RU2423521C1

RU2423521C1 - Biochip for mutation detection in galactose-1-phosphate-uridyl transferase gene causing hepatic involvement in newborns

Info

Publication number: RU2423521C1
Application number: RU2009139324/10A
Authority: RU
Inventors: Екатерина Юрьевна Захарова (RU); Екатерина Юрьевна Захарова; Елена Юрьевна Воскобоева (RU); Елена Юрьевна Воскобоева; Елизавета Владимировна Панкратова (RU); Елизавета Владимировна Панкратова; Александр Георгиевич Степченко (RU); Александр Георгиевич Степченко; Татьяна Васильевна Наседкина (RU); Татьяна Васильевна Наседкина; Александр Васильевич Чудинов (RU); Александр Васильевич Чудинов; София Георгиевна Георгиева (RU); София Георгиевна Георгиева
Original assignee: Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН; Российская Федерация, От Имени Которой Выступает Министерство Образования И Науки Российской Федерации
Priority date: 2009-10-27
Filing date: 2009-10-27
Publication date: 2011-07-10
Also published as: RU2009139324A

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: biochip enabling diagnosing type I galactosemia is produced. Also, a method of using the produced biochip for detecting point mutations in GALT gene is offered. The given method involves a two-round multiplex PCR to produce a one-chained fluorescent marked DNA fragment; hybridisation on the biochip containing a set of oligonucleotides; analysis of the results.

EFFECT: invention extends the range of technological products used in diagnosing type I galactosemia.

3 cl, 34 dwg, 23 tbl, 6 ex

Description

Область техникиTechnical field

Изобретение относится к молекулярной биологии и медицине и рассматривает создание и применение биочипа для определения наличия точечных мутаций в гене галактоза-1-фосфат-уридилтрансферазы, вызывающих поражение печени у новорожденных детей.The invention relates to molecular biology and medicine, and considers the creation and use of a biochip for determining the presence of point mutations in the galactose-1-phosphate-uridyl transferase gene, causing liver damage in newborns.

Одним из наиболее частых нарушений метаболизма, выявляемых в период новорожденности, является повышение концентрации билирубина в сыворотке крови. Известно, что причинами гипербилирубинемии являются: повышенное образование билирубина при распаде гемоглобина в клетках ретикулоэндотелиальной системы, снижение конъюгации билирубина, нарушение его экскреции или сочетание некоторых из вышеперечисленных факторов. Частота гипербилирубинемии составляет около 55% у доношенных новорожденных. В большинстве случаев гипербилирубинемия новороженных является функциональной (связана с незрелостью ферментативной системы) и проходит в течение первых недель жизни. Тем не менее, повышение уровня билирубина может быть связано с патологией экскреторной функции гепатобилиарной системы и носить злокачественный характер, в частности приводить к необратимому поражению центральной нервной системы.One of the most frequent metabolic disorders detected during the neonatal period is an increase in the concentration of bilirubin in the blood serum. It is known that the causes of hyperbilirubinemia are: increased bilirubin formation during the breakdown of hemoglobin in the cells of the reticuloendothelial system, decreased conjugation of bilirubin, impaired excretion, or a combination of some of the above factors. The incidence of hyperbilirubinemia is about 55% in full-term infants. In most cases, neonatal hyperbilirubinemia is functional (associated with the immaturity of the enzymatic system) and disappears during the first weeks of life. Nevertheless, an increase in the level of bilirubin may be associated with the pathology of the excretory function of the hepatobiliary system and be malignant, in particular, lead to irreversible damage to the central nervous system.

За последние десятилетия углубилось понимание основ и патофизиологии многих болезней печени, был установлен ряд новых нозологических форм, появились возможности эффективного лечения многих заболеваний, в частности стала применяться диетотерапия (при галактоземии и тирозинемии), стала возможной трансплантация печени. На сегодняшний день число распознанных наследственных болезней печени у новорожденных составляет около 20 различных форм. Гены всех этих заболеваний картированы, и во многих случаях определен спектр основных патогенных мутаций. Для некоторых генов (кодирующих в основном ферменты) также охарактеризованы полиморфные варианты, представленные преимущественно однонуклеотидными заменами, которые могут влиять на остаточную активность белка. Однако дифференциальная диагностика большинства из них крайне затруднительна ввиду схожести клинических проявлений. В нашей стране число пациентов, которым быстро и правильно устанавливается диагноз, сравнительно невелико. Большинство детей погибают в раннем возрасте, не получая адекватного лечения, а отягощенные семьи не имеют информации о наследственном заболевании.Over the past decades, understanding of the basics and pathophysiology of many liver diseases has deepened, a number of new nosological forms have been established, the possibilities of effective treatment of many diseases have appeared, in particular, diet therapy (for galactosemia and tyrosinemia) has begun, and liver transplantation has become possible. To date, the number of recognized hereditary liver diseases in newborns is about 20 different forms. The genes of all these diseases are mapped, and in many cases the spectrum of the main pathogenic mutations is determined. For some genes (encoding mainly enzymes), polymorphic variants have also been characterized, represented mainly by single nucleotide substitutions, which can affect the residual activity of the protein. However, the differential diagnosis of most of them is extremely difficult due to the similarity of clinical manifestations. In our country, the number of patients who are quickly and correctly diagnosed is relatively small. Most children die at an early age without adequate treatment, and burdened families do not have information about a hereditary disease.

Поскольку в ряде случаев причины злокачественной гипербилирубинемии новорожденных остаются невыясненными, изучение роли генетических факторов в формировании данного патологического состояния - актуальная научная задача, имеющая большое практическое значение.Since in some cases the causes of malignant hyperbilirubinemia in newborns remain unclear, studying the role of genetic factors in the formation of this pathological condition is an urgent scientific task of great practical importance.

Уже на первом месяце жизни могут выявляться первые клинические признаки, свидетельствующие о наследственной патологии печени и желчевыводящих протоков и проявляющиеся в виде синдрома холестаза. Одной из причин нарушения экскреторной функции гепатобилиарной системы в неонатальный период (неонатального холестаза) являются наследственные заболевания. По приблизительным подсчетам распространенность врожденных или наследственных заболеваний печени у детей составляет 1 случай на 2500 новорожденных детей. Именно у таких детей развиваются тяжелые формы печеночной патологии. Правильно и быстро установленный диагноз в данном случае является очень важным, т.к. позволяет прогнозировать течение болезни и проводить адекватную терапию. Однако дифференциальная диагностика этой группы заболеваний чрезвычайно сложна.Already in the first month of life, the first clinical signs that indicate a hereditary pathology of the liver and bile ducts and manifest as cholestasis syndrome can be detected. One of the reasons for the violation of the excretory function of the hepatobiliary system in the neonatal period (neonatal cholestasis) is hereditary disease. According to rough estimates, the prevalence of congenital or hereditary liver diseases in children is 1 case per 2500 newborns. It is in such children that severe forms of hepatic pathology develop. A correct and quick diagnosis in this case is very important, because allows you to predict the course of the disease and conduct adequate therapy. However, differential diagnosis of this group of diseases is extremely difficult.

Одним из факторов, вызывающих тяжелейшие нарушения функционирования печени, является нарушение метаболизма галактозы, вызываемое мутациями в генах, кодирующих белки-ферменты. В результате галактоза, поступающая с пищей в составе молочного сахара - лактозы, подвергается превращению, но реакция превращения не завершается в связи с мутацией гена, кодирующего один из ключевых ферментов. Галактоза и ее производные накапливаются в крови и тканях, оказывая токсическое действие на центральную нервную систему, печень и хрусталик глаза.One of the factors causing severe liver dysfunction is a disturbance in galactose metabolism caused by mutations in genes encoding enzyme proteins. As a result, galactose, which comes with food as part of milk sugar - lactose, undergoes transformation, but the transformation reaction does not end due to mutation of the gene encoding one of the key enzymes. Galactose and its derivatives accumulate in the blood and tissues, exerting a toxic effect on the central nervous system, liver and lens of the eye.

На сегодняшний день известно три аутосомно-рецессивных наследственных заболевания, обусловленных недостаточностью ферментов, участвующих в метаболизме галактозы: галактоземия I типа (недостаточность галактоза-1-фосфат уридилтрансферазы), галактоземия II типа (недостаточность галактокиназы) и галактоземия III типа (недостаточность галактоза-4-эпимеразы).To date, three autosomal recessive inherited diseases are known due to deficiency of enzymes involved in galactose metabolism: type I galactosemia (uridyl transferase deficiency galactose-1-phosphate), type II galactosemia (galactokinase deficiency) and type III galactosemia (galactose-4 deficiency epimerase).

Среди этих заболеваний галактоземия I типа является наиболее тяжелой, требующей неотложной коррекции патологией. Массовый скрининг новорожденных, проводимый во многих странах, направлен на выявление именно этой формы галактоземии.Among these diseases, type I galactosemia is the most severe, requiring urgent correction of pathology. Mass screening of newborns, conducted in many countries, is aimed at identifying this particular form of galactosemia.

Следствием недостаточности галактоза-1-фосфат уридилтрансферазы является накопление галактозы, галактоза-1-фосфата и их производных. Эти метаболиты токсически действуют на ткани мозга, печени, почек, кишечника. При отсутствии специфической диетотерапии (назначения безлактозных смесей) заболевание неуклонно прогрессирует и приводит к необратимым изменениям со стороны печени и нервной системы. Своевременная диагностика галактоземии позволяет вовремя начать диетотерапию и избежать серьезных последствий для здоровья ребенка, а также снизить экономические издержки, связанные с медицинской реабилитацией при поздней диагностике.The consequence of the deficiency of galactose-1-phosphate uridyl transferase is the accumulation of galactose, galactose-1-phosphate and their derivatives. These metabolites toxic effects on the tissues of the brain, liver, kidneys, intestines. In the absence of specific diet therapy (prescribing lactose-free mixtures), the disease is steadily progressing and leads to irreversible changes in the liver and nervous system. Timely diagnosis of galactosemia allows you to start diet therapy on time and avoid serious consequences for the health of the child, as well as reduce the economic costs associated with medical rehabilitation with late diagnosis.

Основными методами подтверждения диагноза галактоземии I типа являются биохимические тесты, основанные на определении концентрации галактозы, галактоза-1-фосфата в крови и/или на измерении уровня активности фермента галактоза-1-фосфат уридиотрансферазы в эритроцитах.The main methods for confirming the diagnosis of type I galactosemia are biochemical tests based on determining the concentration of galactose, galactose-1-phosphate in the blood and / or measuring the level of activity of the enzyme galactose-1-phosphate uridiotransferase in red blood cells.

Трудности интерпретации метаболических изменений связаны с тем, что при поражении печени другой этиологии (как наследственной, так и ненаследственной) возможно повышение уровня галактозы в крови. Описаны ложноположительные тесты при тирозинемии, врожденной атрезии желчевыводящих путей, неонатальном гепатите и многих других заболеваниях (Gitzelmann R, Arbenz UV, Willi UV, et al. Hypergalactosaemia and portosystemic encephalopathy due to persistence of ductus venosus Arantii. // Eur J Pediatr. 1992. V.151. P.564-568).Difficulties in interpreting metabolic changes are associated with the fact that with liver damage of another etiology (both hereditary and non-hereditary), an increase in the level of galactose in the blood is possible. False positive tests are described for tyrosinemia, congenital atresia of the biliary tract, neonatal hepatitis and many other diseases (Gitzelmann R, Arbenz UV, Willi UV, et al. Hypergalactosaemia and portosystemic encephalopathy due to persistence of ductus venosus Arantii. // Eur J Pediatr. V.151. P.564-568).

