RU2418571C1 - Biotransplant, method of its obtaining and method of treating periodontal diseases - Google Patents
Biotransplant, method of its obtaining and method of treating periodontal diseases Download PDFInfo
- Publication number
- RU2418571C1 RU2418571C1 RU2009132351/15A RU2009132351A RU2418571C1 RU 2418571 C1 RU2418571 C1 RU 2418571C1 RU 2009132351/15 A RU2009132351/15 A RU 2009132351/15A RU 2009132351 A RU2009132351 A RU 2009132351A RU 2418571 C1 RU2418571 C1 RU 2418571C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cell
- cells
- suspension
- hyaluronic acid
- culture
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии, и касается лекарственных средств для восстановления тканей пародонта и устранения послеоперационной ретракции тканей альвеолярных отростков при проведении пародонтологических и имплантологических вмешательств.The invention relates to medicine, namely to dentistry, and for medicines for the restoration of periodontal tissues and the elimination of postoperative tissue retraction of the alveolar processes during periodontal and implantological interventions.
Для восстановления тканей пародонта (обобщающее название зубов и околозубных тканей, таких как десна, альвеолярные отростки челюсти, периодонт) используют биотрансплантат, представляющий собой препарат, состоящий из аутологичных фибробластов слизистой оболочки полости рта (или аллогенных фибробластов или фибробластподобных клеток) человека, а также композицию, состоящую из измельченной матрицы кожи человека (или любой другой фармацевтически приемлемой биосовместимой, биодеградируемой матрицы, которая может представлять собой коллагеновые микросферы или частицы животного или человеческого происхождения, в том числе препараты гиалуроновой кислоты) и аутологичных фибробластов слизистой оболочки полости рта (или аллогенных фибробластов или фибробластподобных клеток) человека. Успехи современной эстетической стоматологии во многом определяются научной разработкой и внедрением в практику новых технологий, которые существенно меняют традиционные представления о возможностях лечения. Одним из наиболее перспективных направлений научных поисков, безусловно, являются клеточные технологии, основанные на использовании отдельных клеток для восстановления тканей при различных патологиях. Проблема лечения воспалительных заболеваний пародонта в настоящее время актуальна во всем мире. По данным ВОЗ, распространенность этих заболеваний достигает 90-95% у взрослого населения и 80-83% у подростков, причем с преобладанием деструктивных форм. Поражение периодонта (плотная соединительная ткань, окружающая корень зуба), является одной из главных причин потери зубов у людей среднего возраста и старше и, по-прежнему, остается актуальной проблема разработки методов лечения данной патологии, которые на сегодня ограничены только хирургическими, причем далеко не во всех случаях эффективными методами [Грудянов А.И., Ерохин А.И., Хирургические методы лечения заболеваний пародонта. - М., 2006]. Сами по себе хирургические вмешательства на пародонте не могут радикально решить проблему эффективного купирования патологического процесса, восстановления утраченной костной ткани и адекватных анатомических взаимоотношений тканевых структур пародонта и зуба.To restore periodontal tissues (a generic name for teeth and peridental tissues, such as gums, alveolar processes of the jaw, periodontium), a biograft is used, which is a preparation consisting of autologous fibroblasts of the oral mucosa (or allogeneic fibroblasts or fibroblast-like cells) of a person, as well as the composition consisting of a crushed matrix of human skin (or any other pharmaceutically acceptable biocompatible, biodegradable matrix, which may be a colla gene microspheres or particles of animal or human origin, including preparations of hyaluronic acid) and autologous fibroblasts of the oral mucosa (or allogeneic fibroblasts or fibroblast-like cells) of a person. The successes of modern aesthetic dentistry are largely determined by the scientific development and implementation of new technologies in practice, which significantly change the traditional understanding of treatment options. One of the most promising areas of scientific research, of course, is cell technology based on the use of individual cells for tissue repair in various pathologies. The problem of treating inflammatory periodontal diseases is currently relevant worldwide. According to WHO, the prevalence of these diseases reaches 90-95% in the adult population and 80-83% in adolescents, with the prevalence of destructive forms. The defeat of the periodontium (dense connective tissue surrounding the root of the tooth) is one of the main causes of tooth loss in middle-aged and older people and, as before, the problem of developing treatment methods for this pathology, which today is limited only by surgical ones, is far from being in all cases, effective methods [Grudyanov AI, Erokhin AI, Surgical methods of treatment of periodontal diseases. - M., 2006]. Surgical interventions on periodontal per se cannot radically solve the problem of effective relief of the pathological process, restoration of lost bone tissue and adequate anatomical relationships of the periodontal and tooth tissue structures.
Для восстановления тканей пародонта и устранения послеоперационной ретракции тканей альвеолярных отростков при проведении пародонтологических и имплантологических вмешательств перспективным представляется применение клеточных культур фибробластов и продуцируемых ими биологически активных веществ [Hou L.T., Tsai A.Y., Liu C.M., Feng F. Autologous transplantation of gingival fibroblast-like cells and a hydroxyapatyte complex graft in the treatment of periodontal osseous defects: cell cultivation and long-term report of cases. //Cell Transplant. 2003. - 12(7). - P. 787-797]. Особое внимание именно фибробластам уделяется потому, что они представляют собой клетки мезенхимального происхождения, являются основным клеточным компонентом соединительной ткани, продуцируют проколлаген, фибронектин, гликозаминогликаны, проэластин, ферменты, ростовые факторы, которые, превращаясь в соответствующие волокна, служат волоконным каркасом для соединительной ткани, а фибронектин и гликозаминогликаны формируют экстрацеллюлярный матрикс. Наряду с вышеуказанными веществами фибробласты продуцируют ряд ферментов и ряд белков, играющих чрезвычайно важную роль в регуляции местных гомеостатических процессов и межклеточных взаимодействий [Степанова И.И. Применение фибробастов в стоматологии и имплантологии. Клеточные технологии в биологии и медицине № 3, стр.165-168, 2007]. Хороший клинический эффект от применения аутологичных фибробластов обусловлен их высокой терапевтической активностью: стимуляцией белкового синтеза, выделением факторов роста, ускорением процессов ангиогенеза, пролиферацией эндотелиоцитов капилляров и, соответственно, усилением регенерации тканей пораженного пародонта [McGuire M.C. and Nunn M.E. Evalution of the safety and efficacy of periodontal applications of a living tissue-engineereg human fibroblast-derived dermal substitute.I. Comparison to the gingival autograft: a randomized controlled pilot study, J. Periodontal, vol. 76, n.6, p.867-880, 2005]. В настоящее время в медицине широко используют различные имплантационные препараты, созданные на основе компонентов, синтезируемых фибробластами [Hruza G.J. Arch. Facial Plast. Surg. Vol 6, Nov/Dec., 2004].The use of cell cultures of fibroblasts and biologically active substances produced by them [Hou LT, Tsai AY, Liu CM, Feng F. Autologous transplantation of gingival fibroblast-like cells is promising for restoration of periodontal tissues and elimination of postoperative retraction of tissue of the alveolar processes during periodontal and implantological interventions and a hydroxyapatyte complex graft in the treatment of periodontal osseous defects: cell cultivation and long-term report of cases. // Cell Transplant. 2003 .-- 12 (7). - P. 787-797]. Particular attention is paid to fibroblasts because they are cells of mesenchymal origin, are the main cellular component of connective tissue, produce procollagen, fibronectin, glycosaminoglycans, pro-elastin, enzymes, growth factors that, when converted into the corresponding fibers, serve as a fiber framework for connective tissue, and fibronectin and glycosaminoglycans form an extracellular matrix. Along with the above substances, fibroblasts produce a number of enzymes and a number of proteins that play an extremely important role in the regulation of local homeostatic processes and intercellular interactions [Stepanova II The use of fibrobastes in dentistry and implantology. Cellular Technologies in Biology and Medicine No. 3, pp. 165-168, 2007]. A good clinical effect from the use of autologous fibroblasts is due to their high therapeutic activity: stimulation of protein synthesis, isolation of growth factors, acceleration of angiogenesis, proliferation of capillary endotheliocytes and, accordingly, increased tissue regeneration of the affected periodontium [McGuire M.C. and Nunn M.E. Evaluation of the safety and efficacy of periodontal applications of a living tissue-engineereg human fibroblast-derived dermal substitute. I. Comparison to the gingival autograft: a randomized controlled pilot study, J. Periodontal, vol. 76, n.6, p.867-880, 2005]. Currently, various implant preparations based on components synthesized by fibroblasts are widely used in medicine [Hruza G.J. Arch. Facial Plast. Surg. Vol 6, Nov / Dec., 2004].
Известно применение биологического протеза на основе коллагена для устранения дефекта костной ткани, где в качестве основы используют гемостатическую коллагеновую губку, на которую наносят аутологичный костный мозг [Патент РФ № 2055535, МПК А61В 17/56].It is known to use a collagen-based biological prosthesis to repair a bone defect, where a hemostatic collagen sponge is used as a base on which an autologous bone marrow is applied [RF Patent No. 2055535, IPC АВВ 17/56].
