotide sequence. Figure 3 shows the light signal recorded during the enzyme-mediated conversion of the released pyrophosphate. Figure 4 shows a pyrogram with a variant of the homozygous genotype according to the determined allelic variant, which does not have the replacement of adenine with guanine at position 4889 (A / A) in the nucleotide sequence - corresponds to the norm (example 1). Figure 5 shows a pyrogram with a variant of the heterozygous genotype for a defined allelic variant having substitutions of adenine with guanine at position 4889 (A / G) (example 2).
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.The proposed method is as follows.
У пациента осуществляют забор венозной крови. Кровь исследуют заявленным образом: из 100 мкл цельной крови выделяют ДНК-сорбент однопробирочным методом с использованием комплекта для выделения "ДНК-сорб-В"(ТУ 9398-071-01897593-2008) в соответствии с инструкцией к используемому комплекту.The patient performs a venous blood sampling. Blood is examined in the claimed way: from 100 μl of whole blood, the DNA sorbent is isolated by a single-tube method using the DNA-sorb-B isolation kit (TU 9398-071-01897593-2008) in accordance with the instructions for the kit used.
Из полученного препарата ДНК (объемом 50 мкл) готовят серии разведений в ТЕ-буфере до конечной концентрации 1-3 нг/мкл, добавляют 10 мг конечного раствора ДНК в пробирку для осуществления полимеразной цепной реакции со специфическими праймерами.From the obtained DNA preparation (50 μl), a series of dilutions is prepared in TE buffer to a final concentration of 1-3 ng / μl, 10 mg of the final DNA solution is added to the tube for polymerase chain reaction with specific primers.
Объем полимерной цепной реакции 25 мкл, при этом используют реагенты производства ЦНИИ Эпидемиологии: «ПЦР-смесь-2-blue», смесь десоксинуклеотидтрифосфатов «dNTPs (Т)», «Воск для ПЦР», «Минеральное масло для ПЦР». Для амплификации исследуемого генетического локуса используют специфические олигонуклеотидные праймеры C1A1-F Biotin - ggT gTT Aag TgA gAA ggT gAT Т и C1A1-R Cag gAT AgC Cag gAA gAg AAA (последовательность используемых праймеров представлена в таблице 1). Количество праймеров C1A1-F Biotin - ggT gTT Aag TgA gAA ggT gAT Т и C1A1-R Cag gAT AgC Cag gAA gAg AAA в полимеразной цепной реакции 10 пмоль.The volume of the polymer chain reaction is 25 μl, using reagents manufactured by the Central Research Institute of Epidemiology: “PCR-mixture-2-blue”, a mixture of desoxynucleotide triphosphates “dNTPs (T)”, “Wax for PCR”, “Mineral oil for PCR”. For amplification of the studied genetic locus, specific oligonucleotide primers C1A1-F Biotin - ggT gTT Aag TgA gAA ggT gAT T and C1A1-R Cag gAT AgC Cag gAA gAg AAA are used (the sequence of primers used is presented in table 1). The number of primers C1A1-F Biotin - ggT gTT Aag TgA gAA ggT gAT T and C1A1-R Cag gAT AgC Cag gAA gAg AAA in the polymerase chain reaction of 10 pmol.
Реакцию амплификации проводят по следующей программе.The amplification reaction is carried out according to the following program.
При использовании амплификатора «Терцик» (фирма ДНК-Технология), когда температура достигнет 95°C (режим паузы), пробирки ставят в ячейки амплификатора и выдерживают их при температуре 95°C - 5 мин. Далее пробирки выдерживают 45 циклов: при 95°C - 10 с, при 65°C - 10 с, при 72°C - 10 с, а в конце при 72°C - 2 мин.When using the Tercik amplifier (DNA-Technology company), when the temperature reaches 95 ° C (pause mode), the tubes are placed in the cells of the amplifier and kept at a temperature of 95 ° C for 5 minutes. Further, the tubes withstand 45 cycles: at 95 ° C - 10 s, at 65 ° C - 10 s, at 72 ° C - 10 s, and at the end at 72 ° C - 2 min.