Определение активности фермента является более специфичным и надежным, однако на результаты теста влияет режим хранения и транспортировки образцов. Также ложноположительные результаты могут наблюдаться при недостаточной активности глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы. Кроме того, некоторые полиморфные варианты гена и их сочетания с мутантными аллелями могут искажать результаты биохимической диагностики (Lin HC, Kirby LT, Ng WG, Reichardt JKV. On the nature of the Duarte variant of galactose-1-phosphate uridyl transferase. // Hum Genet. 1994. V.93. P.167-169; Elsas LJ, Dembure PP, Langley S, et al. A common mutation associated with the Duarte galactosemia allele. // Am J Hum Genet. 1994. V.54. P.1030-1036).The determination of enzyme activity is more specific and reliable, however, the storage and transportation of samples affects the test results. False positive results can also be observed with insufficient activity of glucose-6-phosphate dehydrogenase. In addition, some polymorphic variants of the gene and their combinations with mutant alleles can distort the results of biochemical diagnostics (Lin HC, Kirby LT, Ng WG, Reichardt JKV. On the nature of the Duarte variant of galactose-1-phosphate uridyl transferase. // Hum Genet. 1994. V.93. P.167-169; Elsas LJ, Dembure PP, Langley S, et al. A common mutation associated with the Duarte galactosemia allele. // Am J Hum Genet. 1994. V.54. P .1030-1036).

Ген галактоза-1-фосфат уридиотрансферазы человека (GALT) располагаеся на 9 хромосоме (локус 9p13) и состоит из 11 экзонов, разделенных 10 интронами. На сегодняшний день в гене описано более 180 различных мутаций, которые преимущественно представлены миссенс-мутациями.The human galactose-1-phosphate uridiotransferase gene (GALT) is located on chromosome 9 (locus 9p13) and consists of 11 exons separated by 10 introns. To date, the gene describes more than 180 different mutations, which are mainly represented by missense mutations.

Наиболее распространенными являются мутации Q188R и K285N, в совокупности они составляют в европейских популяциях более 70% от всех мутантных аллелей и обуславливают развитие классической формы галактоземии. Так, в популяции Чехии и Словении частоты мутаций Q188R и K285N составляют 46.0% и 25.7%, а в популяции белой расы Америки - 37% и 4% соответственно (Kozak L, Francova H, Fajkusova L, et al. Mutation analysis of the GALT gene in Czech and Slovak galactosemia populations: identification of six novel mutations, including a stop codon mutation (X380R). // Hum Mutat. 2000. V.15. P.206).The most common are the Q188R and K285N mutations, together they make up more than 70% of all mutant alleles in European populations and cause the development of the classical form of galactosemia. Thus, in the Czech Republic and Slovenia populations, the mutation frequencies Q188R and K285N are 46.0% and 25.7%, and in the white race of America - 37% and 4%, respectively (Kozak L, Francova H, Fajkusova L, et al. Mutation analysis of the GALT gene in Czech and Slovak galactosemia populations: identification of six novel mutations, including a stop codon mutation (X380R). // Hum Mutat. 2000. V.15. P.206).

Для некоторых популяций характерны свои особенности профиля мутаций, так среди пациентов афроамериканского происхождения аллель S135L встречается в 62% случаев заболевания, обуславливая относительно легкое течение болезни. Большая делеция в гене GALT, протяженностью 5 т.п.н., является наиболее распространенной в популяции евреев-ашкенази (Elsas LJ, Lai K The molecular biology of galactosemia. // Genet Med. 1998. V.1. P.40-48).Some populations are characterized by their own characteristics of the mutation profile, so among patients of African American origin the S135L allele occurs in 62% of cases of the disease, causing a relatively mild course of the disease. A large deletion in the 5 kb GALT gene is the most common in the Ashkenazi Jewish population (Elsas LJ, Lai K The molecular biology of galactosemia. // Genet Med. 1998. V.1. P.40- 48).

В гене GALT также описано большое число нуклеотидных замен как внутри интронов, так и внутри экзонов, наличие которых отдельно или в различных комбинациях может оказывать влияние на остаточную активность фермента. Одной из наиболее изученных внутригенных замен является мутация N314D в экзоне 10 гена GALT, приводящая к развитию галактоземии Дуарте (Дуарте вариант). Мутация N314D в гомозиготном состоянии, как правило, не приводит к развитию заболевания, однако при этом меняется уровень активности фермента. Комбинации N314D/нормальный аллель, N314D/N314D и N314D/Q188R: обуславливают 75%, 50% и 25% от нормальной активности GALT соответственно. Частота встречаемости аллеля N314D среди здоровых индивидуумов в различных популяциях составляет по литературным данным 6-8% (Lukac-Bajalo J, Marc J, Mlinar B Frequencies of Q188R and N314D mutations and IVS5-24g>A intron variation in the galactose-1-phosphate uridyl transferase gene in the Slovenian population. // Clin Chem Lab Med. 2002. V.40. P.1109-1113). Также описано повышение активности фермента (20-150% от нормы) при наличии генотипа N314D+L218L (вариант Лос-Анжелес или Дуарте 1) (Langley SD et al. Molecular basis for Duarte and Los Angeles variant galactosemia. // Am J Hum Genet. 1997. V.60. P.366-372).The GALT gene also describes a large number of nucleotide substitutions both within introns and inside exons, the presence of which, individually or in various combinations, can affect the residual activity of the enzyme. One of the most studied intragenic substitutions is the N314D mutation in exon 10 of the GALT gene, leading to the development of Duarte galactosemia (Duarte variant). Mutation N314D in the homozygous state, as a rule, does not lead to the development of the disease, however, the level of enzyme activity changes. Combinations of N314D / normal allele, N314D / N314D and N314D / Q188R: account for 75%, 50% and 25% of normal GALT activity, respectively. According to published data, the frequency of the N314D allele among healthy individuals in various populations is 6-8% (Lukac-Bajalo J, Marc J, Mlinar B Frequencies of Q188R and N314D mutations and IVS5-24g> A intron variation in the galactose-1-phosphate uridyl transferase gene in the Slovenian population. // Clin Chem Lab Med. 2002. V.40. P.1109-1113). Also described is an increase in enzyme activity (20-150% of normal) in the presence of the N314D + L218L genotype (variant Los Angeles or Duarte 1) (Langley SD et al. Molecular basis for Duarte and Los Angeles variant galactosemia. // Am J Hum Genet 1997. V.60. P.366-372).

Ранее также были обнаружены следующие мутации в гене GALT, приводящие к развитию галактаземии 1 типа: M142K (Seyrantepe V et al. Identification of mutations in the galactose-1-phosphate uridyltransferase (GALT) gene in 16 Turkish patients with galactosemia, including a novel mutation of F294Y. // Hum Mutat. 1999. V.13. P.339), M142V (Hirokawa H et al. Molecular basis for phenotypic heterogeneity in galactosaemia: prediction of clinical phenotype from genotype in Japanese patients. // Eur J Hum Genet. 1999. V.7. P.757-764), R333W, R333Q (Hirokawa H et al. Molecular basis for phenotypic heterogeneity in galactosaemia: prediction of clinical phenotype from genotype in Japanese patients. // Eur J Hum Genet. 1999.V.7. P.757-64.), R333G (Murphy M et al. Genetic basis of transferase-deficient galactosaemia in Ireland and the population history of the Irish Travellers. // Eur J Hum Genet. 1999. V.7. P.549-554), замена в четвертом интроне нуклеотидов g на c в положении -27 (IVS4-27 g->c) (Kozбk L et al. Mutation analysis of the GALT gene in Czech and Slovak galactosemia populations: identification of six novel mutations, including a stop codon mutation (X380R). // Hum Mutat. 2000. V.15. P.206), замена нуклеотидов а на c в третьем интроне в положении -2 (IVS3-2a->c) (Elsas LJ et al. Galactosemia: a strategy to identify new biochemical phenotypes and molecular genotypes. // Am J Hum Genet. 1995. V.57. P.978-981), возникновение стоп-кодона в 316 положении белка (W316X) (Sommer M et al. Mutations in the galactose-1-phosphate uridyltransferase gene of two families with mild galactosaemia variants. // J Inherit Metab Dis. 1995. V.18. P.567-576).The following mutations in the GALT gene, leading to the development of type 1 galactasemia, were also previously detected: M142K (Seyrantepe V et al. Identification of mutations in the galactose-1-phosphate uridyltransferase (GALT) gene in 16 Turkish patients with galactosemia, including a novel mutation of F294Y. // Hum Mutat. 1999. V.13. P.339), M142V (Hirokawa H et al. Molecular basis for phenotypic heterogeneity in galactosaemia: prediction of clinical phenotype from genotype in Japanese patients. // Eur J Hum Genet . 1999. V.7. P.757-764), R333W, R333Q (Hirokawa H et al. Molecular basis for phenotypic heterogeneity in galactosaemia: prediction of clinical phenotype from genotype in Japanese patients. // Eur J Hum Genet. 1999. V.7. P.757-64.), R333G (Murphy M et al. Genetic basis of transferase-deficient galactosaemia in Ireland and the population history of the Irish Travelers. // Eur J Hum Genet. 1999. V.7. P.549-554), s Names in the fourth intron g c at nucleotide position -27 (IVS4-27 g-> c) (Kozbk L et al. Mutation analysis of the GALT gene in Czech and Slovak galactosemia populations: identification of six novel mutations, including a stop codon mutation (X380R). // Hum Mutat. 2000. V.15. P.206), substitution of nucleotides a for c in the third intron at position -2 (IVS3-2a-> c) (Elsas LJ et al. Galactosemia: a strategy to identify new biochemical phenotypes and molecular genotypes. // Am J Hum Genet . 1995. V.57. P.978-981), the occurrence of a stop codon at the 316 position of the protein (W316X) (Sommer M et al. Mutations in the galactose-1-phosphate uridyltransferase gene of two families with mild galactosaemia variants. / / J Inherit Metab Dis. 1995. V.18. P.567-576).

Для обнаружения точечных мутаций в различных генах применяются следующие методы:The following methods are used to detect point mutations in various genes:

1. экстенция цепи меченым дидезоксирибонуклеозидтрифосфатом (SNP-single nucleotide polymorphism);1. chain extention labeled with dideoxyribonucleoside triphosphate (SNP-single nucleotide polymorphism);

2. аллель - специфичная ПЦР (Allele specific PCR);2. allele - specific PCR (Allele specific PCR);

3. изучение полиморфизма фрагментов после рестрикции (RFLP-restriction fragment length polymorphism);3. study of fragment polymorphism after restriction (RFLP-restriction fragment length polymorphism);

4. анализ конформационного полиморфизма одно- и двухцепочечной ДНК (SSCP и DSCP- single- (double)-strand conformation polymorphism);4. analysis of conformational polymorphism of single and double stranded DNA (SSCP and DSCP- single- (double) -strand conformation polymorphism);

5. гибридизацией на микроматрицах (Hybridization on microaiTay);5. hybridization on microarrays (Hybridization on microaiTay);

6. секвенирование (sequencing);6. sequencing;

7. дидезоксифингерпринтинг (ddF-method);7. dideoxy fingerprinting (ddF-method);

8. ПЦР-гетеродуплексный анализ (PCR-heteroduplex analysis);8. PCR heteroduplex analysis (PCR-heteroduplex analysis);

9. метод несовершенного дуплекса с РНК (RNA mismatch analysis);9. imperfect duplex method with RNA (RNA mismatch analysis);

10. метод структурно-специфичного расщепления (Structure-specific endonuclease cleavage);10. method of structure-specific cleavage (Structure-specific endonuclease cleavage);

11. метод зондов (Line Probe assay (LiPA));11. probe method (Line Probe assay (LiPA));

12. метод PhaB.12. PhaB method.

Однако все перечисленные выше методы имеют определенные недостатки, которые на практике могут существенно усложнить массовый скрининг пациентов. Так, методы экстенции цепи и аллель-специфичная ПЦР (1, 2) требуют постановки независимых реакций по числу изучаемых мутаций (т.е. несколько десятков проб для одного пациента в случае гена галактоза-1-фосфат уридилтрансферазы) и, соответственно, большого количества изучаемого образца.However, all of the above methods have certain disadvantages, which in practice can significantly complicate the mass screening of patients. Thus, chain extension methods and allele-specific PCR (1, 2) require independent reactions according to the number of mutations studied (i.e., several tens of samples for one patient in the case of the galactose-1-phosphate uridyl transferase gene) and, accordingly, a large number the studied sample.