Известно использование остеотропной мембраны на основе коллагена и лекарственных средств для лечения заболеваний пародонта [Патент РФ № 32159101, МПК А61К 6/097].It is known to use an osteotropic membrane based on collagen and drugs for the treatment of periodontal diseases [RF Patent No. 32159101, IPC A61K 6/097].
Известна композиция для лечения воспалительных заболеваний пародонта на основе клеточных культур фибробластов в виде штамма диплоидных клеток легкого эмбриона человека ЛЭЧ-4 [Патент РФ № 2210352, МПК А61К 6/00].A known composition for the treatment of inflammatory periodontal diseases based on cell cultures of fibroblasts in the form of a diploid cell strain of a human lung embryo LEC-4 [RF Patent No. 2210352, IPC A61K 6/00].
Известен способ лечения заболеваний пародонта с помощью введения суспензии мезенхимальных стволовых и хондропрогениторных клеток, полученных из фетальной ткани на разных сроках гестации или их комбинации [Патент РФ 2265445, МПК А61К 35/32].There is a method of treating periodontal diseases by introducing a suspension of mesenchymal stem and chondroprogenic cells obtained from fetal tissue at different gestational periods or a combination thereof [RF Patent 2265445, IPC A61K 35/32].
Недостатками этих способов является сложность подготовки трансплантата костного мозга, использование клеток полученных из фетальной ткани, что не исключает риск вирусной контаминации трансплантата, иммунное отторжение аллотрансплантата.The disadvantages of these methods are the difficulty of preparing a bone marrow transplant, the use of cells obtained from fetal tissue, which does not exclude the risk of viral contamination of the transplant, immune rejection of the allograft.
Известно использование клеточной культуры эмбриональных фибробластов человека М-22 при хирургическом лечении воспалительных заболеваний пародонта [Ерохин А.И. Использование культуры фибробластов человека при хирургическом лечении воспалительных заболеваний пародонта. Диссертация на соискание ученой степени канд. мед. наук. - М., 2002]. Автором исследована жизнеспособность аллофибробастов культивированных с различными видами остеопластических материалов.It is known to use the cell culture of human embryonic fibroblasts M-22 in the surgical treatment of inflammatory periodontal diseases [Erokhin A.I. The use of human fibroblast culture in the surgical treatment of inflammatory periodontal diseases. Thesis for the degree of Cand. honey. sciences. - M., 2002]. The author investigated the viability of allofibrobasts cultured with various types of osteoplastic materials.
Основным недостатком аллогенных биотрансплантатов является неустойчивость терапевтического эффекта и использование клеток из фетального материала.The main disadvantage of allogeneic biografts is the instability of the therapeutic effect and the use of cells from fetal material.
Известен способ лечения пародонтита с помощью биотрансплантата, представляющего собой суспензию аутологичных фибробластов [Патент РФ № 2281776, МПК А61К 35/36].There is a method of treating periodontitis using a biotransplant, which is a suspension of autologous fibroblasts [RF Patent No. 2281776, IPC A61K 35/36].
Известен способ коррещии дефектов мягких тканей посредством одновременного введения аутологичных фибробластов с различными формами коллагена и гликозаминогликанов [Патент США № 6878383, МПК A61F 13/00].A known method for the correction of soft tissue defects by the simultaneous introduction of autologous fibroblasts with various forms of collagen and glycosaminoglycans [US Patent No. 6878383, IPC A61F 13/00].
Недостатком данного изобретения является использование коллагена любого типа и гликозаминогликанов, поперечно-сшитых с помощью, например, глютаральдегида. При биодеградации экзогеного коллагена может высвобождаться мономерный глютаральдегид в ткани и жидкости организма, который может оказывать цитотоксическое действие на фибробласты и вызывать развитие непредвиденных побочных эффектов.The disadvantage of this invention is the use of any type of collagen and glycosaminoglycans cross-linked with, for example, glutaraldehyde. During the biodegradation of exogenous collagen, monomeric glutaraldehyde can be released in the tissues and body fluids, which can have a cytotoxic effect on fibroblasts and cause the development of unforeseen side effects.
Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является создание эффективного биотрансплантата, способа его получения и способа лечения заболеваний пародонта.The problem to which the invention is directed, is the creation of an effective biograft, a method for its preparation and a method for the treatment of periodontal diseases.
Предложена группа изобретений, объединенных общим изобретательским замыслом.A group of inventions united by a common inventive concept is proposed.
Для решения поставленной задачи биотрансплантат для лечения заболеваний пародонта характеризуется тем, что он представляет собой суспензию, содержащую культуры аутологичных или аллогенных фибробластов, или фибробластоподобных клеток в 0,9% растворе хлорида натрия в концентрации 2,0-10,0×106 в 1 мл биотрансплантата, интегрированных на фармацевтически приемлемом биосовместимом биодеградируемом носителе, выбранном из ряда: бесклеточная матрица, препарат гиалуроновой кислоты, бесклеточная матрица и препарат гиалуроновой кислоты.To solve this problem, a biograft for the treatment of periodontal diseases is characterized in that it is a suspension containing cultures of autologous or allogeneic fibroblasts, or fibroblast-like cells in a 0.9% solution of sodium chloride at a concentration of 2.0-10.0 × 10 6 in 1 ml biotransplant integrated on a pharmaceutically acceptable biocompatible biodegradable carrier selected from: cell-free matrix, hyaluronic acid preparation, cell-free matrix and hyaluronic acid preparation.
В частном варианте объемное соотношение суспензии культуры клеток и бесклеточной матрицы или препарата гиалуроновой кислоты составляет 5:1 соответственно.In a particular embodiment, the volume ratio of the cell culture suspension and the cell-free matrix or hyaluronic acid preparation is 5: 1, respectively.
В другом частном варианте объемное соотношение суспензии культуры клеток, бесклеточной матрицы и препарата гиалуроновой кислоты составляет 4:1:1 соответственно.In another particular embodiment, the volume ratio of the suspension of cell culture, cell-free matrix and the preparation of hyaluronic acid is 4: 1: 1, respectively.
В другом частном варианте биотрансплантат содержит суспензию культуры аутологичных или аллогенных фибробластов, или фибробластоподобных клеток, выделенных из кожи, или слизистой оболочки, или костного мозга, или жировой ткани, или пульпы зуба.In another particular embodiment, the biograft contains a culture suspension of autologous or allogeneic fibroblasts, or fibroblast-like cells isolated from the skin or mucous membrane, or bone marrow, or adipose tissue, or tooth pulp.
В другом частном варианте в качестве фармацевтически приемлемого биосовместимого биодеградируемого носителя используют измельченную до размера 100-200 мкм бесклеточную матрицу «Сайметра».In another particular embodiment, as a pharmaceutically acceptable biocompatible biodegradable carrier, a Simetr cell-free matrix-free matrix sized to 100-200 μm is used.
Для решения поставленной задачи способ получения биотрансплантата для лечения заболеваний пародонта характеризуется тем, что биоптат промывают растворами антибиотиков и антимикотика в среде ДМЕМ и переносят в среду ДМЕМ, содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 40 мкг/мл гентамицина и коллагеназы II типа, инкубацию биоптата проводят при 37°С 16-17 часов, полученный клеточный осадок ресуспендируют в среде для культивирования ДМЕМ, 10-20% ЭТС, 40 мкг/мл гентамицина, высевают и культивируют в течение 2-3 недель до получения первичной культуры, затем клетки трипсинизируют и культивируют, после чего среду с 10-20% ЭТС заменяют на среду без сыворотки или на среду ДМЕМ 90% и 10% аутологичной сыворотки и выдерживают 8-14 часов при 37°С, после культивирования клетки собирают с помощью 0,25% трипсин - ЭДТА, отмывают трехкратно путем центрифугирования - ресуспендирования и суспендируют в 0,9% растворе хлорида натрия в концентрации 2,0-10,0×106 в 1 мл биотрансплантата, затем суспензию клеток интегрируют на фармацевтически приемлемом биосовместимом биодеградируемом носителе, выбранном из ряда: бесклеточная матрица, препарат гиалуроновой кислоты, бесклеточная матрица и препарат гиалуроновой кислоты.To solve this problem, the method of producing a biograft for the treatment of periodontal diseases is characterized by the fact that the biopsy is washed with solutions of antibiotics and antimycotics in a DMEM medium and transferred to a DMEM medium containing 10% fetal calf serum, 40 μg / ml gentamicin and type II collagenase, the biopsy is incubated at 37 ° C for 16-17 hours, the resulting cell pellet is resuspended in DMEM cultivation medium, 10-20% ETS, 40 μg / ml gentamicin, seeded and cultured for 2-3 weeks until the primary culture is obtained then the cells are trypsinized and cultured, after which the medium with 10-20% ETS is replaced with medium without serum or with DMEM 90% and 10% autologous serum and incubated for 8-14 hours at 37 ° C, after cultivation, cells are harvested using 0 , 25% trypsin - EDTA, washed three times by centrifugation - resuspension and suspended in a 0.9% sodium chloride solution at a concentration of 2.0-10.0 × 10 6 in 1 ml of biograft, then the cell suspension is integrated on a pharmaceutically acceptable biocompatible biodegradable carrier selected from the series: beskleto the primary matrix, a hyaluronic acid preparation, a cell-free matrix and a hyaluronic acid preparation.
