RU2497120C1

RU2497120C1 - Method for prediction of population biotransformation disorders of foreign substances caused by exposure to man-induced chemical habitat factors

Info

Publication number: RU2497120C1
Application number: RU2012134336/15A
Authority: RU
Inventors: Олег Владимирович Долгих; Нина Владимировна Зайцева; Александр Владимирович Кривцов; Алеся Михайловна Гугович; Дина Гумяровна Дианова; Регина Атласовна Харахорина; Татьяна Станиславовна Лыхина; Дмитрий Владимирович Ланин
Priority date: 2012-08-10
Filing date: 2012-08-10
Publication date: 2013-10-27

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: what is presented is a method for prediction of the population biotransformation disorders of foreign substances caused by the exposure to man-induced chemical habitat factors. One ethnic population living on the territory of the exposure to hazardous chemical factors is sampled; buccal epithelium is sampled; DNA is recovered that is followed by genotyping of the polymorphous version 9893A/G of CYP1A1 gene, 921A/C of CPOX gene, and G308A of TNF-alpha gene; one of the following gene conditions are stated: heterozygous, normal homozygous or minor homozygous; a prevalence ratio of the minor alleles for the genes studied is calculated by formula; and the population disorders are predicted.

EFFECT: invention enables the accurate and reliable prediction of the population biotransformation disorders of foreign substances caused by the exposure to man-induced chemical habitat factors and may be used for providing the preventive ways to protect and stabilise an ethnic population genome in conditions of the increasing environmental pollution.

2 tbl, 1 ex

Description

Изобретение относится к области медицины, а именно к области молекулярной биологии и генетики, и может быть использовано для профилактического обеспечения путей защиты и стабилизации генома этнической популяции в условиях возрастающего загрязнения окружающей среды.The invention relates to medicine, namely to the field of molecular biology and genetics, and can be used to prophylactically provide ways to protect and stabilize the genome of an ethnic population under conditions of increasing environmental pollution.

Здоровье человека постоянно подвергается негативному воздействию химических мутагенов. В связи с этим, актуальной проблемой является разработка методов выявления (прогнозирования) адаптивности отдельной популяции к действию химических мутагенов (ксенобиотиков), связанной с полиморфизмом генов.Human health is constantly exposed to the negative effects of chemical mutagens. In this regard, an urgent problem is the development of methods for identifying (predicting) the adaptability of an individual population to the action of chemical mutagens (xenobiotics) associated with gene polymorphism.

Вследствие генетической гетерогенности популяции человека в ней присутствуют индивиды, генетические особенности которых обуславливают повышенную чувствительность к действию мутагенов.Due to the genetic heterogeneity of the human population, individuals are present in it, the genetic characteristics of which determine an increased sensitivity to the action of mutagens.

Изучение генов ферментов метаболизма ксенобиотиков на молекулярном уровне позволяет прогнозировать вероятность возникновения патологических эффектов, связанных с особенностями токсического действия анализируемого техногенного химического фактора среды обитания.Studying the genes of xenobiotic metabolism enzymes at the molecular level allows us to predict the likelihood of pathological effects associated with the peculiarities of the toxic effect of the analyzed technogenic chemical environmental factor.

Биотрансформация (детоксикация) всех чужеродных веществ, в том числе вредных химических веществ, попадающих в организм через среду обитания, обеспечивается сложной метаболической системой, представленной многочисленными ферментами. Гены, контролирующие синтез соответствующих ферментов, объединены под общим названием «гены метаболизма».Biotransformation (detoxification) of all foreign substances, including harmful chemicals that enter the body through the environment, is provided by a complex metabolic system represented by numerous enzymes. Genes that control the synthesis of the corresponding enzymes are combined under the general name “metabolism genes”.

Для поиска и идентификации ДНК-полиморфизма в настоящее время разработаны и широко применяются различные методы, число которых приближается к ста.To search and identify DNA polymorphism, various methods have now been developed and are widely used, the number of which is approaching one hundred.

В зависимости от целей исследования все молекулярно-генетические методы можно подразделить на две группы: методы, направленные на поиск неизвестных мутаций (первичная идентификация), и анализ известных мутаций.Depending on the objectives of the study, all molecular genetic methods can be divided into two groups: methods aimed at searching for unknown mutations (primary identification), and analysis of known mutations.

Методы, применяемые для первичной идентификации мутаций, то есть позволяющие скринировать на наличие ДНК-поломок достаточно протяженные фрагменты генов включают: метод анализа конформационного полиморфизма однонитевой дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК); денатурирующий градиентный гель-электрофорез; метод гетеродуплексного анализа; метод химического расщепления некомплементарных сайтов; метод тестирования «неполноценного» белка; метод масс-спектрометрии и метод биочипов.Methods used for the primary identification of mutations, that is, allowing screening for sufficiently long gene fragments for DNA damage include: a method for analyzing conformational polymorphism of single-stranded deoxyribonucleic acid (DNA); denaturing gradient gel electrophoresis; heteroduplex analysis method; chemical splitting of non-complementary sites; test method for "inferior" protein; mass spectrometry method and biochip method.

Выявление мутаций этими известными методами должно обязательно подтверждаться результатами прямого секвенирования изучаемого ДНК-фрагмента гена. Таким образом, большинство перечисленных известных методов (за исключением масс-спектрометрии и биочипов) позволяет выявить только подозрительные на наличие точковых и других мутаций участки ДНК, и только метод секвенирования дает полную информацию о типе и характере нуклеотидных изменений. Зачастую первичный поиск нарушений в кодирующих областях гена проводят именно таким образом.Identification of mutations by these known methods must necessarily be confirmed by the results of direct sequencing of the studied DNA fragment of the gene. Thus, most of the known methods listed (with the exception of mass spectrometry and biochips) can only detect DNA segments that are suspicious for the presence of point and other mutations, and only the sequencing method provides complete information about the type and nature of nucleotide changes. Often, the primary search for violations in the coding regions of a gene is carried out in this way.

Одним из самых часто используемых молекулярных методов, позволяющих идентифицировать многие уже известные мутации, является полимеразная цепная реакция (ПЦР) (Патенты РФ №№2343480, 2324937, 2431149 и т.д.). Кроме того, этот метод лежит в основе других методов изучения генома. При этом чаще всего используют так называемое резонансное тушение флюоресценции в TaqMan системе, позволяющее контролировать кинетику ПЦР амплификации непосредственно в ходе реакции. Для детекции мутаций используют зонды, несущие на 5'- и 3'-концах соответственно различные флюорофоры (светители) и их «тушители», которые, находясь рядом, подавляют флюоресценцию. При этом зонды должны быть комплементарны последовательности амплифицируемой ДНК и отличаться лишь одним нуклеотидом, характерным для одного и другого аллеля. Зонд, содержащий на 3'-конце краситель FAM, полностью комплементарен аллелю 1 и при гибридизации дает устойчивый дуплекс. При гибридизации этого зонда с аллелем 2 будет происходить неполное спаривание нуклеотидов и возникает так называемый «мисматч». Соответственно зонд, имеющий метку VIC, полностью комплементарен аллелю 2, но при гибридизации с аллелем 1 не дает устойчивого дуплекса.One of the most commonly used molecular methods to identify many already known mutations is the polymerase chain reaction (PCR) (RF Patents Nos. 2343480, 2324937, 2431149, etc.). In addition, this method underlies other methods of studying the genome. In this case, the so-called resonant quenching of fluorescence in the TaqMan system is most often used, which allows controlling the kinetics of PCR amplification directly during the reaction. To detect mutations, probes are used that carry various fluorophores (luminaires) and their “quenchers” at the 5'- and 3'-ends, respectively, which, when nearby, suppress fluorescence. In this case, the probes should be complementary to the amplified DNA sequence and differ by only one nucleotide characteristic of one and the other allele. A probe containing a FAM dye at the 3'-end is completely complementary to allele 1 and gives a stable duplex upon hybridization. During hybridization of this probe with allele 2, incomplete pairing of nucleotides will occur and the so-called “mismatch” will arise. Accordingly, a probe with a VIC tag is fully complementary to allele 2, but when hybridized with allele 1 it does not produce a stable duplex.

