RU2420587C2 - HUMANISED ANTIBODIES AND Fab BOUND WITH ANTIGEN F1 OF Yersinia pestis, AND METHOD FOR PRODUCING THEREOF WITH USING YEAST - Google Patents
HUMANISED ANTIBODIES AND Fab BOUND WITH ANTIGEN F1 OF Yersinia pestis, AND METHOD FOR PRODUCING THEREOF WITH USING YEAST Download PDFInfo
- Publication number
- RU2420587C2 RU2420587C2 RU2009124226/10A RU2009124226A RU2420587C2 RU 2420587 C2 RU2420587 C2 RU 2420587C2 RU 2009124226/10 A RU2009124226/10 A RU 2009124226/10A RU 2009124226 A RU2009124226 A RU 2009124226A RU 2420587 C2 RU2420587 C2 RU 2420587C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antigen
- fab
- antibody
- domain
- yeast
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Область техникиTechnical field
Изобретение относится к антителам, в частности к гуманизированным антителам, связывающимся с белком F1 из Yersinia pestis, способу получения указанных антител с использованием дрожжей.The invention relates to antibodies, in particular to humanized antibodies that bind to F1 protein from Yersinia pestis, a method for producing said antibodies using yeast.
Предшествующий уровень техникиState of the art
Антитела обычно состоят из двух тяжелых цепей, связанных между собой дисульфидными связями, и легких цепей, ассоциированными с N-концом каждой из тяжелых цепей. Каждая тяжелая цепь содержит на N-конце вариабельный домен с константным доменом на другом конце. Каждая легкая цепь также содержит на N-конце вариабельный домен с константным доменом. Вариабельные домены каждой пары легкой и тяжелой цепей образуют антигенсвязывающий участок. Вариабельные домены легкой и тяжелой цепей обладают похожей общей структурой, и каждый домен включает каркас из четырех участков, последовательности которых являются относительно консервативными, связанных посредством трех участков, определяющих комплементарность (complementarity determining regions, CDRs). Четыре каркасных участка формируют конформацию типа бета-складчатого слоя, а CDRs образуют петли, связывающие конструкцию из бета-складчатого слоя. Участки CDRs расположены в близком соседстве друг с другом благодаря каркасным участкам и вносят вклад в образование антигенсвязывающего участка. Участки CDRs и каркасные участки антител могут быть определены путем ссылки на нумерационную систему Кабата (Kabat numbering system, Kabat et al., (1987) "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Dept. of Health and Human Services, US Government Printing Office) в сочетании in conjunction with x-ray crystallography, as set forth in WO 91/09967.Antibodies typically consist of two heavy chains linked together by disulfide bonds, and light chains associated with the N-terminus of each of the heavy chains. Each heavy chain contains at the N-terminus a variable domain with a constant domain at the other end. Each light chain also contains at the N-terminus a variable domain with a constant domain. The variable domains of each pair of light and heavy chains form an antigen-binding site. The variable domains of light and heavy chains have a similar overall structure, and each domain includes a framework of four regions, the sequences of which are relatively conservative, linked through three regions that define complementarity (complementarity determining regions, CDRs). Four frame sections form a beta-fold type conformation, and CDRs form loops connecting the beta-fold structure. Plots of CDRs are located in close proximity to each other due to the skeleton plots and contribute to the formation of antigen-binding plot. Plots of CDRs and frame sections of antibodies can be determined by reference to the Kabat numbering system, Kabat et al., (1987) "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Dept. of Health and Human Services, US Government Printing Office ) in combination in conjunction with x-ray crystallography, as set forth in WO 91/09967.
Для получения антитела, которое может связываться с каким-либо специфическим антигеном, обычно используют методику Kohler и Milstein (Kohler et al., (1976) Nature 256:495-497). Она включает в себя главным образом иммунизацию мыши антигеном, слияние клеток селезенки из иммунизированной мыши с клетками миеломы мыши и селекцию среди полученных таким образом гибридом одной или нескольких гибридом, которые секретируют моноклональное антитело, специфическое для целевого антигена.Kohler and Milstein (Kohler et al., (1976) Nature 256: 495-497) are usually used to produce antibodies that can bind to any specific antigen. It mainly includes immunization of a mouse with an antigen, fusion of spleen cells from an immunized mouse with mouse myeloma cells, and selection among one or more hybridomas thus obtained that secrete a monoclonal antibody specific for the target antigen.
