RU2445372C1 - METHOD FOR HUMAN GENOTYPE DETERMINATION BY 6174 GENE BRCA2 (617delT) POSITION POLYMORPHISM - Google Patents
METHOD FOR HUMAN GENOTYPE DETERMINATION BY 6174 GENE BRCA2 (617delT) POSITION POLYMORPHISM Download PDFInfo
- Publication number
- RU2445372C1 RU2445372C1 RU2010138108/10A RU2010138108A RU2445372C1 RU 2445372 C1 RU2445372 C1 RU 2445372C1 RU 2010138108/10 A RU2010138108/10 A RU 2010138108/10A RU 2010138108 A RU2010138108 A RU 2010138108A RU 2445372 C1 RU2445372 C1 RU 2445372C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- brca2
- allele
- primer
- common
- polymorphism
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
1. Область техники.1. Field of technology.
Предложенный способ относится к области медицины, биологии и биотехнологии и может быть использован при определении генотипа человека по полиморфизму в позиции 6174 гена BRCA2 (6174delT) с отнесением исследуемого образца к гетерозиготе или гомозиготе по одному из аллельных вариантов.The proposed method relates to the field of medicine, biology and biotechnology and can be used to determine the human genotype by polymorphism at position 6174 of the BRCA2 gene (6174delT) with assignment of the test sample to heterozygous or homozygous according to one of the allelic variants.
Рак молочной железы (РМЖ) является наиболее распространенным онкологическим заболеванием у женщин: он поражает как минимум каждую десятую жительницу развитых стран и занимает лидирующие позиции по смертности вследствие несовершенства ранней диагностики. Индивидуальный риск РМЖ зачастую ассоциирован с отягощенной наследственностью, т.е. онкологическими мутациями, связанными с риском развития РМЖ. Говоря о выявлении лиц, относящихся к группе риска по развитию РМЖ, необходимо учитывать идентифицированные и охарактеризованные к настоящему времени гены - маркеры, мутации в которых приводят к развитию рака молочной железы и рака яичника. Одним из таких генов является ген BRCA2.Breast cancer (BC) is the most common cancer in women: it affects at least one in ten women in developed countries and takes a leading position in mortality due to imperfections in early diagnosis. Individual risk of breast cancer is often associated with burdened heredity, i.e. oncological mutations associated with the risk of breast cancer. Speaking about the identification of people at risk for the development of breast cancer, it is necessary to take into account the genes identified and characterized to date - markers, mutations in which lead to the development of breast cancer and ovarian cancer. One of these genes is the BRCA2 gene.
2. Уровень техники.2. The prior art.
Из литературных данных известно, что у жительниц России примерно 20% РМЖ, возникших в молодом возрасте (до 40 - 50 лет) на фоне неблагоприятной наследственности, объясняются мутациями в генах BRCA1 и BRCA2. Для ряда мутаций гена BRCA2 показана устойчивая ассоциация с возрастанием риска развития РМЖ на протяжении жизни на 50-80%. Одной из таких мутаций является полиморфизм в позиции 6174 гена BRCA2 (6174delT).From the literature data it is known that approximately 20% of breast cancer that occur at a young age (up to 40-50 years old) due to unfavorable heredity are explained by mutations in the BRCA1 and BRCA2 genes. For a number of mutations of the BRCA2 gene, a stable association with an increase in the risk of developing breast cancer over the course of life by 50-80% is shown. One of these mutations is polymorphism at position 6174 of the BRCA2 gene (6174delT).
Широко распространен способ определения типа нуклеотида, находящегося в определенном месте ДНК, основанный на использовании аллель-специфичных праймеров с регистрацией результатов ПЦР по окончании реакции с помощью электрофореза.A widespread method for determining the type of nucleotide located at a specific DNA site is based on the use of allele-specific primers with the registration of PCR results at the end of the reaction by electrophoresis.
Известны различные способы, позволяющие определить тип нуклеотида, находящегося в определенном месте ДНК, основанные на использовании аллель-специфичных праймеров с регистрацией резульатов ПЦР непосредственно в ходе реакции с помощью использования флуоресцентно-меченых проб (олигонуклеотидов) (Andreas R. Tobler at all, "THE SNPlex Genotiping System: A Flexible and Scalable Platform for SNP Genotyping", Journal of Biomolecular Techniques, V. 16, issue 4, Desember 2005).Various methods are known for determining the type of nucleotide located at a specific DNA site, based on the use of allele-specific primers with the registration of PCR results directly during the reaction using fluorescently labeled samples (oligonucleotides) (Andreas R. Tobler at all, "THE SNPlex Genotiping System: A Flexible and Scalable Platform for SNP Genotyping ", Journal of Biomolecular Techniques, V. 16,
При использовании ПЦР с регистрацией результатов в ходе реакции известны различные способы определения генотипа исследуемого образца.When using PCR with recording the results during the reaction, various methods are known for determining the genotype of the test sample.