Непосредственно перед реакцией в ПЦР-смесь добавляют зонды, которые гибридизуются с комплементарными им последовательностями ДНК. В случае гетерозиготы по исследуемым аллелям гибридизуются оба зонда.Immediately before the reaction, probes are added to the PCR mixture that hybridize with their complementary DNA sequences. In the case of heterozygotes, both probes hybridize along the studied alleles.

Достраивая комплементарную последовательность ДНК, TaqF-полимераза за счет своей экзонуклеазной активности разрушает только устойчивые дуплексы. При этом происходит отщепление соответствующего флюорофора, который переходит в раствор и, не находясь под влиянием «тушителя», дает свой флюоресцентный сигнал. В зависимости от сигнала свечения можно судить каким аллелем (аллелями) представлен данный образец ДНК. Интенсивность сигнала флюоресценции зависит от числа циклов ПЦР. Размер амплифицируемого фрагмента ДНК обычно не превышает 150 нуклеотидов, что серьезно ограничивает применение этого метода. Вместе с тем прохождение реакции ПЦР можно контролировать в реальном времени, что является его главным преимуществом. Для того, чтобы диагностировать наличие мутации, иногда достаточно провести менее 25 циклов амплификации.By completing the complementary DNA sequence, TaqF polymerase, due to its exonuclease activity, destroys only stable duplexes. In this case, the corresponding fluorophore is cleaved, which passes into solution and, not being influenced by the quencher, gives its fluorescent signal. Depending on the glow signal, it can be judged by which allele (s) this DNA sample is represented. The fluorescence signal intensity depends on the number of PCR cycles. The size of the amplified DNA fragment usually does not exceed 150 nucleotides, which seriously limits the use of this method. However, the progress of the PCR reaction can be controlled in real time, which is its main advantage. In order to diagnose the presence of a mutation, sometimes less than 25 amplification cycles are enough.

Из уровня техники известен способ прогнозирования бесплодия у женщин - работниц нефтехимических производств (Патент РФ №2386133), который направлен на определение риска развития нарушений репродуктивной функции у работниц нефтехимического производства, подвергшихся комбинированному комплексному воздействию химических веществ. При этом, согласно способу, выделяют ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, проводят генотипирование полиморфизма A2455G и Т3801С гена CYP1A1 и -163С/А и -2467delT гена CYP1A2. При обнаружении гаплотипа CYP1A1*2A, генотипа *1А*1А полиморфных локусов -163С/А и -2467delT гена CYP1A2, гаплотипа CYP1A2*ID прогнозируют развитие бесплодия. При определении гаплотипа CYP1A2*1L прогнозируют устойчивость к формированию бесплодия у работниц.The prior art method for predicting infertility in women workers in petrochemical industries (RF Patent No. 2386133), which aims to determine the risk of developing reproductive dysfunctions in women workers in the petrochemical industry who have undergone the combined complex effects of chemicals. In this case, according to the method, DNA is isolated from peripheral venous blood lymphocytes, the A2455G and T3801C polymorphisms of the CYP1A1 and -163C / A and -2467delT of the CYP1A2 gene are genotyped. If the haplotype CYP1A1 * 2A, genotype * 1A * 1A of polymorphic loci -163C / A and -2467delT of the CYP1A2 gene, haplotype CYP1A2 * ID are detected, the development of infertility is predicted. When determining the haplotype CYP1A2 * 1L, resistance to the formation of infertility in women workers is predicted.

Использование известного изобретения позволяет получить прогностические критерии развития бесплодия или устойчивости к нему на основе молекулярно-генетических маркеров у женщин-работниц нефтехимических производств.Using the known invention allows to obtain prognostic criteria for the development of infertility or resistance to it on the basis of molecular genetic markers in women workers in petrochemical industries.

Однако указанный известный способ является узконаправленным и позволяет устанавливать лишь генетический полиморфизм системы цитохрома р450. Этим способом невозможно идентифицировать полиморфизм генов ферментов 2-й фазы детоксикации, отвечающей за ферментные системы обеспечивающих конъюгацию гаптенов, а также полиморфизм генов, характеризующих иммунный ответ.However, this known method is narrowly targeted and allows you to install only the genetic polymorphism of the cytochrome p450 system. In this way, it is impossible to identify the polymorphism of the enzyme genes of the 2nd phase of detoxification, which is responsible for the enzyme systems providing the conjugation of haptens, as well as the polymorphism of genes that characterize the immune response.

Также известен способ прогнозирования риска развития профессиональной бронхолегочной патологии (Заявка на патент РФ №2010134590), включающий забор венозной крови, выделение генетического материала, проведение полимеразной цепной реакции со специфическими праймерами, определение нуклеотидной последовательности и на основании этого определение полиморфных вариантов гена матриксной металлопротеиназы 1 - полиморфизм 1607delG, причем при проведении полимеразной цепной реакции используют специфические праймеры MP1-F 138F BIOTIN - GCG ТСА AGA CTG АТА ТСТ ТАС ТСА ТАА АСА АТА и MP1-R 138R АСА TgT TAT gCC ACT TAg ATg Agg AAA, а после проведения полимеразной цепной реакции проводят реакцию пиросеквенирования в режиме реального времени с использованием специфического праймера MP1-S 138S gTA gTT AAA ТАА ТТА gAA Ag и детекцию нуклеотидной последовательности с помощью хемилюминисцентного сигнала, далее производят сравнение полученной нуклеотидной последовательности с референсными последовательностями и по полученной пирограмме определяют какой вариант полиморфизма 1607delG имеет место в нуклеотидной последовательности, причем при выявлении отсутствия инсерций/делеций гуанина прогнозируют риск развития профессиональной бронхолегочной патологии менее 20% при воздействии на организм вредных производственных факторов, при выявлении гиперсекреторного гетерозиготного варианта 1G мутации в нуклеотидной последовательности прогнозируют риск развития профессиональной бронхолегочной патологии (30÷50)% при воздействии на организм вредных производственных факторов, а при выявлении гиперсекреторного гомозиготного варианта 2G мутации в нуклеотидной последовательности прогнозируют риск развития профессиональной бронхолегочной патологии (60÷80)% при воздействии на организм вредных производственных факторов.Also known is a method for predicting the risk of developing professional bronchopulmonary pathology (RF Patent Application No. 201034590), including venous blood sampling, isolation of genetic material, polymerase chain reaction with specific primers, determination of the nucleotide sequence and based on this determination of polymorphic variants of the matrix metalloproteinase gene 1 - polymorphism 1607delG, and when carrying out the polymerase chain reaction using specific primers MP1-F 138F BIOTIN - GCG TCA AGA CTG ATA TST TAC TCA TAA ACA ATA and MP1-R 138R ACA TgT TAT gCC ACT TAg ATg Agg AAA, and after the polymerase chain reaction, the pyrosequencing reaction is carried out in real time using a specific primer MP1-S 138S gTA gTT AAA TAA TTA gAA Ag and nucleotide detection sequences using a chemiluminescent signal, then the obtained nucleotide sequence is compared with reference sequences and the resulting pyrogram determines which version of 1607delG polymorphism occurs in the nucleotide sequence, if a lack of insertions / deletions of guanine is detected, the risk of developing a professional bronchopulmonary pathology is predicted to be less than 20% when exposure to harmful production factors, if a hypersecretory heterozygous variant 1G is detected, mutations in the nucleotide sequence predict a risk of developing a professional bronchopulmonary pathology (30 ÷ 50)% harmful production factors, and when identifying a hypersecretory homozygous variant 2G mutation in the nucleotide sequence and predict the risk of developing professional bronchopulmonary pathology (60 ÷ 80)% when exposed to harmful production factors.