В частном варианте суспензию клеток культивируют для адгезии фибробластподобных клеток 1-2 часа при 37°С.In a particular embodiment, the cell suspension is cultured for adhesion of fibroblast-like cells for 1-2 hours at 37 ° C.
Для решения поставленной задачи способ лечения заболеваний пародонта характеризуется тем, что на слизистой оболочке десны в области дефекта предварительно делают надрезы, затем в область дефекта инъекционным путем вводят двукратно или троекратно с интервалом 1-4 недели биотрансплантат, представляющий собой суспензию, содержащую культуры аутологичных или аллогенных фибробластов, или фибробластоподобных клеток в 0,9% растворе хлорида натрия в концентрации 2,0-10,0×106 клеток в 1 мл биотрансплантата, или суспензию, содержащую культуры аутологичных или аллогенных фибробластов, или фибробластоподобных клеток в 0,9% растворе хлорида натрия в концентрации 2,0-10,0×106 клеток в 1 мл биотрансплантата, интегрированных на фармацевтически приемлемом биосовместимом биодеградируемом носителе, выбранном из ряда: бесклеточная матрица, препарат гиалуроновой кислоты, бесклеточная матрица и препарат гиалуроновой кислоты в количестве 3,6-60×106 клеток на курс лечения.To solve this problem, a method of treating periodontal diseases is characterized by the fact that incisions are made on the gingival mucosa in the area of the defect, then a biotransplant is introduced into the defect area twice or three times with an interval of 1-4 weeks, which is a suspension containing cultures of autologous or allogeneic fibroblasts, or fibroblast-like cells in a 0.9% sodium chloride solution at a concentration of 2.0-10.0 × 10 6 cells in 1 ml of biograft, or a suspension containing an autologous culture egg or allogeneic fibroblasts or fibroblast-like cells in a 0.9% sodium chloride solution at a concentration of 2.0-10.0 × 10 6 cells in 1 ml of biograft integrated on a pharmaceutically acceptable biocompatible biodegradable carrier selected from the range: cell-free matrix, preparation hyaluronic acid, a cell-free matrix and a preparation of hyaluronic acid in the amount of 3.6-60 × 10 6 cells per course of treatment.
В частном варианте на слизистой оболочке десны в области дефекта делают надрезы за одну неделю до введения биотрансплантата.In a particular embodiment, incisions are made on the gingival mucosa in the area of the defect one week before the introduction of the biograft.
В другом частном варианте на слизистой оболочке десны в области дефекта делают крестообразные надрезы.In another particular embodiment, cruciate incisions are made on the gingival mucosa in the area of the defect.
Изобретение иллюстрируется следующими чертежами.The invention is illustrated by the following drawings.
На Фиг.1 представлены фибробластподобные клетки в культуре. Фазово-контрастная микроскопия ×200.Figure 1 presents fibroblast-like cells in culture. Phase contrast microscopy × 200.
На Фиг.2 представлена кожная матрица «Сайметра» с интегрированными фибробластподобными клетками. Фазово-контрастная микроскопия ×200.Figure 2 presents the skin matrix "Saymetra" with integrated fibroblast-like cells. Phase contrast microscopy × 200.
Создание условий, способствующих повышению жизнеспособности инъецируемых клеток, позволяет повысить эффективность действия биотрансплантатов, снизить количество инъецируемых клеток и эффективно оперировать количеством живых инъецируемых клеток в зависимости от размеров повреждения. После трансплантации биотрансплантата фибробласты или фибробластподобные клетки постепенно мигрируют с матрицы и благодаря своим синтетическим функциям (синтез волокон, гликозаминогликанов, ферментов, цитокинов, факторов роста) способствуют восстановлению поврежденных тканей.The creation of conditions conducive to increasing the viability of injected cells allows one to increase the effectiveness of the action of biografts, reduce the number of injected cells and effectively operate with the number of live injectable cells depending on the size of the damage. After transplantation of a biograft, fibroblasts or fibroblast-like cells gradually migrate from the matrix and, thanks to their synthetic functions (synthesis of fibers, glycosaminoglycans, enzymes, cytokines, growth factors), contribute to the restoration of damaged tissues.
Использование в биотрансплантате матрицы «Сайметра» без фибробластоподобных клеток или любой другой фармацевтически приемлемой биодеградируемой биосовместимой матрицы в качестве носителя позволяет повысить жизнеспособность инъецируемых фибробластов, оптимизировать их доставку в место дефекта и обеспечить синтез физиологически необходимого уровня компонентов межклеточного матрикса.The use of the Saymetra matrix in a biotransplant without fibroblast-like cells or any other pharmaceutically acceptable biodegradable biocompatible matrix as a carrier allows increasing the viability of injected fibroblasts, optimizing their delivery to the defect site and ensuring the synthesis of a physiologically necessary level of intercellular matrix components.
Для повышения жизнеспособности клеток большую роль играет создание такого биотрансплантата, который максимально бы соответствовал физиологическим условиям, в которых находится фибробласт, а именно - густая сеть межклеточного матрикса, состоящего преимущественно из волокон и основного вещества - гликозаминогликанов, в частности гиалуроновой кислоты.To increase cell viability, an important role is played by the creation of such a biograft that would maximally correspond to the physiological conditions in which fibroblast is located, namely, a dense network of intercellular matrix, consisting mainly of fibers and the main substance - glycosaminoglycans, in particular hyaluronic acid.
По этой причине целесообразным является создание биотрансплантата, содержащего фармацевтически приемлемые препараты биосовместимой биодеградируемой измельченной бесклеточной матрицы с интегрированными на ней фибробластподобными клетками (Фиг.2), включающей волокна (коллагена, эластина) и гиалуроновую кислоту, которая, имея консистенцию геля, позволяет имплантированным клеткам оставаться локализованными в определенном месте, в частности, в месте дефекта ткани.For this reason, it is advisable to create a biograft containing pharmaceutically acceptable preparations of a biocompatible biodegradable crushed cell-free matrix with fibroblast-like cells integrated on it (Figure 2), including fibers (collagen, elastin) and hyaluronic acid, which, having a gel consistency, allows the implanted cells to remain localized in a specific place, in particular, in the place of a tissue defect.
Указанные в изобретении соотношения используемых компонентов - культуры клеток, бесклеточной матрицы и гиалуроновой кислоты - позволяют получить биотрансплантат с консистенцией, удобной для инъецирования и наряду с выраженным клиническим эффектом обеспечивают малотравматичность и простоту инъецирования.The ratios of the components used in the invention — cell culture, cell-free matrix and hyaluronic acid — make it possible to obtain a biograft with a consistency suitable for injection and, along with a pronounced clinical effect, provide low-invasiveness and ease of injection.
Предложенный в изобретении способ введения биотрансплантата двукратно или троекратно с интервалом в 1-4 недели в зависимости от размеров дефекта мягких тканей позволяет также снизить травматичность способа, обеспечить полную реабилитацию тканей после трансплантации и создать оптимальный временной интервал для приживления клеток.The method of introducing a biograft twice or three times with an interval of 1-4 weeks, depending on the size of the soft tissue defect proposed in the invention, can also reduce the invasiveness of the method, ensure complete tissue rehabilitation after transplantation and create an optimal time interval for cell engraftment.
За неделю до инъекции биотрансплантата на прикрепленную часть слизистой оболочки десны без рассечения сосочка наносят, например, крестообразный надрез, провоцирующий острый воспалительный процесс, приводящий к увеличению объема ткани, что позволит без потерь вводить больший объем биотрансплантата, то есть для облегчения процесса клеточной трансплантации представлена новая минимально инвазивная хирургическая процедура, целью которой является индукция временного воспалительного ответа в папиллярной ткани.A week before the biograft injection, an attached part of the gingival mucosa without dissection of the papilla is inflicted, for example, with a cruciform incision, which provokes an acute inflammatory process leading to an increase in tissue volume, which will allow a larger volume of the biograft to be introduced without losses, i.e., a new biotransplant is introduced to facilitate the process of cell transplantation minimally invasive surgical procedure, the purpose of which is the induction of a temporary inflammatory response in papillary tissue.