Капсульный антиген F1 является основным иммунохимическим компонентом антигена, расположенного на поверхности Y. pestis. Антиген F1 присоединен к внешней мембране микроба Y. pestis в виде олигомерного белка, образующего гранулярный слой и постепенно диффундирующего в окружающую среду. Капсульный полимер состоит из множества похожих субъединиц гидрофобного белка, агрегированных при физиологических условиях. Субъединица F1 антигена изначально синтезируется из 170 аминокислот и обладает молекулярной массой 17.6 кДа, затем, после удаления сигнального пептида в ходе секреции на поверхность, формируется белок с молекулярной массой 15.6 кДа и изоэлектрической точкой 4.1 (Karlyshev et al., FEBS Lett. 1992 Feb 3; 297(1-2):77-80).The capsule antigen F1 is the main immunochemical component of the antigen located on the surface of Y. pestis. The F1 antigen is attached to the outer membrane of the microbe Y. pestis in the form of an oligomeric protein that forms a granular layer and gradually diffuses into the environment. The capsule polymer consists of many similar hydrophobic protein subunits aggregated under physiological conditions. The F1 antigen subunit is initially synthesized from 170 amino acids and has a molecular weight of 17.6 kDa, then, after removal of the signal peptide during secretion to the surface, a protein with a molecular mass of 15.6 kDa and an isoelectric point of 4.1 is formed (Karlyshev et al., FEBS Lett. 1992 Feb 3 ; 297 (1-2): 77-80).
Для снижения неблагоприятных реакций пациентов при использовании антител в терапии указанные антитела или их части должны быть гуманизированы для того, чтобы быть менее иммуногенными, чем их мышиные прототипы. Так, авторы настоящего изобретения на основе каркасных участков антител человека сконструировали антитела, содержащие антигенсвязывающие участки, специфичные для антигена F1 из Yersinia pestis.To reduce the adverse reactions of patients when using antibodies in therapy, these antibodies or parts thereof must be humanized in order to be less immunogenic than their murine prototypes. Thus, the authors of the present invention based on the frame sections of human antibodies constructed antibodies containing antigen binding sites specific for the F1 antigen from Yersinia pestis.
Краткое описание изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION
Целью настоящего изобретения было получение реагента, в частности гуманизированного антитела или антигенсвязывающего участка (fragment antigen binding, Fab), для детекции Yersinia pestis и лечения чумы.An object of the present invention was to provide a reagent, in particular a humanized antibody or antigen binding site (fragment antigen binding, Fab), for detecting Yersinia pestis and treating plague.
Указанная цель была достигнута путем конструирования гуманизированного антитела и антигенсвязывающего участка (Fab) на основе ранее изолированного авторами настоящего изобретения мышиного антитела, обладающего способностью к связыванию антигена F1 из Yersinia pestis, и демонстрации высокой специфичности указанного антитела в связывании антигена F1 из Yersinia pestis. Также указанная цель была достигнута путем создания способа получения указанных функциональных антител с использованием клеток дрожжей.This goal was achieved by constructing a humanized antibody and antigen binding site (Fab) based on a mouse antibody previously isolated by the inventors of the present invention with the ability to bind F1 antigen from Yersinia pestis, and to demonstrate the high specificity of the indicated antibody in binding of the F1 antigen from Yersinia pestis. Also, this goal was achieved by creating a method for producing these functional antibodies using yeast cells.
Также настоящее изобретение предоставляет новое гуманизированное антитело, содержащее последовательность аминокислот SEQ ID NO:1 в качестве вариабельного участка тяжелой цепи (VH) указанного антитела, последовательность аминокислот SEQ ID NO:2 в качестве вариабельного участка легкой цепи (VL) указанного антитела и консервативные участки обеих цепей, необходимых для функционирования указанного антитела. Такое новое моноклональное мышиное антитело селективно связывается с антигеном F1 из Yersinia pestis.The present invention also provides a new humanized antibody comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 as a variable region of the heavy chain (VH) of the indicated antibody, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 as the variable region of the light chain (VL) of the indicated antibody and conserved regions of both chains necessary for the functioning of the specified antibodies. Such a new monoclonal mouse antibody selectively binds to the F1 antigen from Yersinia pestis.