Однако указанный известный способ позволяет устанавливать лишь генетический полиморфизм генов 2-й фазы детоксикации. Этим способом невозможно идентифицировать полиморфизм генов 1-й фазы метаболизма, кодирующих ферментные системы процессов окисления гаптенов (прежде всего гидроксилирования), а также полиморфизм генов иммунного ответа.However, this known method allows you to establish only genetic polymorphism of genes of the 2nd phase of detoxification. In this way, it is impossible to identify the polymorphism of genes of the first phase of metabolism encoding the enzyme systems of hapten oxidation processes (primarily hydroxylation), as well as the polymorphism of the immune response genes.

Задачей создания заявляемого изобретения является разработка объективного способа прогнозирования популяционных нарушений биотрансформации чужеродных веществ, обусловленных воздействием вредных химических факторов среды обитания, с обеспечением доступности подобных исследований за счет использования традиционного оборудования.The task of creating the claimed invention is to develop an objective method for predicting population disorders of biotransformation of foreign substances due to exposure to harmful chemical environmental factors, ensuring the availability of such studies through the use of traditional equipment.

Технический результат, достигаемый предлагаемым изобретением, заключается в получении критериев оценки течения популяционных нарушений при воздействии вредных химических факторов среды обитания, позволяющих прогнозировать биотрансформацию под воздействием указанных факторов, с обеспечением точности и достоверности результатов.The technical result achieved by the present invention is to obtain criteria for assessing the course of population disturbances when exposed to harmful chemical environmental factors, allowing prediction of biotransformation under the influence of these factors, ensuring accuracy and reliability of the results.

Указанный технический результат достигается предлагаемым способом прогнозирования популяционных нарушений биотрансформации чужеродных веществ, обусловленных воздействием техногенных химических факторов среды обитания, согласно которому производят отбор группы одной этнической популяции, проживающей на территории воздействия вредных химических факторов, у исследуемого контингента отбирают пробы биологического материала, а именно буккального эпителия, осуществляют выделение из указанной пробы дезоксирибонуклеиновой кислоты ДНК, далее на детектирующем амплификаторе с использованием полимеразной цепной реакции ПЦР проводят генотипирование полиморфизма - 9893A/G гена CYP1A1, 921А/С гена СРОХ и G308A гена TNF-альфа путем исследования аллельного состояния каждого из выбранных генов, устанавливают одно из следующих состояний гена: гетерозиготное, или нормальное гомозиготное, или минорное гомозиготное, рассчитывают распространенность минорного аллеля для каждого гена по формуле:The indicated technical result is achieved by the proposed method for predicting population disorders of the biotransformation of foreign substances caused by exposure to technogenic chemical environmental factors, according to which a group of one ethnic population living in the territory affected by harmful chemical factors is selected, samples of biological material, namely, buccal epithelium, are taken from the studied population. , carry out the selection from the specified sample deoxyribonucleic acid DN K, then a polymorphism — 9893A / G of the CYP1A1, 921A / C gene of the CPPX gene and G308A of the TNF-alpha gene is genotyped using a PCR polymerase chain reaction using a PCR polymerase chain reaction, and one of the following gene states is established: heterozygous , or normal homozygous, or minor homozygous, calculate the prevalence of the minor allele for each gene according to the formula:

$P = \frac{Ч m h o \times 2 + Ч h e t}{2 \times N} \times 100 %,$

где

P = \frac{H m h o \times 2 + H h e t}{2 \times N} \times one hundred %,

Where

Р - распространенность минорного аллеля в исследуемой группе (%);P is the prevalence of the minor allele in the study group (%);

Чmho - число лиц с минорным гомозиготным генотипом;Чho - the number of individuals with a minor homozygous genotype;

Чhet - число лиц с гетерозиготным генотипом;Чhet - the number of individuals with a heterozygous genotype;

N - общее число лиц исследуемой группы одной этнической популяции; рассчитывают коэффициент распространенности минорных аллелей для изучаемых генов по формуле:N is the total number of individuals in the study group of one ethnic population; the prevalence coefficient of minor alleles for the studied genes is calculated by the formula:

$K p = \frac{P_{C Y P} + P_{C P O X} + P_{T N F}}{3}$

, где

K p = \frac{P_{C Y P} + P_{C P O X} + P_{T N F}}{3}

where

Kp - коэффициент распространенности минорных аллелей в исследуемой группе (%);Kp is the prevalence coefficient of minor alleles in the study group (%);

P - распространенности минорных аллелей соответствующих генов в исследуемой группе (%);P is the prevalence of minor alleles of the corresponding genes in the study group (%);

и при превышении указанного коэффициента распространенности минорных аллелей более 10%, при одновременном превышении более, чем на 30% количества лиц в исследуемой группе, в крови которых присутствует в концентрации более, чем референтной, по меньшей мере, одно из приоритетных для среды обитания указанной территории, вредное химическое вещество, прогнозируют популяционные нарушения, связанные с биотрансформацией чужеродных веществ, обусловленных воздействием техногенных химических факторов среды обитания.and if the specified prevalence coefficient of minor alleles is exceeded by more than 10%, while at the same time exceeds by more than 30% the number of individuals in the study group in whose blood there is a concentration of more than the reference, at least one of the priorities for the environment of the specified territory , a harmful chemical substance, population disturbances associated with the biotransformation of foreign substances due to exposure to technogenic chemical environmental factors are predicted.

Указанный технический результат обеспечивается за счет следующего.The specified technical result is ensured by the following.

Для понимания существа вопроса ниже приведено пояснение действия вредных химических веществ среды обитания с учетом нуклеотидных изменений.To understand the essence of the issue, the following is an explanation of the action of harmful chemicals in the environment, taking into account nucleotide changes.

Большинство ксенобиотиков, попадая в организм, не оказывают прямого биологического эффекта, а вначале подвергаются различным превращениям, так называемой биотрансформации, которая завершается их выведением из организма. Как правило, она представляет собой многоступенчатый, «каскадный» процесс, в котором одновременно или поочередно участвуют многие ферменты системы детоксикации. В наиболее типичном варианте биотрансформация ксенобиотиков представлена двухэтапным процессом, включающим в себя активацию (1 фаза), детоксикацию (2 фаза), а также процессами, ассоциированными с состоянием иммунной системы.Most xenobiotics, entering the body, do not have a direct biological effect, but at first they undergo various transformations, the so-called biotransformation, which ends with their elimination from the body. As a rule, it is a multi-stage, “cascading” process, in which many enzymes of the detoxification system are simultaneously or alternately involved. In the most typical embodiment, the biotransformation of xenobiotics is represented by a two-stage process, including activation (1 phase), detoxification (2 phase), as well as processes associated with the state of the immune system.

В заявляемом способе в качестве генов, характеризующих популяционные нарушения биотрансформации чужеродных веществ, предлагается использовать ген CYP1A1, ген СРОХ и ген TNF-альфа, а в качестве их полиморфизмов участки: 9893A/G гена CYP1A1, 921А/С гена СРОХ и G308A гена TNF-альфа. Исследования показали, что только при использовании указанных полиморфизмов обеспечивается достоверное и точное прогнозирование популяционных нарушений в условиях воздействия на популяцию техногенных химических факторов (ТХФ) среды обитания (под ТХФ понимаются факторы техногенного характера, формирующие химическое загрязнение окружающей среды вредными химическими веществами и оказывающие негативное влияние на здоровье). Ниже приведены сведения об участии указанных генов в процессах метаболизма техногенных химических соединенийIn the inventive method, it is proposed to use the CYP1A1 gene, the CROX gene and TNF-alpha gene as genes characterizing population disorders of the biotransformation of foreign substances, and as their polymorphisms sections: 9893A / G of the CYP1A1 gene, 921A / C of the CROX gene and G308A of the TNF-gene alpha. Studies have shown that only with the use of these polymorphisms reliable and accurate prediction of population disturbances is provided under the influence of the environment on the population of technogenic chemical factors (TCF) (TCF refers to technogenic factors that form chemical pollution of the environment with harmful chemicals and have a negative effect on health). Below is information on the participation of these genes in the metabolism of technogenic chemical compounds

В результате действия ферментов 1-й фазы происходит активация ксенобиотиков с образованием промежуточных электрофильных метаболитов (свободные радикалы, перекиси, активные кислород и азот). Фаза активации обеспечивается, главным образом, суперсемейством цитохрома Р-450 (CYP), а также многочисленным семейством нецитохромных окислителей (гидролазы, эстеразы, амидазы, дегидрогеназы и др.). Их основные функции заключаются в присоединении к молекуле ксенобиотика гидрофильных групп, благодаря чему происходит детоксикация десятков тысяч веществ.As a result of the action of phase 1 enzymes, xenobiotics are activated to form intermediate electrophilic metabolites (free radicals, peroxides, active oxygen and nitrogen). The activation phase is provided mainly by the superfamily of cytochrome P-450 (CYP), as well as by a large family of non-cytochrome oxidizing agents (hydrolases, esterases, amidases, dehydrogenases, etc.). Their main functions are to attach hydrophilic groups to the xenobiotic molecule, due to which tens of thousands of substances are detoxified.