Биотрансплантат может состоять из аутологичных фибробластов слизистой оболочки полости рта или аллогенных фибробластов или фибробластподобных клеток человека и любого фармацевтически приемлемого биосовместимого биодеградируемого носителя, который может представлять собой коллагеновые микросферы или частицы животного или человеческого происхождения, в том числе препарат гиалуроновой кислоты.A biograft can consist of autologous fibroblasts of the oral mucosa or allogeneic fibroblasts or human fibroblast-like cells and any pharmaceutically acceptable biocompatible biodegradable carrier, which can be collagen microspheres or particles of animal or human origin, including a hyaluronic acid preparation.
Биотрансплантат может также состоять только из аутологичных фибробластов слизистой оболочки полости рта или аллогенных фибробластов или фибробластподобных клеток человека.A biograft can also consist only of autologous fibroblasts of the oral mucosa or allogeneic fibroblasts or human fibroblast-like cells.
Выделение первичных культур фибробластов или фибробластподобных клетокIsolation of primary cultures of fibroblasts or fibroblast-like cells
Первичные культуры фибробластов или фибробластподобных клеток получают стандартными методами (A Culture of Animal Cells., Freshney J. 3rd edition, Wiley Liss Inc., New York, 1994) с небольшими модификациями.Primary cultures of fibroblasts or fibroblast-like cells are obtained by standard methods (A Culture of Animal Cells., Freshney J. 3rd edition, Wiley Liss Inc., New York, 1994) with minor modifications.
У пациентов берут биопсийный материал из-за ушной раковины, или со слизистой оболочки ротовой полости, или крайней плоти или пуповины новорожденного. Перед получением первичной клеточной культуры биоптат промывают растворами антибиотиков и антимикотика (пенициллин 100 ед./мл, стрептомицин 100 мкг/мл, гентамицин 200 мкг/мл, амфотерицин В 25 мкг/мл) в среде ДМЕМ. После промывки, биоптат переносят в среду ДМЕМ, содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 40 мкг/мл гентамицина и 400-500 мкг/мл коллагеназы II типа («Sigma»). Инкубацию биоптата проводят при 37°С, 16-17 часов. Среду с коллагеназой предварительно стерильно фильтруют. После инкубации полученную клеточную взвесь промывают в фосфатно-солевом буфере («ПанЭко») рН 7,4-7,5 путем центрифугирования при 400g 10 минут.Полученный клеточный осадок ресуспендируют в среде для культивирования - ДМЕМ, 10-20% ЭТС («ПанЭко»), 40 мкг/мл гентамицина и высевают в культуральные флаконы Т 25, ("Nunc"). Флаконы помещают в СО2-инкубатор (37°С, 5% СО2) и культивируют в течение 1-3 недель до получения первичной культуры. В качестве сыворотки используют как ЭТС, так и тестированную сыворотку пуповинной крови человека, так и аутологичную сыворотку крови пациента. Оптимальная концентрация сыворотки 10-20%. Более высокие концентрации сыворотки стимулируют быструю пролиферацию фибробластов. Концентрацию глюкозы в среде ДМЕМ варьируют от 1 до 4,5 г на 1 литр среды. Для культивирования фибробластов и фибробластподобных клеток используют также бессывороточную среду, например, бессывороточную полную ростовую среду для культивирования фибробластов (Fibroblast Basal Medium, BioWhittaker Inc., USA) или иные аналогичные бессывороточные среды для культивирования фибробластподобных клеток. Перед использованием ЭТС проводят тестирование каждого лота ЭТС на колониеобразующие единицы фибробластов (КОЕ - Ф) и отбирают лоты только с высокой эффективностью колониеобразования. Культивирование проводят в чашках Петри, эксплантируя от 100 до 200 клеток в 10 мл полной ростовой среды. После 14 дней культивирования клетки снимают раствором трипсина - ЭДТА («ПанЭко») и переносят в новый (Т-75 «Nunc») культуральный флакон с питательной средой. Клетки инкубируют в течение недели в СО3 инкубаторе (37°С, 5% CO2). Каждые 48-72 часа производят смену питательной среды. По мере роста и достижения субконфлюэнтного слоя клетки трипсинизируют и переносят в новый большей площадью (Т-150, либо Т-175 «Nunc») культуральный флакон. Культуральные флаконы Т-150, Т-175 обладает емкостью, позволяющей снимать 7-15×106 клеток. В дальнейшем клетки переносят в фабрики Т-500 «Nunc» с тройным дном, после 7 дней культивирования с такого матраса снимают 20-30×106 клеток. При достижении субконфлюэнтного монослоя среду с 10-20% ЭТС заменяют на среду без сыворотки или на среду с 10% аутологичной сывороткой пациента. До снятия клеток и получения готовой суспензии клетки выдерживают не менее 8-14 часов при 37°С. Инкубация клеток на среде, не содержащей сыворотки, позволит избавиться от чужеродных белков, содержащихся в ЭТС. В конце инкубации клетки собирают с помощью 0,25% трипсин - ЭДТА, отмывают трехкратно путем центрифугирования - ресуспендирования и суспендируют в 0,9% растворе хлорида натрия для инъекций. Затем клетки соединяют с фармацевтически приемлемым носителем (препаратом «Сайметра»). Объем готового биотрансплантата подбирают для каждого пациента индивидуально.Biopsy material is taken from patients because of the auricle, or from the mucous membrane of the oral cavity, or the foreskin or umbilical cord of the newborn. Before receiving the primary cell culture, the biopsy is washed with solutions of antibiotics and antimycotics (penicillin 100 units / ml, streptomycin 100 μg / ml, gentamicin 200 μg / ml, amphotericin B 25 μg / ml) in DMEM medium. After washing, the biopsy sample is transferred to DMEM medium containing 10% fetal calf serum (ETS), 40 μg / ml gentamicin and 400-500 μg / ml type II collagenase (Sigma). The incubation of the biopsy is carried out at 37 ° C, 16-17 hours. Collagenase medium is pre-sterile filtered. After incubation, the resulting cell suspension is washed in phosphate-buffered saline (PanEco) pH 7.4-7.5 by centrifugation at 400g for 10 minutes. The resulting cell pellet is resuspended in culture medium - DMEM, 10-20% ETS (PanEco "), 40 μg / ml of gentamicin and seeded in culture bottles T 25, (" Nunc "). Vials are placed in a CO 2 incubator (37 ° C, 5% CO 2 ) and cultured for 1-3 weeks to obtain the primary culture. As the serum, both ETS and the tested human cord blood serum are used, as well as the patient’s autologous blood serum. The optimal concentration of serum is 10-20%. Higher serum concentrations stimulate the rapid proliferation of fibroblasts. The glucose concentration in the DMEM medium varies from 1 to 4.5 g per 1 liter of medium. For the cultivation of fibroblasts and fibroblast-like cells, a serum-free medium is also used, for example, serum-free growth medium for culturing fibroblasts (Fibroblast Basal Medium, BioWhittaker Inc., USA) or other similar serum-free media for culturing fibroblast-like cells. Before using ETS, each lot of ETS is tested for colony forming units of fibroblasts (CFU - F) and lots are selected only with high colony formation efficiency. Cultivation is carried out in Petri dishes, explanting from 100 to 200 cells in 10 ml of a complete growth medium. After 14 days of cultivation, the cells are removed with a trypsin-EDTA solution (PanEco) and transferred to a new (T-75 Nunc) culture bottle with nutrient medium. Cells are incubated for a week in a CO 3 incubator (37 ° C, 5% CO 2 ). Every 48-72 hours change the nutrient medium. As the subconfluent layer grows and reaches the cells, trypsinize and transfer to a new, larger area (T-150, or T-175 "Nunc") culture bottle. Culture bottles T-150, T-175 has a capacity that allows you to remove 7-15 × 10 6 cells. Subsequently, the cells are transferred to the T-500 “Nunc” factories with a triple bottom; after 7 days of cultivation, 20-30 × 10 6 cells are removed from such a mattress. Upon reaching a subconfluent monolayer, the medium with 10-20% ETS is replaced with medium without serum or with medium with 10% autologous patient serum. Before removing the cells and obtaining the finished suspension, the cells are incubated for at least 8-14 hours at 37 ° C. Incubation of cells in a serum-free medium will allow you to get rid of foreign proteins contained in ETS. At the end of the incubation, the cells are harvested using 0.25% trypsin - EDTA, washed three times by centrifugation - resuspension, and suspended in a 0.9% sodium chloride solution for injection. Then the cells are combined with a pharmaceutically acceptable carrier (Saymetra drug). The volume of the finished biotransplant is selected individually for each patient.
Выделение фибробластподобных клеток из костного мозга.Isolation of fibroblast-like cells from bone marrow.
Выделение фибробластподобных клеток из костного мозга проводят по стандартной методике [Metod in molecular biology. Basic Cell Culture Protocols, Helgason C.D., Miller C.L., 3 ed. New Jersey, 2005].The selection of fibroblast-like cells from the bone marrow is carried out according to the standard method [Metod in molecular biology. Basic Cell Culture Protocols, Helgason C. D., Miller C. L., 3 ed. New Jersey, 2005].
