RU2422431C2

RU2422431C2 - New cyclohexenone compounds of antrodia camphorata and their application

Info

Publication number: RU2422431C2
Application number: RU2009131324/04A
Authority: RU
Inventors: Шэн-Юнь ЛИУ (CN); Шэн-Юнь ЛИУ; У-Чэ ВЭНЬ (CN); У-Чэ ВЭНЬ; Вань-Лин ТСОУ (CN); Вань-Лин ТСОУ; Мао-Тень КО (CN); Мао-Тень КО; Чунь-Чоу ЧАН (CN); Чунь-Чоу ЧАН; Чунь-Хун ХУАН (CN); Чунь-Хун ХУАН; Я-Ин ЛИ (CN); Я-Ин ЛИ; Ка-Хан ФОК (CN); Ка-Хан ФОК
Original assignee: Гоулден Байотекнолоджи Корпорейшн
Priority date: 2007-01-18
Filing date: 2008-01-10
Publication date: 2011-06-27
Also published as: UA97135C2; CN101225066A; IL199882A0; CN101225066B; IL199882A; WO2008089674A1; RU2009131324A

Abstract

FIELD: medicine, pharmaceutics. ^ SUBSTANCE: present invention refers to new compounds of formula (1) in which X and Y can be oxygen or sulphur, each R1, R2 and R3 are hydrogen atom, methyl or (CH2)m-CH3, and m=1-12, n=1-12 inhibiting tumour cell growth, to a based pharmaceutical compositions (versions), and also to methods of inhibiting breast, liver and prostate cancer cell growth. The offered compounds are recovered from Antrodia camphorata. ^ EFFECT: production of the new compounds inhibiting tumour cell growth. ^ 31 cl, 7 tbl, 8 ex

Description

Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION

Настоящее изобретение относится к новому соединению, в частности к экстракту, выделенному и очищенному из Antrodia camphorata, и к его применению в подавлении роста опухоли.The present invention relates to a new compound, in particular to an extract isolated and purified from Antrodia camphorata, and to its use in suppressing tumor growth.

Уровень техникиState of the art

Antrodia camphorata (Ниу Чанг-Жи), также называемая «Чанг-Жи», «Ниу Чанг-Ку», «Ред-Чанг», «Ред Чанг-Чи», «Чанг-Ку», камфорный камерный гриб и так далее, является эндемичным видом на Тайване, растущим на внутренней гнилой сердцевине древесной стенки коричника Cinnamomum kanehirae Хей на высоте над уровнем моря от 450 м до 2000 м в горах Тайваня. Плодовое тело Antrodia camphorata растет внутри ствола дерева. Cinnamomum kanehirae Хей распространен главным образом в горных областях Тао-Юань, Нан-Тоу и внесен в перечень редких и ценных пород благодаря малой численности, и его чрезмерная вырубка является противозаконной. Таким образом, Antrodia camphorata в природе становится также редкой. Поскольку скорость роста природной Antrodia camphorata является крайне низкой, а сезон роста проходит с июня по октябрь, то цена Antrodia camphorata является очень высокой.Antrodia camphorata (Niu Chang-Ji), also called “Chang-Ji”, “Niu Chang-Ku”, “Red Chang”, “Red Chang-Chi”, “Chang-Ku”, camphor chamber mushroom and so on, is an endemic species in Taiwan that grows on the inner rotten core of the cinnamon cinnamomum kanehirae Hey wood wall at an altitude of 450 m to 2,000 m in the mountains of Taiwan. The fruit body of Antrodia camphorata grows inside a tree trunk. Cinnamomum kanehirae Hey is distributed mainly in the mountainous regions of Tao Yuan, Nan Tou and is listed as a rare and valuable species due to its small number, and its excessive felling is illegal. Thus, Antrodia camphorata in nature also becomes rare. Since the growth rate of natural Antrodia camphorata is extremely low, and the growth season runs from June to October, the price of Antrodia camphorata is very high.

Плодовые тела Antrodia camphorata являются многолетними, бесчерешковыми, пробковыми или древесными, с различными внешними формами, наподобие тарелки, колокола, копыта или башни. Они являются плоскими на поверхности дерева в начале роста. Затем края на передней границе поднимаются, заворачиваясь в форму тарелок или сталактитов. Верхние поверхности Antrodia camphorate являются блестящими, коричневого или темно-коричневого цвета, с незаметными складками, плоскими и тупыми краями. Нижние стороны являются оранжево-красными или частично желтыми с порами на всей поверхности.The fruit bodies of Antrodia camphorata are perennial, beanless, cork or woody, with various external shapes, like a plate, bell, hoof or tower. They are flat on the surface of the tree at the beginning of growth. Then the edges at the front border rise, wrapping themselves in the shape of plates or stalactites. The upper surfaces of Antrodia camphorate are shiny, brown or dark brown in color, with inconspicuous folds, flat and blunt edges. The undersides are orange-red or partially yellow with pores on the entire surface.

В дополнение, Antrodia camphorata издает сильный запах сассафраса (камфорный аромат), становится бледным желто-коричневым после высушивания на солнце, и имеет сильный горький вкус. В традиционной Тайваньской медицине Antrodia camphorata обычно применяется для детоксикации, защиты печени, в качестве противоракового средства. Antrodia camphorata, как и обычные съедобные и медицинские грибы, богата многочисленными питательными веществами, включая полисахариды (такие как р-глюкозан), тритерпеноиды, супероксид-дисмутазу (СОД), аденозин, белки (иммуноглобулины), витамины (такие как витамин В, никотиновая кислота), микроэлементы (такие как кальций, фосфор и германий и прочее), нуклеиновую кислоту, агглютинин, аминокислоты, стероиды, лигнины и стабилизаторы кровяного давления (такие как антродиевая кислота) и тому подобное. Полагают, что эти биоактивные ингредиенты проявляют благоприятные эффекты, такие как: противоопухолевый, усиление иммунитета, протвоаллергический, подавление агглютинации тромбоцитов, противовирусный, противобактериальный, антигипертензивный, снижение уровня глюкозы в крови, снижение холестерина, защита печени и тому подобное.In addition, Antrodia camphorata emits a strong sassafras smell (camphor aroma), becomes pale yellow-brown after drying in the sun, and has a strong bitter taste. In traditional Taiwanese medicine, Antrodia camphorata is usually used to detoxify, protect the liver, and as an anti-cancer agent. Antrodia camphorata, like common edible and medicinal mushrooms, is rich in many nutrients, including polysaccharides (such as p-glucosan), triterpenoids, superoxide dismutase (SOD), adenosine, proteins (immunoglobulins), vitamins (such as vitamin B, nicotinic acid), trace elements (such as calcium, phosphorus and germanium, etc.), nucleic acid, agglutinin, amino acids, steroids, lignins and blood pressure stabilizers (such as anthrodic acid) and the like. It is believed that these bioactive ingredients exhibit beneficial effects, such as: antitumor, enhanced immunity, antiallergic, suppression of platelet agglutination, antiviral, antibacterial, antihypertensive, lowering blood glucose, lowering cholesterol, protecting the liver and the like.