Суперсемейство цитохромов Р-450 (CYP-450) отвечает за микросомальное окисление и представляет собой группу ферментов, имеющих множество изоформ (более 1000), которые не только осуществляют метаболизм лекарств, но и участвуют в синтезе стероидных гормонов, холестерина и других веществ. Изоферменты цитохромов на основании гомологии нуклеотидной и аминокислотной последовательностей подразделяют на семейства, которые, в свою очередь, делят на подсемейства. Каждый изофермент цитохрома Р-450 кодируется своим геном, которые локализуются на разных хромосомах.The superfamily of cytochromes P-450 (CYP-450) is responsible for microsomal oxidation and is a group of enzymes that have many isoforms (more than 1000) that not only metabolize drugs, but also participate in the synthesis of steroid hormones, cholesterol and other substances. Cytochrome isoenzymes based on the homology of the nucleotide and amino acid sequences are divided into families, which, in turn, are divided into subfamilies. Each isoenzyme of cytochrome P-450 is encoded by its own gene, which are localized on different chromosomes.

Семейство Р-450 CYP1 метаболизирует сравнительно небольшую часть техногенных химических факторов, самые важные из которых представлены полициклическими ароматическими углеводородами (ПАУ). Особенно важная роль в этом принадлежит генам CYP1A1 и CYP1A2, локализованным на хромосоме 15.The P-450 family of CYP1 metabolizes a relatively small portion of technogenic chemical factors, the most important of which are polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs). A particularly important role in this belongs to the CYP1A1 and CYP1A2 genes located on chromosome 15.

CYP1A1 кодирует фермент арилуглеводородкарбоксилазу, который участвует в метаболизме эстрогенов, некоторых лекарственных средств и ПАУ - основных компонентов табачного дыма и продуктов сжигания органического топлива. Этот фермент контролирует начальный метаболизм ПАУ и ряда других органических соединений, приводящий к образованию канцерогенов (например, бенз(а)пирена). Участвует в биоактивации нитрозаминов.CYP1A1 encodes the enzyme aryl hydrocarbon carboxylase, which is involved in the metabolism of estrogen, certain drugs and PAHs - the main components of tobacco smoke and products of burning organic fuel. This enzyme controls the initial metabolism of PAHs and a number of other organic compounds, leading to the formation of carcinogens (for example, benzo (a) pyrene). Participates in the bioactivation of nitrosamines.

2-я фаза (детоксикация) отвечает за перенос на активированные продукты 1-й фазы ацетильных, метальных, сульфгидрильных групп либо глутатиона, в результате чего образуются гидрофильные конъюгаты.The 2nd phase (detoxification) is responsible for the transfer of acetyl, methyl, sulfhydryl groups or glutathione to activated products of the 1st phase, resulting in the formation of hydrophilic conjugates.

Ферменты 2-й фазы детоксикации обеспечивают эффективный перевод промежуточных электрофильных метаболитов в водорастворимые, нетоксические соединения, которые выводятся из организма. В процессе 2-й фазы происходит глюкуронирование (УДФ-глюкуронилтрансферазы), ацетилирование (N-ацетилтрансферазы), S-метилирование (тиопуринметилтрансфераза), сульфатирование (сульфотрансферазы), водная конъюгация (эпоксидгидролазы), конъюгация с глютатионом (глютатионтрансферазы), декарбоксилирование копропорфириногеноксидазой.Enzymes of the 2nd phase of detoxification provide an effective translation of intermediate electrophilic metabolites into water-soluble, non-toxic compounds that are excreted from the body. In the process of the 2nd phase, glucuronidation (UDF-glucuronyl transferase), acetylation (N-acetyltransferase), S-methylation (thiopurine methyltransferase), sulfation (sulfotransferase), water conjugation (epoxyhydrolase), conjugation oxidation reduction (conjugation oxidation) are performed.

Ген СРОХ кодирует синтез фермента копропорфириногеноксидазы, который катализирует окислительное декарбоксилирование металлопорфиринов. Металлопорфирины являются макроциклическими комплексами металлов (Mn, Со, Fe, Hg) и гетероциклических органических соединений (пиррол) и отличаются от бесчисленного множества других групп макроциклических комплексов тем, что являются ароматическими макроциклами с уникальной сопряженной σ-системой. В этом сопряженном состоянии металлы проявляют свою биологическую активность. При нарушении синтеза металлопорфиринов, обусловленных дефектом гена, происходит накопление неактивных форм металлоорганических соединений в печени, селезенке, коже и вызывает развитие симптомов интоксикации - гипербилирубинемию, гемолитическую анемию, повышение чувствительности к солнечному свету, неврологические нарушения, злокачественные опухоли.The СРОХ gene encodes the synthesis of the coproporphyrinogen oxidase enzyme, which catalyzes the oxidative decarboxylation of metalloporphyrins. Metalloporphyrins are macrocyclic complexes of metals (Mn, Co, Fe, Hg) and heterocyclic organic compounds (pyrrole) and differ from countless other groups of macrocyclic complexes in that they are aromatic macrocycles with a unique conjugated σ-system. In this conjugated state, metals exhibit their biological activity. If the synthesis of metalloporphyrins due to a gene defect is disturbed, inactive forms of organometallic compounds accumulate in the liver, spleen, and skin and cause the development of intoxication symptoms - hyperbilirubinemia, hemolytic anemia, increased sensitivity to sunlight, neurological disorders, and malignant tumors.

Исключительная роль в элиминации техногенных химических факторов принадлежит иммунной системе. Отсюда важность имеющих место в иммунной системе полиморфизмов.An exclusive role in the elimination of technogenic chemical factors belongs to the immune system. Hence the importance of polymorphisms taking place in the immune system.

Продукт гена TNF-альфа - фактор некроза опухоли альфа относится к цитокиновой системе и представляет собой клеточный медиатор макрофагов и лимфоцитов, играет важную роль в регуляции процессов дифференцировки, роста и метаболизма клеток, является медиатором воспалительных процессов, инициирует образование свободных радикалов и может способствовать развитию оксидативного стресса.TNF-alpha gene product - tumor necrosis factor alpha belongs to the cytokine system and is a cellular mediator of macrophages and lymphocytes, plays an important role in the regulation of differentiation, growth and metabolism of cells, is a mediator of inflammatory processes, initiates the formation of free radicals and can contribute to the development of oxidative stress.

Роль TNF-альфа в развитии оксидативного стресса заключается в активации индуцибельной NO-синтетазы (NOS) - энзима, ответственного за синтез оксида азота, играющего важную роль в образовании и трансформации свободных радикалов.The role of TNF-alpha in the development of oxidative stress is the activation of inducible NO synthetase (NOS), an enzyme responsible for the synthesis of nitric oxide, which plays an important role in the formation and transformation of free radicals.

