RU2428996C2 - Biotransplant for correction of soft tissue defects (versions), method of biotransplant obtaining (versions) and method of correction of soft tissue defects - Google Patents
Biotransplant for correction of soft tissue defects (versions), method of biotransplant obtaining (versions) and method of correction of soft tissue defects Download PDFInfo
- Publication number
- RU2428996C2 RU2428996C2 RU2009132350/15A RU2009132350A RU2428996C2 RU 2428996 C2 RU2428996 C2 RU 2428996C2 RU 2009132350/15 A RU2009132350/15 A RU 2009132350/15A RU 2009132350 A RU2009132350 A RU 2009132350A RU 2428996 C2 RU2428996 C2 RU 2428996C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- culture
- biograft
- cell
- cells
- autologous
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине и касается лекарственных средств для коррекции дефектов мягких тканей, а именно к биотрансплантатам для коррекции дефектов мягких тканей, к способам получения таких биотрансплантатов, а также к способам коррекции дефектов любых мягких тканей, содержащих фибробласты или фибробластподобные клетки. Изобретение может быть использовано в реконструктивной и пластической хирургии, дерматологии, терапевтической косметологии - коррекции локальных дефектов, дистрофических и возрастных нарушений, требующих восстановления объема мягких тканей, в хирургической отоларингологии - пластике голосовых связок, в урологии - лечении недержания мочи, в стоматологии - лечении заболеваний пародонта, в комбустиологии - лечении обширных глубоких ожогов, в эндокринологии - лечении диабетической язвы стопы и подошвы, то есть для регенерации тканей, которые претерпели дегенеративные изменения в результате патологических нарушений или функционального расстройства в организме.The invention relates to medicine and relates to medicines for the correction of soft tissue defects, namely, biotransplants for the correction of soft tissue defects, to methods for producing such biotransplants, as well as to methods for correcting defects of any soft tissues containing fibroblasts or fibroblast-like cells. The invention can be used in reconstructive and plastic surgery, dermatology, therapeutic cosmetology - correction of local defects, dystrophic and age-related disorders requiring restoration of soft tissue volume, in surgical otolaryngology - vocal cord repair, in urology - treatment of urinary incontinence, in dentistry - treatment of diseases periodontal, in combustiology - the treatment of extensive deep burns, in endocrinology - the treatment of diabetic foot and sole ulcers, that is, for tissue regeneration, which Those who underwent degenerative changes as a result of pathological disorders or a functional disorder in the body.
В настоящее время в медицине широко используются различные имплантационные препараты, созданные на основе компонентов, синтезируемых фибробластами [Hruza G.J.Arch. Facial Plast. Surg. Vol 6, Nov/Dec 2004].Currently, various implant preparations based on components synthesized by fibroblasts are widely used in medicine [Hruza G.J. Arch. Facial Plast. Surg. Vol 6, Nov / Dec 2004].
Материалы, в состав которых входит коллаген, в медицине используют уже более 100 лет. Так, в терапевтической косметологии для коррекции морщин, рубцов постакне, контурной пластики известно применение коллагеновых препаратов на основе бычьего коллагена, например Zyderm, Zyplast; Inamed Aesthetics, Santa Barbara, Calif.Materials, which include collagen, have been used in medicine for more than 100 years. So, in therapeutic cosmetology for the correction of wrinkles, post-acne scars, contour plasty, it is known to use collagen preparations based on bovine collagen, for example Zyderm, Zyplast; Inamed Aesthetics, Santa Barbara, Calif.
Однако бычий коллаген - это чужеродный белок и у значительного числа пациентов (до 10%) наблюдаются аллергические реакции как местного, так и системного действия.However, bovine collagen is a foreign protein and in a significant number of patients (up to 10%) allergic reactions of both local and systemic effects are observed.
Более предпочтительным в этом отношении препаратом, лишенным вышеуказанных недостатков является «АллоДерм», производимый компанией «ЛайфЦелл», США. Это переработанная донорская кожа человека, лишенная клеток и структурных иммуноспецифических белков. Основу материала составляют коллаген и эластин. Инъекционная форма «АллоДерм» имеет коммерческое название «Сайметра» и представляет собой матрицу, измельченную до размера 100-200 мкм. Препарат получил широкое распространение для лечения ожоговых поражений, в хирургической отоларингологии, общей хирургии, пластической хирургии, нейрохирургии, хирургической стоматологии, урологии, дерматокосметологии.More preferable in this regard, the drug devoid of the above disadvantages is "Alloderm", manufactured by LifeCell, USA. This is processed human donor skin, devoid of cells and structural immunospecific proteins. The basis of the material is collagen and elastin. The injection form "Alloderm" has the commercial name "Saymetra" and is a matrix, crushed to a size of 100-200 microns. The drug is widely used for the treatment of burn injuries, in surgical otolaryngology, general surgery, plastic surgery, neurosurgery, surgical dentistry, urology, dermatocosmetology.
В настоящее время широкое распространение в медицине, в частности в дерматокосметологии, получили устойчивые гиалуроновые кислоты неживотного происхождения. Это гликозаминогликаны, полученные биотехнологическим путем, не вызывающие иммунного ответа со стороны организма - реципиента, обладающие выраженными гидрофильными свойствами, то есть способностью удерживать воду [Минимально инвазивная косметическая хирургия лица. Под ред. Дж.Нимату III, Р.Хога, Москва, 2007].Currently, stable hyaluronic acids of non-animal origin are widely used in medicine, in particular in dermatocosmetology. These are glycosaminoglycans obtained by a biotechnological method that do not cause an immune response from the body - the recipient, which have pronounced hydrophilic properties, that is, the ability to retain water [Minimally invasive cosmetic surgery of the face. Ed. J. Nimatu III, R. Hoga, Moscow, 2007].
Однако экзогенная гиалуроновая кислота довольно быстро выводится из места введения, что является недостатком данной группы препаратов.However, exogenous hyaluronic acid is rapidly excreted from the injection site, which is a disadvantage of this group of drugs.
В ряде экспериментальных исследований in vivo было продемонстрировано выраженное стимулирующее влияние факторов роста, продуцируемых фибробластами на ускорение процессов ангиогенеза, усиление процессов пролиферации эндотелиоцитов капилляров и крупных сосудов, стимуляция пролиферации гладкомышечных клеток и перицитов, усиление дифференциации миоцитов, усиление остеогенетического процесса, стимуляция регенерации хрящевой ткани, усиление митогенеза периодонтальной связки [Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 2nd ed., 1992, Tran-Hung L et al., J Dent Res 85(9): 819-823, 2006].A number of in vivo experimental studies have demonstrated a pronounced stimulating effect of growth factors produced by fibroblasts on accelerating the processes of angiogenesis, enhancing the proliferation of capillary and large vessel endotheliocytes, stimulating the proliferation of smooth muscle cells and pericytes, enhancing the differentiation of myocytes, enhancing the osteogenetic process, stimulating tissue regeneration increased mitogenesis of the periodontal ligament [Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 2 nd ed., 1992, Tran-Hung L et al., J Dent Res 85 (9): 819-823, 200 6].
Известен способ доставки живых фибробластов к месту дефекта ткани на микросферах [Патент РФ №2277423, МПК A61K 35/28], в котором показано, что фибробласты являются субстратзависимыми клетками и в суспензии находятся в состоянии стресса.A known method of delivering live fibroblasts to the site of tissue defect on the microspheres [RF Patent No. 2277423, IPC A61K 35/28], in which it is shown that fibroblasts are substrate-dependent cells and in suspension are under stress.
Однако, при таком способе доставки, функционирование микросфер с интегрированными на них фибробластами не достаточно эффективно, что не позволяет обеспечить длительное сохранение имплантата в поврежденной ткани.However, with this delivery method, the functioning of microspheres with integrated fibroblasts on them is not effective enough, which does not allow for the long-term preservation of the implant in damaged tissue.
Известны способы восстановления дефектов мягких тканей путем трансплантации аутологичных дермальных фибробластов в суспензии [Патент РФ №2281776, МПК A61K 35/36] и [Патент США №5660850, НКИ 424/426, МПК A61F 2/02]. Известны также смеси аллогенных фибробластов, полученных из пуповины новорожденного и аутологичных фибробластов из кожи собственно пациента [Патент РФ №2308957, МПК A61K 35/36].Known methods for repairing soft tissue defects by transplantation of autologous dermal fibroblasts in suspension [RF Patent No. 2281776, IPC A61K 35/36] and [US Patent No. 5660850, NCI 424/426, IPC A61F 2/02]. Mixtures of allogeneic fibroblasts obtained from the umbilical cord of a newborn and autologous fibroblasts from the skin of the patient proper are also known [RF Patent No. 2308957, IPC A61K 35/36].
Недостатком этих технических решений является высокое количество и низкая жизнеспособность инъецируемых фибробластов, а также недостаточно длительное сохранение имплантата в поврежденной ткани.The disadvantage of these technical solutions is the high number and low viability of the injected fibroblasts, as well as the insufficiently long-term preservation of the implant in damaged tissue.
Известен способ применения клеток на носителе в пародонтологии [Патент РФ №2210352, МПК A61K 6/00], где используют постнатальные дермальные фибробласты, интегрированные на носитель - синтетический гидроксиапатит.A known method of using cells on a carrier in periodontics [RF Patent No. 2210352, IPC A61K 6/00], where postnatal dermal fibroblasts integrated on a carrier — synthetic hydroxyapatite — are used.
Недостатком этого способа является необходимость хирургического вмешательства для внесения трансплантируемого материала, что вызывает значительную травматизацию тканей, а также риск инкапсулирования имплантов фиброзной тканью.The disadvantage of this method is the need for surgical intervention to make the transplanted material, which causes significant tissue trauma, as well as the risk of implant encapsulation with fibrous tissue.
Известен способ иммобилизации клеточной суспензии аттестованного диплоидного штамма или коллагеновых микроносителей с выращенным клеточным монослоем в гель полиэтиленоксида [Патент РФ №2189223, МПК A61K 9/10].A known method of immobilizing a cell suspension of a certified diploid strain or collagen microcarriers with grown cell monolayer in a polyethylene oxide gel [RF Patent No. 2189223, IPC A61K 9/10].
Ограниченное применение данного средства для лечения глубоких кожных дефектов нанесением его на ожоговые поверхности является существенным недостатком данного изобретения.The limited use of this tool for the treatment of deep skin defects by applying it to burn surfaces is a significant disadvantage of this invention.