Аспират костного мозга донора (10-15 мл) выделяют из крыла подвздошной кости, используя гепарин как антикоагулянт у пациента под местной анестезией. Суспензию костномозговых клеток разводят в эквивалентном объеме фосфатно-солевого буфера Дульбекко +2% ЭТС. В 50 мл коническую пробирку («Nunc»), содержащую 15 мл раствора фиколла с плотностью 1,077 г/см3 («ПанЭко»), осторожно наслаивают 20 мл разведенного пунктата костного мозга. Затем полученную смесь центрифугируют при 330g 25 мин. Интерфазное мононуклеарное кольцо осторожно отбирают 5 мл пипеткой в 50-мл пробирки. Отмывают с 5-кратным объемом фосфатно-солевого буфера, двухкратно при 330g 10 мин. Клетки подсчитывают в камере Горяева. Клеточную суспензию в количестве 1×107/мл ресуспендируют в культуральной среде а - MEM (Invitrogen) или DMEM/F12(1:1) с 20% ЭТС (лот сыворотки отбирают, как описано выше) или бессывороточной среде StemPro MSC SFM (Invitrogen) и антибиотиками (пенициллин 100 ед./мл, стрептомицин 100 мкг/мл). 10 мл клеточной суспензии высевают в культуральный флакон 25 см («Nunc») при 37°С и 5% СО2, и инкубируют 14 дней получая таким образом первичную клеточную культуру. Для дальнейшей экспансии клетки пассируют в количестве 3000-5000 кл/см2 в культуральные матрасы («Nunc») с большей посевной площадью. По мере роста и достижения 90% конфлюэнтного слоя клетки снимают раствором 0,25% трипсин-ЭДТА.A donor bone marrow aspirate (10-15 ml) is isolated from the iliac wing using heparin as an anticoagulant in a patient under local anesthesia. A suspension of bone marrow cells is diluted in an equivalent volume of Dulbecco's phosphate-buffered saline + 2% ETS. In a 50 ml conical tube ("Nunc") containing 15 ml of ficoll solution with a density of 1.077 g / cm 3 (PanEco), carefully layered 20 ml of diluted bone marrow punctate. Then the resulting mixture was centrifuged at 330g for 25 minutes. The interphase mononuclear ring is carefully taken with a 5 ml pipette into 50 ml tubes. Wash with 5x volume of phosphate-buffered saline, twice at 330g for 10 minutes. Cells are counted in Goryaev’s cell. The cell suspension in an amount of 1 × 10 7 / ml is resuspended in the culture medium a - MEM (Invitrogen) or DMEM / F12 (1: 1) with 20% ETS (lot of serum was taken as described above) or serum-free medium StemPro MSC SFM (Invitrogen ) and antibiotics (penicillin 100 units / ml, streptomycin 100 μg / ml). 10 ml of the cell suspension are plated in a 25 cm culture vial (“Nunc”) at 37 ° C and 5% CO 2 , and incubated for 14 days, thereby obtaining a primary cell culture. For further expansion, cells are passaged in an amount of 3000-5000 cells / cm 2 in culture mattresses ("Nunc") with a larger sown area. As the growth and achievement of 90% of the confluent layer, the cells are removed with a solution of 0.25% trypsin-EDTA.
Выделение фибробластподобных клеток из жировой ткани.Isolation of fibroblast-like cells from adipose tissue.
Выделение фибробластподобных клеток из жировой ткани проводят по стандартной методике [Zak P.A., Tissue Engineering vol. 7, №2, 2001] с небольшими модификациями.The selection of fibroblast-like cells from adipose tissue is carried out according to standard methods [Zak P.A., Tissue Engineering vol. 7, No. 2, 2001] with minor modifications.
Образцы жировой ткани получают посредством липосакции. Жировую ткань измельчают и подвергают ферментативной обработке коллагеназой I типа (200 ед/мл, Sigma) в среде DMEM, содержащей 100 ед./мл пенициллина и 100 ед/мл стрептомицина при соотношении ткани и среды 1:1 и инкубируют при 37°С в течение часа с постоянным покачиванием/перемешиванием. По окончании инкубации образец смешивают с культуральной средой DMEM, содержащей 10% ЭТС, и фильтруют через 70-100 мкм нейлоновый фильтр. Профильтрованную суспензию центрифугируют при 200g 5-7 минут. Полученный осадок обрабатывают лизирующим буфером (154 mM NH4CL, 10 mМ КНСО3, 0,1 mМ EDTA) в течение 5 минут при 37°С для лизиса эритоцитов, после чего клеточную суспензию центрифугируют при 400g 7 минут. Клеточный осадок (1×106/см2) ресуспендируют в культуральной среде, описанной выше, высевают в культуральный флакон и инкубируют в СО3 инкубаторе (37°С, 5% СО3). Смену среды проводят каждые 3-4 дня. По мере роста и достижения 80-90% конфлюэнтного монослоя клеточную суспензию снимают 0,25% трипсин-ЭДТА.Adipose tissue samples are obtained by liposuction. Adipose tissue is crushed and subjected to enzymatic treatment with type I collagenase (200 units / ml, Sigma) in DMEM medium containing 100 units / ml penicillin and 100 units / ml streptomycin with a tissue: medium ratio of 1: 1 and incubated at 37 ° C in for an hour with constant swaying / stirring. At the end of the incubation, the sample is mixed with DMEM culture medium containing 10% ETS and filtered through a 70-100 μm nylon filter. The filtered suspension is centrifuged at 200g for 5-7 minutes. The resulting pellet was treated with lysis buffer (154 mM NH 4 CL, 10 mM KHCO 3 , 0.1 mM EDTA) for 5 minutes at 37 ° C to lyse erythrocytes, after which the cell suspension was centrifuged at 400g for 7 minutes. The cell pellet (1 × 10 6 / cm 2 ) is resuspended in the culture medium described above, seeded in a culture bottle and incubated in a CO 3 incubator (37 ° C, 5% CO 3 ). A change of environment is carried out every 3-4 days. As 80-90% of the confluent monolayer grows and reaches 0.25% trypsin-EDTA, the cell suspension is removed.
Выделение фибробластподобных клеток из пульпы зубаIsolation of fibroblast-like cells from tooth pulp
Выделение фибробластподобных клеток из пульпы зуба по оригинально разработанной методике.Isolation of fibroblast-like cells from tooth pulp according to an originally developed technique.
Клетки получают из молочных зубов детей или удаленных третьих моляров взрослых. Зубы трехкратно промывают средой DMEM, содержащей 200 мкг/мл гентамицина, 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина. Затем зуб переносят во флакон с 10 мл среды DMEM, содержащей 10% ЭТС, 40 мкг/мл гентамицина и 400-500 мкг/мл коллагеназы II типа. Инкубацию ведут при 37°С, 17 час. Затем клеточную суспензию центрифугируют и осадок ресуспендируют в 5 мл культуральной среды DMEM или DMEM/F 12(1:1), содержащей 20% ЭТС или безсывороточной среде StemPro MSC SFM (Invitrogen) 40 мкг/мл гентамицина. Культивирование проводят в СО3 инкубаторе (37°С, 5% СО2) в течение 2-х недель до образования монослоя. Дальнейшее культивирование и пассирование клеток проводят в среде DMEM или DMEM/F12 (1:1) с 15% ЭТС или безсывороточной среде StemPro MSC SFM (Invitrogen) 40 мкг/мл гентамицина. Среду меняют каждые 3-4 дня. По мере роста и достижения 80-90% конфлюэнтного монослоя клеточную суспензию снимают 0,25% трипсин - ЭДТА.Cells are obtained from the deciduous teeth of children or the removed third molars of adults. The teeth are washed three times with DMEM medium containing 200 μg / ml gentamicin, 100 units / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin. Then the tooth is transferred into a bottle with 10 ml of DMEM medium containing 10% ETS, 40 μg / ml gentamicin and 400-500 μg / ml type II collagenase. Incubation is carried out at 37 ° C, 17 hours. Then the cell suspension is centrifuged and the pellet is resuspended in 5 ml of DMEM or DMEM / F 12 (1: 1) culture medium containing 20% ETS or serum-free StemPro MSC SFM (Invitrogen) 40 μg / ml gentamicin. Cultivation is carried out in a CO 3 incubator (37 ° C, 5% CO 2 ) for 2 weeks before the formation of a monolayer. Further cultivation and passaging of the cells is carried out in DMEM or DMEM / F12 (1: 1) with 15% ETS or serum-free medium StemPro MSC SFM (Invitrogen) 40 μg / ml gentamicin. The environment is changed every 3-4 days. As 80-90% of the confluent monolayer grows and reaches 0.25% trypsin - EDTA, the cell suspension is removed.