При использовании амплификаторов «Gradient Palm Cycler» («MAXYGEN»), «GeneAmp PCR System 2700», «PalmCycler», когда температура достигнет 95°C (режим паузы) ставят пробирки в ячейки амплификатора и продолжают программу при температуре 95°C - 5 мин. Далее 45 циклов выдерживают пробирки 45 циклов: при 95°C - 15 с, при 65°C - 15 с, при 72°C - 20 с, а в конце при 95°C - 2 мин.When using amplifiers “Gradient Palm Cycler” (“MAXYGEN”), “GeneAmp PCR System 2700”, “PalmCycler”, when the temperature reaches 95 ° C (pause mode), put tubes in the cells of the amplifier and continue the program at a temperature of 95 ° C - 5 min After 45 cycles the tubes withstand 45 cycles: at 95 ° C - 15 s, at 65 ° C - 15 s, at 72 ° C - 20 s, and at the end at 95 ° C - 2 min.
После проведения амплификации осуществляют пробоподготовку образцов для секвенирования. После амплификации ПЦР-фрагмент связывают с частицами сефарозы, покрытыми стрептавидином за счет образования комплекса биотин-стрептавидин. Далее его очищают от свободных компонентов реакционной смеси с помощью серии отмывок и проводят стадию щелочной денатурации. В результате остается амплифицированный одноцепочечный ПЦР-фрагмент, который используют в качестве матрицы в реакции секвенирующего синтеза.After amplification, samples are prepared for sequencing. After amplification, the PCR fragment is coupled to streptavidin coated Sepharose particles due to the formation of a biotin-streptavidin complex. Then it is purified from the free components of the reaction mixture using a series of washes and the alkaline denaturation stage is carried out. As a result, the amplified single-chain PCR fragment remains, which is used as a matrix in the sequencing synthesis reaction.
На одноцепочечный ПЦР-ампликлон, выступающий в качестве матрицы, гибридизуют секвенирующий праймер C1A1-S АСС ТСС Cag Cgg gCA А в концентрации 0,3 пМ, разведенный в буфере для отжига.The sequencing primer C1A1-S ACC TCC Cag Cgg gCA A at a concentration of 0.3 pM diluted in an annealing buffer is hybridized to a single-chain PCR amplicon acting as a template.
После полимеразной цепной реакции проводят реакцию пиросеквенирования в режиме реального времени с использованием специфического праймера C1A1-S АСС TCC Cag Cgg gCA А и детекцию нуклеотидной последовательности с помощью хемилюминисцентного сигнала.After the polymerase chain reaction, a real-time pyrosequencing reaction is carried out using a specific primer C1A1-S ACC TCC Cag Cgg gCA A and nucleotide sequence detection using a chemiluminescent signal.
С помощью прибора пиросеквенатора, например «PyroMark Q96 MD» или «PyroMark Q24» (Германия), проводят пиросеквенирование (фиг.1).Using a pyrosequencer device, for example, PyroMark Q96 MD or PyroMark Q24 (Germany), pyrosequencing is performed (Fig. 1).
На данной стадии в ходе секвенирования комплементарной к матричному фрагменту цепи высвобожденный пирофосфат проходит серию ферментативных превращений, в результате чего регистрируют хемилюминесцентный сигнал (фиг.3). Проводят инкубацию исследуемого иммобилизированного фрагмента ДНК в присутствии четырех ферментов (сульфурилазы, люциферазы, апиразы, Taq-полимеразы) и субстратов (аденозин-5-фосфосульфата (APS) и люцеферина) для преобразования высвобожденного пирофосфата в хемилюминисцентный сигнал.At this stage, during sequencing of the chain complementary to the matrix fragment, the released pyrophosphate undergoes a series of enzymatic transformations, as a result of which a chemiluminescent signal is recorded (Fig. 3). The immobilized DNA fragment under study was incubated in the presence of four enzymes (sulfurylase, luciferase, apyrase, Taq polymerase) and substrates (adenosine 5-phosphosulfate (APS) and luciferin) to convert the released pyrophosphate to a chemiluminescent signal.
Реакция пиросеквенирования включает следующие стадии:The pyrosequencing reaction includes the following steps:
- Добавляют один из четырех дезоксинуклеотид-3-фосфатов (dNTP) в реакционную смесь. В том случае, если добавленный нуклеотид комплементарен матричной цепи ДНК, происходит встраивание в растущую цепь, катализируемое ферментом ДНК-полимеразой. Каждый акт включения нуклеотида в цепь ДНК сопровождается высвобождением пирофосфата (PPi) в эквимолярном количестве.- Add one of four deoxynucleotide-3-phosphates (dNTP) to the reaction mixture. In the event that the added nucleotide is complementary to the DNA template strand, insertion into the growing strand catalyzed by the DNA polymerase enzyme takes place. Each act of incorporation of a nucleotide into a DNA strand is accompanied by the release of pyrophosphate (PPi) in an equimolar amount.