Известно, по крайней мере, 8 полиморфных вариантов гена TNF-альфа. Полиморфизм промоторной области гена TNF-альфа G-308A ассоциирован с повышением продукции TNF-альфа и, таким образом, способствует повышению содержания NOS, что сопровождается увеличением концентрации свободных радикалов, которые имеют цитотоксические свойства и играют важную роль в иммуновоспалительных процессах и в развитии оксидативного стресса. Накопление свободных радикалов, в свою очередь, вызывает дегрануляцию тучных клеток. При этом высвобождается широкий спектр биологически активных веществ, обуславливающих гиперчувствительность и гиперреактивность.At least 8 polymorphic variants of the TNF-alpha gene are known. The promoter region polymorphism of the TNF-alpha gene G-308A is associated with an increase in the production of TNF-alpha and, thus, contributes to an increase in the content of NOS, which is accompanied by an increase in the concentration of free radicals, which have cytotoxic properties and play an important role in immuno-inflammatory processes and in the development of oxidative stress . The accumulation of free radicals, in turn, causes mast cell degranulation. In this case, a wide range of biologically active substances that cause hypersensitivity and hypersensitivity are released.

Таким образом, выбор в качестве информационного критерия полиморфизмов - 9893A/G гена CYP1A1, 921А/С гена СРОХ и G308A гена TNF-альфа обеспечивает адекватный прогноз популяционных нарушений биотрансформации чужеродных веществ, обусловленных воздействием техногенных химических факторов, а их идентификация является комплексным критерием ключевых дефектов метаболизма техногенных соединений, ассоциированных с несостоятельностью иммунной системы,Thus, the choice of the CYP1A1 gene, 921A / C of the CPX gene and the TNF-alpha gene as an information criterion for polymorphisms — 9893A / G, of the TNF-alpha gene provides an adequate prognosis of population disorders of the biotransformation of foreign substances caused by exposure to technogenic chemical factors, and their identification is a complex criterion of key defects metabolism of technogenic compounds associated with the failure of the immune system,

Использование других полиморфизмов указанных генов не позволит точно оценить вероятность популяционных нарушений, потому что другие локусы исследуемых генов имеют цитируемый полиморфизм принципиально отличный от 10%-го. В этом случае наблюдаемый полиморфизм будет либо типичным вариантом нормы, либо не совместимым с функцией гена вариантом мутации.The use of other polymorphisms of these genes will not allow us to accurately assess the probability of population disorders, because other loci of the studied genes have a cited polymorphism fundamentally different from 10%. In this case, the observed polymorphism will be either a typical variant of the norm or mutation variant incompatible with the gene function.

Благодаря использованию в предлагаемом способе в качестве исследуемого материала пробы биологического материала - буккального эпителия, обеспечивается простота и надежность исследований, а также получение нужной информативности.Due to the use in the proposed method as a test material of a sample of biological material - buccal epithelium, the simplicity and reliability of research, as well as obtaining the necessary information content, are ensured.

Использование для определения заявленных полиморфизмов генов полимеразной цепной реакции (далее ПЦР), осуществляемой с помощью детектирующего амплификатора, обеспечивает точность и специфичность диагностики, поскольку предполагает четкую идентификацию последовательности нуклеотидов ДНК и их комбинаций.The use of polymerase chain reaction genes (hereinafter PCR) for determination of the claimed polymorphisms, carried out using a detecting amplifier, ensures the accuracy and specificity of the diagnosis, since it requires a clear identification of the DNA nucleotide sequence and their combinations.

Благодаря в последующем установлению одного из следующих состояний гена: гетерозиготное, или нормальное гомозиготное, или минорное гомозиготное, обеспечивается идентификация степени функциональности гена, соответствия его здоровому (дикому) аллельному варианту.Thanks to the subsequent establishment of one of the following states of the gene: heterozygous, or normal homozygous, or minor homozygous, identification of the degree of functionality of the gene and its healthy (wild) allelic variant is provided.

Расчет распространенности минорного аллеля для каждого гена по заявленной формуле позволяет установить приоритетность вклада каждого из них в формирование популяционных нарушений биотрансформации чужеродных веществ.Calculation of the prevalence of the minor allele for each gene according to the stated formula makes it possible to establish the priority of the contribution of each of them to the formation of population disorders of the biotransformation of foreign substances.

А последующий расчет коэффициента распространенности минорных аллелей в исследуемой группе позволяет количественно охарактеризовать величину негативных полиморфизмовA subsequent calculation of the prevalence coefficient of minor alleles in the study group allows us to quantitatively characterize the magnitude of negative polymorphisms

Использование показателя превышения расчетного коэффициента распространенности минорных аллелей более, чем 10%, позволяет прогнозировать популяционные нарушения, связанные с биотрансформацией чужеродных веществ, обусловленных воздействием вредных химических факторов среды обитания. Показатель 10% обусловлен наличием устойчивого аллельного популяционного фона, который может сдвигаться под воздействием стрессовой техногенной нагрузки как в отношении аллельности каждого из анализируемых генов, так и их комбинации.Using an excess of the estimated prevalence rate of minor alleles of more than 10% allows predicting population disorders associated with the biotransformation of foreign substances due to exposure to harmful chemical environmental factors. The 10% indicator is due to the presence of a stable allelic population background, which can shift under the influence of a stressful technogenic load both with respect to the allelicity of each of the analyzed genes, and their combination.

Использование, наряду с вышеуказанным, в качестве дополнительного прогнозного критерия - превышение более, чем на 30% количества лиц в исследуемой группе, в крови которых присутствует в концентрации более, чем референтной, по меньшей мере, одно из приоритетных для среды обитания указанной территории, вредное химическое вещество, который обусловлен тем, что наличие нарушенного аллельного фона по анализируемым полиморфизмам не получит негативной реализации для здоровья без критической распространенности в популяции «носительства» в крови более, чем референтных концентраций техногенных химических факторов.The use, along with the above, as an additional predictive criterion is an excess of more than 30% of the number of people in the study group, in whose blood there is a concentration of more than the reference, at least one of the priority for the environment of the specified territory, harmful a chemical substance, which is due to the fact that the presence of a disturbed allelic background in the analyzed polymorphisms will not receive a negative realization for health without a critical prevalence in the population of “carriage” in the blood more than the reference concentrations of man-made chemical factors.

Предлагаемый способ реализуется следующим образом.The proposed method is implemented as follows.

1. Выбирают территорию экологического риска, характеризующуюся наличием техногенных химических факторов - химических токсикантов, обусловленных экологической средой обитания. Исследования были проведены на территории г. Чусовой, характеризующейся наличием предприятия металлургической промышленности; на территории г.Перми, характеризующейся наличием предприятия химической промышленности; на территории Пермского района Пермского края, характеризующейся наличием предприятия нефтеорганического синтеза.1. Choose the territory of environmental risk, characterized by the presence of technogenic chemical factors - chemical toxicants, due to the ecological environment. Studies were conducted on the territory of the city of Chusovoy, characterized by the presence of a metallurgical industry enterprise; on the territory of Perm, characterized by the presence of a chemical industry enterprise; on the territory of the Perm region of the Perm Territory, characterized by the presence of a petroleum-organic synthesis enterprise.

2. На указанной территории производят отбор группы лиц одной этнической популяции. Затем производят отбор пробы крови у обследуемого человека, в которой определяют содержание вредных химических веществ (контаминантов), приоритетных для территории среды проживания человека. При этом определение вредных веществ в крови проводят по МУК 4.1.2102-4.1.2116-06 «Определение вредных веществ в биологических средах» (Москва, 2008) и по МУК 4.1.763-4.1.779-99 «Определение химических соединений в биологических средах» (Москва, 2000) и устанавливают, имеется ли превышение концентрации этого контаминанта в пробе крови над его референтным уровнем.2. On the specified territory, a group of individuals of the same ethnic population is selected. Then, a blood sample is taken from the person being examined, in which the content of harmful chemicals (contaminants), which are priority for the territory of the human environment, is determined. In this case, the determination of harmful substances in the blood is carried out according to MUK 4.1.2102-4.1.2116-06 “Determination of harmful substances in biological media” (Moscow, 2008) and according to MUK 4.1.763-4.1.779-99 “Determination of chemical compounds in biological media ”(Moscow, 2000) and establish whether there is an excess of the concentration of this contaminant in the blood sample over its reference level.