Методы изучения полиморфизма (3, 4), ПЦР-гетеродуплексный анализ (8) и метод несовершенного дуплекса с РНК (9) трудоемки, занимают большое количество времени, дают косвенное заключение о типе мутации и требуют типовых стандартов (на каждую мутацию); кроме того, для метода несовершенного дуплекса предъявляются повышенные требования к отсутствию РНК-азы. Также данный метод трудоемкий и не приемлем для детекции дуплекса G-U.Methods for studying polymorphism (3, 4), PCR heteroduplex analysis (8) and the imperfect duplex method with RNA (9) are laborious, take a lot of time, give an indirect conclusion about the type of mutation and require standard standards (for each mutation); In addition, for the imperfect duplex method, increased requirements are imposed on the absence of RNAase. Also, this method is time-consuming and not acceptable for the detection of G-U duplex.

Гибридизация на микроматрицах (5) требует сложного компьютерного обсчета полученных результатов и дорогостоящих расходных материалов (собственно микроматрица).Hybridization on microarrays (5) requires a complex computer calculation of the results and expensive consumables (the microarray itself).

Прямое секвенирование (6) требует выделения последовательности гена, отличается высокой себестоимостью и требует секвенирующее устройство.Direct sequencing (6) requires isolation of the gene sequence, has a high cost and requires a sequencing device.

Методы структурно-специфического расщепления (10) и дидезоксифингерпринтинг (7) требуют предварительной стандартизации (подбора условий), что увеличивает трудоемкость, а также наличия типовых стандартов. Кроме того, дидезоксифингерпринтинг выполняется с радиоактивно-меченым зондом.Structurally specific splitting methods (10) and dideoxy fingerprinting (7) require preliminary standardization (selection of conditions), which increases the complexity and the presence of standard standards. In addition, dideoxy fingerprinting is performed with a radiolabeled probe.

Метод зондов (11) отличается высокой себестоимостью и работает в случае небольшого количества мутаций.The probe method (11) has a high cost and works in the case of a small number of mutations.

Осуществление метода PhaB (12) занимает большое количество времени, поскольку связано с репликацией фагов и последующей регистрацией лизирования на культуре M. smegmatis, а также он очень трудоемок.The implementation of the PhaB method (12) takes a large amount of time, since it is associated with the replication of phages and the subsequent registration of lysis in the culture of M. smegmatis, and it is also very laborious.

Данные недостатки устраняются в настоящем изобретении.These disadvantages are eliminated in the present invention.

Метод гибридизации на биочипах выгодно отличается от всех вышеперечисленных методик возможностью определения нескольких присутствующих мутаций одновременно, низкой себестоимостью, малым временем получения результата. Также он не требует дорогостоящего оборудования и высококвалифицированного персонала.The hybridization method on biochips compares favorably with all of the above methods with the ability to determine several mutations present at the same time, low cost, short time to obtain the result. Also, it does not require expensive equipment and highly qualified personnel.

В качестве ближайшего аналога заявленных изобретений может быть принят метод детекции точечных мутаций в гене GALT при помощи гибридизации различных последовательностей ДНК из гена GALT, описанный в патенте US 6207387, выданном патентным ведомством США. Однако представленное изобретение обладает рядом преимуществ по сравнению с методом, изложенным в US 6207387.As the closest analogue of the claimed inventions, a method for detecting point mutations in the GALT gene by hybridization of various DNA sequences from the GALT gene described in US patent 6207387, issued by the US Patent Office, can be adopted. However, the present invention has several advantages compared with the method set forth in US 6207387.

1. Заявленный биочип позволяет детектировать неизвестные ранее мутации в гене GALT, вызывающие развитие галактоземии I типа (E352Q, L358P).1. The claimed biochip allows the detection of previously unknown mutations in the GALT gene that cause the development of type I galactosemia (E352Q, L358P).

2. При помощи заявленного биочипа можно детектировать большее число различных точечных мутаций в гене GALT, что позволит с большей вероятностью исключить ложноположительные результаты при постановке диагноза пациенту.2. Using the claimed biochip, it is possible to detect a greater number of different point mutations in the GALT gene, which will make it possible to exclude false positive results when diagnosing a patient.

3. При реализации описанного в патенте US 6207387 способа детекции точечных мутаций в гене GALT был использован метод гибридизации на мембране, который более ресурсоемок, чем метод гибридизации на биочипах. Следовательно, заявленный биочип будет более приемлем для использования в рутинной диагностике галактоземии I типа в клинических лабораториях.3. When implementing the method of detecting point mutations in the GALT gene described in US Pat. No. 6,207,387, a membrane hybridization method was used that is more resource intensive than the biochip hybridization method. Therefore, the claimed biochip will be more suitable for use in the routine diagnosis of type I galactosemia in clinical laboratories.

Таким образом, заявленное нами изобретение позволит более просто и точно определять наличие мутаций в гене GALT, что позволит в значительной мере улучшить диагностику галактоземии I типа.Thus, our claimed invention will allow us to more easily and accurately determine the presence of mutations in the GALT gene, which will significantly improve the diagnosis of type I galactosemia.

Раскрытие изобретения.Disclosure of the invention.

Заявленные изобретения относятся к биочипу, который позволяет детектировать наличие точечных мутаций у пациента-человека; применению указанного биочипа для постановки диагноза пациенту-человеку, а также способу получения и использования указанного биочипа.The claimed invention relates to a biochip, which allows to detect the presence of point mutations in a human patient; the use of the specified biochip for the diagnosis of the patient-person, as well as the method of obtaining and using the specified biochip.

Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings

Фигура 1. Нанесение олигонуклетидов, комплементарных различным мутациям в гене GALT, на биочип 1.Figure 1. The application of oligonucleotides complementary to various mutations in the GALT gene, on the biochip 1.

Фигура 2. Нанесение олигонуклетидов, комплементарных различным мутациям в гене GALT, на биочип 2.Figure 2. Application of oligonucleotides complementary to various mutations in the GALT gene, on the biochip 2.

Фигура 3. Детекция мутации F95L (TTT->TTG). Прямое ДНК-секвенирование. Стрелками указана локализация мутации. А.Фрагмент экзона 3 гена GALT. Мутация F95L в гетерозиготном состоянии. Б. Фрагмент экзона 3 гена GALT. Норма.Figure 3. Detection of the F95L mutation (TTT-> TTG). Direct DNA sequencing. Arrows indicate the location of the mutation. A. Exon 3 fragment of the GALT gene. Mutation F95L in the heterozygous state. B. Fragment of exon 3 of the GALT gene. Norm.

Фигура 4. Детекция мутации IVS3-2a->c. ПДРФ анализ. При возникновении мутации IVS3-2a->c появляется сайт рестрикции для фермента рестрикции Msp I (C^CGG). Дорожки: 1 - маркер молекулярного веса, 2 - фрагмент экзонов 3-5 гена GALT до рестрикции, 3, 4 - фрагменты экзонов 3-5 гена GALT после обработки ферментом рестрикции Msp I (C^CGG): 3-4 - мутация IVS3-2a->c в гетерозиготном состоянии; 5 - норма.Figure 4. Detection of a mutation IVS3-2a-> c. RFLP analysis. When the IVS3-2a-> c mutation occurs, a restriction site for the restriction enzyme Msp I (C ^ CGG) appears. Lanes: 1 — molecular weight marker, 2 — exon fragment 3-5 of the GALT gene before restriction, 3, 4 — exon fragments of 3-5 the GALT gene after treatment with the restriction enzyme Msp I (C ^ CGG): 3-4 — IVS3 mutation 2a-> c in a heterozygous state; 5 is the norm.

Фигура 5. Детекция полиморфизма IVS4-27 g->c. ПДРФ анализ. При замене g->c исчезает сайт рестрикции для фермента рестрикции Msp I (C^CGG). Дорожки: 1, 2, 3 - фрагменты интрона 4 гена GALT после обработки ферментом рестрикции Msp I (C^CGG); 1 - гомозигота по полиморфизму IVS4-27 g; 2 - гомозигота по полиморфизму IVS4-27 c; 3 - гетерозигота по полиморфизму IVS4-27 g->c.Figure 5. Detection of polymorphism IVS4-27 g-> c. RFLP analysis. When replacing g-> c, the restriction site for the restriction enzyme Msp I (C ^ CGG) disappears. Lanes: 1, 2, 3 — fragments of intron 4 of the GALT gene after treatment with the restriction enzyme Msp I (C ^ CGG); 1 - homozygous for polymorphism IVS4-27 g; 2 - homozygous for polymorphism IVS4-27 c; 3 - heterozygous for polymorphism IVS4-27 g-> c.

Фигура 6. Детекция мутации M142K (ATG->AAG). Прямое ДНК-секвенирование. Стрелками указана локализация мутации. А. Фрагмент экзона 5 гена GALT. Мутация M142K в гомозиготном состоянии. Б. Фрагмент экзона 5 гена GALT. Норма.Figure 6. Detection of the M142K mutation (ATG-> AAG). Direct DNA sequencing. Arrows indicate the location of the mutation. A. Fragment of exon 5 of the GALT gene. Mutation M142K in the homozygous state. B. Fragment of exon 5 of the GALT gene. Norm.

Фигура 7. Детекция мутации Q188R (CAG->CCG). ПДРФ анализ. При мутации Q188R появляется сайт рестрикции для фермента рестрикции Msp I (C^CGG) и исчезает сайт рестрикции для фермента рестрикции Bst2U I (CCWGG). Дорожки: 1 - маркер молекулярного веса, 2-7 - фрагменты экзона 6 гена GALT после обработки ферментом рестрикции Msp I (C^CGG); 2 - гомозигота по мутации Q188R; 3-6 - гетерозиготы по мутации Q188R; 7 - норма.Figure 7. Detection of Q188R mutation (CAG-> CCG). RFLP analysis. With the Q188R mutation, the restriction site for the Msp I restriction enzyme (C ^ CGG) appears and the restriction site for the Bst2U I restriction enzyme (CCWGG) disappears. Lanes: 1 — molecular weight marker, 2–7 — fragments of exon 6 of the GALT gene after treatment with the restriction enzyme Msp I (C ^ CGG); 2 - homozygous for Q188R mutation; 3-6 - heterozygotes for Q188R mutation; 7 is the norm.

Фигура 8. Детекция полиморфизма L218L (CTA->TTA). Прямое ДНК-секвенирование. Обратная цепь. Стрелками указана локализация полиморфизма. А. Фрагмент экзона 7 гена GALT. Полиморфизм L218L в гетерозиготном состоянии. Б. Фрагмент экзона 7 гена GALT. Норма.Figure 8. Detection of L218L polymorphism (CTA-> TTA). Direct DNA sequencing. Reverse circuit. Arrows indicate the localization of polymorphism. A. Fragment of exon 7 of the GALT gene. L218L polymorphism in the heterozygous state. B. Fragment of exon 7 of the GALT gene. Norm.

Фигура 9. Детекция мутации K285N (AAG->AAT). ПДРФ анализ. При мутации K285N появляется сайт рестрикции для фермента рестрикции Sse9 I (^AATT). Дорожки: 1 - маркер молекулярного веса, 2, 3 - фрагменты экзона 9 гена GALT после обработки ферментом рестрикции Sse9 I (^AATT): 2 - норма; 3 - мутация K285N в гетерозиготном состоянии.Figure 9. Detection of the K285N mutation (AAG-> AAT). RFLP analysis. With the K285N mutation, a restriction site for the restriction enzyme Sse9 I (^ AATT) appears. Lanes: 1 — molecular weight marker; 2, 3 — fragments of exon 9 of the GALT gene after treatment with the restriction enzyme Sse9 I (^ AATT): 2 — normal; 3 - mutation K285N in the heterozygous state.