- Фермент сульфурилаза катализирует процесс образования молекулы АТФ-аденозин 3 фосфат из высвобожденного пирофосфата и присутствующего в реакционной смеси аденозин-5-фосфосульфата (APS).- The enzyme sulfurylase catalyzes the process of the formation of the ATP-adenosine 3 phosphate molecule from the released pyrophosphate and adenosine 5-phosphosulfate (APS) present in the reaction mixture.
- Созданная молекула АТФ-аденозин 3 фосфат (АТР) запускает процесс превращения люциферина в оксилюциферин, катализируемого ферментом люциферазой, в результате чего генерируется хемилюминесцентный сигнал, величина которого пропорциональна количеству АТР.- The created molecule ATP-adenosine 3 phosphate (ATP) starts the process of converting luciferin to oxyluciferin catalyzed by the enzyme luciferase, resulting in a chemiluminescent signal that is proportional to the amount of ATP.
- Хемилюминисцентный сигнал регистрируют CCD-камерой, он отображается в виде пика на пирограмме. В течение всей реакции фермент апираза деградирует невстроившиеся нуклеотиды и избыток АТР таким образом, что новый нуклеотид добавляется в цепь ДНК только при полной деградации невстроившихся дезоксинуклеотид-3-фосфатов. Последовательное добавление dNTP обеспечивает появление пиков на пирограмме, составляющих нуклеотидную последовательность исследуемого генетического локуса (фиг.3).- The chemiluminescent signal is recorded by a CCD camera, it is displayed as a peak on the pyrogram. Throughout the reaction, the apyrase enzyme degrades non-integrating nucleotides and excess ATP so that a new nucleotide is added to the DNA chain only with complete degradation of non-integrating deoxynucleotide-3-phosphates. The sequential addition of dNTP ensures the appearance of peaks in the pyrogram constituting the nucleotide sequence of the studied genetic locus (figure 3).
Далее проводят сравнение полученной нуклеотидной последовательности с референсными последовательностями и по полученной пирограмме определяют, какой вариант мутации имеет место в нуклеотидной последовательности.Next, a comparison is made of the obtained nucleotide sequence with reference sequences and the resulting pyrogram determines which variant of the mutation takes place in the nucleotide sequence.
При выявлении на полученной пирограмме отсутствия замены аденина на гуанин и при воздействии на организм вредного производственного фактора раздражающего и сенсибилизирующего действия прогнозируют риск раннего развития профессиональных аллергических дерматозов менее 40%, при выявлении на полученной пирограмме гетерозиготного варианта Сур1А1*2С, обусловленного заменой аденина на гуанин в нуклеотидной последовательности в положении 4889, и при воздействии на организм вредного производственного фактора раздражающего и сенсибилизирующего действия прогнозируют 40-80% риска раннего развития профессиональных аллергических дерматозов.If there is a lack of replacement of adenine with guanine on the resulting pyrogram, and when the harmful production factor of irritating and sensitizing effects is exposed to the body, the risk of early development of occupational allergic dermatoses is predicted to be less than 40%, if the heterozygous Sur1A1 * 2C variant due to the replacement of adenine with guanine in guanine is detected the nucleotide sequence at position 4889, and when exposed to an organism of a harmful production factor, it is irritating and sensitizing th action predict a 40-80% risk of early development of occupational allergic dermatoses.
Пример 1. Больная М., 53 годаExample 1. Patient M., 53 years old
При анализе анамнеза и профессионального маршрута пациентки было выявлено, что больная М. работала с 1992 г. по настоящее время полировщиком оптических деталей в контакте с канифолью. Считает себя больной профессиональным аллергическим дерматозом с 2005 г., когда впервые появились высыпания на ладонных поверхностях, распространившиеся на тыльные поверхности и сопровождаемые зудом. В 2006 г. появились высыпания на коже нижних конечностей. Больная обращалась к дерматологу по месту жительства, но получала лечение с временным эффектом. В выходные дни, во время отпуска отмечает улучшение.When analyzing the patient’s medical history and professional route, it was revealed that patient M. worked from 1992 to the present time as a polisher of optical parts in contact with rosin. Considers herself a patient with occupational allergic dermatosis since 2005, when eruptions on the palmar surfaces, spreading to the back surfaces and accompanied by itching, first appeared. In 2006, rashes appeared on the skin of the lower extremities. The patient consulted a dermatologist at the place of residence, but received treatment with a temporary effect. On weekends, during the holidays notes improvement.