Также производят отбор пробы в виде мазка со слизистой оболочки щеки (буккальный эпителий), причем забор осуществляют сухими стерильными зондами с ватными тампонами вращательными движениями без травматизации после предварительного полоскания полости рта водой.A sample is also taken in the form of a smear from the mucous membrane of the cheek (buccal epithelium), and the sampling is carried out with dry sterile probes with cotton swabs in rotational movements without injury after preliminary rinsing of the oral cavity with water.

После забора материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в стерильную пробирку типа «Эппендорф» с 500 мкл транспортной среды (стерильный 0,9%-ный раствор NaCl). Конец зонда отламывают или отрезают, с расчетом, чтобы он позволил плотно закрыть крышку пробирки. Пробирку с раствором и рабочей частью зонда закрывают.After taking the material, the swab (the working part of the probe with a cotton swab) is placed in a sterile Eppendorf tube with 500 μl of transport medium (sterile 0.9% NaCl solution). The end of the probe is broken off or cut off, with the expectation that it will allow the tube lid to be tightly closed. The tube with the solution and the working part of the probe is closed.

3. Далее производят выделение ДНК из пробы. Для этого пробы в количестве 100 мкл лизируют 300 мкл лизирующего раствора, представляющего собой 0,5%-ный раствор саркозила и протеиназы К (20 мг/мл) в ацетатном буфере (pH 7,5). Затем добавляют сорбент (каолин) и последовательными процедурами промывки отмывают фосфатно-солевым буфером (pH 7,2) пробы от белков и смесью изопропиловый спирт:ацетон от липидов. Нуклеиновые кислоты остаются при этом на сорбенте. Далее адсорбированные на сорбенте ДНК из пробы экстрагируют ТЕ-буфером, представляющим собой смесь 10 мМ трис-HCl и 1 мМ ЭДТА (pH 8,0). Экстракт подвергают центрифугированию. После центрифугирования пробирки надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК.3. Next, DNA is extracted from the sample. For this, samples in an amount of 100 μl are lysed with 300 μl of a lysing solution, which is a 0.5% solution of sarcosyl and proteinase K (20 mg / ml) in acetate buffer (pH 7.5). Then a sorbent (kaolin) is added and the washing samples are washed with phosphate-buffered saline (pH 7.2) from proteins and a mixture of isopropyl alcohol: acetone from lipids. Nucleic acids remain on the sorbent. Next, the DNA adsorbed on the sorbent from the sample is extracted with TE buffer, which is a mixture of 10 mM Tris-HCl and 1 mM EDTA (pH 8.0). The extract is centrifuged. After centrifugation of the tube, the supernatant contains purified DNA.

4. Полученный материал готов к постановке полимеразной цепной реакции (ПЦР). Полимеразную цепную реакцию проводят на детектирующем амплификаторе с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» с использованием готовых наборов праймеров и зондов производства Applied Biosystems, в котором в качестве праймеров использовались участки ДНК гена цитохрома Р-450 -CYP1A1 (9893A/G), гена фермента копропорфириногеноксидазы СРОХ (921А/С) и гена фактора некроза опухолей TNF-альфа (G308A). Каждый раз используется два праймера, каждый из которых комплементарен лишь одному аллельному варианту выбранного участка гена. Эти участки выбраны из базы данных однонуклеотидных замен (SNP) и имеют соответствующее международное обозначение. Для CYP1A1 был выбран участок - rs4646521, для СРОХ - rs1131857, для TNF - rs1800629.4. The resulting material is ready for formulation of the polymerase chain reaction (PCR). The polymerase chain reaction is carried out on a detecting amplifier with hybridization-fluorescence detection in real time using ready-made sets of primers and probes manufactured by Applied Biosystems, in which sections of the cytochrome P-450 -CYP1A1 DNA gene (9893A / G) were used as primers copro porphyrinogen oxidase enzyme CPROX (921A / C) and tumor necrosis factor gene TNF-alpha (G308A). Each time, two primers are used, each of which is complementary to only one allelic variant of the selected gene region. These sites are selected from the database of single nucleotide substitutions (SNP) and have the appropriate international designation. The section - rs4646521 was chosen for CYP1A1, rs1131857 for the CPX, and rs1800629 for TNF.

5. Проводят реакцию амплификации, это достигается тем, что для исследования аллельного состояния каждого гена у отдельного человека готовят свою реакционную смесь. В пробирку вносят 0,1 мкл готовой смеси праймеров и зондов для выбранного гена. В эту же пробирку добавляют остальные компоненты необходимые для осуществления ПЦР: нуклеотиды (дезоксинуклеозидтрифосфаты: по 10 мМ дАТФ, дТТФ, дГТФ, дЦТФ), буфера (100 мМ трис-HCl-буфера, 500 мМ КСl, 40 мМ MgCl₂) и Tag F-полимеразы. Вносят пробу в количестве 10 мкл. Таким образом, общий объем реакционной смеси составляет 25 мкл. Пробирка плотно закрывается пробкой и устанавливается в амлификатор.5. The amplification reaction is carried out, this is achieved by the fact that in order to study the allelic state of each gene in an individual, their reaction mixture is prepared. 0.1 μl of the prepared mixture of primers and probes for the selected gene is added to the tube. The remaining components necessary for PCR are added to the same tube: nucleotides (deoxynucleoside triphosphates: 10 mM dATP, dTTP, dGTF, dTTP), buffers (100 mM Tris-HCl buffer, 500 mM KCl, 40 mM MgCl ₂ ) and Tag F polymerases. Make a sample in an amount of 10 μl. Thus, the total volume of the reaction mixture is 25 μl. The test tube is tightly closed by a stopper and installed in a shock absorber.

6. При проведении ПЦР амплификацию и детекцию проводят на детектирующем амплификаторе CFX96 фирмы Bio-Rad.6. When conducting PCR amplification and detection is carried out on a detection amplifier CFX96 company Bio-Rad.

Используется универсальная программа амплификации, подобранная производителем реактивов. Она включает в себя несколько этапов: 1 этап -активация TaqF-полимеразы (режим «горячего старта») продолжается 15 мин при 95°C; 2 этап - установочные циклы амплификации без измерения флуоресценции (5 циклов); 3 этап - рабочие циклы амплификации с измерением флюоресценции (40 циклов).A universal amplification program selected by the reagent manufacturer is used. It includes several stages: Stage 1 — TaqF polymerase activation (“hot start” mode) lasts 15 minutes at 95 ° C; Stage 2 - installation cycles of amplification without measuring fluorescence (5 cycles); Stage 3 - amplification duty cycles with fluorescence measurement (40 cycles).

Каждый цикл амплификации включает в себя денатурацию ДНК (5 с при 95°C), отжиг праймеров (20 с при 60°C) и саму реакцию полимеризации ДНК (15 с при 72°C).Each amplification cycle includes DNA denaturation (5 s at 95 ° C), primer annealing (20 s at 60 ° C) and the DNA polymerization reaction itself (15 s at 72 ° C).

Регистрация сигнала флюоресценции, возникающего при накоплении продуктов амплификации участков ДНК, проводится в режиме «реального времени» после стадии отжига праймеров для выбранных генов по каналу VIC - для детекции одного из аллельных вариантов генов, и по каналу FAM - для альтернативного варианта.The fluorescence signal arising from the accumulation of amplification products of DNA regions is recorded in the “real time” mode after the annealing of the primers for the selected genes via the VIC channel to detect one of the allelic variants of the genes and through the FAM channel for an alternative.

Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флюоресценции с установленной на заданном уровне пороговой линией, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла (N) в соответствующей графе в таблице результатов, отображаемой в программном обеспечении для амплификатора CFX96.The results are interpreted based on the presence (or absence) of the intersection of the fluorescence curve with the threshold line set at a predetermined level, which corresponds to the presence (or absence) of the threshold cycle value (N) in the corresponding column in the result table displayed in the CFX96 amplifier software.