Известен способ коррекции дефектов мягких тканей посредством одновременного введения аутологичных фибробластов с различными формами коллагена и гликозаминогликанов [Патент США №6878383, НКИ 424/422, МПК A61F 13/00].A known method for the correction of soft tissue defects by the simultaneous introduction of autologous fibroblasts with various forms of collagen and glycosaminoglycans [US Patent No. 6878383, NKI 424/422, IPC A61F 13/00].
В этом способе используются коллагены любого типа и гликозаминогликаны, поперечно-сшитые с помощью, например, глютаральдегида. Ограничением этого способа является то, что при биодеградации зкзогеного коллагена может высвобождаться мономерный глютаральдегид в ткани и жидкости организма, который будет оказывать цитотоксическое действие на фибробласты и вызывать развитие непредвиденных побочных эффектов.This method uses any type of collagen and glycosaminoglycans crosslinked with, for example, glutaraldehyde. The limitation of this method is that during biodegradation of xcogen collagen, monomeric glutaraldehyde can be released in the tissues and body fluids, which will have a cytotoxic effect on fibroblasts and cause the development of unforeseen side effects.
Известен способ получения гибридных матричных имплантатов и эксплантатов [Патент РФ №2201765, МПК A61K 39/00], в состав которых входит матричный материал, образованный фибриллами нерастворимого коллагена и расположенными в нем множеством клеток млекопитающих и множеством микросфер, состоящих из различных веществ.A known method of producing hybrid matrix implants and explants [RF Patent No. 2201765, IPC A61K 39/00], which includes matrix material formed by fibrils of insoluble collagen and many mammalian cells and many microspheres located in it, consisting of various substances.
Недостатком данного изобретения является использование нерастворимого коллагена.The disadvantage of this invention is the use of insoluble collagen.
Задачей настоящего изобретения является создание высокоэффективного биотрансплантата для коррекции дефектов мягких тканей, разработка способа его получения и способа коррекции дефектов мягких тканей, универсальных для соединительной ткани всех органов с устойчиво высоким терапевтическим эффектом.The present invention is the creation of a highly effective biograft for the correction of soft tissue defects, the development of a method for its production and a method for the correction of soft tissue defects, universal for the connective tissue of all organs with a consistently high therapeutic effect.
Техническим результатом настоящего изобретения является значительное снижение количества инъецируемых клеток, повышение их жизнеспособности и обеспечение длительного сохранения имплантата в поврежденной ткани.The technical result of the present invention is a significant reduction in the number of injected cells, increasing their viability and ensuring long-term preservation of the implant in damaged tissue.
Предложена группа изобретений, объединенных общим изобретательским замыслом.A group of inventions united by a common inventive concept is proposed.
Для решения поставленной задачи биотрансплантат для коррекции дефектов мягких тканей характеризуется тем, что он представляет собой суспензию, содержащую культуры аутологичных или аллогенных фибробластов, или фибробластоподобных клеток в 0,9% растворе хлорида натрия в концентрации 0,6-3,0×106 в 1 мл биотрансплантата, интегрированных на фармацевтически приемлемой биосовместимой биодеградируемой измельченной до размера 100-200 мкм бесклеточной матрице в растворе фармацевтически приемлемого биосовместимого биодеградируемого препарата гиалуроновой кислоты.To solve this problem, a biograft for the correction of soft tissue defects is characterized in that it is a suspension containing cultures of autologous or allogeneic fibroblasts, or fibroblast-like cells in a 0.9% sodium chloride solution at a concentration of 0.6-3.0 × 10 6 in 1 ml of biograft integrated on a pharmaceutically acceptable biocompatible biodegradable, cell size-free matrix sized to 100-200 microns, in a solution of a pharmaceutically acceptable biocompatible biodegradable drug hyal Ronova acid.
В частном варианте объемное соотношение суспензии культуры клеток, бесклеточной матрицы и препарата гиалуроновой кислоты составляет 4:1:1 соответственно.In a particular embodiment, the volume ratio of the suspension of cell culture, cell-free matrix and the preparation of hyaluronic acid is 4: 1: 1, respectively.
Для решения поставленной задачи способ получения биотрансплантата для коррекции дефектов мягких тканей характеризуется тем, что биоптат промывают растворами антибиотиков и антимикотика в среде ДМЕМ и переносят в среду ДМЕМ, содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 40 мкг/мл гентамицина и коллагеназы II типа, инкубацию биоптата проводят при 37°C 16-17 часов, полученный клеточный осадок ресуспендируют в среде для культивирования ДМЕМ, 10-20% ЭТС, 40 мкг/мл гентамицина, высевают и культивируют в течение 2-3 недель до получения первичной культуры, затем клетки трипсинизируют и культивируют до наращивания необходимого количества, после чего среду с 10-20% ЭТС заменяют на среду без сыворотки или на среду ДМЕМ 90% и 10% аутологичной сыворотки и выдерживают 8-14 часов при 37°C, после культивирования клетки собирают с помощью 0,25% трипсин - ЭДТА, отмывают трехкратно путем центрифугирования - ресуспендирования и суспендируют в 0,9% растворе хлорида натрия в концентрации 0,6-3,0×106 в 1 мл биотрансплантата, интегрируют на фармацевтически приемлемой биосовместимой биодеградируемой измельченной до размера 100-200 мкм бесклеточной матрице и культивируют для адгезии фибробластподобных клеток 1-2 часа при 37°C, после чего соединяют с фармацевтически приемлемым биосовместимым биодеградируемым препаратом гиалуроновой кислоты.To solve this problem, the method of producing a biograft for the correction of soft tissue defects is characterized in that the biopsy is washed with solutions of antibiotics and antimycotics in DMEM medium and transferred to DMEM medium containing 10% fetal calf serum, 40 μg / ml gentamicin and type II collagenase, incubation of the biopsy specimen carried out at 37 ° C for 16-17 hours, the resulting cell pellet was resuspended in a medium for culturing DMEM, 10-20% ETS, 40 μg / ml gentamicin, seeded and cultured for 2-3 weeks to obtain a primary cult ry, then the cells trypsinize and cultivate to build up the required number, after which the medium with 10-20% ETS is replaced with medium without serum or with DMEM 90% and 10% autologous serum and incubated for 8-14 hours at 37 ° C, after cultivation cells are harvested using 0.25% trypsin - EDTA, washed three times by centrifugation - resuspension and suspended in a 0.9% sodium chloride solution at a concentration of 0.6-3.0 × 10 6 in 1 ml of biotransplant, integrated into a pharmaceutically acceptable biocompatible biodegradable shredded to measure 100-200 microns acellular matrix and adhesion to cultured fibroblast cells for 1-2 hours at 37 ° C, then combined with a pharmaceutically acceptable biocompatible biodegradable hyaluronic acid preparation.
Для решения поставленной задачи также предложен биотрансплантат для коррекции дефектов мягких тканей, характеризующийся тем, что он представляет собой суспензию, содержащую культуры аутологичных или аллогенных фибробластов, или фибробластоподобных клеток в 0,9% растворе хлорида натрия в концентрации 0,6-4,2×106 в 1 мл биотрансплантата, интегрированных на фармацевтически приемлемой биосовместимой биодеградируемой измельченной до размера 100-200 мкм бесклеточной матрице.To solve this problem, a biograft for correction of soft tissue defects has also been proposed, characterized in that it is a suspension containing cultures of autologous or allogeneic fibroblasts, or fibroblast-like cells in a 0.9% sodium chloride solution at a concentration of 0.6-4.2 × 10 6 in 1 ml of biograft integrated on a pharmaceutically acceptable biocompatible biodegradable crushed cell-free matrix to a size of 100-200 microns.
В частном варианте объемное соотношение суспензии культуры клеток и бесклеточной матрицы составляет 5:1 соответственно.In a particular embodiment, the volume ratio of cell culture suspension and cell-free matrix is 5: 1, respectively.
Для решения поставленной задачи также предложен способ получения биотрансплантата для коррекции дефектов мягких тканей, характеризующийся тем, что биоптат промывают растворами антибиотиков и антимикотика в среде ДМЕМ и переносят в среду ДМЕМ, содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 40 мкг/мл гентамицина и коллагеназы II типа, инкубацию биоптата проводят при 37°C 16-17 часов, полученный клеточный осадок ресуспендируют в среде для культивирования ДМЕМ, 10-20% ЭТС, 40 мкг/мл гентамицина, высевают и культивируют в течение 2-3 недель до получения первичной культуры, затем клетки трипсинизируют и культивируют до наращивания необходимого количества, после чего среду с 10-20% ЭТС заменяют на среду без сыворотки или на среду ДМЕМ 90% и 10% аутологичной сыворотки и выдерживают 8-14 часов при 37°С, после культивирования клетки собирают с помощью 0,25% трипсин - ЭДТА, отмывают трехкратно путем центрифугирования - ресуспендирования и суспендируют в 0,9% растворе хлорида натрия в концентрации 0,6-4,2×106 в 1 мл биотрансплантата, затем суспензию клеток интегрируют на фармацевтически приемлемой биосовместимой биодеградируемой измельченной до размера 100-200 мкм бесклеточной матрице и культивируют для адгезии фибробластподобных клеток 1-2 часа при 37°С.To solve this problem, a method for producing a biograft for correction of soft tissue defects is also proposed, characterized in that the biopsy is washed with solutions of antibiotics and antimycotics in DMEM medium and transferred to DMEM medium containing 10% fetal calf serum, 40 μg / ml gentamicin and type II collagenase , the biopsy incubation is carried out at 37 ° C for 16-17 hours, the resulting cell pellet is resuspended in DMEM cultivation medium, 10-20% ETS, 40 μg / ml gentamicin, seeded and cultured for 2-3 weeks until obtained I have a primary culture, then the cells trypsinize and cultivate to build up the required number, after which the medium with 10-20% ETS is replaced with medium without serum or with DMEM 90% and 10% autologous serum and incubated for 8-14 hours at 37 ° C, after cultivation, the cells are harvested using 0.25% trypsin - EDTA, washed three times by centrifugation - resuspension and suspended in a 0.9% sodium chloride solution at a concentration of 0.6-4.2 × 10 6 in 1 ml of biotransplant, then the cell suspension integrate on a pharmaceutically acceptable biomix a dark biodegradable cell-free matrix to a size of 100-200 μm and cultured for adhesion of fibroblast-like cells for 1-2 hours at 37 ° C.