По данным биохимических исследований: незначительное (на верхней границе референсных значений) повышение содержания продуктов перекисного окисления липидов (диеновых конъюгатов, кетодиенов и карбонилов) в сыворотке крови и угнетение антиоксидантной защиты - незначительное снижение (на нижней границе референсных значений) тиолдисульфидного соотношения.According to biochemical studies: a slight (at the upper limit of reference values) increase in the content of lipid peroxidation products (diene conjugates, ketodienes and carbonyls) in the blood serum and inhibition of antioxidant protection - a slight decrease (at the lower limit of the reference values) of the thiol disulfide ratio.
Кровь исследовали согласно предлагаемому способу.Blood was examined according to the proposed method.
Из 100 мкл цельной крови выделили суммарную ДНК однопробирочным методом с использованием комплекта для выделения "ДНК-сорб-В" (ТУ 9398-071-01897593-2008) в соответствии с инструкцией к используемому комплекту.The total DNA was isolated from 100 μl of whole blood using a single-tube method using the DNA-Sorb-B isolation kit (TU 9398-071-01897593-2008) in accordance with the instructions for the kit used.
Из полученного препарата ДНК (объемом 50 мкл) приготовили серии разведений в ТЕ-буфере до конечной концентрации 1-3 нг/мкл, добавляли 10 мг конечного раствора ДНК в пробирку для полимеразной цепной реакции. Объем полимерной цепной реакции 25 мкл, использованы реагенты производства ЦНИИ Эпидемиологии: «ПЦР-смесь-2-blue», смесь десоксинуклеотидтрифосфатов «dNTPs (Т)», «Воск для ПЦР», «Минеральное масло для ПЦР». Для амплификации исследуемого генетического локуса использовали специфические олигонуклеотидные праймеры C1A1-F Biotin - ggT gTT Aag TgA gAA ggT gAT Т и C1A1-R Cag gAT AgC Cag gAA gAg AAA, один из которых мечен биотином. Количество праймеров C1A1-F Biotin - ggT gTT Aag TgA gAA ggT gAT Т и С1А1 - R Cag gAT AgC Cag gAA gAg AAA в полимеразной цепной реакции - 10 пмольFrom the obtained DNA preparation (50 μl), a series of dilutions was prepared in TE buffer to a final concentration of 1-3 ng / μl, 10 mg of the final DNA solution was added to a tube for polymerase chain reaction. The volume of the polymeric chain reaction is 25 μl; reagents manufactured by the Central Research Institute of Epidemiology: “PCR-mixture-2-blue”, a mixture of desoxynucleotide triphosphates “dNTPs (T)”, “Wax for PCR”, “Mineral oil for PCR” were used. For amplification of the studied genetic locus, specific oligonucleotide primers C1A1-F Biotin - ggT gTT Aag TgA gAA ggT gAT T and C1A1-R Cag gAT AgC Cag gAA gAg AAA were used, one of which is labeled with biotin. The number of primers C1A1-F Biotin - ggT gTT Aag TgA gAA ggT gAT T and C1A1 - R Cag gAT AgC Cag gAA gAg AAA in the polymerase chain reaction - 10 pmol
Реакцию амплификации проводили с использованием амплификатора «Терцик» (фирма ДНК-технология). При его нагреве до температуры 95°C (режим паузы) пробирки поставили в ячейки амплификатора и выдержали их при температуре 95°C - 5 мин. Далее пробирки выдерживали 45 циклов: при 95°C - 10 с, при 65°C - 10 с, при 72°C - 10 с, а в конце при 72°C - 2 мин.The amplification reaction was carried out using a Tercik amplifier (DNA technology company). When it was heated to a temperature of 95 ° C (pause mode), the tubes were placed in the cells of the amplifier and kept at a temperature of 95 ° C for 5 minutes. Then the tubes were kept for 45 cycles: at 95 ° C - 10 s, at 65 ° C - 10 s, at 72 ° C - 10 s, and at the end at 72 ° C - 2 min.