Например, в наборах производства Applied Biosystems используют одну пару праймеров для каждого аллеля и два зонда с различными флуорецентными метками, в зависимости от генотипа аллеля фиксируют разгорание различных меток ("TaqMan SNP Genotyping Assays", Applied Biosistems, Prodakt Bulletin, USA, 06/2006). Недостатком способа, используемого в данных наборах, является его высокая стоимость.For example, Applied Biosystems production kits use one pair of primers for each allele and two probes with different fluorescence labels; depending on the allele genotype, different labels burn up ("TaqMan SNP Genotyping Assays", Applied Biosistems, Prodakt Bulletin, USA, 06/2006 ) The disadvantage of the method used in these sets is its high cost.
Предлагаемое изобретение делает более доступным и удешевляет подобные исследования благодаря использованию стандартного оборудования и применению только одного меченого зонда.The present invention makes more affordable and cheaper such studies through the use of standard equipment and the use of only one labeled probe.
3. Раскрытие изобретения.3. Disclosure of the invention.
Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является повышение доступности подобных исследований, поскольку способ может быть осуществлен на стандартном известном оборудовании. Также он обеспечивает возможность применения лишь одного меченого зонда, что снижает затраты на исследование.The technical result, the achievement of which the invention is directed, is to increase the availability of such studies, since the method can be implemented on standard known equipment. It also provides the ability to use only one labeled probe, which reduces research costs.
Указанный результат достигается путем использования при постановке ПЦР аллель-специфичных праймеров на участок с искомой заменой, отличающиеся для каждого аллеля, и общие для двух аллелей праймер и зонд следующего нуклеотидного состава:The indicated result is achieved by using allele-specific primers in the PCR formulation for the site with the desired substitution, which are different for each allele, and the primer and probe of the following nucleotide composition are common for two alleles:
Праймер (отсутствие делеции Т)Primer (lack of T deletion)
BRCA2-61741 5'-CTgATAССТggACAgATTTTCCAC-3'BRCA2-61741 5'-CTgATACSTggACAgATTTTCCAC-3 '
Праймер (присутствие делеции Т)Primer (presence of T deletion)
BRCA2-61742 5'-ССТggACAgATTTTCССТTgC-3'BRCA2-61742 5'-CSTggACAgATTTTCCSTTgC-3 '
Общий праймерCommon primer
BRCA2-61743 5'-AACСААААТATgТСТggATTggAg-3'BRCA2-61743 5'-AACCAAAATATgTSTggATTggAg-3 '
Общий зондCommon probe
BRCA2-6174t (BHQ1) - 5'-TTCTTgTgggA(FdT)TTTTAgCACAgCAAgTgg-3'-PBRCA2-6174t (BHQ1) - 5'-TTCTTgTgggA (FdT) TTTTAgCACAgCAAgTgg-3'-P
где BHQ1 означает присоединенный к 5'-концевому нуклеотиду темновой гаситель флуоресценции, a FdT - флуоресцентный краситель FAM, присоединенный к нуклеотиду Т.where BHQ1 is a dark fluorescence quencher attached to the 5'-terminal nucleotide, and FdT is a FAM fluorescent dye attached to nucleotide T.
Дополнительно в реакционную смесь включают следующие стандартные компоненты:Additionally, the following standard components are included in the reaction mixture:
- смесь дезоксирибонуклеотидтрифосфатов четырех типов;- a mixture of four types of deoxyribonucleotide triphosphates;
- реакционный буфер (100 мМ Tris-HCl (pH 8.8 при 25°С), 500 мМ КСl, 0.8% Р40, 20 мМ MgCl2);- reaction buffer (100 mM Tris-HCl (pH 8.8 at 25 ° C), 500 mM KCl, 0.8% P40, 20 mM MgCl 2 );
- бидистилированная вода;- bidistilled water;
- Taq-полимераза;- Taq polymerase;
- минеральное масло;- mineral oil;
- парафин.- paraffin.
На чертеже (фиг.1) показан пример графиков накопления ДНК, полученных для аллель-специфичных реакций с использованием детектирующего амплификатора. Ось координат «х» - это уровень флуоресценции, «y» - номер цикла. График А - результат исследования гомозиготного образца (кривые изображены в линейном масштабе). График Б - результат исследования гетерозиготного образца (кривые изображены в линейном масштабе).The drawing (figure 1) shows an example of graphs of DNA accumulation obtained for allele-specific reactions using a detecting amplifier. The axis of coordinates “x” is the fluorescence level, “y” is the cycle number. Graph A is the result of a study of a homozygous sample (the curves are shown on a linear scale). Graph B is the result of a study of a heterozygous sample (the curves are depicted on a linear scale).