Фигура 10. Детекция полиморфизма N314D (AAC->GAC). ПДРФ анализ. При замене aac->gac появляется сайт рестрикции для фермента рестрикции Bmu I (ACTGGG(N)5^). Дорожки: 1 - фрагмент 10 экзона гена GALT до рестрикции, 2, 3 - фрагменты экзона 10 гена GALT после обработки ферментом рестрикции Bmu I (ACTGGG(N)5^); 2 - полиморфизм в гетерозиготном состоянии, 3 - норма.Figure 10. Detection of polymorphism N314D (AAC-> GAC). RFLP analysis. When aac-> gac is replaced, the restriction site for the Bmu I restriction enzyme (ACTGGG (N) 5 ^) appears. Lanes: 1 — fragment of exon 10 of the GALT gene before restriction, 2, 3 — fragments of exon 10 of the GALT gene after treatment with the restriction enzyme Bmu I (ACTGGG (N) 5 ^); 2 - polymorphism in the heterozygous state, 3 - normal.

Фигура 11. Детекция мутации R333W (CGG->TGG). Прямое ДНК-секвенирование. Стрелками указана локализация мутации. А. Фрагмент экзона 10 гена GALT. Мутация R333W в гетерозиготном состоянии. Б. Фрагмент экзона 10 гена GALT. Норма.Figure 11. Detection of mutation R333W (CGG-> TGG). Direct DNA sequencing. Arrows indicate the location of the mutation. A. Fragment of exon 10 of the GALT gene. Mutation R333W in the heterozygous state. B. Fragment of exon 10 of the GALT gene. Norm.

Фигура 12. Детекция мутации E352Q (GAG->CAG). Прямое ДНК-секвенирование. Стрелками указана локализация мутации. А. Фрагмент экзона 10 гена GALT. Мутация E352Q в гетерозиготном состоянии. Б. Фрагмент экзона 10 гена GALT. Норма.Figure 12. Detection of mutations E352Q (GAG-> CAG). Direct DNA sequencing. Arrows indicate the location of the mutation. A. Fragment of exon 10 of the GALT gene. Mutation E352Q in the heterozygous state. B. Fragment of exon 10 of the GALT gene. Norm.

Фигура 13. Детекция мутации L358P (CTA->CCA). ПДРФ анализ. При мутации L358P появляется сайт рестрикции для фермента рестрикции BssT1 I (C^CWWGG). Дорожки: 1, 2 - фрагменты экзона 11 гена GALT после обработки ферментом рестрикции BssT1 I (C^CWWGG); 1 - гетерозигота по мутации L358P; 2 - норма.Figure 13. Detection of mutations L358P (CTA-> CCA). RFLP analysis. With the L358P mutation, a restriction site for the BssT1 I restriction enzyme (C ^ CWWGG) appears. Lanes: 1, 2 — fragments of exon 11 of the GALT gene after treatment with the restriction enzyme BssT1 I (C ^ CWWGG); 1 - heterozygous for mutation L358P; 2 - the norm.

Фигура 14. Электрофореграмма мультиплексных ПЦР для второго раунда.Figure 14. Electrophoregram of multiplex PCR for the second round.

Дорожки: 1 - маркер молекулярного веса,Lanes: 1 - molecular weight marker,

2-3 - второй раунд ПЦР: фрагмент экзона 3 гена GALT2-3 - second round of PCR: fragment of exon 3 of the GALT gene

(мутация F95L) - 119 пн+фрагмент экзона 10 гена GALT(F95L mutation) - 119 bp + exon fragment 10 of the GALT gene

(мутация R333W) - 104 пн+фрагмент экзона 6 гена GALT(mutation R333W) - 104 bp + exon 6 fragment of the GALT gene

(мутация Q188R) - 96 пн;(mutation Q188R) - 96 bp;

4-5 - второй раунд ПЦР: фрагмент экзона 10 гена GALT4-5 - second round of PCR: fragment of exon 10 of the GALT gene

(полиморфизм N314D) - 151 пн+фрагмент интрона 3 гена(N314D polymorphism) - 151 bp + intron 3 gene fragment

GALT (мутация IVS3-2a->c) - 107 пн+фрагмент экзона 7 генаGALT (mutation IVS3-2a-> c) - 107 bp + fragment of exon 7 of the gene

GALT (полиморфизм L218L) - 89 пн;GALT (L218L polymorphism) - 89 bp;

6-7 - второй раунд ПЦР: фрагмент интрона 4 гена GALT6-7 - second round of PCR: fragment of intron 4 of the GALT gene

(полиморфизм IVS4-27 g->c) - 130 пн+фрагмент экзона 10(polymorphism IVS4-27 g-> c) - 130 bp + exon fragment 10

гена GALT (мутация E352Q) - 84 пн;GALT gene (mutation E352Q) - 84 bp;

8-9 - второй раунд ПЦР: фрагмент экзона 11 гена GALT8-9 - second round of PCR: fragment of exon 11 of the GALT gene

(мутация L358P) - 139 пн+фрагмент экзона 9 гена GALT(mutation L358P) - 139 bp + fragment of exon 9 of the GALT gene

(мутация K285N) - 112 пн+фрагмент экзона 5 гена GALT(mutation K285N) - 112 bp + exon 5 fragment of the GALT gene

(мутация M142K) - 100 пн.(mutation M142K) - 100 bp

Фигура 15. Гибридизационная картина образца ДНК, полученного из человека, не несущего мутации в гене GALT с биочипом-1. Расположение точек соответствует фиг.1.Figure 15. Hybridization pattern of a DNA sample obtained from a person not carrying a mutation in the GALT gene with biochip-1. The location of the points corresponds to figure 1.

Фигура 16. Гибридизационная картина образца ДНК, полученного из человека не несущего мутации в гене GALT с биочипом-2. Расположение точек соответствует фиг.2.Figure 16. Hybridization picture of a DNA sample obtained from a person not carrying mutations in the GALT gene with biochip-2. The location of the points corresponds to figure 2.

Фигура 17. Гибридизационная картина образца ДНК, полученного из человека не несущего мутации в гене GALT с биочипом-2. Расположение точек соответствует фиг.2.Figure 17. Hybridization picture of a DNA sample obtained from a person not carrying mutations in the GALT gene with biochip-2. The location of the points corresponds to figure 2.

Фигура 18. Гибридизационная картина образца ДНК, полученного из человека несущего мутацию IVS3-2a->c в гене GALT с биочипом-1. Расположение точек соответствует фиг.1.Figure 18. Hybridization picture of a DNA sample obtained from a person carrying the IVS3-2a-> c mutation in the GALT gene with biochip-1. The location of the points corresponds to figure 1.

Фигура 19. Гибридизационная картина образца ДНК, полученного из человека несущего мутации L218L/Q188R/N314D в гене GALT с биочипом-1. Расположение точек соответствует фиг.1.Figure 19. Hybridization pattern of a DNA sample obtained from a human carrier mutation L218L / Q188R / N314D in the GALT gene with biochip-1. The location of the points corresponds to figure 1.

Фигура 20. Гибридизационная картина образца ДНК, полученного из человека несущего мутацию Q188R в гомозиготном состоянии в гене GALT с биочипом-1. Расположение точек соответствует фиг.1.Figure 20. Hybridization picture of a DNA sample obtained from a person carrying the Q188R mutation in a homozygous state in the GALT gene with biochip-1. The location of the points corresponds to figure 1.

Фигура 21. Гибридизационная картина образца ДНК, полученного из человека несущего мутацию Q188R в гомозиготном состоянии в гене GALT с биочипом-2. Расположение точек соответствует фиг.2.Figure 21. Hybridization pattern of a DNA sample obtained from a person carrying the Q188R mutation in a homozygous state in the GALT gene with biochip-2. The location of the points corresponds to figure 2.

Фигура 22. Гибридизационная картина образца ДНК, полученного из человека несущего мутацию Q188R в гетерозиготном состоянии в гене GALT с биочипом-1. Расположение точек соответствует фиг.1.Figure 22. Hybridization pattern of a DNA sample obtained from a person carrying the Q188R mutation in the heterozygous state in the GALT gene with biochip-1. The location of the points corresponds to figure 1.

Фигура 23. Гибридизационная картина образца ДНК, полученного из человека несущего мутацию K285N в гене GALT в гетерозиготном состоянии с биочипом-1. Расположение точек соответствует фиг.1.Figure 23. Hybridization picture of a DNA sample obtained from a person carrying the K285N mutation in the GALT gene in a heterozygous state with biochip-1. The location of the points corresponds to figure 1.

Фигура 24. Гибридизационная картина образца ДНК, полученного из человека несущего мутацию K285N в гене GALT в гетерозиготном состоянии с биочипом-2. Расположение точек соответствует фиг.2.Figure 24. Hybridization pattern of a DNA sample obtained from a person carrying the K285N mutation in the GALT gene in a heterozygous state with biochip-2. The location of the points corresponds to figure 2.

Фигура 25. Гибридизационная картина образца ДНК, полученного из человека несущего мутацию K285N в гене GALT в гомозиготном состоянии с биочипом-2. Расположение точек соответствует фиг.2.Figure 25. Hybridization picture of a DNA sample obtained from a person carrying the K285N mutation in the GALT gene in a homozygous state with biochip-2. The location of the points corresponds to figure 2.

Фигура 26. Гибридизационная картина образца ДНК, полученного из человека несущего мутации IVS4-27 g->c и N314D в гене GALT в гетерозиготном состоянии с биочипом-1. Расположение точек соответствует фиг.1.Figure 26. Hybridization pattern of a DNA sample obtained from a person carrying the mutation IVS4-27 g-> c and N314D in the GALT gene in a heterozygous state with biochip-1. The location of the points corresponds to figure 1.

Фигура 27. Гибридизационная картина образца ДНК, полученного из человека несущего мутацию N314D и полиморфизм IVS4-27 g->c в гомозиготном состоянии в гене GALT с биочипом-2. Расположение точек соответствует фиг.2.Figure 27. Hybridization pattern of a DNA sample obtained from a person carrying the N314D mutation and IVS4-27 g-> c polymorphism in the homozygous state in the GALT gene with biochip-2. The location of the points corresponds to figure 2.

Фигура 28. Гибридизационная картина образца ДНК, полученного из человека несущего мутацию M142K в гене GALT в гетерозиготном состоянии с биочипом-1. Расположение точек соответствует фиг.1.Figure 28. Hybridization picture of a DNA sample obtained from a person carrying the M142K mutation in the GALT gene in a heterozygous state with biochip-1. The location of the points corresponds to figure 1.

Фигура 29. Гибридизационная картина образца ДНК, полученного из человека несущего мутацию M142K в гене GALT в гомозиготном состоянии с биочипом-2. Расположение точек соответствует фиг.2.Figure 29. Hybridization picture of a DNA sample obtained from a person carrying the M142K mutation in the GALT gene in a homozygous state with biochip-2. The location of the points corresponds to figure 2.

Фигура 30. Гибридизационная картина образца ДНК, полученного из человека несущего мутацию L358P в гене GALT в гетерозиготном состоянии с биочипом-1. Расположение точек соответствует фиг.1.Figure 30. Hybridization pattern of a DNA sample obtained from a person carrying the L358P mutation in the GALT gene in a heterozygous state with biochip-1. The location of the points corresponds to figure 1.

Фигура 31. Гибридизационная картина образца ДНК, несущего мутацию F95L и нормальную последовательность гена GALT с биочипом-2. Расположение точек соответствует расположению олигонуктеотидов столбца F95 на фиг.2.Figure 31. Hybridization pattern of a DNA sample carrying the F95L mutation and the normal sequence of the GALT gene with biochip-2. The location of the points corresponds to the location of the oligonucleotides of column F95 in figure 2.

Фигура 32. Гибридизационная картина образца ДНК, несущего мутацию R333W/R333Q/R333G и нормальную последовательность гена GALT с биочипом-2. Расположение точек соответствует расположению олигонуктеотидов столбцов R333-1 и R333-2 на фиг.2.Figure 32. Hybridization pattern of a DNA sample carrying the R333W / R333Q / R333G mutation and the normal sequence of the GALT gene with biochip-2. The location of the points corresponds to the location of the oligonucleotides of columns R333-1 and R333-2 in figure 2.

Фигура 33. Гибридизационная картина образца ДНК, несущего мутацию E352Q и нормальную последовательность гена GALT с биочипом-2. Расположение точек соответствует расположению олигонуктеотидов столбца E352 на фиг.2.Figure 33. Hybridization pattern of a DNA sample carrying the E352Q mutation and the normal sequence of the GALT gene with biochip-2. The location of the points corresponds to the location of the oligonucleotides of column E352 in figure 2.