Тритерпеноиды являются наиболее изученным компонентом среди многочисленных композиций Antrodia camphorate. Тритерпеноиды являются общим наименованием для природных соединений, содержащих 30 атомов углерода с пентациклическими или гексациклическими структурами. Горький вкус Antrodia camphorata обусловлен компонентом из тритерпеноидов. Три новых тритерпеноидов эргостанового типа (антцин А, антцин В, антцин С) были выделены Chemg et al. из плодовых тел Antrodia camphorata (Chemg, I. H., and Chiang, H. C. 1995. Three new triterpenoids from Antrodia cinnamomea. J. Nat. Prod. 58:365-371). Три новых соединения, названных жанкуевой кислотой А, жанкуевой кислотой В и жанкуевой кислотой С, были экстрагированы из плодовых тел Antrodia camphorata этанолом Chen et al. (Chen, С.H., and Yang, S. W. 1995. New steroid acids from Antrodia cinnamomea, - a fungus parasitic on Cinnamomum micranthum. J. Nat. Prod. 58:1655-1661). В дополнение, Chemg et al. также нашли в плодовых телах Antrodia camphorata три других новых тритерпеноида, являющихся сесквитерпена лактоном и двумя соединениями, полученными из бифенила, 4,7-диметокси-5-метил-1,3-бензодиоксолом и 2,2',5,5'-тетраметокси-3,4,3',4'-би-метилендиокси-6,6'-диметилбифенилом (Chiang, H. С., Wu, D. Р., Chemg, I. W., and Ueng, С.H. 1995. А sesquiterpene lactone, phenyl and biphenyl compounds from Antrodia cinnamomea. Phytochemistry. 39:613-616). В 1996 четыре новых тритерпеноида эргостанового типа (антцины Е и F и метил антцинаты G и H) были выделены Chemg et al. с помощью тех же самых аналитических методов (Chemg, I. H., Wu, D. P., and Chiang, H. С.1996. Triteroenoids from Antrodia cinnamomea. Phytochemistry. 41:263-267). Два родственных к эргостану стероида, жанкуевые кислоты D и Е вместе с тремя ланоста-связанными тритерпенами, 15 альфа-ацетил-дегидросульфуреновой кислотой, дегидроебурикоевой кислотой и дегидросульфуреновой кислотой были выделены Yang et al. (Yang, S. W., Shen, Y. С., and Chen, С.H. 1996. Steroids and triterpenoids of Antrodia cinnamomea-a fungus parasitic on Cinnamomum micranthum. Phytochemistry. 41:1389-1392). Поиски точных активных ингредиентов с противоопухолевым эффектом все еще остаются на экспериментальной стадии, и нуждаются в разъяснении, хотя сообщалось о противоопухолевых эффектах Antrodia camphorata (таких, как в вышеупомянутых ссылках). Если будет найдена точная противоопухолевая композиция, это внесет большой вклад в благоприятные эффекты лечения рака.Triterpenoids are the most studied component among the numerous compositions of Antrodia camphorate. Triterpenoids are the common name for natural compounds containing 30 carbon atoms with pentacyclic or hexacyclic structures. The bitter taste of Antrodia camphorata is due to the triterpenoid component. Three new ergostane-type triterpenoids (Antzin A, Antzin B, Antzin C) were isolated by Chemg et al. from the fruiting bodies of Antrodia camphorata (Chemg, I. H., and Chiang, H. C. 1995. Three new triterpenoids from Antrodia cinnamomea. J. Nat. Prod. 58: 365-371). Three new compounds, called gencuic acid A, gencuic acid B and gencuic acid C, were extracted from the fruiting bodies of Antrodia camphorata with ethanol Chen et al. (Chen, C. H., and Yang, S. W. 1995. New steroid acids from Antrodia cinnamomea, - a fungus parasitic on Cinnamomum micranthum. J. Nat. Prod. 58: 1655-1661). In addition, Chemg et al. also found in the fruit bodies of Antrodia camphorata three other new triterpenoids, which are sesquiterpena lactone and two compounds derived from biphenyl, 4,7-dimethoxy-5-methyl-1,3-benzodioxole and 2,2 ', 5,5'-tetramethoxy -3,4,3 ', 4'-bi-methylenedioxy-6,6'-dimethylbiphenyl (Chiang, H. C., Wu, D. R., Chemg, IW, and Ueng, C. H. 1995. A sesquiterpene lactone, phenyl and biphenyl compounds from Antrodia cinnamomea. Phytochemistry. 39: 613-616). In 1996, four new ergostane-type triterpenoids (Antcins E and F and Methyl Antcinates G and H) were isolated by Chemg et al. using the same analytical methods (Chemg, I. H., Wu, D. P., and Chiang, H. P.1996. Triteroenoids from Antrodia cinnamomea. Phytochemistry. 41: 263-267). Two ergostane-related steroids, genuic acids D and E, together with three lanosta-linked triterpenes, 15 alpha-acetyl-dehydrosulfuric acid, dehydroburicuric acid and dehydrosulfuric acid were isolated by Yang et al. (Yang, S. W., Shen, Y. S., and Chen, C. H. 1996. Steroids and triterpenoids of Antrodia cinnamomea-a fungus parasitic on Cinnamomum micranthum. Phytochemistry. 41: 1389-1392). The search for the exact active ingredients with an antitumor effect is still at the experimental stage and needs to be clarified, although the antitumor effects of Antrodia camphorata (such as in the above links) have been reported. If an accurate antitumor composition is found, this will greatly contribute to the beneficial effects of cancer treatment.

Раскрытие изобретенияDisclosure of invention

Чтобы идентифицировать противоопухолевые соединения из экстрактов Antrodia camphorata, в данном изобретении было выделено и очищено соединение формулы (1),In order to identify antitumor compounds from extracts of Antrodia camphorata, a compound of formula (1) was isolated and purified in this invention,

в котором Х и Y могут быть кислородом или серой, R₁, R₂ и R₃ каждый являются атомом водорода, метилом или (СН₂)_m-СН₃, а m=1-12; n=1-12.in which X and Y may be oxygen or sulfur, R ₁ , R ₂ and R ₃ are each a hydrogen atom, methyl or (CH ₂ ) _m —CH ₃ , and m = 1-12; n = 1-12.

Предпочтительным соединением общей формулы (1) является 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енон, как показано в формуле (2), с молекулярной формулой С₂₄Н₃₈O₄, в виде бледно-желтого порошка, с молекулярной массой 390.A preferred compound of general formula (1) is 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methyl-5 (3,7,11-trimethyl-dodeca-2,6,10-trienyl) cyclohex-2-enone, as shown in formula (2), with a molecular formula of C ₂₄ H ₃₈ O ₄ , in the form of a pale yellow powder, with a molecular weight of 390.

Соединения со структурой формулы (1) и формулы (2) очищены путем водной экстракции или экстракции органическим растворителем Antrodia camphorata. Органические растворители включают без ограничения спирты, такие как метанол, этанол или пропанол, сложные эфиры, такие как этилацетат, алканы, такие как гексан, или алкил галоиды, такие как хлорметан, хлорэтан. Среди них предпочтительным является спирт, особо предпочтительным является этанол.Compounds with the structure of formula (1) and formula (2) are purified by aqueous extraction or extraction with an organic solvent of Antrodia camphorata. Organic solvents include, but are not limited to, alcohols such as methanol, ethanol or propanol, esters such as ethyl acetate, alkanes such as hexane, or alkyl halides such as chloromethane, chloroethane. Among them, alcohol is preferred; ethanol is particularly preferred.

Соединениями, которые можно применять в соответствии с изобретением, может быть подавлен рост опухолевых клеток, что можно далее применять для медицинской композиции для лечения рака и усиления лечебных эффектов. Соединения изобретения можно применять для ряда раковых клеток, включая рак молочной железы, рак печени и рак простаты, что приводит к замедлению роста раковых клеток, с последующим подавлением пролиферации раковых клеток и снижением риска развития опухоли. Таким образом, их можно применять в лечении рака, такого как рак молочной железы, рак печени, рак простаты и тому подобного.Compounds that can be used in accordance with the invention can inhibit the growth of tumor cells, which can be further used for a medical composition for treating cancer and enhancing therapeutic effects. The compounds of the invention can be used for a number of cancer cells, including breast cancer, liver cancer and prostate cancer, which leads to a slowdown in the growth of cancer cells, followed by suppression of the proliferation of cancer cells and a decrease in the risk of developing a tumor. Thus, they can be used in the treatment of cancer, such as breast cancer, liver cancer, prostate cancer and the like.

С другой стороны, соединения формулы (1) и/или формулы (2) в изобретении могут быть включены в медицинские композиции для лечения рака молочной железы, рака печени и рака простаты, для подавления роста опухолевых клеток. Медицинские композиции включают не только соединения формулы (1) и/или формулы (2), но также и фармацевтически пригодные носители. Носители включают без ограничения наполнители, такие как вода, уплотнители, такие как сахароза или крахмал, связующие агенты, такие как производные целлюлозы, разбавители, дезинтегранты, усилители абсорбции или подсластители. Фармацевтическая композиция настоящего изобретения может быть произведена путем смешивания соединений формулы (1) и/или (2) по крайней мере с одним из носителей с помощью обычных способов, известных в фармацевтической области техники, и может быть сформулирована без ограничения в виде порошка, таблетки, капсулы, пилюль, гранул или другой жидкой формулы.On the other hand, the compounds of formula (1) and / or formula (2) in the invention can be included in medical compositions for the treatment of breast cancer, liver cancer and prostate cancer, to inhibit the growth of tumor cells. Medical compositions include not only compounds of formula (1) and / or formula (2), but also pharmaceutically acceptable carriers. Carriers include, but are not limited to, bulking agents such as water, sealants such as sucrose or starch, binders such as cellulose derivatives, diluents, disintegrants, absorption enhancers or sweeteners. The pharmaceutical composition of the present invention can be produced by mixing the compounds of formula (1) and / or (2) with at least one of the carriers using conventional methods known in the pharmaceutical field of technology, and can be formulated without limitation in the form of a powder, tablets, capsules, pills, granules or other liquid formula.