После успешно проведенного культивирования часть выведенной культуры фибробластподобных клеток подвергают криоконсервированию после 1-го пассажа в среде для криозаморозки: 50% ДМЕМ, 40% ЭТС, 10% ДМСО («Merk») в количестве 1×106/мл, где в жидком азоте они могут храниться бессрочно. Запас криоконсервированных клеток дает возможность создать мастер-банк, что позволяет проводить процедуры в определенно назначенное время.After successful cultivation, part of the removed culture of fibroblast-like cells is subjected to cryopreservation after the 1st passage in cryo-freezing medium: 50% DMEM, 40% ETS, 10% DMSO (Merk) in an amount of 1 × 10 6 / ml, where in liquid nitrogen they can be stored indefinitely. The stock of cryopreserved cells makes it possible to create a master bank, which allows you to carry out the procedure at a specific time.
Тестирование клеток на биобезопасность проводят следующим образом.Testing cells for biosafety is as follows.
После 1-го пассажа образец культуры фибробластподобных клеток исследуют на исключение вирусной и бактериальной инфекции, проводят кариотипирование.After the 1st passage, a sample of the culture of fibroblast-like cells is examined to exclude viral and bacterial infections, and karyotyping is performed.
Наличие вирусной и бактериальной инфекции являются абсолютным противопоказанием к дальнейшему культивированию и хранению клеток. Все процедуры по получению клеточных биотрансплантатов проводят в условиях GMP, GTP, GLP.The presence of viral and bacterial infections is an absolute contraindication to the further cultivation and storage of cells. All procedures for obtaining cell biografts are carried out under GMP, GTP, GLP.
Для характеризации полученных клеток определяют их фенотип, проводят фазово-контрастную микроскопию (Фиг.1), выполняют тест на КОКф (колониеобразующие единицы фибробластов), проводят специфическое окрашивание клеток на F - актин и Westem-blott анализ клеточных лизатов на экспрессию коллагена I типа.To characterize the obtained cells, their phenotype is determined, phase contrast microscopy is performed (Figure 1), a test for COKf (colony forming units of fibroblasts) is performed, specific staining of the cells for F - actin and Westem-blott analysis of cell lysates for expression of type I collagen are performed.
Для иллюстрации изобретения приведены следующие примеры.The following examples are provided to illustrate the invention.
Пример 1Example 1
Доброволец Н. 42 года, пол женский.Volunteer N. 42 years old, female.
При осмотре ротовой полости выявлены: тонкий биотип десны, выраженная рецессия десны между 3 и 4,4 и 5 зубами слева.When examining the oral cavity revealed: a thin biotype of the gums, severe gingival recession between 3 and 4.4 and 5 teeth on the left.
При клиническом и рентгенологическом исследовании был поставлен диагноз рецессии десны II класса по Миллеру, предрасположенность к генерализованным рецессиям.Clinical and X-ray examination was diagnosed with Miller class II gum recession, a predisposition to generalized recessions.
Назначение: пересадка аутологичных фибробластов, интегрированных на матрице фармацевтически приемлемого препарата «Сайметра» в собственно слизистую оболочку, прилежащую к шейке зуба и в межзубные десневые сосочки.Appointment: transplantation of autologous fibroblasts integrated on the matrix of the pharmaceutically acceptable preparation Saymetra into the mucous membrane proper, adjacent to the neck of the tooth and into the interdental gingival papillae.
У добровольца был взят биоптат со слизистой оболочки верхнего неба диаметром 0,3 мм.A biopsy sample was taken from the volunteer from the mucous membrane of the upper palate with a diameter of 0.3 mm.
Перед получением первичной клеточной культуры биоптат промывают растворами антибиотиков и антимикотика (пенициллин 100 ед./мл, стрептомицин 100 мкг/мл, гентамицин 200 мкг/мл, амфотерицин В 25 мкг/мл) в среде ДМЕМ. После промывки, биоптат переносят в среду ДМЕМ, содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 40 мкг/мл гентамицина и коллагеназы II типа («Sigma»). Инкубацию биоптата проводят при 37°С, 16-17 часов. Полученный клеточный осадок ресуспендируют в среде для культивирования -ДМЕМ, 10-20% ЭТС («ПанЭко»), 40 мкг/мл гентамицина и высевают в культуральные флаконы Т25, ("Nunc"). Флаконы помещают в СО2-инкубатор (37°С, 5% СО2) и культивируют в течение 2 недель до получения первичной культуры. По мере роста и достижения субконфлюэнтного слоя клетки трипсинизируют и переносят в новый большей площадью (Т-75, Т-175 «Nunc») культуральный флакон. При достижении субконфлюэнтного монослоя среду с 10-20% ЭТС заменяют на среду без сыворотки. До снятия клеток и получения готовой суспензии клетки выдерживают не менее 8-14 часов при 37°С. В конце инкубации клетки собирают с помощью 0,25% трипсин - ЭДТА, отмывают трехкратно путем центрифугирования - ресуспендирования, суспендируют в количестве 2×106 в 0,4 мл 0,9% раствора хлорида натрия для инъекций и соединяют в соотношении 5:1 с препаратом «Сайметра».Before receiving the primary cell culture, the biopsy is washed with solutions of antibiotics and antimycotics (penicillin 100 units / ml, streptomycin 100 μg / ml, gentamicin 200 μg / ml, amphotericin B 25 μg / ml) in DMEM medium. After washing, the biopsy sample is transferred to DMEM medium containing 10% fetal calf serum (ETS), 40 μg / ml gentamicin and type II collagenase (Sigma). The incubation of the biopsy is carried out at 37 ° C, 16-17 hours. The resulting cell pellet was resuspended in a medium for culturing with -DEMEM, 10-20% ETS (PanEco), 40 μg / ml gentamicin and plated in T25 culture bottles ("Nunc"). The vials are placed in a CO 2 incubator (37 ° C, 5% CO 2 ) and cultured for 2 weeks until a primary culture is obtained. As the subconfluent layer grows and reaches the cells, trypsinize and transfer to a new culture vial with a larger area (T-75, T-175 "Nunc"). When a subconfluent monolayer is reached, the medium with 10-20% ETS is replaced with serum-free medium. Before removing the cells and obtaining the finished suspension, the cells are incubated for at least 8-14 hours at 37 ° C. At the end of the incubation, the cells are harvested using 0.25% trypsin - EDTA, washed three times by centrifugation - resuspension, suspended in an amount of 2 × 10 6 in 0.4 ml of a 0.9% sodium chloride solution for injection and combined in a ratio of 5: 1 with the drug "Saymetra."
Пациентке проводят профессиональную гигиену полости рта. За 7 дней до введения клеточного препарата на прикрепленной части слизистой оболочки десны без рассечения сосочка наносят крестообразные надрезы в проекции планируемого введения клеток. Препарат, состоящий из клеточного материала, интегрированного на фармацевтически приемлемый препарат «Сайметра», аспирируют в инсулиновый шприц и вводят в собственно слизистую оболочку, прилежащую к шейке зуба и в межзубные десневые сосочки на глубину 1 мм.The patient is undergoing professional oral hygiene. 7 days before the introduction of the cell preparation, cross-shaped incisions are made in the projection of the planned cell injection on the attached part of the gingival mucosa without dissecting the papilla. The preparation, consisting of cellular material integrated into the Saymetra pharmaceutically acceptable preparation, is aspirated into an insulin syringe and injected into the mucous membrane proper, adjacent to the neck of the tooth and into the interdental gingival papillae to a depth of 1 mm.
Клинические наблюдения проводят в период от 1 недели до 6 месяцев после инъекции.Clinical observations are carried out in the period from 1 week to 6 months after injection.
Первые положительные изменения были отмечены через месяц, к 3-му месяцу прирост тканей достигал максимального значения. К 6-му месяцу отмечали стабильный клинический эффект. Визуально отмечены утолщение прикрепленной слизистой оболочки десны в местах инъекций, плотное сращение слизистой оболочки десны с твердыми тканями зуба, уменьшение размеров рецессии десны.The first positive changes were noted after a month, by the 3rd month, tissue growth reached its maximum value. By the 6th month, a stable clinical effect was noted. Visually marked thickening of the attached mucous membrane of the gum at the injection site, a dense fusion of the mucous membrane of the gum with hard tooth tissues, a decrease in the size of the gum recession.
Пример 2Example 2
Доброволец П. 45 лет, пол мужской.Volunteer P. 45 years old, male gender.
При осмотре ротовой полости выявлены: тонкий биотип десны, выраженная рецессия десны между 2 и 3, 4 и 5 зубами справа.When examining the oral cavity revealed: a thin biotype of the gums, severe gingival recession between 2 and 3, 4 and 5 teeth on the right.
При клиническом и рентгенологическом исследовании был поставлен диагноз рецессии десны II класса по Миллеру, предрасположенность к генерализованным рецессиям.Clinical and X-ray examination was diagnosed with Miller class II gum recession, a predisposition to generalized recessions.