После проведения амплификации осуществили пробоподготовку образцов для секвенирования. Для пиросеквенирования использовали приборы и станцию для пробоподготовки фирмы «Qiagen», Германия.After amplification, samples were prepared for sequencing. For pyrosequencing, we used instruments and a sample preparation station from Qiagen, Germany.
Далее проведен отжиг секвенирующего праймера. Полученные пробы подвергли пиросеквенированию на приборе «PyroMark Q96 MD» (Германия).Next, the sequencing primer was annealed. The obtained samples were subjected to pyrosequencing on a PyroMark Q96 MD instrument (Germany).
При анализе результатов выявлен гомозиготный вариант A4889G, не имеющий замены аденина на гуанин в положении 4889 - вариант генотипа соответствующий нормальной активности цитохрома Р-450 1А1.When analyzing the results, a homozygous variant of A4889G was identified that does not have adenine to guanine substitution at position 4889 — a variant of the genotype corresponding to the normal activity of cytochrome P-450 1A1.
Вывод: у больной М. выявлен гомозиготный вариант Сур1А1*2С полиморфизма A4889G, не имеющий замену аденина на гуанин, свидетельствующий о нормальной активности фермента. Раннего развития профессионального аллергодерматоза при воздействии на организм вредных производственных факторов раздражающего и сенсибилизирующего действия не наблюдается, заболевание развилось через 13 лет после начала работы с факторами раздражающего и сенсибилизирующего действия.Conclusion: Patient M. revealed a homozygous variant of Sur1A1 * 2C polymorphism A4889G, which does not have the replacement of adenine with guanine, indicating normal enzyme activity. There is no early development of occupational allergic dermatosis with exposure to harmful production factors of an irritating and sensitizing effect; the disease developed 13 years after the start of work with irritating and sensitizing factors.
Пример 2. Больная В., 58 летExample 2. Patient C., 58 years old
При анализе анамнеза и профессионального маршрута пациента, было выявлено, что больная В. в течение 21 года работала на Московском заводе АЗЛК слесарем-сборщиком, в контакте с металлами-аллергенами: хромом, никелем, кобальтом и бензином. Через год после начала работы был поставлен диагноз: Профессиональная экзема верхних конечностей. При обследовании в НИИ МТ РАМН диагноз был подтвержден и уточнен: Профессиональная экзема верхних конечностей.When analyzing the patient’s history and professional route, it was revealed that patient V. worked for 21 years at the AZLK Moscow plant as a fitter, in contact with allergen metals: chromium, nickel, cobalt and gasoline. A year after the start of work, the diagnosis was made: Occupational eczema of the upper extremities. When examined at the Research Institute of MT RAMS, the diagnosis was confirmed and specified: Occupational eczema of the upper limbs.
По данным биохимических исследований: повышение содержания продуктов перекисного окисления липидов (диеновых конъюгатов, кетодиенов и карбонилов) в сыворотке крови и угнетение антиоксидантной защиты - снижение тиолдисульфидного соотношения.According to biochemical studies: an increase in the content of lipid peroxidation products (diene conjugates, ketodienes and carbonyls) in blood serum and inhibition of antioxidant protection - a decrease in the thiol disulfide ratio.
Кровь исследовали согласно предлагаемому способу.Blood was examined according to the proposed method.
Из 100 мкл цельной крови выделяли суммарную ДНК однопробирочным методом с использованием комплекта для выделения "ДНК-сорб-В" (ТУ 9398-071-01897593-2008) в соответствии с инструкцией к используемому комплекту.The total DNA was isolated from 100 μl of whole blood using a single-tube method using the DNA-Sorb-B isolation kit (TU 9398-071-01897593-2008) in accordance with the instructions for the kit used.