По соотношению пороговых циклов, полученных по двум каналам детекции, определяют состояние гена в исследуемом участке ДНК (метод аллельной дискриминации). Возможных вариантов состояния гена было два: гомозиготное - в случае, когда одно из значений порогового цикла не определяется (ниже пороговой линии) и гетерозиготное - в случае, когда получено два значения пороговых циклов и по этим каналам получены параболические кривые флюоресценции. В зависимости от того, накопление какого продукта амплификации происходит в реакции, устанавливается гетерозиготное, или нормальное гомозиготное, или минорное состояние гена.The ratio of the threshold cycles obtained through the two detection channels determines the state of the gene in the studied DNA region (allelic discrimination method). There were two possible variants of the state of the gene: homozygous - in the case when one of the values of the threshold cycle is not determined (below the threshold line) and heterozygous - in the case when two values of the threshold cycles were obtained and parabolic fluorescence curves were obtained from these channels. Depending on the accumulation of which amplification product occurs in the reaction, a heterozygous or normal homozygous or minor state of the gene is established.

При проведении массовых исследований регистрируются частоты аллельных вариантов изучаемых генов и частоты состояний генов (генотипов) в соответствии с таблицей 1.When conducting mass research, the frequencies of allelic variants of the studied genes and the frequencies of the states of genes (genotypes) are recorded in accordance with table 1.

Таблица 1Table 1 Аллельные состояния анализируемых генов Allelic states of the analyzed genes состояние гена (генотип)gene condition (genotype) нормальный аллельnormal allele минорный аллельminor allele CYP1A1-GGCYP1A1-GG НормальноеNormal СРОХ-ААSROCH-AA отсутствуетabsent гомозиготноеhomozygous TNF-GGTNF-GG CYP1A1-GCYP1A1-G CYP1A1-АCYP1A1-A ГетерозиготноеHeterozygous СРОХ-АSROCH-A СРОХ-ССРОХ-С TNF-GTNF-G TNF-ATNF-A CYP1A1-AACYP1A1-AA Минорное гомозиготноеMinor homozygous отсутствуетabsent СРОХ-ССSROCH-SS TNF-AATNF-AA

Примечание: В таблице приведены варианты аллельных состояний анализируемых генов (гетерозиготное и гомозиготное). Для каждого варианта генов приведены сочетания нуклеотидов, характерные для нормальных и минорных комбинаций.Note: The table shows the variants of allelic states of the analyzed genes (heterozygous and homozygous). For each gene variant, nucleotide combinations characteristic of normal and minor combinations are given.

Частоты аллелей используются в дальнейшем для расчета их распространенности в популяциях по формуле:Allele frequencies are used later to calculate their prevalence in populations by the formula:

$P = \frac{Ч m h o \times 2 + Ч h e t}{2 \times N} \times 100 %,$

где

P = \frac{H m h o \times 2 + H h e t}{2 \times N} \times one hundred %,

Where

P - распространенность минорного аллеля в исследуемой группе (%);P is the prevalence of the minor allele in the study group (%);

N - число наблюдений в популяции.N is the number of observations in the population.

Далее рассчитывают коэффициент распространенности минорных аллелей для выбранных генов по формуле:Next, the prevalence coefficient of minor alleles for the selected genes is calculated by the formula:

$K p = \frac{P_{C Y P} + P_{C P O X} + P_{T N F}}{3}$

, где

K p = \frac{P_{C Y P} + P_{C P O X} + P_{T N F}}{3}

where

P - распространенности минорных аллелей соответствующих генов в исследуемой группе (%).P is the prevalence of minor alleles of the corresponding genes in the study group (%).

7. Для прогнозирования популяционных нарушений биотрансформации чужеродных веществ, обусловленных воздействием техногенных химических факторов среды обитания, сравнивают установленный коэффициент распространенности минорных аллелей в исследуемой группе с величиной 10% и при превышении указанного коэффициента более этой величины и одновременно при превышении более, чем на 30% количества лиц в исследуемой группе, в крови которых присутствует в концентрации более чем референтной, по меньшей мере, одно из приоритетных для среды обитания указанной территории, вредное химическое вещество, прогнозируют указанные популяционные нарушения.7. To predict population disorders of the biotransformation of foreign substances caused by the effects of technogenic chemical environmental factors, the established prevalence coefficient of minor alleles in the study group is compared with a value of 10% and when the specified coefficient is exceeded by more than this value and at the same time if the amount exceeds more than 30% persons in the study group, in the blood of which is present in a concentration of more than reference, at least one of the priority for the environment in of the indicated territory, a harmful chemical substance, the indicated population disturbances are predicted.

Предлагаемый способ был испытан в клинических условиях.The proposed method has been tested in a clinical setting.

Для апробации предлагаемого способа были исследованы 188 ребенка европеоидной расы (возраст 3-7 лет), проживающие на территории Пермского Прикамья в условиях внешнесредовой экспозиции следующих приоритетных для конкретных городских территорий проживания указанных детей вредных химических веществ: метанол, фенол, формальдегид, бенз(а)пирен, свинец.To test the proposed method were studied 188 children of the Caucasian race (age 3-7 years) living in the Perm Prikamye under the conditions of external environmental exposure of the following harmful chemicals that are priority for specific urban areas of these children: methanol, phenol, formaldehyde, benz (a) pyrene, lead.

Для доказательства достоверности предлагаемого способа была исследована контрольная популяция детей (возраст 3 - 7 лет) в количестве 33 человек, проживающих в сельской местности, в которой отсутствовали вышеуказанные вредные химические соединения.To prove the reliability of the proposed method, a control population of children (3-7 years old) was studied in an amount of 33 people living in rural areas in which the above harmful chemical compounds were absent.

Ниже в таблице 2 приведены результаты, полученные при реализации предлагаемого способа, на территориях, для которых характерны в качестве приоритетных вышеуказанные вредные химические соединения.Table 2 below shows the results obtained during the implementation of the proposed method, in territories for which the above mentioned harmful chemical compounds are characteristic as priorities.

Таблица 2table 2 Данные, полученные при реализации предлагаемого способаThe data obtained during the implementation of the proposed method ГенGene Состояние гена иGene condition and КонтрольнаяControl ИсследуемаяResearched аллеляallele популяция,population популяция,population %/(число лиц)% / (number of persons) %/(число лиц)% / (number of persons) N=33N = 33 N=188N = 188 А/А*A / A * 0%(0)0% (0) 4%(8)4% (8) CYP1A1CYP1A1 A/G**A / G ** 12%(4)12% (4) 19%(36)19% (36) -9893A/G-9893A / G G/G***G / G *** 88%(29)88% (29) 77%(144)77% (144) G****G **** 92%92% 86%86% A*****A ***** 8%8% 14%fourteen% СРОХSHROP С/С*C / C * 0%(0)0% (0) 0%(0)0% (0) 921А/С921A / C А/С**A / C ** 24%(8)24% (8) 18%(34)18% (34) А/А***A / A *** 76%(25)76% (25) 82%(154)82% (154) A****A **** 88%88% 91,1%91.1% C*****C ***** 12%12% 8,9%8.9% А/А*A / A * 0%(0)0% (0) 3%(5)3% (5) TNF -альфа TNF alpha A/G**A / G ** 6%(2)6% (2) 22%(41)22% (41) G308AG308a G/G***G / G *** 94%(31)94% (31) 75%(142)75% (142) G****G **** 97%97% 86%86% A*****A ***** 3%3% 14%fourteen% Процент детей, Percentage of children Метанол, %Methanol% 28,5%↑N28.5% ↑ N 54,29%↑N54.29% ↑ N имеющих в кровиhaving blood Фенол, %Phenol,% 21,4%↑N21.4% ↑ N 73,27%↑N73.27% ↑ N превышение нормыexcess of norm Формальдегид, %Formaldehyde% 20,1%↑N20.1% ↑ N 78,57%↑N78.57% ↑ N по содержанию чужеродныхby the content of alien Бенз(а)пирен, %Benz (a) pyrene,% 00 52,17%↑N52.17% ↑ N химических веществchemical substances Свинец, %Lead,% 19,4%↑N19.4% ↑ N 81,3%81.3% ПримечаниеNote * - минорная гомозигота,* - minor homozygote, ** - гетерозиготна** - heterozygous *** - нормальная гомозигота*** - normal homozygote **** - нормальный аллель**** - normal allele ***** - минорный аллель***** - minor allele ↑N - превышение нормы (референтной концентрации)↑ N - excess of the norm (reference concentration) Норма (N) для метанола 0,369±0,117 мг/дм³; для фенола 0,01±0,007 мг/дм³; для формальдегида 0,005±0,0014 мг/дм³; для бенз(а)пирена - 0; для свинца - 0,129±0,021 мг/дм³.Norm (N) for methanol 0.369 ± 0.117 mg / dm ³ ; for phenol 0.01 ± 0.007 mg / dm ³ ; for formaldehyde 0.005 ± 0.0014 mg / dm ³ ; for benz (a) pyrene - 0; for lead - 0.129 ± 0.021 mg / dm ³ .