Назначение: пересадка аутологичных фибробластов, интегрированных на матрице фармацевтически приемлемого препарата «Сайметра» в собственно слизистую оболочку, прилежащую к шейке зуба и в межзубные десневые сосочки.Appointment: transplantation of autologous fibroblasts integrated on the matrix of the pharmaceutically acceptable preparation Saymetra into the mucous membrane proper, adjacent to the neck of the tooth and into the interdental gingival papillae.
У добровольца был взят биоптат со слизистой оболочки верхнего неба диаметром 0,2 мм.A biopsy was taken from the volunteer from the mucous membrane of the upper palate with a diameter of 0.2 mm.
Перед получением первичной клеточной культуры биоптат промывают растворами антибиотиков и антимикотика (пенициллин 100 ед./мл, стрептомицин 100 мкг/мл, гентамицин 200 мкг/мл, амфотерицин В 25 мкг/мл) в среде ДМЕМ. После промывки, биоптат переносят в среду ДМЕМ, содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 40 мкг/мл гентамицина и коллагеназы II типа («Sigma»). Инкубацию биоптата проводят при 37°С, 16-17 часов. Полученный клеточный осадок ресуспендируют в среде для культивирования - ДМЕМ, 10-20% ЭТС («ПанЭко»), 40 мкг/мл гентамицина и высевают в культуральные флаконы (Т-25 "Nunc"), флаконы помещают в СО3-инкубатор (37°С, 5% СО3) и культивируют в течение 2 недель до получения первичной культуры. По мере роста и достижения субконфлюэнтного слоя клетки трипсинизируют и переносят в новый большей площадью (Т-75, Т-150 «Nunc») культуральный флакон. При достижении субконфлюэнтного монослоя среду с 10-20% ЭТС заменяют на среду без сыворотки. До снятия клеток и получения готовой суспензии клетки выдерживают в культуральных флаконах не менее 16-18 час при 37°С. В конце инкубации клетки собирают из культуральных флаконов с помощью 0,25% трипсин - ЭДТА, отмывают трехкратно путем центрифугирования-ресуспендирования и суспендируют в 0,9% растворе хлорида натрия для инъекций в концентрации 10×106 клеток в 1 мл биотрансплантата. Пациенту проводят профессиональную гигиену полости рта. За неделю до инъекции биотрансплантата на прикрепленной части слизистой оболочки десны без рассечения сосочка наносят крестообразные надрезы. Пациенту был рекомендован раствор хлоргексидина для полоскания рта после еды. Затем была проведена инъекция биотрансплантата, состоящего из клеточного материала, интегрированного на фармацевтически приемлемый препарат «Сайметра», который аспируют в инсулиновый шприц и вводят в собственно слизистую оболочку, прилежащую к шейке зуба и в межзубные десневые сосочки на глубину 1 мм. Биотрансплантат вводят из расчета 50-70 мкл на точку введения. Такой же объем вводят и с лингуальной стороны.Before receiving the primary cell culture, the biopsy is washed with solutions of antibiotics and antimycotics (penicillin 100 units / ml, streptomycin 100 μg / ml, gentamicin 200 μg / ml, amphotericin B 25 μg / ml) in DMEM medium. After washing, the biopsy sample is transferred to DMEM medium containing 10% fetal calf serum (ETS), 40 μg / ml gentamicin and type II collagenase (Sigma). The incubation of the biopsy is carried out at 37 ° C, 16-17 hours. The obtained cell pellet is resuspended in a culture medium - DMEM, 10-20% ETS (PanEco), 40 μg / ml gentamicin and seeded in culture bottles (T-25 "Nunc"), the bottles are placed in a CO 3 incubator (37 ° C, 5% CO 3 ) and cultured for 2 weeks to obtain the primary culture. As the subconfluent layer grows and reaches the cells, trypsinize and transfer to a new culture vial with a larger area (T-75, T-150 "Nunc"). When a subconfluent monolayer is reached, the medium with 10-20% ETS is replaced with serum-free medium. Before removing the cells and obtaining the finished suspension, the cells are kept in culture bottles for at least 16-18 hours at 37 ° C. At the end of the incubation, the cells are collected from the culture vials using 0.25% trypsin-EDTA, washed three times by centrifugation-resuspension, and suspended in a 0.9% solution of sodium chloride for injection at a concentration of 10 × 10 6 cells in 1 ml of biograft. The patient is undergoing professional oral hygiene. A week before the biotransplant injection, cruciate incisions are made on the attached part of the gingival mucosa without dissecting the papilla. The patient was recommended a chlorhexidine solution for rinsing the mouth after eating. Then, a biograft was injected, consisting of cellular material integrated into the Saymetra pharmaceutically acceptable preparation, which is aspirated into an insulin syringe and injected into the mucous membrane adjacent to the neck of the tooth and into the interdental gingival papillae to a depth of 1 mm. The biograft is administered at a rate of 50-70 μl per injection point. The same volume is also introduced from the linguistic side.
Клинические наблюдения проводят в период от 1 недели до 6 месяцев после инъекции биотрансплантата. Первые положительные изменения были отмечены через месяц, к 6-му месяцу прирост тканей достигал максимального значения. Визуально отмечены утолщение прикрепленной слизистой оболочки десны в местах инъекций, плотное сращение слизистой оболочки десны с твердыми тканями зуба, уменьшение размеров рецессии десны.Clinical observations are carried out in the period from 1 week to 6 months after biotransplant injection. The first positive changes were noted after a month, by the 6th month, tissue growth reached its maximum value. Visually marked thickening of the attached mucous membrane of the gum at the injection site, a dense fusion of the mucous membrane of the gum with hard tooth tissues, a decrease in the size of the gum recession.
Пример 3Example 3
Доброволец Н. 52 г., пол мужской.Volunteer N. 52, male gender.
При осмотре ротовой полости выявлены: тонкий биотип десны, выраженная рецессия десны между 2 и 3 зубами справа.Examination of the oral cavity revealed: a thin gingival biotype, a pronounced gingival recession between 2 and 3 teeth on the right.
При клиническом и рентгенологическом исследовании был поставлен диагноз рецессии десны II класса по Миллеру, предрасположенность к генерализованным рецессиям.Clinical and X-ray examination was diagnosed with Miller class II gum recession, a predisposition to generalized recessions.
Назначение: пересадка аутологичных фибробластов слизистой оболочки ротовой полости в собственно слизистую оболочку, прилежащую к шейке зуба и в межзубные десневые сосочки.Appointment: transplantation of autologous fibroblasts of the oral mucosa into the mucous membrane proper, adjacent to the neck of the tooth and into the interdental gingival papillae.
У добровольца был взят биоптат со слизистой оболочки верхнего неба диаметром 0,4 мм.A biopsy sample was taken from the volunteer from the mucous membrane of the upper palate with a diameter of 0.4 mm.
Перед получением первичной клеточной культуры биоптат промывают растворами антибиотиков и антимикотика (пенициллин 100 ед./мл, стрептомицин 100 мкг/мл, гентамицин 200 мкг/мл, амфотерицин В 25 мкг/мл) в среде ДМЕМ. После промывки, биоптат переносят в среду ДМЕМ, содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 40 мкг/мл гентамицина и коллагеназы II типа («Sigma»). Инкубацию биоптата проводят при 37°С, 16-17 часов. Полученный клеточный осадок ресуспендируют в среде для культивирования - ДМЕМ, 10-20% ЭТС («ПанЭко»), 40 мкг/мл гентамицина и высевают в культуральные флаконы (Т-25 "Nunc"). Флаконы помещают в СО2-инкубатор (37°С, 5% СО2) и культивируют в течение 1,5 недель до получения первичной культуры. По мере роста и достижения субконфлюэнтного слоя клетки трипсинизируют и переносят в новый большей площадью (Т-75, Т-150 «Nunc») культуральный флакон. При достижении субконфлюэнтного монослоя среду с 10-20% ЭТС заменяют на среду без сыворотки. До снятия клеток и получения готовой суспензии, клетки выдерживают в культуральных флаконах не менее 16-18 часов при 37°С. В конце инкубации клетки собирают из культуральных флаконов с помощью 0.25% трипсин - ЭДТА, отмывают трехкратно путем центрифугирования - ресуспендирования и суспендируют в 0,9% растворе хлорида натрия в концентрации 10,0×106мл.Before receiving the primary cell culture, the biopsy is washed with solutions of antibiotics and antimycotics (penicillin 100 units / ml, streptomycin 100 μg / ml, gentamicin 200 μg / ml, amphotericin B 25 μg / ml) in DMEM medium. After washing, the biopsy sample is transferred to DMEM medium containing 10% fetal calf serum (ETS), 40 μg / ml gentamicin and type II collagenase (Sigma). The incubation of the biopsy is carried out at 37 ° C, 16-17 hours. The resulting cell pellet was resuspended in a culture medium - DMEM, 10-20% ETS (PanEco), 40 μg / ml gentamicin and seeded in culture bottles (T-25 "Nunc"). The vials are placed in a CO 2 incubator (37 ° C, 5% CO 2 ) and cultured for 1.5 weeks until a primary culture is obtained. As the subconfluent layer grows and reaches the cells, trypsinize and transfer to a new culture vial with a larger area (T-75, T-150 "Nunc"). When a subconfluent monolayer is reached, the medium with 10-20% ETS is replaced with serum-free medium. Before removing the cells and obtaining the finished suspension, the cells are kept in culture bottles for at least 16-18 hours at 37 ° C. At the end of the incubation, the cells are collected from the culture vials using 0.25% trypsin - EDTA, washed three times by centrifugation - resuspension, and suspended in a 0.9% sodium chloride solution at a concentration of 10.0 × 10 6 ml.