Из полученного препарата ДНК (объемом 50 мкл) приготовили серии разведений в ТЕ-буфере до конечной концентрации 1-3 нг/мкл, добавили 10 мг конечного раствора ДНК в пробирку для полимеразной цепной реакции. Объем полимерной цепной реакции 25 мкл, использованы реагенты производства ЦНИИ Эпидемиологии: «ПЦР-смесь-2-blue», смесь десоксинуклеотидтрифосфатов «dNTPs (Т)», «Воск для ПЦР», «Минеральное масло для ПЦР». Для амплификации исследуемого генетического локуса использовали специфические олигонуклеотидные праймеры «C1A1-F Biotin - ggT gTT Aag TgA gAA ggT gAT Т» и «C1A1-R Cag gAT AgC Cag gAA gAg AAA», один из которых мечен биотином. Количество праймеров «C1A1-F Biotin - ggT gTT Aag TgA gAA ggT gAT Т» и «C1A1-R Cag gAT AgC Cag gAA gAg AAA» в полимеразной цепной реакции - 10 пмоль.From the obtained DNA preparation (50 μl), a series of dilutions was prepared in TE buffer to a final concentration of 1-3 ng / μl, 10 mg of the final DNA solution was added to the tube for polymerase chain reaction. The volume of the polymeric chain reaction is 25 μl; reagents manufactured by the Central Research Institute of Epidemiology: “PCR-mixture-2-blue”, a mixture of desoxynucleotide triphosphates “dNTPs (T)”, “Wax for PCR”, “Mineral oil for PCR” were used. For amplification of the studied genetic locus, the specific oligonucleotide primers “C1A1-F Biotin - ggT gTT Aag TgA gAA ggT gAT T” and “C1A1-R Cag gAT AgC Cag gAA gAg AAA” were used, one of which is labeled with biotin. The number of primers "C1A1-F Biotin - ggT gTT Aag TgA gAA ggT gAT T" and "C1A1-R Cag gAT AgC Cag gAA gAg AAA" in the polymerase chain reaction - 10 pmol.
Реакцию амплификации проводили с использованием амплификатора «Терцик» (фирма ДНК-технология). При его нагреве до температуры 95°C (режим паузы) пробирки поставили в ячейки амплификатора и выдержали их при температуре 95°C - 5 мин. Далее выдерживали пробирки 45 циклов: при 95°C - 10 с, при 65°C - 10 с, при 72°C - 10 с, а в конце при 72°C - 2 мин.The amplification reaction was carried out using a Tercik amplifier (DNA technology company). When it was heated to a temperature of 95 ° C (pause mode), the tubes were placed in the cells of the amplifier and kept at a temperature of 95 ° C for 5 minutes. The tubes were then kept for 45 cycles: at 95 ° C for 10 s, at 65 ° C for 10 s, at 72 ° C for 10 s, and at the end at 72 ° C for 2 minutes.
После проведения амплификации осуществляли пробоподготовку образцов для секвенирования. Для пиросеквенирования использовали приборы и станцию для пробоподготовки фирмы «Qiagen», Германия.After amplification, samples were prepared for sequencing. For pyrosequencing, we used instruments and a sample preparation station from Qiagen, Germany.
Проводили отжиг секвенирующего праймера, далее пробы подвергли пиросеквенированию на приборе «PyroMark Q96 MD».The sequencing primer was annealed, then the samples were pyrosequenced using a PyroMark Q96 MD instrument.
При анализе результатов был выявлен гетерозиготный вариант Сур1А1*2С полиморфизма A4889G, имеющий замену аденина на гуанин.An analysis of the results revealed a heterozygous variant of Sur1A1 * 2C polymorphism A4889G, which has the replacement of adenine with guanine.
Вывод: у больной В. был выявлен гетерозиготный вариант Сур1А1*2С полиморфизма A4889G, имеющий замену аденина на гуанин, свидетельствующий о повышенной активности фермента. Следовательно, имеет место повышенное образование промежуточных токсичных метаболитов. Это и явилось причиной раннего развития профессионального аллергического дерматоза через год после начала работы с вредными производственными факторами раздражающего и сенсибилизирующего действия.Conclusion: in patient B., a heterozygous variant of Sur1A1 * 2C polymorphism A4889G was detected, which has the replacement of adenine with guanine, indicating an increased activity of the enzyme. Therefore, there is an increased formation of intermediate toxic metabolites. This was the reason for the early development of professional allergic dermatosis a year after the start of work with harmful production factors of irritating and sensitizing effects.