Пример расчета частоты минорных аллелей и коэффициента их распространенности в исследуемой и контрольной группах (данные из таблицы 2):An example of calculating the frequency of minor alleles and their prevalence coefficient in the studied and control groups (data from table 2):

$K p = \frac{P_{C Y P} + P_{C P O X} + P_{T N F}}{3} = \frac{14 + 8.9 + 14}{3} = 12,3$

(для исследуемой группы)

K p = \frac{P_{C Y P} + P_{C P O X} + P_{T N F}}{3} = \frac{fourteen + 8.9 + fourteen}{3} = 12.3

(for the study group)

$K p = \frac{P_{C Y P} + P_{C P O X} + P_{T N F}}{3} = \frac{8 + 12 + 3}{3} = 7.6$

(для контрольной группы)

K p = \frac{P_{C Y P} + P_{C P O X} + P_{T N F}}{3} = \frac{8 + 12 + 3}{3} = 7.6

(for control group)

Данные, приведенные в таблице 2, показывают следующее.The data shown in table 2 show the following.

Распространенность минорной гомозиготы по гену CYP1A1 (-9893A/G) в исследуемой и контрольной группах составила 4% и 0%, соответственно, а распространенность минорного аллеля A в них составила 14% и 8%.The prevalence of minor homozygous for the CYP1A1 gene (-9893A / G) in the study and control groups was 4% and 0%, respectively, and the prevalence of minor A allele in them was 14% and 8%.

CYP1A1 характеризуется преимущественно монооксигеназной активностью, которая индуцируется полициклическими ароматическими углеводородами, и он участвуя в промежуточном обмене многих эндогенных метаболитов, кроме того, осуществляет активацию бенз(а)пирена. Высокая активность этого фермента ассоциирована с заменой нуклеотида и сопровождается повышенным риском онкозаболеваний при воздействии ПАУ.CYP1A1 is characterized mainly by monooxygenase activity, which is induced by polycyclic aromatic hydrocarbons, and it participates in the intermediate metabolism of many endogenous metabolites, in addition, it activates benzo (a) pyrene. The high activity of this enzyme is associated with nucleotide replacement and is associated with an increased risk of cancer when exposed to PAHs.

Распространенность минорной гомозиготы по гену СРОХ 921А/С в исследуемой и контрольной группах составила 5% и 0%, соответственно, а распространенность минорного аллеля A в них составила 8,9% и 12%. Измененный полиморфизм СРОХ 921А/С характеризуется повышением чувствительности к гаптенам и развитием симптомов интоксикации при следовых количествах ксенобиотиков.The prevalence of minor homozygous for the СРОХ 921А / С gene in the studied and control groups was 5% and 0%, respectively, and the prevalence of minor A allele in them was 8.9% and 12%. Altered polymorphism СРОХ 921А / С is characterized by increased sensitivity to haptens and the development of symptoms of intoxication with trace amounts of xenobiotics.

Распространенность минорных гомозигот по гену TNF-альфа в исследуемой и контрольной группах составила 3% и 0%, соответственно, а распространенность минорного аллеля A в них составила 14% и 3%. У гомозиготных носителей аллеля A (замена G308A в гене TNF-альфа) не происходило адекватного иммунного ответа на антиген. Индивиды с носительством минорного аллеля в промоторной области гена TNF-альфа были ассоциированы с нарушениями дифференцировки клеток, аутоиммунными, инфекционными заболеваниями.The prevalence of minor homozygotes for the TNF-alpha gene in the study and control groups was 3% and 0%, respectively, and the prevalence of minor A allele in them was 14% and 3%. In homozygous carriers of the A allele (replacement of G308A in the TNF-alpha gene), an adequate immune response to the antigen did not occur. Individuals with minor allele carriage in the promoter region of the TNF-alpha gene were associated with cell differentiation disorders, autoimmune, and infectious diseases.

Таким образом, несмотря на соответствие нормальному (не превышает 10%) распределению минорного аллеля СРОХ 921А/С, суммарный полиморфизм генов, участвующих в формировании мажорного полиморфизма, не обеспечивает адекватную адаптацию к внешнесредовой химической нагрузке.Thus, despite the correspondence to the normal (not exceeding 10%) distribution of the minor СРОХ 921А / С allele, the total polymorphism of the genes involved in the formation of major polymorphism does not provide adequate adaptation to the external chemical load.

Таким образом, изучение исключительно суммарного полиморфизма генов по ключевым по отношению к детоксикации приоритетных техногенных химических факторов с детекцией распространенности контаминации ими биосред позволит получить достоверную информацию об их опасности для организма.Thus, the study of exclusively total gene polymorphism based on key technological detrimental factors with respect to detoxification with the detection of the prevalence of biological media contamination by them will provide reliable information about their danger to the body.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет точно и достоверно прогнозировать популяционные нарушения биотрансформации чужеродных веществ, обусловленных воздействием техногенных химических факторов среды обитания, что позволит своевременно проводить профилактические мероприятия по обеспечению путей защиты и стабилизации генома этнической популяции, оптимизировать с точки зрения обеспечения безопасности жизнедеятельности жизненный и профессиональный маршрут.Thus, the proposed method allows you to accurately and reliably predict population violations of the biotransformation of foreign substances caused by exposure to anthropogenic chemical environmental factors, which will allow timely preventive measures to provide ways to protect and stabilize the genome of the ethnic population, and optimize life and professional life from the point of view of life safety route.

Claims

A method for predicting population disturbances in the biotransformation of foreign substances caused by exposure to technogenic chemical environmental factors, characterized in that a group of one ethnic population living in the territory affected by harmful chemical factors is selected, samples of biological material, namely, buccal epithelium, are selected from the studied contingent from the indicated deoxyribonucleic acid (DNA) sample, then on a detecting amplifier using Using the polymerase chain reaction of PCR, the polymorphism is genotyped - 9893A / G of the CYP1A1 gene, 921A / C of the CPPX gene and G308A of the TNF-alpha gene by examining the allelic state of each of the selected genes, one of the following states of the gene is established: heterozygous or normal homozygous, or minor , calculate the prevalence of the minor allele for each gene according to the formula:

P = \frac{H m h o \cdot 2 + H h e t}{2 \cdot N} \cdot one hundred %,

where P is the prevalence of the minor allele in the study group,%;
Чho - the number of individuals with a minor homozygous genotype;
Чhet - the number of individuals with a heterozygous genotype;
N is the total number of individuals in the study group of one ethnic population;
the prevalence coefficient of minor alleles for the studied genes is calculated by the formula:

TO R = \frac{P_{C Y P} + P_{C P O X} + P_{T N F}}{3}

,
where Kp is the prevalence coefficient of minor alleles in the study group,%;
P - the prevalence of minor alleles of the corresponding genes in the study group,%;
and if the specified prevalence coefficient of minor alleles is exceeded by more than 10%, while more than 30% exceeds the number of persons in the study group in whose blood there is a concentration of more than reference, at least one of the harmful chemical substance, predict population disturbances associated with the biotransformation of foreign substances caused by exposure to technogenic chemical environmental factors.