Фигура 34. Гибридизационная картина образца ДНК, полученного из человека несущего мутацию несущего мутацию Q188R в гене GALT в гомозиготном состоянии с биочипом-2. Расположение точек соответствует фиг.2.Figure 34. Hybridization picture of a DNA sample obtained from a person carrying a mutation bearing a Q188R mutation in the GALT gene in a homozygous state with biochip-2. The location of the points corresponds to figure 2.

Осуществление изобретенияThe implementation of the invention

Осуществление изобретения проиллюстрировано следующими примерами.The implementation of the invention is illustrated by the following examples.

Пример 1. Установление мутаций, использованных для создания биочипа.Example 1. Identification of mutations used to create a biochip.

С целью разработки биочипа были проанализированы частоты мутаций в гене GALT у пациентов с галактоземией 1 типа из Российской Федерации. Частоты мутаций Q188R и K285N составляют на данный момент исследования 60% и 16% соответственно. Среди редких мутаций, обнаруженных у пациентов, четыре уже были описаны ранее (IVS3-2a->g (обнаружена у двух пациентов), M142K (обнаружена у двух пациентов), R333W (обнаружена у одного пациента), W316X (обнаружена у одного пациента)) и две новые: E352Q (обнаружена у двух пациентов), L358P (обнаружена у двух пациентов). В результате массового скрининга было выявлено 25 носителей мутантных аллелей (Q188R, K285N, или редких мутаций); носителей только полиморфизма N314D (вариант Дуарте) - 5 человек, носителей полиморфизма N314D в сочетании с какой-либо мутацией в транс-положении - 40 человек. В случаях сочетанного носительства мутации и полиморфизма N314D был также обнаружен полиморфизм IVS-27g->c в гетерозиготном состоянии, в цис-положении с N314D. При этом активность фермента у таких пациентов была снижена по сравнению с нормой.In order to develop a biochip, mutation frequencies in the GALT gene were analyzed in patients with type 1 galactosemia from the Russian Federation. The mutation frequencies of Q188R and K285N are currently 60% and 16%, respectively. Among the rare mutations found in patients, four have already been described previously (IVS3-2a-> g (found in two patients), M142K (found in two patients), R333W (found in one patient), W316X (found in one patient) ) and two new ones: E352Q (found in two patients), L358P (found in two patients). Mass screening revealed 25 carriers of mutant alleles (Q188R, K285N, or rare mutations); carriers of only N314D polymorphism (Duarte variant) - 5 people; carriers of N314D polymorphism in combination with any mutation in the trans position - 40 people. In cases of combined carriage of a mutation and N314D polymorphism, an IVS-27g-> c polymorphism was also found in the heterozygous state, in the cis position with N314D. Moreover, the activity of the enzyme in such patients was reduced compared with the norm.

При анализе литературных данных также были выбраны мутации и полиморфизмы, которые с наибольшей частотой встречались в других популяциях.In the analysis of literature data, mutations and polymorphisms were also selected, which were most often found in other populations.

Учитывая информацию, изложенную выше, для создания биочипа были выбраны следующие мутации и полиморфизмы в гене GALT: F95L, IVS3-2a->c, IVS4-27 g->c, M142K, M142V, Q188R, L218L, K285N, N314D, R333W, R333G, R333Q, E352Q, L358P, W316X.Considering the information presented above, the following mutations and polymorphisms in the GALT gene were selected to create the biochip: F95L, IVS3-2a-> c, IVS4-27 g-> c, M142K, M142V, Q188R, L218L, K285N, N314D, R333W, R333G, R333Q, E352Q, L358P, W316X.

Пример 2. Дизайн и оптимизация последовательностей олигонуклеотидов для иммобилизации на микрочипе.Example 2. Design and optimization of oligonucleotide sequences for immobilization on a microchip.

Дизайн олигонуклеотидных последовательностей для иммобилизации на микрочипе проводили с учетом анализа нуклеотидной последовательности гена галактоза-1-фосфат уридилтрансферазы в областях пяти мутаций и пяти значимых полиморфизмов. Для этой цели использовали программу Oligo 6 (США).The design of oligonucleotide sequences for immobilization on a microchip was carried out taking into account the analysis of the nucleotide sequence of the galactose-1-phosphate uridyl transferase gene in the regions of five mutations and five significant polymorphisms. For this purpose, the Oligo 6 program (USA) was used.

Пример 3. Конструирование микрочипа для детекции полиморфизма в гене галактоза-1-фосфат уридилтрансферазы.Example 3. Construction of a microchip for the detection of polymorphism in the galactose-1-phosphate uridyl transferase gene.

При выборе полиморфных локусов, анализ которых будет проводиться при помощи биочипа по изобретению, руководствовались следующими подходами: 1) в гене выбирались функционально значимые аллели, встречающиеся с наибольшей частотой; 2) включали только те нуклеотидные замены, полиморфизм которых уже изучен в ряде популяций России.When choosing polymorphic loci, the analysis of which will be carried out using the biochip according to the invention, they were guided by the following approaches: 1) functionally significant alleles that were found with the greatest frequency were selected in the gene; 2) included only those nucleotide substitutions whose polymorphism has already been studied in a number of populations of Russia.

Последовательности нуклеотидов, использованных для создания биочипа по изобретению, приведены в таблицах 1 и 2.The nucleotide sequences used to create the biochip according to the invention are shown in tables 1 and 2.

Олигонуклеотиды, приведенные в таблице 1, 2, синтезированы с использованием стандартной фосфоамитидной процедуры на автоматическом синтезаторе 394 DNA/RNA Synthesizer ("Applied Biosystems", США) На 3'-конце олигонуклеотидов находится спейсер со свободной аминогруппой, который вводили при синтезе с помощью 3'-Amino-Modifier C7 CPG 500 ("Glen Reseach", США) с целью проведения фотоиндуцируемой совместной полимеризации олигонуклеотидов и компонентов полиакриламидного геля.The oligonucleotides shown in Table 1, 2 were synthesized using the standard phosphoamitide procedure using an automated 394 DNA / RNA Synthesizer (Applied Biosystems, USA). At the 3'-end of the oligonucleotides there is a free amino group spacer, which was introduced during synthesis using 3 '-Amino-Modifier C7 CPG 500 ("Glen Reseach", USA) for the purpose of photoinduced co-polymerization of oligonucleotides and components of a polyacrylamide gel.

С целью повышения надежности определения сигнала каждую олигонуклеотидную пробу продублировали. Для подбора последовательности олигонуклетидов, обеспечивающих максимальную специфичность, в биочипе использовались несколько типов олигонуклеотидов, комплементарных одной и той же мутации/полиморфизму или немутантной последовательности.In order to increase the reliability of signal determination, each oligonucleotide sample was duplicated. To select the sequence of oligonucleotides that provide maximum specificity, several types of oligonucleotides complementary to the same mutation / polymorphism or non-mutant sequence were used in the biochip.

Факт наличия немутантных и мутантных аллелей в геноме пациента установлен при анализе интенсивности флюоресценции соответствующих ячеек на чипе. Нанесение олигонуклетидов, комплементарных нормальной последовательности и различным мутациям/полиморфизмам гена GALT, на биочип показано на фигурах 1 и 2 (обозначение олигонуклеотидов такое же, как и в таблице 1 и 2).The fact of the presence of non-mutant and mutant alleles in the patient’s genome was established by analyzing the fluorescence intensity of the corresponding cells on the chip. The application of oligonucleotides complementary to the normal sequence and various mutations / polymorphisms of the GALT gene on the biochip is shown in figures 1 and 2 (the designation of oligonucleotides is the same as in table 1 and 2).

Таким образом, сконструированный биочип позволяет определять наличие мутаций в гене галактоза-1-фосфат уридилтрансферазы, приводящие к возникновению заболевания.Thus, the designed biochip allows us to determine the presence of mutations in the galactose-1-phosphate gene of uridyl transferase, leading to the onset of the disease.

Пример 4. Подготовка образцов ДНК от здоровых доноров и больных галактоземией 1 типа для тестирования биочипа.Example 4. Preparation of DNA samples from healthy donors and patients with type 1 galactosemia for biochip testing.

В результате работы были отобраны образцы ДНК больных галактоземией детей для каждой из десяти исследуемых мутаций. Эти образцы ДНК подготовлены для тестирования полученного ДНК-чипа.As a result of the work, DNA samples of children with galactosemia patients were selected for each of the ten studied mutations. These DNA samples are prepared for testing the resulting DNA chip.

Все выбранные нами для создания биочипа мутации были подтверждены методом прямого нерадиоактивного секвенирования и/или анализом полиморфизма длины рестрикционных фрагментов. В качестве примеров на фигурах 3-13 приведены результаты части экспериментов. Как видно на приведенных фигурах мутации и полиморфизмы хорошо детектируются с помощью данных методов. Таким образом, в результате данной работы были отобраны образцы ДНК, которые можно применить для тестирования полученного биочипа.All mutations that we selected to create the biochip were confirmed by direct non-radioactive sequencing and / or restriction fragment length polymorphism analysis. As examples in figures 3-13 shows the results of part of the experiments. As can be seen in the figures, mutations and polymorphisms are well detected using these methods. Thus, as a result of this work, DNA samples were selected that can be used to test the resulting biochip.

Пример 5. Гибридизация биочипа с ДНК-зондами с известной структурой и с ДНК-зондами, полученными от пациентов.Example 5. Hybridization of the biochip with DNA probes with a known structure and with DNA probes obtained from patients.

В результате исследования подобраны олигонуклеотидные праймеры и условия проведения реакции для проведения второго раунда ПЦР на последовательности гена GALT, полученной в первом раунде ПЦР, для дальнейшей детекции патогенно-значимых нуклеотидных замен гена GALT на микрочипе. Для проведения второго раунда мультиплексной ПЦР были подобраны следующие олигонуклеотидные праймеры (Таблица 3).As a result of the study, oligonucleotide primers and reaction conditions were selected for the second round of PCR using the GALT gene sequence obtained in the first round of PCR to further detect pathologically significant nucleotide substitutions of the GALT gene on the microchip. For the second round of multiplex PCR, the following oligonucleotide primers were selected (Table 3).

Так как экзоны гена GALT располагаются плотным кластером, а размер интронов гена GALT не превышает 740 bp, то чтобы избежать перекрестной ПЦР, второй раунд проводили следующим образом: аликвота от первого раунда ПЦР объемом 5 мкл с последующей мультиплексной ПЦР:Since the exons of the GALT gene are located in a dense cluster, and the size of the introns of the GALT gene does not exceed 740 bp, in order to avoid cross-PCR, the second round was carried out as follows: an aliquot from the first round of PCR with a volume of 5 μl followed by multiplex PCR:

1. Фагмент экзона 3 гена GALT (мутация F95L)+фрагмент экзона 10 гена GALT (мутация R333W)+фрагмент экзона 6 гена GALT (мутация Q188R);1. Exon 3 fragment of the GALT gene (F95L mutation) + exon 10 fragment of the GALT gene (R333W mutation) + exon 6 fragment of the GALT gene (Q188R mutation);

2. Фагмент экзона 10 гена GALT (полиморфизм N314D, W316X)+фрагмент интрона 3 гена GALT (мутация IVS3-2a->c)+фрагмент экзона 7 гена GALT (полиморфизм L218L);2. Fragment of exon 10 of the GALT gene (polymorphism N314D, W316X) + fragment of intron 3 of the GALT gene (mutation IVS3-2a-> c) + fragment of exon 7 of the GALT gene (polymorphism L218L);

3. Фагмент интрона 4 гена GALT (полиморфизм IVS4-27 g->c)+фрагмент экзона 10 гена GALT (мутация E352Q);3. The intron 4 fragment of the GALT gene (IVS4-27 g-> c polymorphism) + fragment of exon 10 of the GALT gene (mutation E352Q);

4. Фагмент экзона 11 гена GALT (мутация L358P)+фрагмент экзона 9 гена GALT (мутация K285N)+фрагмент экзона 5 гена GALT (мутация M142K).4. Fragment of exon 11 of the GALT gene (mutation L358P) + fragment of exon 9 of the GALT gene (mutation K285N) + fragment of exon 5 of the GALT gene (mutation M142K).