Для решения поставленной задачи также предложен биотрансплантат для коррекции дефектов мягких тканей, характеризующийся тем, что он представляет собой суспензию, содержащую культуры аутологичных или аллогенных фибробластов, или фибробластоподобных клеток в 0,9% растворе хлорида натрия в концентрации 0,6-5,5×106 в 1 мл биотрансплантата в растворе фармацевтически приемлемого биосовместимого биодеградируемого препарата гиалуроновой кислоты или препарата коллагена.To solve this problem, a biograft for correction of soft tissue defects has also been proposed, characterized in that it is a suspension containing cultures of autologous or allogeneic fibroblasts, or fibroblast-like cells in a 0.9% sodium chloride solution at a concentration of 0.6-5.5 × 10 6 in 1 ml of biotransplant in a solution of a pharmaceutically acceptable biocompatible biodegradable preparation of hyaluronic acid or collagen preparation.
В частном варианте объемное соотношение суспензии культуры клеток и препарата гиалуроновой кислоты или препарата коллагена составляет 5:1 соответственно.In a particular embodiment, the volume ratio of the cell culture suspension and the hyaluronic acid preparation or the collagen preparation is 5: 1, respectively.
Для решения поставленной задачи также предложен способ получения биотрансплантата для коррекции дефектов мягких тканей, характеризующийся тем, что биоптат промывают растворами антибиотиков и антимикотика в среде ДМЕМ и переносят в среду ДМЕМ, содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 40 мкг/мл гентамицина и коллагеназы II типа, инкубацию биоптата проводят при 37°С 16-17 часов, полученный клеточный осадок ресуспендируют в среде для культивирования ДМЕМ, 10-20% ЭТС, 40 мкг/мл гентамицина, высевают и культивируют в течение 2-3 недель до получения первичной культуры, затем клетки трипсинизируют и культивируют до наращивания необходимого количества, после чего среду с 10-20% ЭТС заменяют на среду без сыворотки или на среду ДМЕМ 90% и 10% аутологичной сыворотки и выдерживают 8-14 часов при 37°С, после культивирования клетки собирают с помощью 0,25% трипсин - ЭДТА, отмывают трехкратно путем центрифугирования - ресуспендирования и суспендируют в 0,9% растворе хлорида натрия в концентрации 0,6-5,5×106 в 1 мл биотрансплантата, после чего соединяют с фармацевтически приемлемым биосовместимым биодеградируемым препаратом гиалуроновой кислоты или препаратом коллагена.To solve this problem, a method for producing a biograft for correction of soft tissue defects is also proposed, characterized in that the biopsy is washed with solutions of antibiotics and antimycotics in DMEM medium and transferred to DMEM medium containing 10% fetal calf serum, 40 μg / ml gentamicin and type II collagenase the biopsy sample is incubated at 37 ° C for 16-17 hours, the resulting cell pellet is resuspended in DMEM cultivation medium, 10-20% ETS, 40 μg / ml gentamicin, seeded and cultured for 2-3 weeks until obtained primary culture, then the cells are trypsinized and cultured until the required number is grown, after which the medium with 10-20% ETS is replaced with medium without serum or with DMEM 90% and 10% autologous serum and incubated for 8-14 hours at 37 ° C, after cultivation, the cells are harvested using 0.25% trypsin - EDTA, washed three times by centrifugation - resuspension and suspended in a 0.9% sodium chloride solution at a concentration of 0.6-5.5 × 10 6 in 1 ml of biotransplant, and then combined with pharmaceutically acceptable biocompatible biodegra iruemym preparation of hyaluronic acid or a collagen preparation.
Для решения поставленной задачи способ коррекции дефектов мягких тканей характеризуется тем, что биотрансплантат, представляющий собой суспензию культуры аутологичных или аллогенных фибробластов, или фибробластоподобных клеток в количестве 3,6-60×106 клеток на курс лечения, вводят в область дефекта инъекционным путем двукратно с интервалом 3-6 недель.To solve the problem, a method for the correction of soft tissue defects is characterized in that a biograft, which is a suspension of a culture of autologous or allogeneic fibroblasts, or fibroblast-like cells in the amount of 3.6-60 × 10 6 cells per treatment course, is injected into the defect area twice with an interval of 3-6 weeks.
В частном варианте в качестве фармацевтически приемлемой биосовместимой биодеградируемой бесклеточной матрицы используют препарат «Сайметра».In a particular embodiment, the drug "Saymetra" is used as a pharmaceutically acceptable biocompatible biodegradable cell-free matrix.
В другом частном варианте биотрансплантат содержит суспензию культуры аутологичных или аллогенных фибробластов, или фибробластоподобных клеток, выделенных из ткани органа, соответствующего поврежденному.In another particular embodiment, the biograft contains a suspension of a culture of autologous or allogeneic fibroblasts, or fibroblast-like cells, isolated from the tissue of an organ corresponding to a damaged one.
В другом частном варианте биотрансплантат содержит суспензию культуры аутологичных или аллогенных фибробластов, или фибробластоподобных клеток, выделенных из кожи, или слизистой оболочки, или крайней плоти, или пуповины новорожденного, или костного мозга, или жировой ткани, или пульпы зуба.In another particular embodiment, the biograft contains a culture suspension of autologous or allogeneic fibroblasts, or fibroblast-like cells isolated from the skin or mucous membrane, or the foreskin, or the umbilical cord of a newborn, or bone marrow, or adipose tissue, or tooth pulp.
Изобретение иллюстрируется следующими чертежами.The invention is illustrated by the following drawings.
На Фиг.1 представлены фибробластподобные клетки в культуре. Фазово-контрастная микроскопия х200.Figure 1 presents fibroblast-like cells in culture. Phase contrast microscopy x200.
На Фиг.2 представлены колониеобразующие единицы фибробластов (КОЕ-Ф).Figure 2 presents colony forming units of fibroblasts (CFU-F).
На Фиг.3 представлен Western-blott анализ тотальных клеточнах лизатов на содержание коллагена I типа в культурах фибробластов из различных источников.Figure 3 shows a Western-blott analysis of total cell lysates for type I collagen in fibroblast cultures from various sources.
На Фиг.4 представлен конъюгированный флюоресцентной меткой (TRITC) фаллоидин, специфично связывающий F-формы актина фибробластов. Флюоресцентная микроскопия.Figure 4 shows a fluorescent label conjugated (TRITC) phalloidin that specifically binds F-forms of fibroblast actin. Fluorescence microscopy.
На Фиг.5а представлена интактная кожная матрица «Сайметра» без фибробластоподобных клеток. Фазово-контрастная микроскопия х200.On figa presents an intact skin matrix "Saymetra" without fibroblast-like cells. Phase contrast microscopy x200.
На Фиг.5б представлена кожная матрица «Сайметра» с интегрированными фибробластподобными клетками. Фазово-контрастная микроскопия х200.On figb presents the skin matrix "Saymetra" with integrated fibroblast-like cells. Phase contrast microscopy x200.
Создание условий, способствующих повышению жизнеспособности инъецируемых клеток, позволяет повысить эффективность действия биотрансплантатов, снизить количество инъецируемых клеток и эффективно оперировать количеством живых инъецируемых клеток в зависимости от размеров повреждения. После трансплантации биотрансплантата фибробласты или фибробластподобные клетки постепенно мигрируют с матрицы и благодаря своим синтетическим функциям (синтез волокон, гликозаминогликанов, ферментов, цитокинов, факторов роста) способствуют восстановлению поврежденных тканей.The creation of conditions conducive to increasing the viability of injected cells allows one to increase the effectiveness of the action of biografts, reduce the number of injected cells and effectively operate with the number of live injectable cells depending on the size of the damage. After transplantation of a biograft, fibroblasts or fibroblast-like cells gradually migrate from the matrix and, thanks to their synthetic functions (synthesis of fibers, glycosaminoglycans, enzymes, cytokines, growth factors), contribute to the restoration of damaged tissues.
Использование в биотрансплантате бесклеточной матрицы «Сайметра» (Фиг.5а) или любой другой фармацевтически приемлемой биодеградируемой биосовместимой матрицы в качестве носителя позволяет повысить жизнеспособность инъецируемых фибробластов, оптимизировать их доставку в место дефекта и обеспечить синтез физиологически необходимого уровня компонентов межклеточного матрикса.The use of a Saymetra cell-free matrix in a biotransplant (Fig. 5a) or any other pharmaceutically acceptable biodegradable biocompatible matrix as a carrier can increase the viability of injected fibroblasts, optimize their delivery to the defect site and ensure the synthesis of a physiologically necessary level of intercellular matrix components.
Для повышения жизнеспособности клеток большую роль играет создание такого биотрансплантата, который максимально бы соответствовал физиологическим условиям, в которых находится фибробласт, а именно - густая сеть межклеточного матрикса, состоящего преимущественно из волокон и основного вещества - гликозаминогликанов, в частности гиалуроновой кислоты.To increase cell viability, an important role is played by the creation of such a biograft that would maximally correspond to the physiological conditions in which fibroblast is located, namely, a dense network of intercellular matrix, consisting mainly of fibers and the main substance - glycosaminoglycans, in particular hyaluronic acid.
По этой причине целесообразным является создание биотрансплантата, содержащего фармацевтически приемлемые препараты биосовместимой биодеградируемой измельченной бесклеточной матрицы с интегрированными на ней фибробластподобными клетками (Фиг.5б), включающей волокна (коллагена, эластина) и гиалуроновую кислоту, которая, имея консистенцию геля, позволяет имплантированным клеткам оставаться локализованными в определенном месте, в частности в месте дефекта ткани.For this reason, it is advisable to create a biograft containing pharmaceutically acceptable preparations of a biocompatible biodegradable crushed cell-free matrix with fibroblast-like cells integrated on it (Fig.5b), including fibers (collagen, elastin) and hyaluronic acid, which, having the gel consistency, allows the implanted cells to remain implanted localized in a specific place, in particular in the place of a tissue defect.
Указанные в изобретении соотношения используемых компонентов - культуры клеток, бесклеточной матрицы и препарата гиалуроновой кислоты или препарата коллагена - позволяют получить биотрансплантат с консистенцией, удобной для инъецирования и наряду с выраженным клиническим эффектом обеспечивают малотравматичность и простоту инъецирования.The ratios of the components used in the invention — cell culture, cell-free matrix and hyaluronic acid preparation or collagen preparation — make it possible to obtain a biograft with a consistency suitable for injection and, together with a pronounced clinical effect, provide low-invasiveness and ease of injection.
Предложенный в изобретении способ введения биотрансплантата двукратно с интервалом в 3-6 недель в зависимости от размеров дефекта мягких тканей позволяет также снизить травматичность способа, обеспечить полную реабилитацию тканей после трансплантации и создать оптимальный временной интервал для приживления клеток.The method of biotransplant administration proposed in the invention twice with an interval of 3-6 weeks, depending on the size of the soft tissue defect, can also reduce the invasiveness of the method, ensure complete rehabilitation of tissues after transplantation, and create an optimal time interval for cell engraftment.