В дополнение, поскольку соединения настоящего изобретения в то же время обладают антиоксидантной активностью, они могут быть идеальными добавками к здоровому питанию, диетам и напиткам, медицинским продуктам и косметике, и являются благоприятными для здоровья человека благодаря способностям к профилактике сердечно-сосудистых заболеваний или мутации клеток.In addition, since the compounds of the present invention at the same time have antioxidant activity, they can be ideal additives for healthy eating, diets and drinks, medical products and cosmetics, and are beneficial to human health due to their ability to prevent cardiovascular diseases or cell mutations .

Настоящее изобретение далее разъясняется в следующих примерах и иллюстрациях воплощений. Эти примеры, однако, нельзя рассматривать как ограничивающие объем изобретения, и предполагается, что специалистами в данной области техники легко могут быть сделаны модификации, находящиеся в пределах сущности изобретения и объема приложенной формулы.The present invention is further explained in the following examples and illustrations of embodiments. These examples, however, cannot be construed as limiting the scope of the invention, and it is intended that those skilled in the art can easily make modifications that are within the spirit of the invention and the scope of the appended claims.

Осуществление изобретенияThe implementation of the invention

Мицелий, плодовые тела или их смесь из Antrodia camphorata вначале экстрагировали водой или органическими растворителями до получения водного экстракта или органического экстракта Antrodia camphorata с применением способов, известных специалистам в данной области техники. Органические растворители включали без ограничения спирты, такие как метанол, этанол или пропанол, сложные эфиры, такие как этилацетат, алканы, такие как гексан, или алкил галоиды, такие как хлорметан, хлорэтан. Среди них предпочтительным является спирт, особо предпочтительным является этанол.The mycelium, fruiting bodies or a mixture thereof from Antrodia camphorata was first extracted with water or organic solvents to obtain an aqueous extract or organic extract of Antrodia camphorata using methods known to those skilled in the art. Organic solvents included, without limitation, alcohols such as methanol, ethanol or propanol, esters such as ethyl acetate, alkanes such as hexane, or alkyl halides such as chloromethane, chloroethane. Among them, alcohol is preferred; ethanol is particularly preferred.

Водные или органические экстракты из Antrodia camphorata подвергали высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) для выделения и очистки. Каждую фракцию отбирали и анализировали на противораковый эффект. В активных фракциях с противораковым эффектами анализировали состав и впоследствии исследовали активность против различных опухолевых клеток. Вышеуказанный подход привел к идентификации новых соединений формулы (1) и формулы (2), ингибирующих рост некоторых опухолевых клеток, не обнаруженных ранее в Antrodia camphorata, и о которых не сообщалось в каких-либо предыдущих публикациях.The aqueous or organic extracts from Antrodia camphorata were subjected to high performance liquid chromatography (HPLC) for isolation and purification. Each fraction was selected and analyzed for anti-cancer effect. In active fractions with anti-cancer effects, the composition was analyzed and subsequently investigated activity against various tumor cells. The above approach has led to the identification of new compounds of formula (1) and formula (2) that inhibit the growth of certain tumor cells not previously found in Antrodia camphorata, and which have not been reported in any previous publications.

Соединение 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енон формулы (2) разъясняется ниже в качестве примера настоящего изобретения. Противоопухолевые эффекты 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,б,10-триенил)-циклогекс-2-енона оценивали путем анализа с 3-(4, 5-диметилтиазол-2-ил)-2, S-дифенил тетразолия бромидом (МТТ) тестом в соответствии с моделью скрининга противоопухолевых лекарств Национального института рака (NCI) по уровню выживания клеток с применением клеточных линий, таких как клетки рака молочной железы, рака печени, рака простаты и тому подобных. Вышеуказанные тесты доказали, что 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енон снижает уровни выживания клеточных линий рака молочной железы (MCF-7 и MDA-MB-231), клеточных линий гепатоцеллюлярной карциномы (Нер 3В и Нер G2) и клеточных линий рака простаты (LNCaP и DU-145), в то же время показывая относительно низкие значения концентрации полуингибирования (IC₅₀). Рост клеток рака молочной железы, рака печени и рака простаты подавлялся 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-еноном, который таким образом можно применять для лечения рака, такого как рак молочной железы, рак печени, рак простаты и тому подобное. Подробности примеров описаны далее.The compound 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methyl-5 (3,7,11-trimethyl-dodeca-2,6,10-trienyl) cyclohex-2-enone of the formula (2) is explained below as an example of the present invention. The antitumor effects of 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methyl-5 (3,7,11-trimethyl-dodeca-2, b, 10-trienyl) cyclohex-2-enone were evaluated by analysis with 3- (4 , 5-dimethylthiazol-2-yl) -2, S-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) test in accordance with the National Cancer Institute (NCI) anticancer drug screening model for cell survival using cell lines such as breast cancer cells, liver cancer, prostate cancer and the like. The above tests proved that 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methyl-5 (3,7,11-trimethyl-dodeca-2,6,10-trienyl) -cyclohex-2-enone reduces cell line survival rates breast cancer (MCF-7 and MDA-MB-231), hepatocellular carcinoma cell lines (Hep 3B and Hep G2) and prostate cancer cell lines (LNCaP and DU-145), while at the same time showing relatively low concentration of half-inhibition ( IC ₅₀ ). The growth of breast cancer cells, liver cancer and prostate cancer was suppressed by 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methyl-5 (3,7,11-trimethyl-dodeca-2,6,10-trienyl) -cyclohex-2 -enone, which thus can be used to treat cancer, such as breast cancer, liver cancer, prostate cancer and the like. Details of the examples are described below.

Пример 1Example 1

Выделение 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енонаIsolation of 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methyl-5 (3,7,11-trimethyl-dodeca-2,6,10-trienyl) cyclohex-2-enone

100 г мицелия, плодовых тел или их смеси из Antrodia camphorata помещали в колбу. В колбу добавляли подходящее количество воды и спирта (70-100% спиртовой раствор) и перемешивали при 20-25°С в течение по крайней мере 1 часа. Раствор фильтровали через фильтр и 0,45 мкм мембрану, и собирали фильтрат в качестве экстракта.100 g of mycelium, fruiting bodies or mixtures thereof from Antrodia camphorata were placed in a flask. A suitable amount of water and alcohol (70-100% alcohol solution) was added to the flask and stirred at 20-25 ° C for at least 1 hour. The solution was filtered through a filter and a 0.45 μm membrane, and the filtrate was collected as an extract.

Фильтрат из Antrodia camphorata подвергали анализу посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Разделение проводили на колонке RP18, мобильная фаза состояла из метанола (А) и 0,1-0,5% уксусной кислоты (В), с условиями градиента 0-10 мин в 95%~20% В, 10-20 мин в 20%~10% В, 20-35 мин в 10%~10% В, 35-40 мин в 10%~95% В, при скорости потока 1 мл/мин. Поток, вытекающий из колонки, контролировали детектором в УФ/видимой области.The filtrate from Antrodia camphorata was analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC). Separation was carried out on an RP18 column, the mobile phase consisted of methanol (A) and 0.1-0.5% acetic acid (B), with gradient conditions of 0-10 min at 95% ~ 20% B, 10-20 min at 20 % ~ 10% V, 20-35 min at 10% ~ 10% V, 35-40 min at 10% ~ 95% V, at a flow rate of 1 ml / min. The column flow was monitored by a UV / visible detector.