Реакционная смесь (25 мкл) на втором этапе ПЦР содержала 0,5 пмоль каждого праймера, 2,5 мкл буфера для ПЦР с 2,5 мМ MgCl₂ («Силекс», Россия), 6,25 нМ каждого из dNTP («Силекс», Россия), 0,2 нМ флюоресцентно меченого dUTP-Cy5 и 1 ед.акт. Taq-полимеразы («Силекс», Россия). Для амплификации использовали программируемый ДНК-амплификатор фирмы «ДНК-технология» (Россия). После предварительной денатурации ДНК (3 минуты при 94°С) проводили амплификацию в режиме: 33 цикла амплификации: 94°С 30 сек, 59°С 30 сек, 72°С 1 мин. Заключительный синтез 72°С - 3 минуты.The reaction mixture (25 μl) at the second PCR stage contained 0.5 pmol of each primer, 2.5 μl of PCR buffer with 2.5 mM MgCl ₂ (Sileks, Russia), 6.25 nM of each of dNTP (Silex ”, Russia), 0.2 nM fluorescently labeled dUTP-Cy5 and 1 unit. Taq polymerase (Sileks, Russia). For amplification, a programmable DNA amplifier of the DNA Technology company (Russia) was used. After preliminary DNA denaturation (3 minutes at 94 ° C), amplification was performed in the mode: 33 amplification cycles: 94 ° C for 30 sec, 59 ° C for 30 sec, 72 ° C for 1 min. The final synthesis of 72 ° C - 3 minutes.

Электрофореграмма мультиплексных ПЦР представлена на фиг.14.Electrophoregram multiplex PCR is presented in Fig.14.

Гибридизацию на микрочипе проводили с использованием флюоресцентно меченых образцов, полученных на второй стадии реакции ПЦР, в 32 мкл смеси следующего состава: 8 мкл формамида ("Serva", США), 8 мкл 20XSSPE ("Promega", США), 4 мкл амплификата и 12 мкл Н₂О. Гибридизационную смесь денатурировали при 95°С (5 мин), охлаждали на льду (3 мин), наносили на биочип и оставляли на ночь при температуре 37°С.Далее чип отмывали в 1XSSPE в течение 5 мин при 20°С и высушивали.Microchip hybridization was carried out using fluorescently labeled samples obtained in the second stage of the PCR reaction in 32 μl of a mixture of the following composition: 8 μl of formamide (Serva, USA), 8 μl of 20XSSPE (Promega, USA), 4 μl of amplification and 12 μl of H ₂ O. The hybridization mixture was denatured at 95 ° C (5 min), cooled on ice (3 min), applied to the biochip and left overnight at 37 ° C. The chip was then washed in 1XSSPE for 5 min at 20 ° C and dried.

Флюоресцентный сигнал от ячеек регистрировали с помощью широкопольного люминисцентного микроскопа, снабженного камерой ПЗС и программным обеспечением Imageware («Биочип-ИМБ», Россия). Использовали нормированные сигналы флюоресценции Jm=(Im-I₀)/(Bm-I₀), где Im - интенсивность сигнала на единицу площади внутренней части составляющей ячейки, Bm - фоновый сигнал, отражающий распределение освещенности микрочипа, I₀- темновой ток ПЗС матрицы, а m - номер ячейки чипа. При анализе интенсивности флюоресценции использовали среднее значение между двумя дублирующими ячейками. Сигналы Jm сортировали по возрастанию. Ячейкой сравнения считали ячейку, после которой наблюдали резкое увеличение нормированного сигнала. Считали, что ячейка имеет положительный сигнал, если ее сигнал превышал сигнал ячейки сравнения. Затем сравнивали между собой ячейки, содержащие нуклеотидную последовательность дикого типа и соответствующую мутантную последовательность, выявляя доминирующий сигнал, который превышал пороговое значение. Пороговое значение сигнала определяли статистически, обработав более 20 гибридизационных картин. Если в паре положительных сигналов «проба дикого типа - мутантная проба» ни один из сигналов не доминировал, значимыми считали сигналы с обеих ячеек, что соответствовало гетерозиготному состоянию анализируемого локуса.The fluorescent signal from the cells was recorded using a wide-field luminescent microscope equipped with a CCD camera and Imageware software (Biochip-IMB, Russia). We used normalized fluorescence signals Jm = (Im-I ₀ ) / (Bm-I ₀ ), where Im is the signal intensity per unit area of the internal part of the cell component, Bm is the background signal reflecting the distribution of the microchip illumination, I ₀ is the dark current of the CCD matrix , and m is the chip cell number. When analyzing the fluorescence intensity, an average value between two duplicate cells was used. Signals Jm were sorted in ascending order. The reference cell was considered the cell, after which a sharp increase in the normalized signal was observed. It was believed that the cell has a positive signal if its signal exceeded the signal of the comparison cell. Then, cells containing the wild-type nucleotide sequence and the corresponding mutant sequence were compared with each other, revealing a dominant signal that exceeded the threshold value. The threshold signal value was determined statistically by processing more than 20 hybridization patterns. If in the pair of positive signals “wild-type probe - mutant probe” none of the signals dominated, the signals from both cells were considered significant, which corresponded to the heterozygous state of the analyzed locus.

Пример 6. Анализ данных, полученных при гибридизации на биочипе по изобретению.Example 6. Analysis of data obtained by hybridization on a biochip according to the invention.

6.1. Результат трех различных гибридизаций продуктов ПЦР-реакции, полученных с использованием геномной ДНК доноров, не болеющих галактаземией 1 типа, с биочипом по изобретению приведен на фигурах 15-17 и таблицах 4-6.6.1. The result of three different hybridizations of the PCR reaction products obtained using the genomic DNA of donors not suffering from type 1 galactasemia with the biochip according to the invention is shown in figures 15-17 and tables 4-6.

Согласно сведениям, приведенным в таблицах 4-6 и на фигурах 15-17, уровень нормированных сигналов флюоресценции (Jm) в точках, соответствующих нормальной последовательности гена GALT, в несколько раз выше, чем в точках соответствующих мутированным последовательностям. Таким образом, заявленный биочип не дает ложноположительных результатов в случае пациента, не несущего указанных мутаций в последовательности гена GALT.According to the information given in tables 4-6 and figures 15-17, the level of normalized fluorescence signals (Jm) at the points corresponding to the normal sequence of the GALT gene is several times higher than at the points corresponding to the mutated sequences. Thus, the claimed biochip does not give false positive results in the case of a patient who does not carry these mutations in the sequence of the GALT gene.

6.2. Результат трех различных гибридизаций продуктов ПЦР-реакции, полученных с использованием геномной ДНК доноров, несущих полиморфизм IVS3-2a->c, с биочипом по изобретению приведен на фигуре 18 и таблице 7.6.2. The result of three different hybridizations of the PCR reaction products obtained using the genomic DNA of donors carrying the IVS3-2a-> c polymorphism with the biochip according to the invention is shown in FIG. 18 and Table 7.

Согласно сведениям, приведенным в таблице 7 и на фигуре 18, уровень сигналов флюоресценции в точках, соответствующих мутации IVS3-2a->c в гене GALT, такой же, как и в точках, соответствующих последовательности, не содержащей данную замену в интроне 3. Данный факт говорит о том, что мутация находится в гетерозиготном состоянии. Во всех остальных точках уровень сигнала, соответствующий нормальным последовательностям, в несколько раз сильнее сигнала, соответствующего мутированным последовательностям. Таким образом, заявленный биочип позволяет установить наличие мутации IVS3-2a->c в гене GALT с высокой специфичностью (даже в гетерозиготном состоянии). При этом не возникает ложноположительных сигналов, соответствующих другим мутациям.According to the information given in table 7 and figure 18, the level of fluorescence signals at the points corresponding to the IVS3-2a-> c mutation in the GALT gene is the same as at the points corresponding to the sequence that does not contain this substitution in intron 3. This the fact suggests that the mutation is in a heterozygous state. At all other points, the signal level corresponding to normal sequences is several times stronger than the signal corresponding to mutated sequences. Thus, the claimed biochip allows us to establish the presence of the IVS3-2a-> c mutation in the GALT gene with high specificity (even in the heterozygous state). In this case, false positive signals corresponding to other mutations do not occur.

6.3. В результате гибридизации продуктов ПЦР-реакции, полученных с использованием геномной ДНК пациента, несущего мутации L218L/Q188R/N314D в гетерозиготном состоянии, был получен результат, приведенный на фигуре 19 и таблице 8.6.3. As a result of hybridization of the PCR reaction products obtained using the genomic DNA of a patient carrying the heterozygous L218L / Q188R / N314D mutations, the result is shown in Figure 19 and Table 8.

Согласно сведениям, приведенным в таблице 8 и на фигуре 19, уровень сигналов флюоресценции в точках, соответствующих мутации L218L/Q188R/N314D в гене GALT, такой же, как и в точках, соответствующих последовательностям, не содержащим данные замены. Данный факт говорит о том, что мутации находятся в гетерозиготном состоянии. Во всех остальных точках уровень сигнала, соответствующий нормальным последовательностям, в несколько раз сильнее сигнала, соответствующего мутированным последовательностям. Таким образом, заявленный биочип позволяет установить наличие мутаций L218L/Q188R/N314D в гене GALT с высокой специфичностью (даже в гетерозиготном состоянии). При этом не возникает ложноположительных сигналов, соответствующих другим мутациям.According to the information given in table 8 and figure 19, the level of fluorescence signals at the points corresponding to the L218L / Q188R / N314D mutation in the GALT gene is the same as at the points corresponding to the sequences that do not contain replacement data. This fact suggests that mutations are in a heterozygous state. At all other points, the signal level corresponding to normal sequences is several times stronger than the signal corresponding to mutated sequences. Thus, the claimed biochip allows us to establish the presence of mutations L218L / Q188R / N314D in the GALT gene with high specificity (even in the heterozygous state). In this case, false positive signals corresponding to other mutations do not occur.

6.4. В результате гибридизации продуктов ПЦР-реакции, полученных с использованием геномной ДНК пациента, несущего мутацию Q188R в гомозиготном состоянии, был получен результат, приведенный на фигурах 20 и 21 и таблицах 9 и 10.6.4. As a result of hybridization of the PCR reaction products obtained using the genomic DNA of a patient carrying the Q188R mutation in the homozygous state, the result is shown in figures 20 and 21 and tables 9 and 10.

Согласно сведениям, приведенным в таблицах 9 и 10 и на фигурах 20 и 21, уровень сигналов флюоресценции в точках, соответствующих мутации Q188R в гене GALT, в несколько десятков раз сильнее, чем в точках, соответствующих последовательностям, не содержащим данные замены. Данный факт говорит о том, что мутация находится в гомозиготном состоянии. Во всех остальных точках уровень сигнала, соответствующий нормальным последовательностям, в несколько раз сильнее сигнала, соответствующего мутированным последовательностям. Данный факт показывает, что заявленный биочип позволяет установить наличие мутации Q188R в гене GALT с высокой специфичностью (в гомозиготном состоянии). При этом не возникает ложноположительных сигналов, соответствующих другим мутациям.According to the information given in tables 9 and 10 and in figures 20 and 21, the level of fluorescence signals at the points corresponding to the Q188R mutation in the GALT gene is several tens of times stronger than at the points corresponding to sequences that do not contain replacement data. This fact suggests that the mutation is in a homozygous state. At all other points, the signal level corresponding to normal sequences is several times stronger than the signal corresponding to mutated sequences. This fact shows that the claimed biochip allows us to establish the presence of a Q188R mutation in the GALT gene with high specificity (in the homozygous state). In this case, false positive signals corresponding to other mutations do not occur.