Также настоящее изобретение предоставляет изолированный фрагмент ДНК, кодирующий описанное выше антитело.The present invention also provides an isolated DNA fragment encoding the antibody described above.
Также настоящее изобретение предоставляет гуманизированный антигенсвязывающий участок (Fab), который селективно связывается с антигеном F1 из Yersinia pestis и включает в себя вариабельный участок тяжелой цепи (VH) с последовательностью аминокислот SEQ ID NO:1, соединенный с доменом CH1 иммуноглобулина человека, и вариабельный участок легкой цепи (VL) с последовательностью аминокислот SEQ ID NO:2, соединенный с доменом CL иммуноглобулина человека.The present invention also provides a humanized antigen binding site (Fab) that selectively binds to the F1 antigen from Yersinia pestis and includes a heavy chain variable region (VH) with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 connected to the
Также настоящее изобретение предоставляет гуманизированный антигенсвязывающий участок (Fab), описанный выше, в котором домен CH1 является доменом CH1 иммуноглобулина человека IgG1, а домен CL является доменом CL иммуноглобулина человека каппа.The present invention also provides a humanized antigen binding site (Fab) as described above, wherein the
Также настоящее изобретение предоставляет изолированный фрагмент ДНК, кодирующий антигенсвязывающий участок (Fab), описанный выше.The present invention also provides an isolated DNA fragment encoding an antigen binding site (Fab) described above.
Также настоящее изобретение предоставляет клетку дрожжей, трансформированную фрагментом ДНК, описанным выше, и обладающую способностью к продукции указанного Fab.The present invention also provides a yeast cell transformed with the DNA fragment described above and having the ability to produce said Fab.
Также настоящее изобретение предоставляет клетку дрожжей, описанную выше, где указанной клеткой дрожжей является Pichia pastoris.The present invention also provides a yeast cell as described above, wherein said yeast cell is Pichia pastoris.
Также настоящее изобретение предоставляет способ получения Fab, описанного выше, включающий выращивание указанных дрожжей в питательной среде и выделение указанного Fab из культуральной жидкости.The present invention also provides a method for producing the Fab described above, comprising growing said yeast in a culture medium and isolating said Fab from the culture fluid.
Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings
На Фиг.1 показано конструирование и последовательность гуманизированного фрагмента VH Fab против антигена F1 из Y. pestis. Каркасные участки подчеркнуты.Figure 1 shows the construction and sequence of a humanized V H Fab fragment against the F1 antigen from Y. pestis. Frame sections are underlined.
На Фиг.2 показано конструирование и последовательность гуманизированного фрагмента VL Fab против антигена F1 из Y. pestis. Каркасные участки подчеркнуты.Figure 2 shows the construction and sequence of a humanized V L Fab fragment against the F1 antigen from Y. pestis. Frame sections are underlined.
На Фиг.3 показана последовательность гуманизированного фрагмента VH Fab против антигена F1 из Y. pestis, соединенного с доменом CH1 иммуноглобулина человека IgG1, содержащего сайты рестрикции XhoI и XbaI на концах. Каркасные участки подчеркнуты, гипервариабельные петли (CDR) выделены курсивом.Figure 3 shows the sequence of the humanized V H Fab fragment against the F1 antigen of Y. pestis, connected to the
На Фиг.4 показана последовательность гуманизированного фрагмента VL Fab против антигена F1 из Y. pestis, соединенного с доменом CL иммуноглобулина человека каппа, содержащего сайты рестрикции XhoI и XbaI на концах. Каркасные участки подчеркнуты, гипервариабельные петли (CDR) выделены курсивом.Figure 4 shows the sequence of the humanized V L Fab fragment against the F1 antigen of Y. pestis, connected to the C L domain of the human kappa immunoglobulin containing the XhoI and XbaI restriction sites at the ends. Frame sections are underlined, hypervariable loops (CDRs) in italics.
На Фиг.5 показана карта плазмид pPICZαA-F1-hybrid-H (А) и pPICZαA-F1-hybrid-L (В).Figure 5 shows a map of plasmids pPICZαA-F1-hybrid-H (A) and pPICZαA-F1-hybrid-L (B).