Фракции, собранные на 25-30 мин, отбирали и концентрировали до получения 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енона, продукта в виде бледно-желтого порошка. Анализ 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11 -триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енона показал молекулярную формулу C₂₄H₃₈O₄, молекулярную массу 390, точку плавления 48°С~52°С. Исследование ЯМР спектра показало, что ¹Н-NMK(CDC1₃)δ(м.д.)=1.51, 1.67, 1.71, 1.75, 1.94, 2.03, 2.07, 2.22, 2.25, 3.68, 4.05, 5.07, и 5.14; ¹³C-NMK(CDC1₃)δ(м.д.)=12.31, 16.1, 16.12, 17.67, 25.67, 26.44, 26.74, 27.00, 39.71, 39.81, 4.027, 43.34, 59.22, 60.59, 120.97, 123.84, 124.30, 131.32, 135.35, 135.92, 138.05, 160.45, и 197.12.Fractions collected for 25-30 minutes were collected and concentrated to give 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methyl-5 (3,7,11-trimethyl-dodeca-2,6,10-trienyl) cyclohex -2-enone, a product in the form of a pale yellow powder. Analysis of 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methyl-5 (3,7,11-trimethyl-dodeca-2,6,10-trienyl) cyclohex-2-enone showed the molecular formula C ₂₄ H ₃₈ O ₄ , molecular weight 390, melting point 48 ° C ~ 52 ° C. An analysis of the NMR spectrum showed that ¹ H-NMK (CDC1 ₃ ) δ (ppm) = 1.51, 1.67, 1.71, 1.75, 1.94, 2.03, 2.07, 2.22, 2.25, 3.68, 4.05, 5.07, and 5.14; ¹³ C-NMK (CDC1 ₃ ) δ (ppm) = 12.31, 16.1, 16.12, 17.67, 25.67, 26.44, 26.74, 27.00, 39.71, 39.81, 4.027, 43.34, 59.22, 60.59, 120.97, 123.84, 124.30, 131.32, 135.35, 135.92, 138.05, 160.45, and 197.12.

Химическую структуру 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енона сравнивали с базой данных химических соединений, и не было найдено подобной структуры. Эти данные подтвердили, что 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енон является новым соединением, о котором не сообщалось ранее.The chemical structure of 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methyl-5 (3,7,11-trimethyl-dodeca-2,6,10-trienyl) cyclohex-2-enone was compared with a database of chemical compounds, and no similar structure was found. These data confirmed that 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methyl-5 (3,7,11-trimethyl-dodeca-2,6,10-trienyl) cyclohex-2-enone is a new compound, o which was not previously reported.

Пример 2Example 2

Анализ выживания in vitro для эффектов против рака молочной железыIn Vitro Survival Analysis for Effects Against Breast Cancer

Модель скрининга противораковых лекарств NCI выбрали для тестирования противоракового эффекта соединения из примера 1 изобретения. Выделенное соединение 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11 -триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енон из примера 1 добавляли в среду для культивирования клеток рака молочной железы человека, MCF-7 или MDA-MB-231, для анализа выживания опухолевых клеток. Этот анализ проводили с применением теста с 3-(4, 5-диметилтиазол-2-ил)-2, S-дифенил тетразолия бромидом (МТТ), обычно применяемого для определения клеточной пролиферации, процента жизнеспособных клеток и цитотоксичности. МТТ является желтым красителем, который абсорбируется живыми клетками и восстанавливается до багряно-синих кристаллов формазана редуктазой сукцинат-тетразолия в митохондриях. Образование формазана, таким образом, применяют для оценки и определения уровня выживания клеток.The NCI anticancer drug screening model was selected to test the anticancer effect of the compound of Example 1 of the invention. The isolated 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methyl-5 (3,7,11-trimethyl-dodeca-2,6,10-trienyl) cyclohex-2-enone compound of Example 1 was added to the culture medium human breast cancer cells, MCF-7 or MDA-MB-231, for tumor cell survival analysis. This analysis was performed using a test with 3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2, S-diphenyl tetrazolium bromide (MTT), commonly used to determine cell proliferation, percent viable cells and cytotoxicity. MTT is a yellow dye that is absorbed by living cells and is reduced to a crimson-blue crystals of formazan by succinate-tetrazolium reductase in mitochondria. Formazan formation is thus used to evaluate and determine the level of cell survival.

Клетки рака молочной железы человека MCF-7 и MDA-MB-231 культивировали по отдельности в средах, содержащих эмбриональную телячью сыворотку, в течение 24 часов. Пролиферировавшие клетки отмывали один раз ФБР, затем обрабатывали 1 × трипсин-ЭДТА и центрифугировали при 1200 об/мин в течение 5 минут. Надосадочную жидкость отбрасывали, а осадок клеток ресуспендировали в 10 мл свежей среды для культивирования при легком встряхивании. Клетки помещали в 96-луночный планшет. Этанольные экстракты Antrodia camphorata (контрольная группа, общие экстракты Antrodia camphorata без очистки) добавляли в каждую из 96 лунок со следующей концентрацией: 30, 10, 3, 1, 0.3, 0.1 и 0.03 мкг/мл, соответственно, в то время как 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енон (экспериментальная группа) добавляли в каждую из 96 лунок со следующей концентрацией: 30, 10, 3, 1, 0.3, 0.1 и 0.03 мкг/мл, соответственно. Клетки инкубировали при 37°С в 5% CO₂ инкубаторе в течение 48 часов. МТТ добавляли с концентрацией 2,5 мг/мл в каждую лунку в темноте, и инкубировали в течение 4 часов, с последующим добавлением 100 мкл литического буфера для остановки реакции. Планшеты анализировали на ИФА-ридере при длине волны 570 нм для определения уровня выживания. Значения концентрации полу-ингибирования (IC₅₀) подсчитывали и указывали в таблице 1.Human breast cancer cells MCF-7 and MDA-MB-231 were individually cultured in media containing fetal calf serum for 24 hours. Proliferated cells were washed once with PBS, then treated with 1 × trypsin-EDTA and centrifuged at 1200 rpm for 5 minutes. The supernatant was discarded, and the cell pellet was resuspended in 10 ml of fresh culture medium with gentle shaking. Cells were placed in a 96-well plate. Ethanol extracts of Antrodia camphorata (control group, total extracts of Antrodia camphorata without purification) were added to each of 96 wells with the following concentrations: 30, 10, 3, 1, 0.3, 0.1 and 0.03 μg / ml, respectively, while 4- hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methyl-5 (3,7,11-trimethyl-dodeca-2,6,10-trienyl) cyclohex-2-enone (experimental group) was added to each of 96 wells with the following concentration: 30, 10, 3, 1, 0.3, 0.1 and 0.03 μg / ml, respectively. Cells were incubated at 37 ° C in a 5% CO ₂ incubator for 48 hours. MTT was added at a concentration of 2.5 mg / ml to each well in the dark, and incubated for 4 hours, followed by the addition of 100 μl of lytic buffer to stop the reaction. The tablets were analyzed on an ELISA reader at a wavelength of 570 nm to determine the level of survival. The values of the concentration of semi-inhibition (IC ₅₀ ) were calculated and indicated in table 1.

Таблица 1Table 1 Результаты анализа выживания in vitro для подавления клеток рака молочной железыIn Vitro Survival Analysis Results for Breast Cancer Cell Suppression ОбразцыSamples IC₅₀ (мкг/мл)IC ₅₀ (μg / ml) Контрольная группа (экстракт из Antrodia группа camphorata)Control group (extract from Antrodia camphorata group) MCF-7Mcf-7 11,13211,132 MDA-MB-231MDA-MB-231 25,81225,812 Экспериментальная (формула 2)Experimental (formula 2) MCF-7Mcf-7 0,8520.852 MDA-MB-231MDA-MB-231 1,0311,031

Из результатов таблицы 1 видно, что 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енон является мощным ингибитором роста клеточной линии рака молочной железы человека. Значения IC50 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енона для MCF-7 и MDA-MB-231 составляют 0,852 мкг/мл и 1,031 мкг/мл, соответственно, что значительно ниже, чем у общих экстрактов из Antrodia camphorata. Таким образом, 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11 -триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енон из Antrodia camphorata можно применять для подавления роста клеток рака молочной железы.From the results of table 1 it can be seen that 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methyl-5 (3,7,11-trimethyl-dodeca-2,6,10-trienyl) cyclohex-2-enone is a potent inhibitor human breast cancer cell line growth. IC50 Values of 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methyl-5 (3,7,11-trimethyl-dodeca-2,6,10-trienyl) cyclohex-2-enone for MCF-7 and MDA-MB -231 are 0.852 μg / ml and 1.031 μg / ml, respectively, which is significantly lower than the total extracts from Antrodia camphorata. Thus, 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methyl-5 (3,7,11-trimethyl-dodeca-2,6,10-trienyl) cyclohex-2-enone from Antrodia camphorata can be used to suppress breast cancer cell growth.