После успешно проведенного культивирования часть выведенной культуры фибробластподобных клеток подвергают криоконсервированию после 1-го пассажа в среде для криозаморозки: 50% ДМЕМ, 40% ЭТС, 10% ДМСО («Merk») в количестве 1×106/мл, где в жидком азоте они могут храниться бессрочно. Запас криоконсервированных клеток дает возможность создать мастер-банк, что позволяет проводить процедуры в определенно назначенное время.After successful cultivation, part of the removed culture of fibroblast-like cells is subjected to cryopreservation after the 1st passage in cryo-freezing medium: 50% DMEM, 40% ETS, 10% DMSO (Merk) in an amount of 1 × 10 6 / ml, where in liquid nitrogen they can be stored indefinitely. The stock of cryopreserved cells makes it possible to create a master bank, which allows you to carry out the procedure at a specific time.
Тестирование клеток на биобезопасность проводят следующим образом.Testing cells for biosafety is as follows.
После 1-го пассажа образец культуры фибробластподобных клеток исследуют на исключение вирусной и бактериальной инфекции, проводят кариотипирование.After the 1st passage, a sample of the culture of fibroblast-like cells is examined to exclude viral and bacterial infections, and karyotyping is performed.
Наличие вирусной и бактериальной инфекции являются абсолютным противопоказанием к дальнейшему культивированию и хранению клеток. Все процедуры по получению клеточных биотрансплантатов проводят в условиях GMP, GTP, GLP.The presence of viral and bacterial infections is an absolute contraindication to the further cultivation and storage of cells. All procedures for obtaining cell biografts are carried out under GMP, GTP, GLP.
Для характеризации полученных клеток определяют их фенотип, проводят фазово-контрастную микроскопию (Фиг.1), выполняют тест на КОКф (колониеобразующие единицы фибробластов (Фиг.2), проводят специфическое окрашивание клеток на F - актин (Фиг.4) и Western-blott анализ клеточных лизатов на экспрессию коллагена I типа (Фиг.3).To characterize the obtained cells, their phenotype is determined, phase-contrast microscopy is carried out (Figure 1), a test for KOKf (colony forming units of fibroblasts (Figure 2) is performed, specific staining of cells for F - actin (Figure 4) and Western-blott analysis of cell lysates for the expression of type I collagen (Figure 3).
Выделение первичных культур фибробластов или фибробластподобных клеток.Isolation of primary cultures of fibroblasts or fibroblast-like cells.
Первичные культуры фибробластов или фибробластподобных клеток получают стандартными методами (A Culture of Animal Cells., Freshney J. 3rd edition, Wiley Liss Inc., New York 1994) с небольшими модификациями.Primary cultures of fibroblasts or fibroblast-like cells are obtained by standard methods (A Culture of Animal Cells., Freshney J. 3rd edition, Wiley Liss Inc., New York 1994) with minor modifications.
У пациентов берут биопсийный материал из-за ушной раковины, или со слизистой оболочки ротовой полости, или крайней плоти, или пуповины новорожденного. Перед получением первичной клеточной культуры биоптат промывают растворами антибиотиков и антимикотика (пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл, гентамицин 200 мкг/м, амфотерицин B 25 мкг/мл) в среде ДМЕМ. После промывки биоптат переносят в среду ДМЕМ, содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 40 мкг/мл гентамицина и 400-500 мкг/мл коллагеназы II типа («Sigma»). Инкубацию биоптата проводят при 37°C, 16-17 часов. Среду с коллагеназой предварительно стерильно фильтруют. После инкубации полученную клеточную взвесь промывают в фосфатно-солевом буфере («ПанЭко») pH 7,4-7,5 путем центрифугирования при 400g 10 минут. Полученный клеточный осадок ресуспендируют в среде для культивирования - ДМЕМ, 10-20% ЭТС («ПанЭко»), 40 мкг/мл гентамицина и высевают в культуральные флаконы (Т - 25 “Nunc”). Флаконы помещают в CO2-инкубатор (37°C, 5% CO2) и культивируют в течение 2-3 недель до получения первичной культуры. В качестве сыворотки используют как ЭТС, так и тестированную сыворотку пуповинной крови человека, так и аутологичную сыворотку крови пациента. Оптимальная концентрация сыворотки 10-20%. Более высокие концентрации сыворотки стимулируют быструю пролиферацию фибробластов. Концентрацию глюкозы в среде ДМЕМ варьируют от 1 до 4,5 г на 1 литр среды. Для культивирования фибробластов и фибробластподобных клеток используют также бессывороточную среду, например бессывороточную полную ростовую среду для культивирования фибробластов (Fibroblast Basal Medium, BioWhittaker Inc., USA) или иные аналогичные бессывороточные среды для культивирования фибробластподобных клеток. Перед использованием ЭТС проводят тестирование каждого лота ЭТС на колониеобразующие единицы фибробластов (КОЕ-Ф) и отбирают лоты только с высокой эффективностью колониеобразования. Культивирование проводят в чашках Петри, эксплантируя от 100 до 200 клеток в 10 мл полной ростовой среды. После 14 дней культивирования клетки снимают раствором трипсина - ЭДТА («ПанЭко») и переносят в новый (Т-75 «Nunc») культуральный флакон с питательной средой. Клетки инкубируют в течение недели в CO2 инкубаторе (37°C, 5% CO2). Каждые 48-72 часа производят смену питательной среды. По мере роста и достижения субконфлюэнтного слоя клетки трипсинизируют и переносят в новый большей площадью (Т-150, либо Т-175 «Nunc») культуральный флакон. Культуральные флаконы Т-150, Т-175 обладает емкостью, позволяющей снимать 7-15×106 клеток. В дальнейшем клетки переносят в фабрики Т-500 «Nunc» с тройным дном, после 7 дней культивирования с такого матраса снимают 20-30×106 клеток. При достижении субконфлюэнтного монослоя среду с 10-20% ЭТС заменяют на среду без сыворотки или на среду с 10% аутологичной сывороткой пациента. До снятия клеток и получения готовой суспензии клетки выдерживают не менее 8-14 часов при 37°C. Инкубация клеток на среде, не содержащей сыворотки, позволит избавиться от чужеродных белков, содержащихся в ЭТС. В конце инкубации клетки собирают с помощью 0,25% трипсин - ЭДТА, отмывают трехкратно путем центрифугирования - ресуспендирования и суспендируют в 0,9% растворе хлорида натрия для инъекций. Затем клетки соединяют с фармацевтически приемлемым носителем, препаратом «Сайметра» и препаратом гиалуроновой кислоты, или препаратом «Сайметра», или препаратом гиалуроновой кислоты, или коллагеном. Объем готового биотрансплантата подбирают для каждого пациента индивидуально.Biopsy material is taken from patients because of the auricle, or from the mucous membrane of the oral cavity, or the foreskin, or the umbilical cord of a newborn. Before receiving the primary cell culture, the biopsy is washed with solutions of antibiotics and antimycotics (penicillin 100 units / ml, streptomycin 100 μg / ml, gentamicin 200 μg / m, amphotericin B 25 μg / ml) in DMEM medium. After washing, the biopsy sample is transferred to DMEM medium containing 10% fetal calf serum (ETS), 40 μg / ml gentamicin and 400-500 μg / ml type II collagenase (Sigma). Biopsy incubation is carried out at 37 ° C, 16-17 hours. Collagenase medium is pre-sterile filtered. After incubation, the resulting cell suspension is washed in phosphate-buffered saline (PanEco) pH 7.4-7.5 by centrifugation at 400g for 10 minutes. The obtained cell pellet was resuspended in a culture medium - DMEM, 10-20% ETS (PanEco), 40 μg / ml gentamicin and plated in culture bottles (T - 25 “Nunc”). The vials are placed in a CO 2 incubator (37 ° C, 5% CO 2 ) and cultured for 2-3 weeks until a primary culture is obtained. As the serum, both ETS and the tested human cord blood serum are used, as well as the patient’s autologous blood serum. The optimal concentration of serum is 10-20%. Higher serum concentrations stimulate the rapid proliferation of fibroblasts. The glucose concentration in the DMEM medium varies from 1 to 4.5 g per 1 liter of medium. For the cultivation of fibroblasts and fibroblast-like cells, serum-free medium is also used, for example, serum-free growth medium for culturing fibroblasts (Fibroblast Basal Medium, BioWhittaker Inc., USA) or other similar serum-free medium for culturing fibroblast-like cells. Before using ETS, each lot of ETS is tested for colony forming units of fibroblasts (CFU-F) and lots are selected only with high colony formation efficiency. Cultivation is carried out in Petri dishes, explanting from 100 to 200 cells in 10 ml of a complete growth medium. After 14 days of cultivation, the cells are removed with a trypsin-EDTA solution (PanEco) and transferred to a new (T-75 Nunc) culture bottle with nutrient medium. Cells are incubated for a week in a CO 2 incubator (37 ° C, 5% CO 2 ). Every 48-72 hours change the nutrient medium. As the subconfluent layer grows and reaches the cells, trypsinize and transfer to a new, larger area (T-150, or T-175 "Nunc") culture bottle. Culture bottles T-150, T-175 has a capacity that allows you to remove 7-15 × 10 6 cells. Subsequently, the cells are transferred to the T-500 “Nunc” factories with a triple bottom; after 7 days of cultivation, 20-30 × 10 6 cells are removed from such a mattress. Upon reaching a subconfluent monolayer, the medium with 10-20% ETS is replaced with medium without serum or with medium with 10% autologous patient serum. Before removing the cells and obtaining the finished suspension, the cells are incubated for at least 8-14 hours at 37 ° C. Incubation of cells in a serum-free medium will allow you to get rid of foreign proteins contained in ETS. At the end of the incubation, the cells are harvested using 0.25% trypsin - EDTA, washed three times by centrifugation - resuspension, and suspended in a 0.9% sodium chloride solution for injection. Then the cells are combined with a pharmaceutically acceptable carrier, Saymetra drug and hyaluronic acid preparation, or Saymetra drug, or hyaluronic acid preparation, or collagen. The volume of the finished biotransplant is selected individually for each patient.
Выделение фибробластподобных клеток из костного мозга.Isolation of fibroblast-like cells from bone marrow.
Выделение фибробластподобных клеток из костного мозга проводят по стандартной методике [Metod in molecular biology. Basic Cell Culture Protocols, Helgason C.D., Miller C.L., 3 ed, New Jersey, 2005].The selection of fibroblast-like cells from the bone marrow is carried out according to the standard method [Metod in molecular biology. Basic Cell Culture Protocols, Helgason C. D., Miller C. L., 3 ed, New Jersey, 2005].