6.5. В результате гибридизации продуктов ПЦР-реакции, полученных с использованием геномной ДНК пациента, несущего мутацию Q188R в гетерозиготном состоянии, был получен результат, приведенный на фигуре 22 и таблице 11.6.5. As a result of hybridization of the PCR reaction products obtained using the genomic DNA of a patient carrying the Q188R mutation in the heterozygous state, the result is shown in figure 22 and table 11.

Согласно сведениям, приведенным в таблице 11 и на фигуре 22, уровень сигналов флюоресценции в точках, соответствующих мутации Q188R в гене GALT, такой же, как и в точках, соответствующих последовательностям, не содержащим данные замены. Данный факт говорит о том, что мутация находится в гетерозиготном состоянии. Во всех остальных точках уровень сигнала, соответствующий нормальным последовательностям, в несколько раз сильнее сигнала, соответствующего мутированным последовательностям. Таким образом, биочип позволяет установить наличие мутации Q188R в гене GALT с высокой специфичностью (в гетерозиготном состоянии). При этом не возникает ложноположительных сигналов, соответствующих другим мутациям.According to the information given in table 11 and figure 22, the level of fluorescence signals at the points corresponding to the Q188R mutation in the GALT gene is the same as at points corresponding to sequences that do not contain replacement data. This fact suggests that the mutation is in a heterozygous state. At all other points, the signal level corresponding to normal sequences is several times stronger than the signal corresponding to mutated sequences. Thus, the biochip allows us to establish the presence of the Q188R mutation in the GALT gene with high specificity (in the heterozygous state). In this case, false positive signals corresponding to other mutations do not occur.

6.6. В результате гибридизации продуктов ПЦР-реакции, полученных с использованием геномной ДНК пациента, несущего мутации K285N в гетерозиготном состоянии, был получен результат, приведенный на фигурах 23 и 24 и таблицах 12 и 13.6.6. As a result of hybridization of the PCR reaction products obtained using the genomic DNA of a patient carrying the K285N mutation in the heterozygous state, the result is shown in figures 23 and 24 and tables 12 and 13.

Согласно сведениям, приведенным на фигурах 23 и 24 и таблицах 12 и 13, уровень сигналов флюоресценции в точках, соответствующих мутации K285N в гене GALT, такой же, как и в точках, соответствующих последовательностям, не содержащим данные замены. Данный факт говорит о том, что мутация находится в гетерозиготном состоянии. Во всех остальных точках уровень сигнала, соответствующий нормальным последовательностям, в несколько раз сильнее сигнала, соответствующего мутированным последовательностям. Данный факт показывает, что заявленный биочип позволяет установить наличие мутаций K285N в гене GALT с высокой специфичностью (даже в гетерозиготном состоянии). При этом не возникает ложноположительных сигналов, соответствующих другим мутациям.According to the information given in figures 23 and 24 and tables 12 and 13, the level of fluorescence signals at the points corresponding to the K285N mutation in the GALT gene is the same as at points corresponding to sequences that do not contain replacement data. This fact suggests that the mutation is in a heterozygous state. At all other points, the signal level corresponding to normal sequences is several times stronger than the signal corresponding to mutated sequences. This fact shows that the claimed biochip allows us to establish the presence of K285N mutations in the GALT gene with high specificity (even in the heterozygous state). In this case, false positive signals corresponding to other mutations do not occur.

6.7. В результате гибридизации продуктов ПЦР-реакции, полученных с использованием геномной ДНК пациента, несущего мутацию K285N в гомозиготном состоянии, был получен результат, приведенный на фигуре 25 и таблице 14.6.7. As a result of hybridization of the PCR reaction products obtained using the genomic DNA of a patient carrying the K285N mutation in the homozygous state, the result is shown in figure 25 and table 14.

Согласно сведениям, приведенным в таблице 14 и на фигуре 25, уровень сигналов флюоресценции в точках, соответствующих мутации K285N в гене GALT, в несколько раз сильнее, чем в точках, соответствующих последовательностям, не содержащим данные замены. Данный факт говорит о том, что мутация находится в гомозиготном состоянии. Во всех остальных точках уровень сигнала, соответствующий нормальным последовательностям, в несколько раз сильнее сигнала, соответствующего мутированным последовательностям. Данный факт показывает, что заявленный биочип позволяет установить наличие мутации K285N в гене GALT с высокой специфичностью (в гомозиготном состоянии). При этом не возникает ложноположительных сигналов, соответствующих другим мутациям.According to the information given in table 14 and figure 25, the level of fluorescence signals at the points corresponding to the K285N mutation in the GALT gene is several times stronger than at the points corresponding to sequences that do not contain replacement data. This fact suggests that the mutation is in a homozygous state. At all other points, the signal level corresponding to normal sequences is several times stronger than the signal corresponding to mutated sequences. This fact shows that the claimed biochip allows us to establish the presence of the K285N mutation in the GALT gene with high specificity (in the homozygous state). In this case, false positive signals corresponding to other mutations do not occur.

6.8. В результате гибридизации продуктов ПЦР-реакции, полученных с использованием геномной ДНК пациента, несущего мутации IVS4-27 g->c и N314D в гетерозиготном состоянии, был получен результат, приведенный на фигуре 26 и таблице 15.6.8. As a result of hybridization of the PCR reaction products obtained using the genomic DNA of a patient carrying mutations IVS4-27 g-> c and N314D in the heterozygous state, the result is shown in figure 26 and table 15.

Согласно сведениям, приведенным в таблице 15 и на фигуре 26, уровень сигналов флюоресценции в точках, соответствующих мутациям IVS4-27 g->c и N314D в гене GALT, такой же, как и в точках, соответствующих последовательностям, не содержащим данные замены. Данный факт говорит о том, что мутация находится в гетерозиготном состоянии. Во всех остальных точках уровень сигнала, соответствующий нормальным последовательностям, в несколько раз сильнее сигнала, соответствующего мутированным последовательностям. Таким образом, биочип позволяет установить наличие мутаций IVS4-27 g->c и N314D в гене GALT с высокой специфичностью (в гетерозиготном состоянии). При этом не возникает ложноположительных сигналов, соответствующих другим мутациям.According to the information given in table 15 and figure 26, the level of fluorescence signals at points corresponding to mutations IVS4-27 g-> c and N314D in the GALT gene is the same as at points corresponding to sequences that do not contain replacement data. This fact suggests that the mutation is in a heterozygous state. At all other points, the signal level corresponding to normal sequences is several times stronger than the signal corresponding to mutated sequences. Thus, the biochip allows us to establish the presence of mutations IVS4-27 g-> c and N314D in the GALT gene with high specificity (in the heterozygous state). In this case, false positive signals corresponding to other mutations do not occur.

6.9. В результате гибридизации продуктов ПЦР-реакции, полученных с использованием геномной ДНК пациента, несущего полиморфизм IVS4-27 g->c в и мутацию N314D в гомозиготном состоянии, был получен результат, приведенный на фигуре 27 и таблице 16.6.9. As a result of hybridization of the PCR reaction products obtained using the genomic DNA of a patient carrying the IVS4-27 g-> c in polymorphism and the N314D mutation in the homozygous state, the result is shown in figure 27 and table 16.

Согласно сведениям, приведенным в таблице 16 и на фигуре 27, уровень сигналов флюоресценции в точках, соответствующих мутации N314D и полиморфизму IVS4-27 g->c в гене GALT в несколько раз сильнее, чем в точках соответствуюших нормальной последовательности гена GALT. Данный факт говорит о том, что полиморфизм IVS4-27 g->c и мутация N314D находятся в гомозиготном состоянии. Во всех остальных точках уровень сигнала, соответствующий нормальным последовательностям, в несколько раз сильнее сигнала, соответствующего мутированным последовательностям. Таким образом, биочип позволяет установить наличие полиморфизма IVS4-27 g->c и мутации N314D в гене GALT с высокой специфичностью. При этом не возникает ложноположительных сигналов, соответствующих другим мутациям.According to the information given in table 16 and figure 27, the level of fluorescence signals at the points corresponding to the N314D mutation and the IVS4-27 g-> c polymorphism in the GALT gene is several times stronger than at the points corresponding to the normal sequence of the GALT gene. This fact suggests that the IVS4-27 g-> c polymorphism and the N314D mutation are in a homozygous state. At all other points, the signal level corresponding to normal sequences is several times stronger than the signal corresponding to mutated sequences. Thus, the biochip allows us to establish the presence of the IVS4-27 g-> c polymorphism and the N314D mutation in the GALT gene with high specificity. In this case, false positive signals corresponding to other mutations do not occur.

6.10. В результате гибридизации продуктов ПЦР-реакции, полученных с использованием геномной ДНК пациента, несущего мутации M142K в гетерозиготном состоянии, был получен результат, приведенный на фигуре 28 и таблице 17.6.10. As a result of hybridization of the PCR reaction products obtained using the genomic DNA of a patient carrying the heterozygous M142K mutation, the result is shown in figure 28 and table 17.

Согласно сведениям, приведенным в таблице 17 и на фигуре 28, уровень сигналов флюоресценции в точках, соответствующих мутации M142K в гене GALT, такой же, как и в точках, соответствующих последовательностям, не содержащим данные замены. Данный факт говорит о том, что мутация находится в гетерозиготном состоянии. Во всех остальных точках уровень сигнала, соответствующий нормальным последовательностям, в несколько раз сильнее сигнала, соответствующего мутированным последовательностям. Таким образом, биочип позволяет установить наличие мутаций M142K в гене GALT с высокой специфичностью (в гетерозиготном состоянии). При этом не возникает ложноположительных сигналов, соответствующих другим мутациям.According to the information given in table 17 and figure 28, the level of fluorescence signals at points corresponding to the M142K mutation in the GALT gene is the same as at points corresponding to sequences that do not contain replacement data. This fact suggests that the mutation is in a heterozygous state. At all other points, the signal level corresponding to normal sequences is several times stronger than the signal corresponding to mutated sequences. Thus, the biochip allows us to establish the presence of M142K mutations in the GALT gene with high specificity (in the heterozygous state). In this case, false positive signals corresponding to other mutations do not occur.

6.11. В результате гибридизации продуктов ПЦР-реакции, полученных с использованием геномной ДНК пациента, несущего мутацию M142K в гомозиготном состоянии, был получен результат, приведенный на фигуре 29 и таблице 18.6.11. As a result of hybridization of the PCR reaction products obtained using the genomic DNA of a patient carrying the mutation M142K in the homozygous state, the result is shown in figure 29 and table 18.

Согласно сведениям, приведенным в таблице 18 и на фигуре 29, уровень сигналов флюоресценции в точках, соответствующих мутации M142K в гене GALT, в несколько десятков раз сильнее, чем в точках, соответствующих последовательностям, не содержащим данные замены. Данный факт говорит о том, что мутация находится в гомозиготном состоянии. Во всех остальных точках уровень сигнала, соответствующий нормальным последовательностям, в несколько раз сильнее сигнала, соответствующего мутированным последовательностям. Данный факт показывает, что заявленный биочип позволяет установить наличие мутации M142K в гене GALT с высокой специфичностью (в гомозиготном состоянии). При этом не возникает ложноположительных сигналов, соответствующих другим мутациям.According to the information given in table 18 and figure 29, the level of fluorescence signals at the points corresponding to the M142K mutation in the GALT gene is several tens of times stronger than at the points corresponding to sequences that do not contain replacement data. This fact suggests that the mutation is in a homozygous state. At all other points, the signal level corresponding to normal sequences is several times stronger than the signal corresponding to mutated sequences. This fact shows that the claimed biochip allows us to establish the presence of the M142K mutation in the GALT gene with high specificity (in the homozygous state). In this case, false positive signals corresponding to other mutations do not occur.

6.12. В результате гибридизации продуктов ПЦР-реакции, полученных с использованием геномной ДНК пациента, несущего мутацию L358P в гетерозиготном состоянии, был получен результат, приведенный на фигуре 30 и таблице 19.6.12. As a result of hybridization of the PCR reaction products obtained using the genomic DNA of a patient carrying a heterozygous L358P mutation, the result is shown in FIG. 30 and Table 19.