Пример 3Example 3

Дополнительное исследование in vitro по адъювантной терапии клеток рака молочной железыAdditional in vitro adjuvant treatment of breast cancer cells

Эксперимент также проводили в соответствии с in vitro моделью скрининга противораковых лекарств NCI. Клетки рака молочной железы человека MCF-7 и MDA-МВ-231 культивировали по отдельности в средах, содержащих эмбриональную телячью сыворотку, в течение 24 часов. Пролиферировавшие клетки отмывали один раз ФБР, затем обрабатывали 1 × трипсин-ЭДТА и центрифугировали при 1200 об/мин в течение 5 минут. Надосадочную жидкость отбрасывали, а осадок клеток ресуспендировали в 10 мл свежей среды для культивирования при легком встряхивании. Клетки помещали в 96-луночный планшет после добавления 0,0017 мг/мл Таксола, и обрабатывали в течение 72 часов. 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11 - триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енон, полученный в примере 1, добавляли в каждую из 96 лунок в следующих концентрациях: 0 мкг/мл (контрольная группа); 30, 10, 3, 1, 0.3, 0.1 и 0.03 мкг/мл (экспериментальная группа), соответственно. Клетки инкубировали при 37°С в 5% СО₂ инкубаторе в течение 48 часов. МТТ добавляли с концентрацией 2,5 мг/мл в каждую лунку в темноте, и инкубировали в течение 4 часов, с последующим добавлением 100 мкл литического буфера для остановки реакции. Планшеты анализировали на ИФА-ридере при длине волны 570 нм для определения уровня выживания. Значения концентрации полу-ингибирования (IC₅₀) подсчитывали и указывали в таблице 2.The experiment was also conducted in accordance with the in vitro NCI anticancer drug screening model. Human breast cancer cells MCF-7 and MDA-MB-231 were individually cultured in media containing fetal calf serum for 24 hours. Proliferated cells were washed once with PBS, then treated with 1 × trypsin-EDTA and centrifuged at 1200 rpm for 5 minutes. The supernatant was discarded, and the cell pellet was resuspended in 10 ml of fresh culture medium with gentle shaking. Cells were placed in a 96-well plate after the addition of 0.0017 mg / ml Taxol, and processed for 72 hours. 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methyl-5 (3,7,11-trimethyl-dodeca-2,6,10-trienyl) cyclohex-2-enone obtained in Example 1 was added to each of 96 wells in the following concentrations: 0 μg / ml (control group); 30, 10, 3, 1, 0.3, 0.1 and 0.03 μg / ml (experimental group), respectively. Cells were incubated at 37 ° C in a 5% CO ₂ incubator for 48 hours. MTT was added at a concentration of 2.5 mg / ml to each well in the dark, and incubated for 4 hours, followed by the addition of 100 μl of lytic buffer to stop the reaction. The tablets were analyzed on an ELISA reader at a wavelength of 570 nm to determine the level of survival. The values of the concentration of semi-inhibition (IC ₅₀ ) were calculated and indicated in table 2.

Таблица 2table 2 Результаты дополнительной терапии Таксолом in vitro клеток рака молочной железыThe results of additional therapy with Taxol in vitro breast cancer cells ОбразцыSamples Результатыresults Контрольная группа Control group Уровень выживания клеток (%)Cell survival rate (%) MCF-7 (0,0017 мкг/мл Таксола)MCF-7 (0.0017 μg / ml Taxol) 65±165 ± 1 MDA-MB-231 (0,0017 мкг/мл Таксола)MDA-MB-231 (0.0017 mcg / ml Taxol) 76±376 ± 3 Экспериментальная группаExperimental group IC₅₀ (мкг/мл)IC ₅₀ (μg / ml) MCF-7 (0,0017 мкг/мл Таксола+формула 2)MCF-7 (0.0017 μg / ml Taxol + Formula 2) 0,0090.009 MDA-MB-231 (0,0017 мкг/мл Таксола+формула 2)MDA-MB-231 (0.0017 mcg / ml Taxol + Formula 2) 0,0110.011

Из результатов таблицы 2 видно, что значения IC₅₀ 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енона для MCF-7 и MDA-MB-231 снизились до 0,009 мкг/мл и 0,011 мкг/мл, соответственно, после добавления Таксола. Таким образом, эти результаты подтверждают ингибиторную активность 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11 -триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енона из Antrodia camphorate, который можно применять для подавления роста клеток рака молочной железы, и показывают лучшую противоопухолевую синергетическую активность при комбинации с Таксолом.From the results of table 2 it can be seen that the IC ₅₀ values of 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methyl-5 (3,7,11-trimethyl-dodeca-2,6,10-trienyl) cyclohex-2-enone for MCF-7 and MDA-MB-231 decreased to 0.009 μg / ml and 0.011 μg / ml, respectively, after addition of Taxol. Thus, these results confirm the inhibitory activity of 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methyl-5 (3,7,11-trimethyl-dodeca-2,6,10-trienyl) cyclohex-2-enone from Antrodia camphorate, which can be used to inhibit the growth of breast cancer cells, and show the best antitumor synergistic activity when combined with Taxol.

Пример 4Example 4

Анализ выживания in vitro для эффектов против рака печениIn Vitro Survival Analysis for Effects Against Liver Cancer

Модель скрининга противораковых лекарств NCI также применяли для анализа противораковых эффектов соединения, выделенного в примере 1 настоящего изобретения. Выделенное соединение 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енон из примера 1 добавляли в среду для культивирования клеток рака печени человека, Нер 3В или Нер G2, для анализа выживания опухолевых клеток.The NCI anticancer drug screening model was also used to analyze the anticancer effects of the compound isolated in Example 1 of the present invention. The isolated 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methyl-5 (3,7,11-trimethyl-dodeca-2,6,10-trienyl) cyclohex-2-enone compound from Example 1 was added to the culture medium human liver cancer cells, Hep 3B or Hep G2, for tumor cell survival analysis.

Клетки рака печени человека Нер 3В и Нер G2 культивировали по отдельности в средах, содержащих эмбриональную телячью сыворотку, в течение 24 часов. Пролиферировавшие клетки отмывали один раз ФБР, затем обрабатывали 1 × трипсин-ЭДТА и центрифугировали при 1200 об/мин в течение 5 минут.Human liver cancer cells Hep 3B and Hep G2 were individually cultured in media containing fetal calf serum for 24 hours. Proliferated cells were washed once with PBS, then treated with 1 × trypsin-EDTA and centrifuged at 1200 rpm for 5 minutes.

Надосадочную жидкость отбрасывали, а осадок клеток ресуспендировали в 10 мл свежей среды для культивирования при легком встряхивании. Клетки помещали в 96-луночный планшет. Этанольные экстракты Antrodia camphorata (контрольная группа, общие экстракты Antrodia camphorata без очистки) добавляли в каждую из 96 лунок со следующей концентрацией: 30, 10, 3, 1, 0.3, 0.1 и 0.03 мкг/мл, соответственно, в то время как 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11 -триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енон (экспериментальная группа) добавляли в каждую из 96 лунок со следующей концентрацией: 30, 10, 3, 1, 0.3, 0.1 и 0.03 мкг/мл, соответственно. Клетки инкубировали при 37°С в 5% СО₂ инкубаторе в течение 48 часов. МТТ добавляли с концентрацией 2,5 мг/мл в каждую лунку в темноте, и инкубировали в течение 4 часов, с последующим добавлением 100 мкл литического буфера для остановки реакции. Планшеты анализировали на ИФА-ридере при длине волны 570 нм для определения уровня выживания. Значения концентрации полу-ингибирования (IC₅₀) подсчитывали и указывали в таблице 3.The supernatant was discarded, and the cell pellet was resuspended in 10 ml of fresh culture medium with gentle shaking. Cells were placed in a 96-well plate. Ethanol extracts of Antrodia camphorata (control group, total extracts of Antrodia camphorata without purification) were added to each of 96 wells with the following concentrations: 30, 10, 3, 1, 0.3, 0.1 and 0.03 μg / ml, respectively, while 4- hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methyl-5 (3,7,11-trimethyl-dodeca-2,6,10-trienyl) cyclohex-2-enone (experimental group) was added to each of 96 wells with the following concentration: 30, 10, 3, 1, 0.3, 0.1 and 0.03 μg / ml, respectively. Cells were incubated at 37 ° C in a 5% CO ₂ incubator for 48 hours. MTT was added at a concentration of 2.5 mg / ml to each well in the dark, and incubated for 4 hours, followed by the addition of 100 μl of lytic buffer to stop the reaction. The tablets were analyzed on an ELISA reader at a wavelength of 570 nm to determine the level of survival. The values of the concentration of semi-inhibition (IC ₅₀ ) were calculated and indicated in table 3.