Аспират костного мозга донора (10-15 мл) выделяют из крыла подвздошной кости, используя гепарин как антикоагулянт у пациента под местной анестезией. Суспензию костномозговых клеток разводят в эквивалентном объеме фосфатно-солевого буфера Дульбекко +2% ЭТС. В 50 мл коническую пробирку («Nunc»), содержащую 15 мл раствора фиколла с плотностью 1,077 г/см3 («ПанЭко»), осторожно наслаивают 20 мл разведенного пунктата костного мозга. Затем полученную смесь центрифугируют при 330g 25 мин. Интерфазное мононуклеарное кольцо осторожно отбирают 5 мл пипеткой в 50-мл пробирки. Омывают с 5-кратным объемом фосфатно-солевого буфера, двухкратно при 330g 10 мин. Клетки подсчитывают в камере Горяева. Клеточную суспензию в количестве 1×107/мл ресуспендируют в культуральной среде α - MEM (Invitrogen) с 20% ЭТС (лот сыворотки отбирают, как описано выше) и антибиотиками (пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл). 10 мл клеточной суспензии высевают в культуральный флакон 25 см2 («Nunc») при 37°C и 5% CO2, и инкубируют 14 дней, получая таким образом первичную клеточную культуру. Для дальнейшей экспансии клетки пассируют в количестве 3000-5000 кл/см2 в культуральные матрасы («Nunc») с большей посевной площадью. По мере роста и достижения 90% конфлюэнтного слоя клетки снимают раствором 0,25% трипсин-ЭДТА и рассеивают в культуральные фабрики.A donor bone marrow aspirate (10-15 ml) is isolated from the iliac wing using heparin as an anticoagulant in a patient under local anesthesia. A suspension of bone marrow cells is diluted in an equivalent volume of Dulbecco's phosphate-buffered saline + 2% ETS. In a 50 ml conical tube ("Nunc") containing 15 ml of ficoll solution with a density of 1.077 g / cm 3 (PanEco), carefully layered 20 ml of diluted bone marrow punctate. Then the resulting mixture was centrifuged at 330g for 25 minutes. The interphase mononuclear ring is carefully taken with a 5 ml pipette into 50 ml tubes. Wash with a 5-fold volume of phosphate-buffered saline, twice at 330g for 10 minutes. Cells are counted in Goryaev’s cell. The cell suspension in an amount of 1 × 10 7 / ml was resuspended in α-MEM culture medium (Invitrogen) with 20% ETS (lot of serum was taken as described above) and antibiotics (penicillin 100 u / ml, streptomycin 100 μg / ml). 10 ml of the cell suspension are seeded in a culture bottle of 25 cm 2 ("Nunc") at 37 ° C and 5% CO 2 , and incubated for 14 days, thus obtaining the primary cell culture. For further expansion, cells are passaged in an amount of 3000-5000 cells / cm 2 in culture mattresses ("Nunc") with a larger sown area. As the growth and achievement of 90% of the confluent layer, the cells are removed with a solution of 0.25% trypsin-EDTA and scattered in culture factories.
Выделение фибробластподобных клеток из жировой ткани.Isolation of fibroblast-like cells from adipose tissue.
Выделение фибробластподобных клеток из жировой ткани проводят по стандартной методике [Zak Р.А., Tissue Engineering vol. 7, №2, 2001] с небольшими модификациями.The selection of fibroblast-like cells from adipose tissue is carried out according to standard methods [Zak P.A., Tissue Engineering vol. 7, No. 2, 2001] with minor modifications.
Образцы жировой ткани получают посредством липосакции. Жировую ткань измельчают и подвергают ферментативной обработке коллагеназой I типа (200 ед/мл, Sigma) в среде DMEM, содержащей 100 ед/мл пенициллина и 100 ед/мл стрептомицина при соотношении ткани и среды 1:1 и инкубируют при 37°C в течение часа с постоянным покачиванием/перемешиванием. По окончании инкубации образец смешивают с культуральной средой DMEM, содержащей 10% ЭТС и фильтруют через 100 мкм нейлоновый фильтр. Профильтрованную суспензию центрифугируют при 200g 5-7 минут. Полученный осадок обрабатывают лизирующим буфером (154 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA) в течение 5 минут при 37°C для лизиса эритроцитов, после чего клеточную суспензию центрифугируют при 400g 7 минут. Клеточный осадок (1×106 /см2) ресуспендируют в культуральной среде, описанной выше, высевают в культуральный флакон и инкубируют в CO2 инкубаторе (37°C, 5% CO2). Смену среды проводят каждые 3-4 дня. По мере роста и достижения 80-90% конфлюэнтного монослоя клеточную суспензию снимают 0,25% трипсин-ЭДТА.Adipose tissue samples are obtained by liposuction. Adipose tissue is crushed and subjected to enzymatic treatment with type I collagenase (200 units / ml, Sigma) in DMEM medium containing 100 units / ml penicillin and 100 units / ml streptomycin with a tissue: medium ratio of 1: 1 and incubated at 37 ° C for hours with constant shaking / stirring. At the end of the incubation, the sample is mixed with DMEM culture medium containing 10% ETS and filtered through a 100 μm nylon filter. The filtered suspension is centrifuged at 200g for 5-7 minutes. The resulting pellet was treated with lysis buffer (154 mM NH 4 Cl, 10 mM KHCO 3 , 0.1 mM EDTA) for 5 minutes at 37 ° C to lyse red blood cells, after which the cell suspension was centrifuged at 400g for 7 minutes. The cell pellet (1 × 10 6 / cm 2 ) is resuspended in the culture medium described above, seeded in a culture vial and incubated in a CO 2 incubator (37 ° C, 5% CO 2 ). A change of environment is carried out every 3-4 days. As 80-90% of the confluent monolayer grows and reaches 0.25% trypsin-EDTA, the cell suspension is removed.
Выделение фибробластподобных клеток из пульпы зуба.Isolation of fibroblast-like cells from tooth pulp.
Выделение фибробластподобных клеток из пульпы зуба проводят по оригинально разработанной методике.The selection of fibroblast-like cells from the pulp of the tooth is carried out according to the original developed method.
Клетки получают из молочных зубов детей или удаленных третьих моляров взрослых. Зубы трехкратно промывают средой DMEM, содержащей 200 мкг/мл гентамицина, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина. Затем зуб переносят во флакон с 10 мл среды DMEM, содержащей 10% ЭТС, 40 мкг/мл гентамицина и 400-500 мкг/мл коллагеназы II типа. Инкубацию ведут при 37°C, 17 час. Затем клеточную суспензию центрифугируют и осадок ресуспендируют в 5 мл культуральной среды DMEM, содержащей 20% ЭТС, 40 мкг/мл гентамицина. Культивирование проводят в CO2 инкубаторе (37°C, 5% CO2) в течение 2-х недель до образования монослоя. Дальнейшее культивирование и пассирование клеток проводят в среде DMEM с 15% ЭТС, 40 мкг/мл гентамицина. Среду меняют каждые 3-4 дня. По мере роста и достижения 80-90% конфлюэнтного монослоя клеточную суспензию снимают 0,25% трипсин - ЭДТА.Cells are obtained from the deciduous teeth of children or the removed third molars of adults. The teeth are washed three times with DMEM medium containing 200 μg / ml gentamicin, 100 units / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin. Then the tooth is transferred into a bottle with 10 ml of DMEM medium containing 10% ETS, 40 μg / ml gentamicin and 400-500 μg / ml type II collagenase. Incubation is carried out at 37 ° C, 17 hours. Then the cell suspension is centrifuged and the pellet is resuspended in 5 ml of DMEM culture medium containing 20% ETS, 40 μg / ml gentamicin. Cultivation is carried out in a CO 2 incubator (37 ° C, 5% CO 2 ) for 2 weeks until a monolayer is formed. Further cultivation and passage of cells is carried out in DMEM medium with 15% ETS, 40 μg / ml gentamicin. The environment is changed every 3-4 days. As 80-90% of the confluent monolayer grows and reaches 0.25% trypsin - EDTA, the cell suspension is removed.
Для иллюстрации изобретения приведены следующие примеры.The following examples are provided to illustrate the invention.
Пример 1.Example 1
Доброволец В. 50 лет, пол мужской.Volunteer V. 50 years old, male gender.
При осмотре кожи лица обнаружено: наличие глубоких морщин на лбу, наличие выраженных, глубоких носогубных складок.When examining the skin of the face it was found: the presence of deep wrinkles on the forehead, the presence of pronounced, deep nasolabial folds.
Диагноз: возрастные изменения кожи лица.Diagnosis: age-related changes in facial skin.
Коррекция проблемных зон кожи была проведена заявленным способом с использованием биотрансплантата, состоящего из аутологичной культуры фибробластов, интегрированных на матрице фармацевтически приемлемого препарата «Сайметра» в фармацевтически приемлемом препарате гиалуроновой кислоты IALSystem.Correction of problem areas of the skin was carried out by the claimed method using a biograft, consisting of an autologous culture of fibroblasts integrated on the matrix of the pharmaceutically acceptable preparation "Saymetra" in the pharmaceutically acceptable preparation of hyaluronic acid IALSystem.
Для этого у добровольца из заушной области был взят биоптат кожи диаметром 0,4 мм.For this, a skin biopsy sample with a diameter of 0.4 mm was taken from a behind-the-ear area from a volunteer.