ПЦР проводят в отдельных пробирках для каждого варианта аллеля. Для того чтобы отличить два аллеля используют праймер на участок с исходной заменой, отличающийся для каждого аллеля, и общий для двух аллелей праймер.PCR is carried out in separate tubes for each variant of the allele. In order to distinguish between two alleles, a primer is used for the site with the initial substitution, which is different for each allele, and a common primer for the two alleles.
В результате указанного выбора праймеров и зонда можно судить о генотипе исследуемого образца по форме и расположению кривых накопления ДНК.As a result of this choice of primers and probe, one can judge the genotype of the test sample by the shape and location of the DNA accumulation curves.
4. Осуществление изобретения.4. The implementation of the invention.
В качестве материала для исследования рекомендуется использовать кровь, соскобы букального эпителия, биоптаты мягких тканей человека. Выделение ДНК из биоматериала производится с использованием комплекта реагентов для выделения ДНК (не является предметом данного патента).It is recommended to use blood, scrapings of buccal epithelium, and biopsy specimens of human soft tissues as a material for research. Isolation of DNA from biomaterial is performed using a set of reagents for DNA isolation (not the subject of this patent).
В данную реакционную смесь добавляют образец ДНК и проводят ПЦР в режиме реального времени, регистрацию сигнала осуществляют с помощью детектирующего амплификатора.A DNA sample is added to this reaction mixture and real-time PCR is performed, the signal is recorded using a detecting amplifier.
Генотип (аллельный состав) исследуемого образца определяют после окончания программы амплификации по соотношению пороговых циклов для каждого из продуктов ПЦР (пороговый цикл - номер температурного цикла ПЦР, на котором детектирующий амплификатор зарегестрировал появление специфичного сигнала для данного типа продукта реакции) следующим образом:The genotype (allelic composition) of the test sample is determined after the end of the amplification program by the ratio of the threshold cycles for each PCR product (the threshold cycle is the number of the PCR temperature cycle at which the detecting amplifier registered the appearance of a specific signal for this type of reaction product) as follows:
1. Определяют среднее значение порогового цикла (Ct) для ПЦР-дублей.1. Determine the average value of the threshold cycle (Ct) for PCR duplicates.
2. Определяют разницу между Ct (ΔCt) для двух аллелей.2. Determine the difference between Ct (ΔCt) for two alleles.
Для исследуемого образца возможны следующие варианты относительного расположения кинетических кривых:For the test sample, the following options for the relative location of the kinetic curves are possible:
A) ΔCt между кинетическими кривыми, описывающими две реакции, находится в диапазоне от 4 циклов и выше. Такой образец следует интерпретировать как гомозиготный по исследуемому полиморфизму. Генотип в этом случае соответствует аллелю с меньшим Ct.A) ΔCt between the kinetic curves describing the two reactions is in the range of 4 cycles and above. Such a sample should be interpreted as homozygous for the studied polymorphism. The genotype in this case corresponds to an allele with a lower Ct.
Б) ΔCt между кинетическими кривыми, описывающими две реакции, находится в диапазоне от 0 до 2 циклов. Такой образец следует интерпретировать как гетерозиготный по исследуемому полиморфизму.B) ΔCt between the kinetic curves describing the two reactions is in the range from 0 to 2 cycles. Such a sample should be interpreted as heterozygous for the studied polymorphism.
Для применения данного способа в промышленном масштабе компоненты реакционной смеси возможно выпускать в наборе, готовом для применения:To apply this method on an industrial scale, the components of the reaction mixture can be produced in a kit, ready for use:
- пробирки со смесью для амплификации, запечатанной парафином, включающие реакционный буфер, дезоксирибонуклеотидтрифосфаты, праймеры, флуоресцентные зонды;- tubes with a mixture for amplification, sealed with paraffin, including reaction buffer, deoxyribonucleotide triphosphates, primers, fluorescent probes;
- пробирки с раствором Taq-полимеразы;- tubes with a solution of Taq polymerase;
- пробирки с минеральным маслом.- test tubes with mineral oil.
При использовании данного набора в пробирки со смесью для амплификации добавляют раствор Taq-полимеразы, минеральное масло и подготовленный образец ДНК.When using this kit, Taq polymerase solution, mineral oil and a prepared DNA sample are added to the tubes with the mixture for amplification.