Из результатов таблицы 3 видно, что 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енон является мощным ингибитором роста клеточной линии рака печени человека. Значения IC₅₀ 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енона для Нер 3В и Нер G2 составляют 0,005 мкг/мл и 1,679 мкг/мл, соответственно, что значительно ниже, чем у общих экстрактов из Antrodia camphorata. Таким образом, 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енон из Antrodia camphorata можно применять для подавления роста клеток рака печени.From the results of table 3 it is seen that 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methyl-5 (3,7,11-trimethyl-dodeca-2,6,10-trienyl) cyclohex-2-enone is a potent inhibitor growth of the human liver cancer cell line. The IC ₅₀ values of 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methyl-5 (3,7,11-trimethyl-dodeca-2,6,10-trienyl) cyclohex-2-enone for Hep 3B and Hep G2 are 0.005 μg / ml and 1.679 μg / ml, respectively, which is significantly lower than the total extracts from Antrodia camphorata. Thus, 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methyl-5 (3,7,11-trimethyl-dodeca-2,6,10-trienyl) cyclohex-2-enone from Antrodia camphorata can be used to suppress liver cancer cell growth.

Пример 5Example 5

Дополнительное исследование in vitro по адъювантной терапии клеток рака печениAdditional in vitro adjuvant therapy for liver cancer cells

Эксперимент также проводили в соответствии с in vitro моделью скрининга противораковых лекарств NCI. Клетки рака печени человека Нер 3В и Нер G2 культивировали по отдельности в средах, содержащих эмбриональную телячью сыворотку, в течение 24 часов. Пролиферировавшие клетки отмывали один раз ФБР, затем обрабатывали 1 × трипсин-ЭДТА и центрифугировали при 1200 об/мин в течение 5 минут. Надосадочную жидкость отбрасывали, а осадок клеток ресуспендировали в 10 мл свежей среды для культивирования при легком встряхивании. Клетки Нер 3В обрабатывали 0,0043 мг/мл Ловастатина в течение 72 часов, а Нер G2 обрабатывали 0,0017 мг/мл Таксола в течение 72 часов, перед помещением в 96-луночный планшет. 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11 -триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енон, полученный в примере 1, добавляли в каждую из 96 лунок в следующих концентрациях: 0 мкг/мл (контрольная группа); 30, 10, 3, 1, 0.3, 0.1 и 0.03 мкг/мл (экспериментальная группа), соответственно. Клетки инкубировали при 37°С в 5% СО₂инкубаторе в течение 48 часов. МТТ добавляли с концентрацией 2,5 мг/мл в каждую лунку в темноте, и инкубировали в течение 4 часов, с последующим добавлением 100 мкл литического буфера для остановки реакции. Планшеты анализировали на ИФА-ридере при длине волны 570 нм для определения уровня выживания. Значения концентрации полу-ингибирования (IC₅₀) подсчитывали и указывали в таблице 4.The experiment was also conducted in accordance with the in vitro NCI anticancer drug screening model. Human liver cancer cells Hep 3B and Hep G2 were individually cultured in media containing fetal calf serum for 24 hours. Proliferated cells were washed once with PBS, then treated with 1 × trypsin-EDTA and centrifuged at 1200 rpm for 5 minutes. The supernatant was discarded, and the cell pellet was resuspended in 10 ml of fresh culture medium with gentle shaking. Hep 3B cells were treated with 0.0043 mg / ml Lovastatin for 72 hours, and Hep G2 cells were treated with 0.0017 mg / ml Taxol for 72 hours, before being placed in a 96-well plate. 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methyl-5 (3,7,11-trimethyl-dodeca-2,6,10-trienyl) cyclohex-2-enone obtained in Example 1 was added to each of 96 wells in the following concentrations: 0 μg / ml (control group); 30, 10, 3, 1, 0.3, 0.1 and 0.03 μg / ml (experimental group), respectively. Cells were incubated at 37 ° C in a 5% CO ₂ incubator for 48 hours. MTT was added at a concentration of 2.5 mg / ml to each well in the dark, and incubated for 4 hours, followed by the addition of 100 μl of lytic buffer to stop the reaction. The tablets were analyzed on an ELISA reader at a wavelength of 570 nm to determine the level of survival. The values of the concentration of semi-inhibition (IC ₅₀ ) were calculated and indicated in table 4.

Таблица 4Table 4 Результаты дополнительной терапии in vitro клеток рака печениThe results of additional in vitro therapy of liver cancer cells ОбразцыSamples Результатыresults Контрольная группа Control group Уровень выживания клеток (%) Cell survival rate (%) Нер 3В (0,0043 мкг/мл Ловастатина)Ner 3B (0.0043 mcg / ml Lovastatin) 61±361 ± 3 Нер G2 (0,0017 мкг/мл Таксола)Ner G2 (0.0017 mcg / ml Taxol) 81±281 ± 2 Экспериментальная группаExperimental group IC₅₀ (мкг/мл)IC ₅₀ (μg / ml) Нер 3В (0,0043 мкг/мл Ловастатина+формула 2)Ner 3B (0.0043 mcg / ml Lovastatin + formula 2) 0,0020.002 Нер G2 (0,0017 мкг/мл Таксола+формула 2)Ner G2 (0.0017 mcg / ml Taxol + Formula 2) 0,0080.008

Из результатов таблицы 4 видно, что значения IC₅₀ 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енона для Нер 3В и Нер G2 снизились до 0,002 мкг/мл и 0,008 мкг/мл, соответственно, после добавления синергетических активностей Ловастатина и Таксола. Таким образом, эти результаты подтверждают ингибиторную активность 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енона из Antrodia camphorata, который можно применять для подавления роста клеток рака печени, и показывают лучшую противоопухолевую синергетическую активность при комбинации с Таксолом.From the results of table 4 it is seen that the IC ₅₀ values of 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methyl-5 (3,7,11-trimethyl-dodeca-2,6,10-trienyl) cyclohex-2-enone for Hep 3B and Hep G2 decreased to 0.002 μg / ml and 0.008 μg / ml, respectively, after adding the synergistic activities of Lovastatin and Taxol. Thus, these results confirm the inhibitory activity of 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methyl-5 (3,7,11-trimethyl-dodeca-2,6,10-trienyl) cyclohex-2-enone from Antrodia camphorata, which can be used to suppress the growth of liver cancer cells, and show the best antitumor synergistic activity when combined with Taxol.

Пример 6Example 6

Анализ выживания in vitro для эффектов против рака простатыIn Vitro Survival Analysis for Effects Against Prostate Cancer

Модель скрининга противораковых лекарств NCI также применяли для анализа противораковых эффектов соединения, выделенного в примере 1 настоящего изобретения. Выделенное соединение 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-пиклогекс-2-енон из примера 1 добавляли в среду для культивирования клеток рака простаты человека, LNCaP или DU-145, для анализа выживания опухолевых клеток.The NCI anticancer drug screening model was also used to analyze the anticancer effects of the compound isolated in Example 1 of the present invention. The isolated 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methyl-5 (3,7,11-trimethyl-dodeca-2,6,10-trienyl) -pyclohex-2-enone compound from Example 1 was added to the culture medium human prostate cancer cells, LNCaP or DU-145, for analysis of tumor cell survival.

Клетки рака простаты человека LNCaP или DU-145 культивировали по отдельности в средах, содержащих эмбриональную телячью сыворотку, в течение 24 часов. Пролиферировавшие клетки отмывали один раз ФБР, затем обрабатывали 1 × трипсин-ЭДТА и центрифугировали при 1200 об/мин в течение 5 минут. Надосадочную жидкость отбрасывали, а осадок клеток ресуспендировали в 10 мл свежей среды для культивирования при легком встряхивании. Клетки помещали в 96-луночный планшет. Этанольные экстракты Antrodia camphorata (контрольная группа, общие экстракты Antrodia camphorata без очистки) или 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,б,10-триенил)-циклогекс-2-енон (экспериментальная группа) добавляли в каждую из 96 лунок со следующей концентрацией: 30, 10, 3, 1, 0.3, 0.1 и 0.03 мкг/мл, соответственно. Клетки инкубировали при 37°С в 5% CO₂ инкубаторе в течение 48 часов. МТТ добавляли с концентрацией 2,5 мг/мл в каждую лунку в темноте, и инкубировали в течение 4 часов, с последующим добавлением 100 мкл литического буфера для остановки реакции. Планшеты анализировали на ИФА-ридере при длине волны 570 нм для определения уровня выживания. Значения концентрации полу-ингибирования (IC₅₀) подсчитывали и указывали в таблице 5.Human prostate cancer cells LNCaP or DU-145 were individually cultured in media containing fetal calf serum for 24 hours. Proliferated cells were washed once with PBS, then treated with 1 × trypsin-EDTA and centrifuged at 1200 rpm for 5 minutes. The supernatant was discarded, and the cell pellet was resuspended in 10 ml of fresh culture medium with gentle shaking. Cells were placed in a 96-well plate. Ethanol extracts of Antrodia camphorata (control group, general extracts of Antrodia camphorata without purification) or 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methyl-5 (3,7,11-trimethyl-dodeca-2, b, 10-trienyl) β-cyclohex-2-enone (experimental group) was added to each of 96 wells with the following concentrations: 30, 10, 3, 1, 0.3, 0.1, and 0.03 μg / ml, respectively. Cells were incubated at 37 ° C in a 5% CO ₂ incubator for 48 hours. MTT was added at a concentration of 2.5 mg / ml to each well in the dark, and incubated for 4 hours, followed by the addition of 100 μl of lytic buffer to stop the reaction. The tablets were analyzed on an ELISA reader at a wavelength of 570 nm to determine the level of survival. The values of the concentration of semi-inhibition (IC ₅₀ ) were calculated and indicated in table 5.