Перед получением первичной клеточной культуры биоптат промывают растворами антибиотиков и антимикотика (пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл, гентамицин 200 мкг/мл, амфотерицин B 25 мкг/мл) в среде ДМЕМ. После промывки биоптат переносят в среду ДМЕМ, содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 40 мкг/мл гентамицина и коллагеназы II типа («Sigma»). Инкубацию биоптата проводят при 37°C, 16-17 часов. Полученный клеточный осадок ресуспендируют в среде для культивирования - ДМЕМ, 10-20% ЭТС («ПанЭко»), 40 мкг/мл гентамицина и высевают в культуральные флаконы (Т-25 “Nunc”). Флаконы помещают в CO2-инкубатор (37°C, 5% CO2) и культивируют в течение 2 недель до получения первичной культуры. По мере роста и достижения субконфлюэнтного слоя клетки трипсинизируют и переносят в новый большей площадью (Т-75, Т-175 «Nunc») культуральный флакон. В дальнейшем клетки переносят в фабрики Т-500 («Nunc») с тройным дном, после 7 дней культивирования с такого матраса можно снять 20-30×106 клеток. При достижении субконфлюэнтного монослоя среду с 10-20% ЭТС заменяют на среду без сыворотки. До снятия клеток и получения готовой суспензии клетки выдерживают не менее 8-14 часов при 37°C. В конце инкубации клетки собирают с помощью 0,25% трипсин - ЭДТА, отмывают трехкратно путем центрифугирования - ресуспендирования и суспендируют в 0,9% растворе хлорида натрия для инъекций в количестве 15×106 в 4 мл.Before receiving the primary cell culture, the biopsy is washed with solutions of antibiotics and antimycotics (penicillin 100 units / ml, streptomycin 100 μg / ml, gentamicin 200 μg / ml, amphotericin B 25 μg / ml) in DMEM medium. After washing, the biopsy sample is transferred to DMEM medium containing 10% fetal calf serum (ETS), 40 μg / ml gentamicin and type II collagenase (Sigma). Biopsy incubation is carried out at 37 ° C, 16-17 hours. The resulting cell pellet is resuspended in a culture medium - DMEM, 10-20% ETS (PanEco), 40 μg / ml gentamicin and seeded in culture bottles (T-25 “Nunc”). The vials were placed in a CO 2 incubator (37 ° C, 5% CO 2 ) and cultured for 2 weeks until a primary culture was obtained. As the subconfluent layer grows and reaches the cells, trypsinize and transfer to a new culture vial with a larger area (T-75, T-175 "Nunc"). Subsequently, the cells are transferred to the T-500 factories ("Nunc") with a triple bottom; after 7 days of cultivation, 20-30 × 10 6 cells can be removed from such a mattress. When a subconfluent monolayer is reached, the medium with 10-20% ETS is replaced with serum-free medium. Before removing the cells and obtaining the finished suspension, the cells are incubated for at least 8-14 hours at 37 ° C. At the end of the incubation, the cells are harvested using 0.25% trypsin - EDTA, washed three times by centrifugation - resuspension, and suspended in a 0.9% solution of sodium chloride for injection in an amount of 15 × 10 6 in 4 ml.
Для регидратации препарата «Сайметра» используют 0,9% раствор хлорида натрия для инъекций. Регидратацию проводят по алгоритму компании «ЛайфЦелл». Клеточную суспензию в 4 мл 0,9% раствора хлорида натрия для инъекций смешивают осторожным пипетированием с 1 мл препарата «Сайметра» и инкубируют гибридный имплант для адгезии фибробластподобных клеток 2 часа при 37°C. Затем 5 мл импланта смешивают с 1 мл препарата гиалуроновой кислоты - «IAL System» с получением биотрансплантата.For rehydration of the drug "Saymetra" use a 0.9% solution of sodium chloride for injection. Rehydration is carried out according to the algorithm of LifeCell. A cell suspension in 4 ml of a 0.9% sodium chloride solution for injection is mixed by careful pipetting with 1 ml of Simetra and the hybrid implant is incubated for adhesion of fibroblast-like cells for 2 hours at 37 ° C. Then 5 ml of the implant is mixed with 1 ml of the IAL System hyaluronic acid preparation to obtain a biograft.
Биотрансплантат в количестве 15×106 клеток двукратно с интервалом 3 недели инъецируют в средний слой дермы кожи лба и носогубных складок туннельным способом. Вкол производят интрадермально посредством инсулиновой иглы 25,4 мм, 27 G параллельно ходу морщины или поперек с интервалом 8-10 мм, на вколе производят введение 0,05 мл препарата.A biograft of 15 × 10 6 cells is injected twice with an interval of 3 weeks into the middle layer of the dermis of the skin of the forehead and nasolabial folds by the tunneling method. An injection is made intradermally by means of an insulin needle of 25.4 mm, 27 G parallel to the course of the wrinkle or across with an interval of 8-10 mm, 0.05 ml of the drug is administered at the injection.
Перед инъекциями поверхность кожи обрабатывают 0,5% раствором хлоргексидина, затем проводят местную анестезию 5% кремом Эмла.Before injections, the skin surface is treated with a 0.5% chlorhexidine solution, then local anesthesia is performed with 5% Emla cream.
Наблюдения за клиническими результатами проводят посредством фотографирования пациента до, после и через 6 месяцев после курса лечения.Observation of clinical results is carried out by photographing the patient before, after and 6 months after the course of treatment.
Результаты оценивают по сравнительному анализу до и после пересадки фибробластов, а также по данным визуального наблюдения. Через 6 месяцев после проведения курса лечения наблюдали уменьшение глубины и значительное сглаживание морщин в области лба, значительное уменьшение выраженности и глубины носогубных складок.The results are evaluated by comparative analysis before and after fibroblast transplantation, as well as by visual observation. 6 months after the course of treatment, a decrease in depth and a significant smoothing of wrinkles in the forehead, a significant decrease in the severity and depth of the nasolabial folds were observed.
Пример 2.Example 2
Доброволец А. 47 лет, пол женский.Volunteer A. 47 years old, female.
При осмотре кожи лица обнаружено: снижение тургора кожи в области щек и подбородка, изменение контура лица, наличие мелких морщин на лбу, вокруг глаз, наличие выраженных носогубных складок.When examining the skin of the face it was found: a decrease in skin turgor in the cheeks and chin, a change in the contour of the face, the presence of fine wrinkles on the forehead, around the eyes, the presence of pronounced nasolabial folds.
Диагноз: возрастные изменения кожи лица.Diagnosis: age-related changes in facial skin.
Коррекция проблемных зон кожи была проведена заявленным способом с использованием биотрансплантата, состоящего из аутологичной культуры фибробластов, интегрированных на матрице фармацевтически приемлемого препарата «Сайметра».Correction of problem areas of the skin was carried out by the claimed method using a biograft, consisting of an autologous culture of fibroblasts integrated on the matrix of the pharmaceutically acceptable preparation "Saymetra".
Для этого у добровольца из заушной области был взят биоптат кожи диаметром 0,5 мм.For this, a skin biopsy sample with a diameter of 0.5 mm was taken from a behind-the-ear area from a volunteer.
Перед получением первичной клеточной культуры биоптат промывают растворами антибиотиков и антимикотика (пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл, гентамицин 200 мкг/мл, амфотерицин B 25 мкг/мл) в среде ДМЕМ. После промывки биоптат переносят в среду ДМЕМ, содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 40 мкг/мл гентамицина и коллагеназы II типа («Sigma»). Инкубацию биоптата проводят при 37°C, 16-17 часов. Полученный клеточный осадок ресуспендируют в среде для культивирования - ДМЕМ, 10-20% ЭТС («ПанЭко»), 40 мкг/мл гентамицина и высевают в культуральные флаконы (Т-25 “Nunc”). Флаконы помещают в CO2-инкубатор (37°C, 5% CO2) и культивируют в течение 2 недель до получения первичной культуры. По мере роста и достижения субконфлюэнтного слоя клетки трипсинизируют и переносят в новый большей площадью (Т-75, Т-175 «Nunc») культуральный флакон. В дальнейшем клетки переносят в фабрики Т-500 («Nunc») с тройным дном, после 7 дней культивирования с такого матраса можно снять 20-30×106 клеток. При достижении субконфлюэнтного монослоя среду с 10-20% ЭТС заменяют на среду без сыворотки. До снятия клеток и получения готовой суспензии клетки выдерживают не менее 8-14 часов при 37°C. В конце инкубации клетки собирают с помощью 0,25% трипсин - ЭДТА, отмывают трехкратно путем центрифугирования - ресуспендирования и суспендируют в 0,9% растворе хлорида натрия для инъекций в концентрации 20×106 в 5 мл.Before receiving the primary cell culture, the biopsy is washed with solutions of antibiotics and antimycotics (penicillin 100 units / ml, streptomycin 100 μg / ml, gentamicin 200 μg / ml, amphotericin B 25 μg / ml) in DMEM medium. After washing, the biopsy sample is transferred to DMEM medium containing 10% fetal calf serum (ETS), 40 μg / ml gentamicin and type II collagenase (Sigma). Biopsy incubation is carried out at 37 ° C, 16-17 hours. The resulting cell pellet is resuspended in a culture medium - DMEM, 10-20% ETS (PanEco), 40 μg / ml gentamicin and seeded in culture bottles (T-25 “Nunc”). The vials were placed in a CO 2 incubator (37 ° C, 5% CO 2 ) and cultured for 2 weeks until a primary culture was obtained. As the subconfluent layer grows and reaches the cells, trypsinize and transfer to a new culture vial with a larger area (T-75, T-175 "Nunc"). Subsequently, the cells are transferred to the T-500 factories ("Nunc") with a triple bottom; after 7 days of cultivation, 20-30 × 10 6 cells can be removed from such a mattress. When a subconfluent monolayer is reached, the medium with 10-20% ETS is replaced with serum-free medium. Before removing the cells and obtaining the finished suspension, the cells are incubated for at least 8-14 hours at 37 ° C. At the end of the incubation, the cells are harvested using 0.25% trypsin - EDTA, washed three times by centrifugation - resuspension, and suspended in a 0.9% sodium chloride solution for injection at a concentration of 20 × 10 6 in 5 ml.
Для регидратации препарата «Сайметра» используют 1 мл 0,9% раствор хлорида натрия для инъекций. Регидратацию проводят по алгоритму компании «ЛайфЦелл». Клеточную суспензию в растворе 0,9% растворе хлорида натрия для инъекций смешивают осторожным пипетированием с 1 мл препарата «Сайметра» и инкубируют гибридный имплант для адгезии фибробластподобных клеток 2 часа при 37°C с получением биотрансплантата.For rehydration of the drug "Saymetra" use 1 ml of 0.9% sodium chloride solution for injection. Rehydration is carried out according to the algorithm of LifeCell. A cell suspension in a solution of 0.9% sodium chloride solution for injection is mixed by careful pipetting with 1 ml of Simetra and the hybrid implant is incubated for adhesion of fibroblast-like cells for 2 hours at 37 ° C to obtain a biotransplant.
Биотрансплантат в количестве 20×106 клеток двукратно с интервалом 3 недели инъецируют в средний слой дермы кожи лба и носогубных складок туннельным способом. Вкол производят интрадермально посредством инсулиновой иглы 25,4 мм, 27 G параллельно ходу морщины или поперек с интервалом 8-10 мм, на вколе производят введение 0,05 мл препарата.A biograft in an amount of 20 × 10 6 cells is injected twice with an interval of 3 weeks into the middle layer of the dermis of the skin of the forehead and nasolabial folds by the tunneling method. An injection is made intradermally by means of an insulin needle of 25.4 mm, 27 G parallel to the course of the wrinkle or across with an interval of 8-10 mm, 0.05 ml of the drug is administered at the injection.