Предлагаемый способ прогнозирования риска раннего развития профессиональных аллергических дерматозов позволяет повысить точность полученных результатов за счет снижения до минимума ошибки при интерпретации результатов путем устранения «человеческого фактора» и скорость проведения анализа на 25% по сравнению с прототипом за счет применения метода пиросеквенирования, использование которого позволяет в единицу времени проводить большее количество анализов, например, при проведении диспансеризации или периодических медицинских осмотров большого количества работающих во вредных и/или опасных условиях труда, за короткие (сжатые) сроки времени.The proposed method for predicting the risk of early development of professional allergic dermatoses allows to increase the accuracy of the results by minimizing errors in interpreting the results by eliminating the "human factor" and the analysis speed by 25% compared to the prototype through the use of pyrosequencing, which allows a unit of time to conduct a larger number of tests, for example, during medical examinations or periodic medical examinations ters a large number of working in harmful and / or dangerous conditions, in short (short) periods of time.
Предложенный способ прогнозирования риска раннего развития профессиональных аллергических дерматозов может быть применен в клинических, биохимических, молекулярно-генетических лабораториях, укомплектованных оборудованием, выпускаемым отечественной или зарубежной промышленностью.The proposed method for predicting the risk of early development of professional allergic dermatoses can be applied in clinical, biochemical, molecular genetic laboratories equipped with equipment manufactured by domestic or foreign industry.
Claims (1)
С1А1-F Biotin - ggT gTT Aag TgA gAA ggT gAT Т
C1A1-R Cag gAT AgC Cag gAA gAg AAA,
а после проведения полимеразной цепной реакции проводят реакцию пиросеквенирования в режиме реального времени с использованием специфического праймера C1A1-S АСС ТСС Cag Cgg gCA А и детекцию нуклеотидной последовательности с помощью хемилюминесцентного сигнала, далее проводят сравнение полученной нуклеотидной последовательности в положении 4889 с референсными последовательностями, при выявлении на полученной пирограмме отсутствия замены аденина на гуанин и при воздействии на организм вредного производственного фактора раздражающего и сенсибилизирующего действия прогнозируют риск раннего развития профессиональных аллергических дерматозов менее 40%, при выявлении на полученной пирограмме гетерозиготного варианта Сур1А1*2С, обусловленного заменой аденина на гуанин в нуклеотидной последовательности в положении 4889, и при воздействии на организм вредного производственного фактора раздражающего и сенсибилизирующего действия прогнозируют 40÷80% риска раннего развития профессиональных аллергических дерматозов. A method for predicting the risk of early development of occupational allergic dermatoses, including venous blood sampling, isolation of genetic material, polymerase chain reaction with specific primers, determination of the nucleotide sequence and based on this determination of the polymorphism variant A4889G of cytochrome P-450 1A1, characterized in that during polymerase chain reactions use specific primers
C1A1-F Biotin - ggT gTT Aag TgA gAA ggT gAT T
C1A1-R Cag gAT AgC Cag gAA gAg AAA,
and after the polymerase chain reaction, a real-time pyrosequencing reaction is carried out using a specific primer C1A1-S ACC TCC Cag Cgg gCA A and the nucleotide sequence is detected using a chemiluminescent signal, then the obtained nucleotide sequence at position 4889 is compared with reference sequences, if any on the resulting pyrogram, the absence of the replacement of adenine with guanine and when the organism is exposed to a harmful production factor irritating and of a sibilizing effect, the risk of early development of occupational allergic dermatoses is predicted to be less than 40%, if a heterozygous variant of Sur1A1 * 2C is detected on the resulting pyrogram due to substitution of adenine for guanine in the nucleotide sequence at position 4889, and 40 is predicted when the harmful production factor is irritating and sensitizing, ÷ 80% risk of early development of occupational allergic dermatoses.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2011133883/15A RU2467330C1 (en) | 2011-08-12 | 2011-08-12 | Method for prediction of risk of developing early occupational allergic dermatoses |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2011133883/15A RU2467330C1 (en) | 2011-08-12 | 2011-08-12 | Method for prediction of risk of developing early occupational allergic dermatoses |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2467330C1 true RU2467330C1 (en) | 2012-11-20 |
Family
ID=47323337