Таблица 5Table 5 Результаты анализа выживания in vitro для подавления клеток рака простатыIn Vitro Survival Analysis Results for Suppression of Prostate Cancer Cells ОбразцыSamples IC₅₀ (мкг/мл)IC ₅₀ (μg / ml) Контрольная группа (экстракт из Antrodia camphorata)Control group (extract from Antrodia camphorata) LNCaPLNCaP 11,49111,491 DU-145DU-145 41,39241,392 Экспериментальная группа (формула 2)Experimental group (formula 2) LNCaPLNCaP 2,3782,378 DU-145DU-145 1,8121,812

Из результатов таблицы 5 видно, что 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енон является мощным ингибитором роста клеточной линии рака простаты человека. Значения IC₅₀ 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енона для LNCaP и DU-145 составляют 2,378 мкг/мл и 1,812 мкг/мл, соответственно, что значительно ниже, чем у общих экстрактов из Antrodia camphorata. Таким образом, 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енон из Antrodia camphorata можно применять для подавления роста клеток рака простаты.From the results of table 5 it is seen that 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methyl-5 (3,7,11-trimethyl-dodeca-2,6,10-trienyl) cyclohex-2-enone is a potent inhibitor human prostate cancer cell line growth. The IC ₅₀ values of 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methyl-5 (3,7,11-trimethyl-dodeca-2,6,10-trienyl) cyclohex-2-enone for LNCaP and DU-145 are 2.378 μg / ml and 1.812 μg / ml, respectively, which is significantly lower than the total extracts from Antrodia camphorata. Thus, 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methyl-5 (3,7,11-trimethyl-dodeca-2,6,10-trienyl) cyclohex-2-enone from Antrodia camphorata can be used to suppress prostate cancer cell growth.

Пример 7Example 7

Дополнительное исследование in vitro по адъювантной терапии клеток рака простатыAdditional in vitro adjuvant treatment of prostate cancer cells

Эксперимент также проводили в соответствии с in vitro моделью скрининга противораковых лекарств NCI. Клетки рака простаты человека LNCaP и DU-145 культивировали по отдельности в средах, содержащих эмбриональную телячью сыворотку, в течение 24 часов. Пролиферировавшие клетки отмывали один раз ФБР, затем обрабатывали 1 × трипсин-ЭДТА и центрифугировали при 1200 об/мин в течение 5 минут. Надосадочную жидкость отбрасывали, а осадок клеток ресуспендировали в 10 мл свежей среды для культивирования при легком встряхивании. Клетки LNCaP обрабатывали 0,0017 мг/мл Таксола в течение 72 часов, а DU-145 обрабатывали 0,0043 мг/мл Таксола в течение 72 часов, перед помещением в 96-луночный планшет. 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енон, полученный в примере 1, добавляли в каждую из 96 лунок в следующих концентрациях: 0 мкг/мл (контрольная группа); 30, 10, 3, 1, 0.3, 0.1 и 0.03 мкг/мл (экспериментальная группа), соответственно. Клетки инкубировали при 37°С в 5% CO₂ инкубаторе в течение 48 часов. МТТ добавляли с концентрацией 2,5 мг/мл в каждую лунку в темноте, и инкубировали в течение 4 часов, с последующим добавлением 100 мкл литического буфера для остановки реакции. Планшеты анализировали на ИФА-ридере при длине волны 570 нм для определения уровня выживания. Значения концентрации полу-ингибирования (IC₅₀) подсчитывали и указывали в таблице 6.The experiment was also conducted in accordance with the in vitro NCI anticancer drug screening model. Human prostate cancer cells LNCaP and DU-145 were individually cultured in media containing fetal calf serum for 24 hours. Proliferated cells were washed once with PBS, then treated with 1 × trypsin-EDTA and centrifuged at 1200 rpm for 5 minutes. The supernatant was discarded, and the cell pellet was resuspended in 10 ml of fresh culture medium with gentle shaking. LNCaP cells were treated with 0.0017 mg / ml Taxol for 72 hours, and DU-145 was treated with 0.0043 mg / ml Taxol for 72 hours, before being placed in a 96-well plate. 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methyl-5 (3,7,11-trimethyl-dodeca-2,6,10-trienyl) cyclohex-2-enone obtained in Example 1 was added to each of 96 wells in the following concentrations: 0 μg / ml (control group); 30, 10, 3, 1, 0.3, 0.1 and 0.03 μg / ml (experimental group), respectively. Cells were incubated at 37 ° C in a 5% CO ₂ incubator for 48 hours. MTT was added at a concentration of 2.5 mg / ml to each well in the dark, and incubated for 4 hours, followed by the addition of 100 μl of lytic buffer to stop the reaction. The tablets were analyzed on an ELISA reader at a wavelength of 570 nm to determine the level of survival. The values of the concentration of semi-inhibition (IC ₅₀ ) were calculated and indicated in table 6.

Таблица 6Table 6 Результаты дополнительной терапии Таксолом in vitro клеток рака простатыThe results of additional therapy with Taxol in vitro prostate cancer cells ОбразцыSamples Результатыresults Контрольная группа Control group Уровень выживания клеток (%)Cell survival rate (%) LNCaP (0,0017 мкг/мл Таксола)LNCaP (0.0017 mcg / ml Taxol) 56±356 ± 3 DU-145 (0,0043 мкг/мл Таксола)DU-145 (0.0043 mcg / ml Taxol) 70±270 ± 2 Экспериментальная группаExperimental group IC₅₀ (мкг/мл)IC ₅₀ (μg / ml) LNCaP 3В (0,0017 мкг/мл Ловастатина+формула 2)LNCaP 3B (0.0017 μg / ml Lovastatin + Formula 2) 0,9610.961 DU-145 (0,0043 мкг/мл Таксола+формула 2)DU-145 (0.0043 μg / ml Taxol + Formula 2) 0,5150.515

Из результатов таблицы 6 видно, что значения IC₅₀ 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енона для клеток рака простаты человека LNCaP и DU-145 снизились до 0,961 мкг/мл и 0,5158 мкг/мл, соответственно, после комбинации с Таксолом. Таким образом, эти результаты подтверждают ингибиторную активность 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енона из Antrodia camphorate, который можно применять для подавления роста клеток рака простаты, и показывают лучшую противоопухолевую синергетическую активность при комбинации с Таксолом.From the results of table 6 it can be seen that the IC ₅₀ values of 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methyl-5 (3,7,11-trimethyl-dodeca-2,6,10-trienyl) cyclohex-2-enone for human prostate cancer cells, LNCaP and DU-145 decreased to 0.961 μg / ml and 0.5158 μg / ml, respectively, after combination with Taxol. Thus, these results confirm the inhibitory activity of 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methyl-5 (3,7,11-trimethyl-dodeca-2,6,10-trienyl) cyclohex-2-enone from Antrodia camphorate, which can be used to suppress the growth of prostate cancer cells, and show the best antitumor synergistic activity when combined with Taxol.