Перед инъекциями поверхность кожи обрабатывают 0,5% раствором хлоргексидина, затем проводят местную анестезию 5% кремом Эмла.Before injections, the skin surface is treated with a 0.5% chlorhexidine solution, then local anesthesia is performed with 5% Emla cream.
Наблюдения за клиническими результатами проводят посредством фотографирования пациента до, после и через 6 месяцев после курса лечения.Observation of clinical results is carried out by photographing the patient before, after and 6 months after the course of treatment.
Результаты оценивают по сравнительному анализу до и после пересадки фибробластов, а также по данным визуального наблюдения.The results are evaluated by comparative analysis before and after fibroblast transplantation, as well as by visual observation.
Через месяц после завершения курса лечения кожи отмечали улучшение состояния кожи, уменьшение глубины морщин, улучшение цвета и контура лица, которое усиливалось со временем и сохранялось на протяжении всего срока наблюдения. Через 6 месяцев после проведения курса лечения наблюдали улучшение тургора кожи, цвета и контура лица; наблюдали сглаживание морщин, уменьшение выраженности и глубины носогубных складок.A month after the completion of the skin treatment course, an improvement in the skin condition, a decrease in the depth of wrinkles, and an improvement in the color and contour of the face were observed, which intensified over time and remained throughout the observation period. 6 months after the course of treatment, an improvement in skin turgor, color and contour of the face were observed; observed smoothing of wrinkles, a decrease in the severity and depth of the nasolabial folds.
Пример 3.Example 3
Доброволец В. 47 лет, пол мужской.Volunteer V. 47 years old, male.
При осмотре кожи лица обнаружено: обезвоживание кожи и снижение ее тургора, наличие морщин вокруг глаз, на щеках, в области лба.When examining the skin of the face it was found: dehydration of the skin and a decrease in its turgor, the presence of wrinkles around the eyes, on the cheeks, in the forehead.
Диагноз: возрастные изменения кожи лица.Diagnosis: age-related changes in facial skin.
Коррекция проблемных зон кожи была проведена заявленным способом с использованием биотрансплантата, состоящего из аутологичной культуры фибробластов в фармацевтически приемлемом препарате гиалуроновой кислоты TEOSYAL Meso.Correction of problem areas of the skin was carried out by the claimed method using a biotransplant consisting of an autologous culture of fibroblasts in a pharmaceutically acceptable preparation of hyaluronic acid TEOSYAL Meso.
Для этого у добровольца из заушной области был взят биоптат кожи диаметром 0,3 мм.For this, a skin biopsy sample with a diameter of 0.3 mm was taken from a behind-the-ear area from a volunteer.
Перед получением первичной клеточной культуры биоптат промывают растворами антибиотиков и антимикотика (пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл, гентамицин 200 мкг/мл, амфотерицин B 25 мкг/мл) в среде ДМЕМ. После промывки биоптат переносят в среду ДМЕМ, содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 40 мкг/мл гентамицина и коллагеназы II типа («Sigma»). Инкубацию биоптата проводят при 37°C, 16-17 часов. Полученный клеточный осадок ресуспендируют в среде для культивирования - ДМЕМ, 10-20% ЭТС («ПанЭко»), 40 мкг/мл гентамицина и высевают в культуральные флаконы (Т-25 “Nunc”). Флаконы помещают в CO2-инкубатор (37°C, 5% CO2) и культивируют в течение 2 недель до получения первичной культуры. По мере роста и достижения субконфлюэнтного слоя клетки трипсинизируют и переносят в новый большей площадью (Т-75, Т-175 «Nunc») культуральный флакон. В дальнейшем клетки переносят в фабрики Т-500 («Nunc») с тройным дном, после 7 дней культивирования с такого матраса можно снять 20-30×106 клеток. При достижении субконфлюэнтного монослоя среду с 10-20% ЭТС заменяют на среду без сыворотки. До снятия клеток и получения готовой суспензии клетки выдерживают не менее 8-14 часов при 37°C. В конце инкубации клетки собирают с помощью 0,25% трипсин - ЭДТА, отмывают трехкратно путем центрифугирования - ресуспендирования и суспендируют в 0,9% растворе хлорида натрия для инъекций в количестве 30×106 в 5 мл. Затем клетки соединяют с 1 мл фармацевтически приемлемым носителем гиалуроновой кислоты - TEOSYAL Meso с получением биотрансплантата.Before receiving the primary cell culture, the biopsy is washed with solutions of antibiotics and antimycotics (penicillin 100 units / ml, streptomycin 100 μg / ml, gentamicin 200 μg / ml, amphotericin B 25 μg / ml) in DMEM medium. After washing, the biopsy sample is transferred to DMEM medium containing 10% fetal calf serum (ETS), 40 μg / ml gentamicin and type II collagenase (Sigma). Biopsy incubation is carried out at 37 ° C, 16-17 hours. The resulting cell pellet is resuspended in a culture medium - DMEM, 10-20% ETS (PanEco), 40 μg / ml gentamicin and seeded in culture bottles (T-25 “Nunc”). The vials were placed in a CO 2 incubator (37 ° C, 5% CO 2 ) and cultured for 2 weeks until a primary culture was obtained. As the subconfluent layer grows and reaches the cells, trypsinize and transfer to a new culture vial with a larger area (T-75, T-175 "Nunc"). Subsequently, the cells are transferred to the T-500 factories ("Nunc") with a triple bottom; after 7 days of cultivation, 20-30 × 10 6 cells can be removed from such a mattress. When a subconfluent monolayer is reached, the medium with 10-20% ETS is replaced with serum-free medium. Before removing the cells and obtaining the finished suspension, the cells are incubated for at least 8-14 hours at 37 ° C. At the end of the incubation, the cells are harvested using 0.25% trypsin - EDTA, washed three times by centrifugation - resuspension, and suspended in a 0.9% solution of sodium chloride for injection in an amount of 30 × 10 6 in 5 ml. Then the cells are combined with 1 ml of a pharmaceutically acceptable carrier of hyaluronic acid - TEOSYAL Meso to obtain a biograft.
Биотрансплантат в количестве 30×106 клеток двукратно с интервалом 3 недели инъецируют в средний слой дермы туннельным способом по всему лицу и папулами в области глаз. Вкол производят интрадермально посредством инсулиновой иглы 25,4 мм, 30 G параллельно ходу морщины или поперек с интервалом 8-10 мм, на вколе производят введение 0,05 мл препарата; в случае сниженного тонуса кожи и мелких морщин биотрансплантат вводят папуллами в проблемную зону: вколы производят на глубину 2 мм по параллельным линиям с интервалом 5-8 мм.A biograft of 30 × 10 6 cells is injected twice with an interval of 3 weeks into the middle layer of the dermis by a tunnel method throughout the face and papules in the eye area. An injection is made intradermally by means of an insulin needle of 25.4 mm, 30 G parallel to the wrinkles or across with an interval of 8-10 mm, 0.05 ml of the drug is injected at the injection; in case of reduced skin tone and fine wrinkles, the biograft is injected with papullomas into the problem area: injections are made to a depth of 2 mm in parallel lines with an interval of 5-8 mm.
Перед инъекциями поверхность кожи обрабатывают 0,5% раствором хлоргексидина, затем проводят местную анестезию 5% кремом Эмла.Before injections, the skin surface is treated with a 0.5% chlorhexidine solution, then local anesthesia is performed with 5% Emla cream.
Наблюдения за клиническими результатами проводят посредством фотографирования пациента до, после и через 6 месяцев после курса лечения.Observation of clinical results is carried out by photographing the patient before, after and 6 months after the course of treatment.
Результаты оценивают по сравнительному анализу до и после пересадки фибробластов, а также по данным визуального наблюдения.The results are evaluated by comparative analysis before and after fibroblast transplantation, as well as by visual observation.
Через неделю после завершения курса отмечали улучшение состояния кожи, которое усиливалось со временем и сохранялось на протяжении всего срока наблюдения.A week after completion of the course, an improvement in skin condition was noted, which intensified over time and persisted throughout the observation period.
Через 6 месяцев после проведения курса лечения наблюдали улучшение тургора кожи, цвета и контура лица; наблюдали сглаживание морщин, уменьшение выраженности и глубины носогубных складок.6 months after the course of treatment, an improvement in skin turgor, color and contour of the face were observed; observed smoothing of wrinkles, a decrease in the severity and depth of the nasolabial folds.
Пример 4.Example 4
Доброволец К. 52 года, пол мужской.Volunteer K., 52 years old, male gender.
При осмотре кожи лица обнаружено: обезвоживание кожи и снижение ее тургора, наличие морщин вокруг глаз, на щеках, в области лба.When examining the skin of the face it was found: dehydration of the skin and a decrease in its turgor, the presence of wrinkles around the eyes, on the cheeks, in the forehead.
Диагноз: возрастные изменения кожи лица.Diagnosis: age-related changes in facial skin.
Коррекция проблемных зон кожи была проведена заявленным способом с использованием биотрансплантата, состоящего из аутологичной культуры фибробластов в фармацевтически приемлемом препарате коллагена, например Evolance.Correction of problem areas of the skin was carried out by the claimed method using a biotransplant consisting of an autologous culture of fibroblasts in a pharmaceutically acceptable collagen preparation, for example Evolance.
Для этого у добровольца из заушной области был взят биоптат кожи диаметром 0,1 мм.For this, a skin biopsy sample with a diameter of 0.1 mm was taken from a behind-the-ear area from a volunteer.