Пациенту проводят профессиональную гигиену полости рта. За неделю до инъекции биотрансплантата на прикрепленную часть слизистой оболочки десны без рассечения сосочка наносят крестообразный надрез. Пациенту был рекомендован раствор хлоргексидина для полоскания рта после еды. Через неделю была проведена первая инъекция биотрансплантата, состоящего из суспензии аутологичных фибробластов в физиологическом растворе для инъекций. Биотрансплантат аспирировали в инсулиновый шприц и вводили по 50-70 мкл как с фациальной стороны, так и лингуальной в собственно слизистую оболочку, прилежащую к шейке зуба и в межзубные десневые сосочки на глубину 1 мм. Вторая инъекция была сделана через две недели после первой инъекции. Третья инъекция была проведена через три недели после второй.The patient is undergoing professional oral hygiene. A week before the biograft injection, a cruciate incision is applied to the attached part of the gingival mucosa without dissecting the papilla. The patient was recommended a chlorhexidine solution for rinsing the mouth after eating. A week later, the first biotransplant injection was performed, consisting of a suspension of autologous fibroblasts in saline for injection. The biograft was aspirated into an insulin syringe and 50-70 μl were injected both from the facies side and lingual into the mucous membrane proper, adjacent to the tooth neck and into the interdental gingival papillae to a depth of 1 mm. A second injection was made two weeks after the first injection. A third injection was given three weeks after the second.
Клинические наблюдения проводили в период от 1 недели до 6 месяцев после третьей инъекции биотрансплантата.Clinical observations were performed from 1 week to 6 months after the third biotransplant injection.
Первые положительные изменения были отмечены через 3 недели, к 6-му месяцу прирост тканей достигал максимального значения. Визуально отмечены утолщение прикрепленной слизистой оболочки десны в местах инъекций, плотное сращение слизистой оболочки десны с твердыми тканями зуба, уменьшение размеров рецессии десны.The first positive changes were noted after 3 weeks, by the 6th month, tissue growth reached its maximum value. Visually marked thickening of the attached mucous membrane of the gum at the injection site, a dense fusion of the mucous membrane of the gum with hard tooth tissues, a decrease in the size of the gum recession.
Таким образом, предлагаемое изобретение может быть использовано для лечения дегенерации ткани, произошедшей в результате функционального нарушения или болезни периодонта, дефектов слизистой оболочки ротовой полости, а также устранения послеоперационной ретракции тканей альвеолярных отростков при проведении пародонтологических и имплантологических вмешательств. Значительное снижение количества инъецируемых клеток, повышение их жизнеспособности и обеспечение длительного сохранения имплантата в поврежденной ткани также позволит снизить стоимость лечения.Thus, the present invention can be used to treat tissue degeneration resulting from a functional disorder or periodontal disease, defects in the mucous membrane of the oral cavity, as well as the elimination of postoperative tissue retraction of the alveolar processes during periodontal and implantological interventions. A significant reduction in the number of injected cells, increasing their viability and ensuring long-term preservation of the implant in damaged tissue will also reduce the cost of treatment.
Claims (7)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009132351/15A RU2418571C1 (en) | 2009-08-28 | 2009-08-28 | Biotransplant, method of its obtaining and method of treating periodontal diseases |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009132351/15A RU2418571C1 (en) | 2009-08-28 | 2009-08-28 | Biotransplant, method of its obtaining and method of treating periodontal diseases |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2009132351A RU2009132351A (en) | 2011-03-10 |
| RU2418571C1 true RU2418571C1 (en) | 2011-05-20 |
Family
ID=44733590
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2009132351/15A RU2418571C1 (en) | 2009-08-28 | 2009-08-28 | Biotransplant, method of its obtaining and method of treating periodontal diseases |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2418571C1 (en) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8790890B2 (en) | 2011-10-03 | 2014-07-29 | Obshhestvo S Organichennoi Otvetstvennost' Yu “Vitacel” | Diagnostic method for connective tissue and its application |
| RU2551312C1 (en) * | 2014-04-24 | 2015-05-20 | Людмила Владимировна Уварова | Method for dentofacial tissue repair |
| RU2558988C1 (en) * | 2014-04-15 | 2015-08-10 | Людмила Владимировна Уварова | Method for periodontal tissue repair |
| RU2700510C1 (en) * | 2018-11-15 | 2019-09-17 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Витацел" | Method for making a biotransplant, a biotransplant for eliminating gingival recessions and recovering a lost gum volume, a method of eliminating gingival recessions and recovering a lost gum volume |
-
2009
- 2009-08-28 RU RU2009132351/15A patent/RU2418571C1/en active
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8790890B2 (en) | 2011-10-03 | 2014-07-29 | Obshhestvo S Organichennoi Otvetstvennost' Yu “Vitacel” | Diagnostic method for connective tissue and its application |
| RU2558988C1 (en) * | 2014-04-15 | 2015-08-10 | Людмила Владимировна Уварова | Method for periodontal tissue repair |
| RU2551312C1 (en) * | 2014-04-24 | 2015-05-20 | Людмила Владимировна Уварова | Method for dentofacial tissue repair |
| RU2700510C1 (en) * | 2018-11-15 | 2019-09-17 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Витацел" | Method for making a biotransplant, a biotransplant for eliminating gingival recessions and recovering a lost gum volume, a method of eliminating gingival recessions and recovering a lost gum volume |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2009132351A (en) | 2011-03-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zhang et al. | Tissue engineered hybrid tooth–bone constructs | |
| Chandrahasa et al. | Proliferation of mature ex vivo human dental pulp using tissue engineering scaffolds | |
| CN113318274B (en) | Hydrogel and preparation method and application thereof | |
| CN103585177A (en) | Applications of mesenchymal stem cell and genetically modified mesenchymal stem cell | |
| US11058721B2 (en) | Composition comprising a substantially pure population of multipotent stromal cells encapsulated in platelet-poor plasma (PPP) | |
| TW201103572A (en) | Method and composition for restoration of age-related tissue loss in the face or selected areas of the body | |
| CN108057116A (en) | Application of the stem cell composition in skin injury medicine | |
| US20190015551A1 (en) | Construct for preventing immunological rejection generated when used in transplants, and method for using collagen in a gel state, in the form of dry lyophilised spongy mouldings and 3d matrices | |
| JPWO2019216438A1 (en) | Periodontal disease therapeutic agent containing culture supernatant of mesenchymal cells | |
| CN108865986A (en) | For repairing articular cartilage damage/defect mescenchymal stem cell preparation and its preparation method and application | |
| KR102104120B1 (en) | 3D bioprinting construct using human nasal inferior turbinate derived mesenchymal stem cell and uses thereof | |
| RU2418571C1 (en) | Biotransplant, method of its obtaining and method of treating periodontal diseases | |
| WO2007077824A1 (en) | Cellular composition for transplantation | |
| RU2428996C2 (en) | Biotransplant for correction of soft tissue defects (versions), method of biotransplant obtaining (versions) and method of correction of soft tissue defects | |
| Sándor et al. | Combining adipose-derived stem cells, resorbable scaffolds and growth factors: An overview of tissue engineering | |
| CN108066750A (en) | Stem cell and its secretion are used to treat the new application of skin burn | |
| CN111840330B (en) | Anti-hair loss repairing composition and application | |
| EP3101121B1 (en) | Use of genetically modified odontogenic stem cells | |
| RU2281776C1 (en) | Biotransplant and method for correction of soft tissue defect, method for preparing biotransplant | |
| CN103387959A (en) | Stem cell from deciduous teeth, and preparation method and application thereof | |
| JP2004331557A (en) | Method for regenerating tooth germ | |
| CN108066824A (en) | A kind of new method for preparing skin blemish medicine | |
| CN205235020U (en) | Icariin - small intestine submucosa patch | |
| CN110755689B (en) | Three-dimensional reconstruction method of hair follicle and hair follicle prepared by reconstruction method | |
| RU2265445C1 (en) | Biotransplant, method for its obtaining (variants) and method for treating parodontium diseases |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: SUB-LICENCE Effective date: 20160510 |