Пример 8Example 8

Исследование антиоксидантной активности in vitroIn vitro study of antioxidant activity

Человеческий липопротеин низкой плотности (LDL), окисленный ионом медиHuman Low Density Lipoprotein (LDL) Oxidized by Copper Ion

(Cu²⁺), широко применяют для оценки антиоксидантной активности анализируемых образцов. Антиоксидантную активность образца определяют по содержанию диенов в LDL после окисления, и выражают в эквивалентах Тролокса с применением стандартной кривой, рассчитанной по водорастворимому стандарту витамина Е Тролоксу (значение 1 антиоксидантной активности соответствует 2 мкМ Тролокса).(Cu ²⁺ ) are widely used to evaluate the antioxidant activity of the analyzed samples. The antioxidant activity of the sample is determined by the content of dienes in LDL after oxidation, and expressed in Trolox equivalents using a standard curve calculated according to the water-soluble standard of vitamin E Trolox (a value of 1 antioxidant activity corresponds to 2 μM Trolox).

Вначале готовили следующие растворы: бидистиллированную воду (отрицательная контрольная группа), 5 мМ натрий-фосфатный буфер (НФБ), 1 мкМ и 2 мкМ раствор Тролокса (положительная контрольная группа), и 40 мкг/мл 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енона, выщеленного в примере 1. Концентрацию холестерина LDL (LDL-C) определяли с применением метода ферментативной реакции, готовя разведения до 0,1-0,25 мг/мл с помощью 5 мМ НФБ. Одну сотую мкл LDL добавляли в каждую лунку 96-луночного кварцевого планшета, с последующим добавлением вышеупомянутого Тролокса и соединения, выделенного в примере 1. Чтобы индуцировать окисление, добавляли стандартизированный окисляющий агент CuSO₄, до конечной концентрации 5 мкМ в каждую 250 мкл лунку. Планшет анализировали на ИФА-ридере при длине волны 232 нм при 37°С в течение 12 часов. Время отбора пробы составило 15 минут. Результаты показаны в таблице 7.Initially, the following solutions were prepared: bidistilled water (negative control group), 5 mM sodium phosphate buffer (NPS), 1 μM and 2 μM Trolox solution (positive control group), and 40 μg / ml 4-hydroxy-2,3-dimethoxy -6-methyl-5 (3,7,11-trimethyl-dodeca-2,6,10-trienyl) -cyclohex-2-enone, leached in example 1. The concentration of LDL cholesterol (LDL-C) was determined using the enzymatic method reaction, preparing dilutions to 0.1-0.25 mg / ml using 5 mM NPF. One hundredth μl of LDL was added to each well of a 96-well quartz plate, followed by the addition of the aforementioned Trolox and the compound isolated in Example 1. To induce oxidation, a standardized oxidizing agent CuSO _{4 was} added to a final concentration of 5 μM in each 250 μl of well. The tablet was analyzed on an ELISA reader at a wavelength of 232 nm at 37 ° C for 12 hours. The sampling time was 15 minutes. The results are shown in table 7.

Таблица 7Table 7 Результаты исследования антиоксидантной активности in vitroIn vitro antioxidant activity test results ОбразцыSamples Tlag (мин)Tlag (min) ΔTlag (мин)ΔTlag (min) Значения активностиActivity Values Отрицательный контрольNegative control H₂O (Tlag₀)H ₂ O (Tlag ₀ ) 185185 Положительный контрольPositive control 1 мкМ Тролокс1 μM Trolox 2 мкМ Тролокс2 μM Trolox 266266 8181 0,480.48 Экспериментальная группаExperimental group 40 мкг/мл формулы 240 μg / ml of formula 2 344344 159159 1,001.00 439439 208208 1,301.30

Замечание 1: Время лаг-фазы (Tlag, мин) определяли как пересечение лаг-фазы с фазой распространения поглощения при 234 нм. ΔTlag(мин) определяли как разницу во времени между Tlag и Tlag₀ для каждого образца.Note 1: The lag phase time (Tlag, min) was determined as the intersection of the lag phase with the absorption propagation phase at 234 nm. ΔTlag (min) was determined as the time difference between Tlag and Tlag ₀ for each sample.

Замечание 2: Считается, что соединение обладает антиоксидантной способностью, когда значение антиоксидантной активности больше 0,5.Note 2: It is believed that the compound has antioxidant ability when the value of antioxidant activity is greater than 0.5.

Из результатов таблицы 7 видно, что значение антиоксидантной активности 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11 -триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енона составляет 1,3, что гораздо больше стандартного значения 0,5. Таким образом, соединения изобретения обладают антиоксидантной активностью, что может быть использовано для здорового питания, диет и напитков, медицинских продуктов и косметики, и оказывать значительные благоприятные эффекты в отношении здоровья человека благодаря способности к профилактике сердечно-сосудистых заболеваний или мутации клеток.From the results of table 7 it is seen that the value of the antioxidant activity of 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methyl-5 (3,7,11-trimethyl-dodeca-2,6,10-trienyl) -cyclohex-2-enone is 1.3, which is much more than the standard value of 0.5. Thus, the compounds of the invention have antioxidant activity, which can be used for a healthy diet, diets and drinks, medical products and cosmetics, and have significant beneficial effects on human health due to the ability to prevent cardiovascular diseases or cell mutations.

Claims

1. The compound having the formula (1):

in which X and Y can be oxygen or sulfur, R ₁ , R ₂ and R ₃ are each a hydrogen atom, methyl or (CH ₂ ) _m —CH ₃ , and m = 1-12; n = 1-12.

2. The compound according to claim 1, in which the compound is isolated from Antrodia camphorata.

3. The compound according to claim 2, in which the compound is isolated from extracts of Antrodia camphorata obtained using organic solvents.

4. The compound according to claim 3, in which the organic solvents are selected from the group consisting of alcohols, esters, alkanes and alkyl halogens.

5. The compound according to claim 4, in which the alcohol is ethanol.

6. The compound according to claim 2, in which the compound is isolated from aqueous extracts of Antrodia camphorata.

7. The compound according to claim 1, which is 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methyl-5 (3,7,11-trimethyl-dodeca-2,6,10-trienyl) cyclohex-2-enone .

8. The compound according to claim 1 or 7, exhibiting antioxidant activity.

9. A method of inhibiting the growth of breast cancer cells, comprising the use of a compound according to claim 1 or 7.

10. The method according to claim 9, in which the compound is isolated from Antrodia camphorata.

11. The method according to claim 10, in which the compound is isolated from extracts of Antrodia camphorata obtained using organic solvents.

12. The method according to claim 11, in which the organic solvents are selected from the group consisting of alcohols, esters, alkanes and alkyl halides.

13. The method according to item 12, in which the organic solvent is ethanol.

14. The method of claim 10, wherein the compound is isolated from aqueous extracts of Antrodia camphorata.

15. The method according to claim 9, in which the breast cancer cells belong to the cell line MCF-7 or MDA-MB-231.

16. A method of inhibiting the growth of liver cancer cells, comprising the use of a compound according to claim 1 or 7.

17. The method according to clause 16, in which the compound is isolated from Antrodia camphorata.

18. The method according to 17, in which the compound is isolated from extracts of Antrodia camphorata obtained using organic solvents.

19. The method of claim 18, wherein the organic solvents are selected from the group consisting of alcohols, esters, alkanes, and alkyl halides.

20. The method according to claim 19, in which the organic solvent is ethanol.

21. The method according to 17, in which the compound is isolated from aqueous extracts of Antrodia camphorata.

22. The method according to clause 16, in which liver cancer cells belong to the cell line Hep 3 In or Hep G2.

23. A method of inhibiting the growth of prostate cancer cells, comprising using a compound according to claim 1 or 7.

24. The method of claim 23, wherein the compound is isolated from Antrodia camphorata.

25. The method according to paragraph 24, in which the compound is isolated from extracts of Antrodia camphorata obtained using organic solvents.

26. The method according A.25, in which the organic solvents are selected from the group consisting of alcohols, esters, alkanes and alkyl halogens.

27. The method according to p, in which the organic solvent is ethanol.

28. The method according to paragraph 24, in which the compound is isolated from aqueous extracts of Antrodia camphorata.

29. The method according to item 23, in which the cells of the prostate cancer belong to the cell line LNCaP or DU145.

30. A pharmaceutical composition for suppressing the growth of tumor cells, comprising an active dose of a compound according to claim 1 and a pharmaceutically acceptable carrier in which the tumor cells are selected from the group consisting of breast cancer, liver cancer and prostate cancer.

31. A pharmaceutical composition for suppressing the growth of tumor cells, comprising an active dose of a compound according to claim 7 and a pharmaceutically acceptable carrier in which the tumor cells are selected from the group consisting of breast cancer, liver cancer and prostate cancer.