Согласно сведениям, приведенным в таблице 19 и на фигуре 30, уровень сигналов флюоресценции в точках, соответствующих мутации L358P в гене GALT, такой же, как и в точках, соответствующих последовательностям, не содержащим данные замены. Данный факт говорит о том, что мутация находится в гетерозиготном состоянии. Во всех остальных точках уровень сигнала, соответствующий нормальным последовательностям, в несколько раз сильнее сигнала, соответствующего мутированным последовательностям. Таким образом, биочип позволяет установить наличие мутаций L358P в гене GALT с высокой специфичностью (даже в гетерозиготном состоянии). При этом не возникает ложноположительных сигналов, соответствующих другим мутациям.According to the information given in table 19 and figure 30, the level of fluorescence signals at points corresponding to the L358P mutation in the GALT gene is the same as at points corresponding to sequences that do not contain replacement data. This fact suggests that the mutation is in a heterozygous state. At all other points, the signal level corresponding to normal sequences is several times stronger than the signal corresponding to mutated sequences. Thus, the biochip allows us to establish the presence of L358P mutations in the GALT gene with high specificity (even in the heterozygous state). In this case, false positive signals corresponding to other mutations do not occur.

Поскольку в распоряжении авторов не было пациентов, несущищих мутации F95, R333, E352, то зонды для детекции специфичности биочипа по изобретению были синтезированны искусственно (соответствовали мутированным последовательностям гена GALT).Since the authors did not have at their disposal patients carrying mutations F95, R333, E352, the probes for detecting the specificity of the biochip according to the invention were synthesized artificially (they corresponded to mutated GALT gene sequences).

6.13. В результате гибридизации искусственных зондов, содержащих мутацию F95L и нормальную последовательность гена, c биочипом-2 был получен результат, представленный на фигуре 31 и таблице 20.6.13. As a result of hybridization of artificial probes containing the F95L mutation and the normal gene sequence, with biochip-2, the result is shown in figure 31 and table 20.

Таблица 20Table 20 Значения нормированных сигналов флюоресценции (Jm) для точек биочипа. Расположение значений в таблице соответствует расположению олигонуктеотидов столбца F95 на фигуре 2Values of normalized fluorescence signals (Jm) for biochip points. The location of the values in the table corresponds to the location of the oligonucleotides of column F95 in figure 2 F95F95 нормаnorm 0,810.81 нормаnorm 0,890.89 мутацияmutation 1,421.42 мутацияmutation 1,651.65

Согласно сведениям, приведенным в таблице 20 и на фигуре 31, уровень сигналов флюоресценции в точках, соответствующих мутации F95L в гене GALT, такой же, как и в точках, соответствующих последовательностям, не содержащим данные замены. Со всеми остальными точками биочипа-2 искусственный зонд не взаимодействовал. Таким образом, приведенные данные показывают, что заявленный биочип позволяет установить наличие мутации F95L в гене GALT с высокой специфичностью. При этом не возникает ложноположительных сигналов, соответствующих другим мутациям.According to the information given in table 20 and figure 31, the level of fluorescence signals at points corresponding to the F95L mutation in the GALT gene is the same as at points corresponding to sequences that do not contain replacement data. The artificial probe did not interact with all other points of the biochip-2. Thus, the above data show that the claimed biochip allows us to establish the presence of the F95L mutation in the GALT gene with high specificity. In this case, false positive signals corresponding to other mutations do not occur.

6.14. В результате гибридизации искусственных зондов, содержащих мутации R333W/R333Q/R333G и нормальную последовательность гена GALT, c биочипом-2 был получен результат, представленный на фигуре 32 и таблице 21.6.14. As a result of hybridization of artificial probes containing R333W / R333Q / R333G mutations and the normal GALT gene sequence with biochip-2, the result is shown in Figure 32 and Table 21.

Таблица 21Table 21 Значения нормированных сигналов флюоресценции (Jm) для точек биочипа, соответствующих R333. Расположение значений в таблице соответствует расположению олигонуктеотидов столбцов R333-1 и R333-2 на фигуре 2Values of normalized fluorescence signals (Jm) for biochip points corresponding to R333. The location of the values in the table corresponds to the location of the oligonucleotides of columns R333-1 and R333-2 in figure 2 R333-1R333-1 R333-2R333-2 нормаnorm 0,530.53 0,140.14 нормаnorm 0,620.62 0,150.15 мутацияmutation 0,980.98 1,511.51 мутацияmutation 1,021,02 1,371.37 мутацияmutation 0,410.41 1,061.06 мутацияmutation 0,370.37 0,980.98

Согласно сведениям, приведенным в таблице 21 и на фигуре 32, уровень сигналов флюоресценции в точках, соответствующих мутациям R333W/R333Q/R333G в гене GALT, такой же, как и в точках, соответствующих последовательностям, не содержащим данные замены. Со всеми остальными точками биочипа-2 искусственный зонд не взаимодействовал. Также наиболее предпочтительными для создания биочипа по изобретению были выбраны последовательноть Seq ID NO: 26, соответствующая немутированному гену, и последовательность Seq ID NO: 10, соответствующая мутации R333W. Таким образом, приведенные данные показывают, что заявленный биочип позволяет установить наличие мутации R333W в гене GALT с высокой специфичностью. При этом не возникает ложноположительных сигналов, соответствующих другим мутациям.According to the information given in table 21 and figure 32, the level of fluorescence signals at points corresponding to mutations R333W / R333Q / R333G in the GALT gene is the same as at points corresponding to sequences that do not contain replacement data. The artificial probe did not interact with all other points of the biochip-2. Also the most preferred sequence for creating a biochip according to the invention was Seq ID NO: 26, corresponding to the un mutated gene, and Seq ID NO: 10, corresponding to R333W mutation. Thus, the above data show that the claimed biochip allows us to establish the presence of the R333W mutation in the GALT gene with high specificity. In this case, false positive signals corresponding to other mutations do not occur.

6.15. В результате гибридизации искусственных зондов, содержащих мутацию E352Q c биочипом-2 был получен результат, представленный на фигуре 33 и таблице 22.6.15. As a result of hybridization of artificial probes containing the E352Q mutation with biochip-2, the result is shown in Figure 33 and Table 22.

Таблица 22Table 22 Значения нормированных сигналов флюоресценции (Jm) для точек биочипа, соответствующих E352. Расположение значений в таблице соответствует расположению олигонуктеотидов столбца E352 на фигуре 2Values of normalized fluorescence signals (Jm) for biochip points corresponding to E352. The location of the values in the table corresponds to the location of the oligonucleotides of column E352 in figure 2 E352E352 нормаnorm 0,060.06 нормаnorm 0,070,07 мутацияmutation 1,421.42 мутацияmutation 1,951.95

Согласно сведениям, приведенным в таблице 23 и на фигуре 33, уровень сигналов флюоресценции в точках, соответствующих мутации E352Q в гене GALT, в несколько десятков раз сильнее, чем в точках, соответствующих последовательностям, не содержащих мутации. Со всеми остальными точками биочипа-2 искусственный зонд не взаимодействовал. Таким образом, приведенные данные показывают, что заявленный биочип позволяет установить наличие мутации E352Q в гене GALT с высокой специфичностью. При этом не возникает ложноположительных сигналов, соответствующих другим мутациям.According to the information given in table 23 and figure 33, the level of fluorescence signals at points corresponding to the E352Q mutation in the GALT gene is several tens of times stronger than at points corresponding to sequences that do not contain mutations. The artificial probe did not interact with all other points of the biochip-2. Thus, the data show that the claimed biochip allows us to establish the presence of the E352Q mutation in the GALT gene with high specificity. In this case, false positive signals corresponding to other mutations do not occur.

6.16. В результате гибридизации продуктов ПЦР-реакции, полученных с использованием геномной ДНК пациента, несущего мутацию Q188R в гомозиготном состоянии, был получен результат, приведенный на фигуре 34 и таблице 23.6.16. As a result of hybridization of the PCR reaction products obtained using the genomic DNA of a patient carrying the Q188R mutation in the homozygous state, the result is shown in figure 34 and table 23.

Согласно сведениям, приведенным в таблице 23 и на фигуре 33, уровень сигналов флюоресценции в точках, соответствующих мутации Q188R в гене GALT, в несколько десятков раз сильнее, чем в точках, соответствующих последовательностям, не содержащим данные замены. Данный факт говорит о том, что мутация находится в гомозиготном состоянии. Во всех остальных точках уровень сигнала, соответствующий нормальным последовательностям, в несколько раз сильнее сигнала, соответствующего мутированным последовательностям. Данный факт показывает, что заявленный биочип позволяет установить наличие мутации Q188R в гене GALT с высокой специфичностью. При этом не возникает ложноположительных сигналов, соответствующих другим мутациям.According to the information given in table 23 and figure 33, the level of fluorescence signals at the points corresponding to the Q188R mutation in the GALT gene is several tens of times stronger than at the points corresponding to sequences that do not contain replacement data. This fact suggests that the mutation is in a homozygous state. At all other points, the signal level corresponding to normal sequences is several times stronger than the signal corresponding to mutated sequences. This fact shows that the claimed biochip allows us to establish the presence of a Q188R mutation in the GALT gene with high specificity. In this case, false positive signals corresponding to other mutations do not occur.

Исходя из всего изложенного выше можно сделать вывод, что биочип по изобретению позволяет:Based on the foregoing, we can conclude that the biochip according to the invention allows:

1. детектировать точечные мутации в гене GALT с высокой специфичностью и надежностью, достаточной для постановки клинического диагноза при заболевании галактаземии 1 типа;1. detect point mutations in the GALT gene with high specificity and reliability sufficient for clinical diagnosis of type 1 galactasemia disease;

2. установить, находится ли мутация, вызывающая заболевание в гомо- или гетерозиготном состоянии. Данная информация является существенной при подборе лечения заболевания.2. establish whether the mutation causing the disease is in a homo- or heterozygous state. This information is essential in the selection of treatment for the disease.

Таким образом, все приведенные сведения убедительно показывают, что биочип по изобретению соответствует условию патентоспособности «промышленная применимость».Thus, all the above information convincingly shows that the biochip according to the invention meets the condition of patentability "industrial applicability".

Claims

1. A biochip for detecting point mutations in the GALT gene that cause human type 1 galactosemia, and containing the sequences Seq ID NO: 1, Seq ID NO: 2, Seq ID NO: 3, Seq ID NO: 4, Seq ID NO: 5, Seq ID NO: 6, Seq ID NO: 7, Seq ID NO: 8, Seq ID NO: 10, Seq ID NO: 10, Seq ID NO: 12, Seq ID NO: 13, Seq ID NO: 14, Seq ID NO: 15, Seq ID NO: 16, Seq ID NO: 18, Seq ID NO: 19, Seq ID NO: 20, Seq ID NO: 21, Seq ID NO: 22, Seq ID NO: 23, Seq ID NO: 24, Seq ID NO: 25, Seq ID NO: 26, Seq ID NO: 28, Seq ID NO: 29, Seq ID NO: 31.

2. The use of the biochip according to claim 1 for the detection of point mutations in the GALT gene that cause human type 1 galactosemia.

3. A method for detecting point mutations in the GALT gene that cause human type 1 galactosemia, comprising:
1) staging a two-round multiplex PCR on the patient’s genomic DNA using primers containing the sequences Seq ID NO: 32, Seq ID NO: 33, Seq ID NO: 34, Seq ID NO: 35, Seq ID NO: 36, Seq ID NO: 36 : 37, Seq ID NO: 38, Seq ID NO: 39, Seq ID NO: 40, Seq ID NO: 41, Seq ID NO: 42, Seq ID NO: 43, Seq ID NO: 44, Seq ID NO: 45 , Seq ID NO: 46, Seq ID NO: 47, Seq ID NO: 48, Seq ID NO: 49, Seq ID NO: 50, Seq ID NO: 51, Seq ID NO: 52, Seq ID NO: 53, Seq ID NO: 54, Seq ID NO: 55, Seq ID NO: 56, Seq ID NO: 57, Seq ID NO: 58, Seq ID NO: 59,
2) hybridization of the obtained PCR products with a biochip according to claim 1,
3) analysis of the results of hybridization with the establishment of the presence of a mutation and its homozygous or heterozygous state.