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2011133883/15A RU2467330C1 (en) | 2011-08-12 | 2011-08-12 | Method for prediction of risk of developing early occupational allergic dermatoses |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2467330C1 (en) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2552031C1 (en) * | 2014-05-15 | 2015-06-10 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Уфимский научно-исследовательский институт медицины труда и экологии человека" | Method for prediction of risk of occupational allergodermatoses |
EA024837B1 (en) * | 2013-09-06 | 2016-10-31 | Российская Академия Медицинских Наук Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение "Научно-Исследовательский Институт Медицины Труда" Российской Академии Медицинских Наук (Фбгу "Нии Мт" Рамн) | Method for predicting risk of early development of professional allergodermatosis affected by chrome, nickel and cobalt |
-
2011
- 2011-08-12 RU RU2011133883/15A patent/RU2467330C1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
ЛАЗАРАШВИЛИ Н.А. Роль системы «оксиданты-антиоксиданты» и генетического биохимического полиморфизма в патогенезе профессиональных аллергических дерматозов: Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. - М., 2006, с.48-87. TSATSAKIS A.M. et al. Relation of PON1 and CYP1A1 genetic polymorphisms to clinical findings in a cross-sectional study of a Greek rural population professionally exposed to pesticides. Toxicol Lett. 2009 Apr 10; 186(1): 66-72. * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EA024837B1 (en) * | 2013-09-06 | 2016-10-31 | Российская Академия Медицинских Наук Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение "Научно-Исследовательский Институт Медицины Труда" Российской Академии Медицинских Наук (Фбгу "Нии Мт" Рамн) | Method for predicting risk of early development of professional allergodermatosis affected by chrome, nickel and cobalt |
RU2552031C1 (en) * | 2014-05-15 | 2015-06-10 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Уфимский научно-исследовательский институт медицины труда и экологии человека" | Method for prediction of risk of occupational allergodermatoses |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CA2904658C (en) | Method for identifying the quantitative cellular composition in a biological sample | |
Lambert et al. | Quantification of maternal microchimerism by HLA‐specific real‐time polymerase chain reaction: studies of healthy women and women with scleroderma | |
CA2887218C (en) | System for amplification of a fetal dna species | |
Sarasquete et al. | Minimal residual disease monitoring in multiple myeloma: a comparison between allelic-specific oligonucleotide real-time quantitative polymerase chain reaction and flow cytometry | |
US20150259745A1 (en) | Method for evaluating and comparing immunorepertoires | |
EP1325963B1 (en) | Method for non-invasive diagnosis of transplantations and transfusions | |
JP6302048B2 (en) | Noninvasive early detection of solid organ transplant rejection by quantitative analysis of mixtures by deep sequencing of HLA gene amplicons using next-generation systems | |
CA2824854A1 (en) | Immunodiversity assessment method and its use | |
CN110699446B (en) | SNP marker rs3174298 related to non-syndrome cleft lip and palate diagnosis and application thereof | |
RU2467330C1 (en) | Method for prediction of risk of developing early occupational allergic dermatoses | |
Andersen et al. | Real-time polymerase chain reaction estimation of bone marrow tumor burden using clonal immunoglobulin heavy chain gene and bcl-1/JH rearrangements in mantle cell lymphoma | |
US20100304988A1 (en) | Diagnostic of immune graft tolerance | |
CN113999901A (en) | Cardiac muscle specific methylation markers | |
Cusick et al. | Performance characteristics of chimerism testing by next generation sequencing | |
RU2386133C1 (en) | Method for prediction of sterility in women working in petrochemical production | |
CN101671736B (en) | Gene detection kit used for detecting cell chimerism or individual recognition | |
CN105177152B (en) | Detect the method and primer of HLA-B*51 allele | |
JP2008136404A (en) | Method for confirming amount of dna after conversion treatment of non-methylated cytosine in dna methylation detection | |
Schiff et al. | HLA alleles and risk of cervical intraepithelial neoplasia among southwestern American Indian women | |
CN116716386A (en) | Detection kit for vitamin C deficiency risk assessment and application method thereof | |
RU2459585C2 (en) | Method of predicting risk of development of occupational bronchopulmonary pathology | |
Minuti et al. | Chimerism analysis using next generation sequencing | |
Luhm et al. | Quantitative evaluation of post—bone marrow transplant engraftment status using fluorescent-labeled variable number of tandem repeats | |
US9340836B2 (en) | Allelic discrimination assays for MRSA strains | |
CN110938680A (en) | Gene variation site detection method for simultaneously detecting DNA and RNA |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20160813 |
|
NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20170523 |
|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20190813 |