Claims (1)
Праймер (отсутствие делеции Т)
BRCA2-61741 5'-CTgATACCTggACAgATTTTCCAC-3'
Праймер (присутствие делеции Т)
BRCA2-617425'-CCTggACAgATTTTCCCTTgC-3'
Общий праймер
BRCA2-61743 5'-AACCAAAATATgTCTggATTggAg-3'
Общий зонд
BRCA2-6174t (BHQ1) - 5'-TTCTTgTgggA(FdT)TTTTAgCACAgCAAg
Tgg-3'-P,
где BHQ1 означает присоединенный к 5'-концевому нуклеотиду темновой гаситель флуоресценции, a FdT - флуоресцентный краситель FAM, присоединенный к нуклеотиду Т,
и после проведения ПЦР с использованием указанных праймеров определяется среднее значение порогового цикла (Ct) для ПЦР-дублей и фиксируется разница между Ct (ΔCt) для двух аллелей, и если ΔCt между кинетическими кривыми, описывающими две реакции, находится в диапазоне от 0 до 2 циклов, такой образец следует интерпретировать как гетерозиготный по исследуемому полиморфизму, а если ΔCt между кинетическими кривыми, описывающими две реакции, находится в диапазоне от 4 циклов и выше, то такой образец следует интерпретировать как гомозиготный по исследуемому полиморфизму, а генотип в этом случае соответствует аллелю с меньшим Ct. A method for determining the human genotype by polymorphism at position 6174 of the BRCA2 gene (6174delT), based on the use of allele-specific primers with real-time PCR results, characterized in that primers that are different for each allele are used, a common primer for two alleles and a common fluorescent probe of the following nucleotide composition:
Primer (lack of T deletion)
BRCA2-61741 5'-CTgATACCTggACAgATTTTCCAC-3 '
Primer (presence of T deletion)
BRCA2-617425'-CCTggACAgATTTTCCCTTgC-3 '
Common primer
BRCA2-61743 5'-AACCAAAATATgTCTggATTggAg-3 '
Common probe
BRCA2-6174t (BHQ1) - 5'-TTCTTgTgggA (FdT) TTTTAgCACAgCAAg
Tgg-3'-P,
where BHQ1 means attached to the 5'-terminal nucleotide dark quencher of fluorescence, and FdT is a fluorescent dye FAM attached to nucleotide T,
and after PCR using the indicated primers, the average threshold cycle (Ct) value for PCR duplicates is determined and the difference between Ct (ΔCt) for two alleles is fixed, and if ΔCt between the kinetic curves describing the two reactions is in the range from 0 to 2 cycles, such a sample should be interpreted as heterozygous for the studied polymorphism, and if ΔCt between the kinetic curves describing the two reactions is in the range of 4 cycles or higher, then such a sample should be interpreted as homozygous for the study polymorphism, and the genotype in this case corresponds to an allele with lower Ct.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2010138108/10A RU2445372C1 (en) | 2010-09-15 | 2010-09-15 | METHOD FOR HUMAN GENOTYPE DETERMINATION BY 6174 GENE BRCA2 (617delT) POSITION POLYMORPHISM |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2010138108/10A RU2445372C1 (en) | 2010-09-15 | 2010-09-15 | METHOD FOR HUMAN GENOTYPE DETERMINATION BY 6174 GENE BRCA2 (617delT) POSITION POLYMORPHISM |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2445372C1 true RU2445372C1 (en) | 2012-03-20 |
Family
ID=46030124
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2010138108/10A RU2445372C1 (en) | 2010-09-15 | 2010-09-15 | METHOD FOR HUMAN GENOTYPE DETERMINATION BY 6174 GENE BRCA2 (617delT) POSITION POLYMORPHISM |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2445372C1 (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2756203C1 (en) * | 2020-11-13 | 2021-09-28 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования Иркутский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for determining human genotype associated with acetylation of xenobiotics |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2343480C2 (en) * | 2006-10-11 | 2009-01-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-производственная фирма ДНК-Технология" | Method of determination of genotype of person on polymorphism in gene of interleukin 18 position 607 (c/a) |
RU2008146886A (en) * | 2006-06-01 | 2010-07-20 | Томаш БЫРСКИ (PL) | QUICK PURPOSE OF ADEQUATE NEOADJUVANT CHEMOTHERAPY TO PATIENTS WITH BREAST CANCER BASED ON THE IDENTIFICATION OF SYSTEMIC MUTATIONS BRCA1 |
-
2010