Перед получением первичной клеточной культуры биоптат промывают растворами антибиотиков и антимикотика (пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл, гентамицин 200 мкг/мл, амфотерицин В 0,0025 мг/мл) в среде ДМЕМ. После промывки биоптат переносят в среду ДМЕМ, содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 40 мкг/мл гентамицина и коллагеназы II типа («Sigma»). Инкубацию биоптата проводят при 37°C, 16-17 часов. Полученный клеточный осадок ресуспендируют в среде для культивирования - ДМЕМ, 10-20% ЭТС («ПанЭко»), 40 мкг/мл гентамицина и высевают в культуральные флаконы (Т-25 “Nunc”). Флаконы помещают в CO2-инкубатор (37°C, 5% CO2) и культивируют в течение 3-х недель до получения первичной культуры. По мере роста и достижения субконфлюэнтного слоя клетки трипсинизируют и переносят в новый большей площадью (Т-75, Т-175 «Nunc») культуральный флакон. В дальнейшем клетки переносят в фабрики Т-500 («Nunc») с тройным дном, после 7 дней культивирования с такого матраса можно снять 20-30×106 клеток. При достижении субконфлюэнтного монослоя среду с 10-20% ЭТС заменяют на среду без сыворотки. До снятия клеток и получения готовой суспензии клетки выдерживают не менее 8-14 часов при 37°C. В конце инкубации клетки собирают с помощью 0,25% трипсин - ЭДТА, отмывают трехкратно путем центрифугирования - ресуспендирования и суспендируют в 0,9% растворе хлорида натрия для инъекций в количестве 30×106 в 5 мл. Затем клетки соединяют с 1 мл фармацевтически приемлемым препаратом коллагена «Evolance» с получением биотрансплантата.Before receiving the primary cell culture, the biopsy is washed with solutions of antibiotics and antimycotics (penicillin 100 units / ml, streptomycin 100 μg / ml, gentamicin 200 μg / ml, amphotericin B 0.0025 mg / ml) in DMEM medium. After washing, the biopsy sample is transferred to DMEM medium containing 10% fetal calf serum (ETS), 40 μg / ml gentamicin and type II collagenase (Sigma). Biopsy incubation is carried out at 37 ° C, 16-17 hours. The resulting cell pellet is resuspended in a culture medium - DMEM, 10-20% ETS (PanEco), 40 μg / ml gentamicin and seeded in culture bottles (T-25 “Nunc”). The vials were placed in a CO 2 incubator (37 ° C, 5% CO 2 ) and cultured for 3 weeks until a primary culture was obtained. As the subconfluent layer grows and reaches the cells, trypsinize and transfer to a new culture vial with a larger area (T-75, T-175 "Nunc"). Subsequently, the cells are transferred to the T-500 factories ("Nunc") with a triple bottom; after 7 days of cultivation, 20-30 × 10 6 cells can be removed from such a mattress. When a subconfluent monolayer is reached, the medium with 10-20% ETS is replaced with serum-free medium. Before removing the cells and obtaining the finished suspension, the cells are incubated for at least 8-14 hours at 37 ° C. At the end of the incubation, the cells are harvested using 0.25% trypsin - EDTA, washed three times by centrifugation - resuspension, and suspended in a 0.9% solution of sodium chloride for injection in an amount of 30 × 10 6 in 5 ml. The cells are then combined with 1 ml of a pharmaceutically acceptable Evolance collagen preparation to produce a biograft.
Биотрансплантат в количестве 30×106 клеток двукратно с интервалом 3 недели инъецируют в средний слой дермы туннельным способом по всему лицу и папулами в области глаз. Вкол производят интрадермально посредством инсулиновой иглы 25,4 мм, 30 G параллельно ходу морщины или поперек с интервалом 8-10 мм, на вколе производят введение 0,05 мл препарата. В случае сниженного тонуса кожи и мелких морщин биотрансплантат вводят папуллами в проблемную зону, вколы производят на глубину 2 мм по параллельным линиям с интервалом 5-8 мм.A biograft of 30 × 10 6 cells is injected twice with an interval of 3 weeks into the middle layer of the dermis by a tunnel method throughout the face and papules in the eye area. An injection is made intradermally by means of an insulin needle of 25.4 mm, 30 G parallel to the course of the wrinkle or across with an interval of 8-10 mm, 0.05 ml of the drug is administered at the injection. In the case of reduced skin tone and fine wrinkles, the biograft is injected with papullomas into the problem area, injections are produced to a depth of 2 mm in parallel lines with an interval of 5-8 mm.
Перед инъекциями поверхность кожи обрабатывают 0,5% раствором хлоргексидина, затем проводят местную анестезию 5% кремом Эмла.Before injections, the skin surface is treated with a 0.5% chlorhexidine solution, then local anesthesia is performed with 5% Emla cream.
Наблюдения за клиническими результатами проводят посредством фотографирования пациента до, после и через 6 месяцев после курса лечения.Observation of clinical results is carried out by photographing the patient before, after and 6 months after the course of treatment.
Результаты оценивают по сравнительному анализу до и после пересадки фибробластов, а также по данным визуального наблюдения.The results are evaluated by comparative analysis before and after fibroblast transplantation, as well as by visual observation.
Через неделю после завершения курса отмечали улучшение состояния кожи лица, которое усиливалось со временем и сохранялось на протяжении всего срока наблюдения в течение 6 месяцев. Наблюдалось улучшение цвета и контура лица, тургора кожи, сглаживание крупных и исчезновение мелких морщин.A week after the completion of the course, an improvement in the condition of the skin of the face was noted, which intensified over time and remained throughout the observation period for 6 months. There was an improvement in the color and contour of the face, skin turgor, smoothing of large and the disappearance of small wrinkles.
Таким образом, проведенные экспериментальные исследования подтверждают высокий терапевтический эффект при использовании предлагаемого биотрансплантата, отсутствие побочных реакций и осложнений, и дают возможность использовать фармацевтически приемлемые препараты с регистрационными удостоверениями МЗ РФ. Значительное снижение количества инъецируемых клеток, повышение их жизнеспособности и обеспечение длительного сохранения имплантата в поврежденной ткани также позволит снизить стоимость лечения.Thus, the conducted experimental studies confirm the high therapeutic effect when using the proposed biograft, the absence of adverse reactions and complications, and make it possible to use pharmaceutically acceptable drugs with registration certificates of the Ministry of Health of the Russian Federation. A significant reduction in the number of injected cells, increasing their viability and ensuring long-term preservation of the implant in damaged tissue will also reduce the cost of treatment.
Claims (19)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009132350/15A RU2428996C2 (en) | 2009-08-28 | 2009-08-28 | Biotransplant for correction of soft tissue defects (versions), method of biotransplant obtaining (versions) and method of correction of soft tissue defects |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009132350/15A RU2428996C2 (en) | 2009-08-28 | 2009-08-28 | Biotransplant for correction of soft tissue defects (versions), method of biotransplant obtaining (versions) and method of correction of soft tissue defects |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2009132350A RU2009132350A (en) | 2011-03-10 |
| RU2428996C2 true RU2428996C2 (en) | 2011-09-20 |
Family
ID=44758816
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2009132350/15A RU2428996C2 (en) | 2009-08-28 | 2009-08-28 | Biotransplant for correction of soft tissue defects (versions), method of biotransplant obtaining (versions) and method of correction of soft tissue defects |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2428996C2 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8790890B2 (en) | 2011-10-03 | 2014-07-29 | Obshhestvo S Organichennoi Otvetstvennost' Yu “Vitacel” | Diagnostic method for connective tissue and its application |
| RU2567004C2 (en) * | 2013-11-14 | 2015-10-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Экселлент Кволити Брендинг" | Method of separating fibroblasts, method of creating thereof-based biotransplant (versions) and method of regenerating human tissues (versions) |
| RU2578804C1 (en) * | 2015-04-27 | 2016-03-27 | Екатерина Евгеньевна Фаустова | Method for rejuvenation patient's body |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114344454A (en) * | 2022-01-21 | 2022-04-15 | 郑州市金水区蕾娜斯医疗美容门诊部 | Preparation method of autologous fat collagen injection |
-
2009
- 2009-08-28 RU RU2009132350/15A patent/RU2428996C2/en active
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8790890B2 (en) | 2011-10-03 | 2014-07-29 | Obshhestvo S Organichennoi Otvetstvennost' Yu “Vitacel” | Diagnostic method for connective tissue and its application |
| RU2567004C2 (en) * | 2013-11-14 | 2015-10-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Экселлент Кволити Брендинг" | Method of separating fibroblasts, method of creating thereof-based biotransplant (versions) and method of regenerating human tissues (versions) |
| RU2578804C1 (en) * | 2015-04-27 | 2016-03-27 | Екатерина Евгеньевна Фаустова | Method for rejuvenation patient's body |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2009132350A (en) | 2011-03-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11369716B2 (en) | Reparative cell isolation and delivery | |
| TWI283707B (en) | Use of adipose tissue-derived stromal cells for chondrocyte differentiation and cartilage repair | |
| JP6687757B2 (en) | Methods for preparing 3D cartilage organoid blocks | |
| US11801331B2 (en) | Composition for cartilage regeneration and preparing thereof | |
| CN113318274B (en) | Hydrogel and preparation method and application thereof | |
| JP2003517858A (en) | Augmentation and repair of age-related soft tissue defects | |
| CN103585177A (en) | Applications of mesenchymal stem cell and genetically modified mesenchymal stem cell | |
| MXPA04011043A (en) | Treatments with autologous fibroblast. | |
| CN108865986B (en) | Mesenchymal stem cell preparation for repairing articular cartilage damage/defect and preparation method and application thereof | |
| CN103768656A (en) | Tissue engineered bone constructed from allogeneic bone marrow mesenchymal stem cells and application thereof | |
| CN108057116A (en) | Application of the stem cell composition in skin injury medicine | |
| KR102104120B1 (en) | 3D bioprinting construct using human nasal inferior turbinate derived mesenchymal stem cell and uses thereof | |
| KR20160095677A (en) | Composition for treatment of cartilage damage and method for preparation of artificial cartilage | |
| US20190015551A1 (en) | Construct for preventing immunological rejection generated when used in transplants, and method for using collagen in a gel state, in the form of dry lyophilised spongy mouldings and 3d matrices | |
| CN112870445A (en) | Preparation method and application of soft tissue repair material | |
| RU2428996C2 (en) | Biotransplant for correction of soft tissue defects (versions), method of biotransplant obtaining (versions) and method of correction of soft tissue defects | |
| RU2418571C1 (en) | Biotransplant, method of its obtaining and method of treating periodontal diseases | |
| CN108066750A (en) | Stem cell and its secretion are used to treat the new application of skin burn | |
| CN109771694A (en) | The preparation method and application of self assembly polypeptide nano fiber water gel scaffold material | |
| RU2281776C1 (en) | Biotransplant and method for correction of soft tissue defect, method for preparing biotransplant | |
| US20100104641A1 (en) | Therapeutic composition, and use of a cell-free substance | |
| KR20160046970A (en) | Trypsin free cell stamp system using scaffold and method for cell culturing using thereof | |
| CN108057131A (en) | A kind of novel agent box containing stem cell | |
| CN110755689B (en) | Three-dimensional reconstruction method of hair follicle and hair follicle prepared by reconstruction method | |
| Asad et al. | Three-dimensional cultures of gingival fibroblasts on fibrin-based scaffolds for gingival augmentation: A proof-of-concept study |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE Effective date: 20150508 |
|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: SUB-LICENCE Effective date: 20150714 |
|
| PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20210617 |