- 2010-09-15 RU RU2010138108/10A patent/RU2445372C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2008146886A (en) * | 2006-06-01 | 2010-07-20 | Томаш БЫРСКИ (PL) | QUICK PURPOSE OF ADEQUATE NEOADJUVANT CHEMOTHERAPY TO PATIENTS WITH BREAST CANCER BASED ON THE IDENTIFICATION OF SYSTEMIC MUTATIONS BRCA1 |
RU2343480C2 (en) * | 2006-10-11 | 2009-01-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-производственная фирма ДНК-Технология" | Method of determination of genotype of person on polymorphism in gene of interleukin 18 position 607 (c/a) |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
WEITZEL J.N. et al., Evidence for common ancestral origin of a recurring BRCA1 genomic rearrangement identified in high-risk Hispanic families, Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 2007, v.16, n.8, p.1615-1620. JAZAERI A.A. et al., Gene expression profiles of BRCA1-linked, BRCA2-linked, and sporadic ovarian cancers, J. Natl. Cancer Inst., 2002, v.94, n.13, p.990-1000. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2756203C1 (en) * | 2020-11-13 | 2021-09-28 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования Иркутский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for determining human genotype associated with acetylation of xenobiotics |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2012235778A (en) | Method for simultaneously detecting gene mutations of acetaldehyde dehydrogenase 2 and alcohol dehydrogenase 2 | |
US10253366B2 (en) | Discrimination of blood type variants | |
KR20130036146A (en) | Probe for detecting polymorphism, method of detecting polymorphism, method of evaluating drug efficacy, and reagent kit for detecting polymorphism | |
Luthra et al. | TaqMan RT-PCR assay coupled with capillary electrophoresis for quantification and identification of bcr-abl transcript type | |
JP2013074888A (en) | METHOD FOR DETECTING MUTATION AT GENE IL28B (rs8099917) AND ITPA(rs1127354) | |
KR101450792B1 (en) | Novel SNP marker for discriminating Black Coat Colour of Pig and use thereof | |
RU2343480C2 (en) | Method of determination of genotype of person on polymorphism in gene of interleukin 18 position 607 (c/a) | |
RU2013149142A (en) | MARKERS ASSOCIATED WITH SIGN OF BETA-THALASSEMIA | |
RU2445372C1 (en) | METHOD FOR HUMAN GENOTYPE DETERMINATION BY 6174 GENE BRCA2 (617delT) POSITION POLYMORPHISM | |
EP1964929B1 (en) | Hla-b genotyping method and kit based on real-time pcr | |
KR20200073407A (en) | SNP Markers for discriminating quality of pig semen and their uses | |
US20110237443A1 (en) | Amelogenin SNP on Chromosome X | |
JP2012010698A (en) | Method for detecting polymorphism of base at position-1639 of vkorc1 gene, and nucleic acid probe and kit therefor | |
RU2445371C1 (en) | METHOD FOR HUMAN GENOTYPE DETERMINATION BY 2579 GENE BRCA1 (rs4986850) POSITION POLYMORPHISM | |
RU2445373C1 (en) | METHOD FOR HUMAN GENOTYPE DETERMINATION BY 4343 GENE BRCA1 (rsL799950) POSITION POLYMORPHISM | |
ES2445709T3 (en) | Method for the identification by molecular techniques of genetic variants that do not encode D (D-) antigen and encode altered C (C + W) antigen | |
RU2445368C2 (en) | METHOD FOR HUMAN GENOTYPE DETERMINATION BY 5382 GENE BRCA1 (5382insC) POSITION POLYMORPHISM | |
RU2445369C2 (en) | METHOD FOR HUMAN GENOTYPE DETERMINATION BY 185 GENE BRCA1 (185delAG) POSITION POLYMORPHISM | |
KR20170049768A (en) | Single nucleotide polymorphism markers for determining of skin color and melanism sensitivity and use thereof | |
RU2332669C2 (en) | Method of human genotype definition on basis of polymorphism in interleukin 1-alpha gene position (c/t) | |
RU2548811C2 (en) | METHOD FOR DETERMINING HUMAN GENOTYPE BY POLYMORPHISM IN MATRIX METALLOPROTEINASE MMP9-1562 C>T (rs3918242) GENE | |
US20170081713A1 (en) | Multivalent probes having single nucleotide resolution | |
KR101081333B1 (en) | Discrimination of MC1R genotypes of the Jindo using allele-specific probes and primers | |
RU2332670C2 (en) | Method of human genotype definition on basis of interleukin gene 6 position 174(g/c) polymorphism | |
US20160040235A1 (en) | Methods for Diagnosing and Treating Diseases Caused by Genetic Copy Number Variants of Ultra-Conserved Elements |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200916 |