На Фиг.6 показана схематическая карта плазмиды pPICZαA-F1-hybrid-H-L.Figure 6 shows a schematic map of the plasmid pPICZαA-F1-hybrid-H-L.
Подробное описание настоящего изобретенияDetailed description of the present invention
Антитела, полученные против определенных белков или мимотопов, могут обладать некоторыми преимуществами, поскольку такие антитела не сильно загрязнены антителами против других соединений, что могло бы, в противном случае, повлиять на точность диагностического метода. Способы получения таких антител известны из предшествующего уровня техники и подробно описаны Harlow и др, (Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1988), и включают в себя иммунизацию животных с целью получения препаратов антител, которые выделяют из, например, плазмы или асцитной жидкости и очищают способами, известными из уровня техники, с получением препаратов, дающих реакцию с антигеном. Множество видов имеют белки с близкими последовательностями и поэтому могут возникнуть сложности в ходе использования стандартных протоколов иммунизации при получении антител, которые узнают белок только одного вида. Поэтому также стоит рассмотреть модификации стандартных методов получения антител, таких как, например, разностные (вычитательные) гибридизационные методики. Такие модификации могут быть известны специалисту в данной области техники, также они описаны в настоящем описании. В других методах антитела, которые могут быть использованы в рамках настоящего изобретения, получают с использованием рекомбинантных методов, описанных Sambrook и др. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Labs Press, 1989)).Antibodies obtained against certain proteins or mimotopes may have some advantages, since such antibodies are not heavily contaminated with antibodies against other compounds, which could otherwise affect the accuracy of the diagnostic method. Methods for producing such antibodies are known in the art and are described in detail by Harlow et al. (Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1988), and include immunizing animals to produce antibody preparations that are isolated from, for example, plasma or ascites fluid and purified by methods known in the art to obtain preparations that give a reaction with an antigen. Many species have proteins with close sequences and therefore difficulties may arise when using standard immunization protocols to produce antibodies that recognize a protein of only one species. Therefore, it is also worth considering modifications to standard methods for producing antibodies, such as, for example, difference (subtractive) hybridization techniques. Such modifications may be known to those skilled in the art, and are also described herein. In other methods, antibodies that can be used in the framework of the present invention, obtained using recombinant methods described by Sambrook and others (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Labs Press, 1989)).
Вкратце, моноклональные антитела получают путем слияния клеток селезенки из иммунизированного животного и клеток миеломы с получением гибридомы. Гибридомы могут быть проверены на способность к продукции нужного антитела, затем гибридомы могут быть выращены, из них могут быть выделены указанные антитела. Термин "выращенные клетки", использованный здесь, означает гибридомы или другие линии клеток, которые производят антитела. Методы получения и проверки таких выращенных клеток описаны Harlow и др., (см. выше). Получение материала, использующегося в качестве антигена, для инъекций животных включают в себя методики, хорошо известные из уровня техники, например, использование полноразмерного белка, использование пептида, выбранного из иммуногенных участков белка, модифицирование антигена такими способами, как, например, связывание с динитрофенолом, связывание с арсаниловой кислотой, денатурация антигена, связывание антигена с белком-переносчиком, таким как, например, keyhole limpet hemacyanin, с пептидами, содержащими участки связывания с рецепторами Т-клеток класса II, с бусинами, а также любыми другими методами, известными из уровня техники. Смотри Harlow и др. (см. выше).Briefly, monoclonal antibodies are obtained by fusion of spleen cells from an immunized animal and myeloma cells to produce a hybridoma. Hybridomas can be tested for the ability to produce the desired antibody, then hybridomas can be grown, and these antibodies can be isolated. The term "grown cells", as used here, means hybridomas or other cell lines that produce antibodies. Methods for obtaining and testing such grown cells are described by Harlow et al., (See above). The preparation of material used as an antigen for animal injections includes methods well known in the art, for example, the use of a full-sized protein, the use of a peptide selected from immunogenic regions of the protein, the modification of the antigen by methods such as, for example, binding to dinitrophenol, binding to arsanilic acid, denaturation of the antigen, binding of the antigen to a carrier protein, such as, for example, keyhole limpet hemacyanin, with peptides containing T-receptor binding sites Current Class II, with the beads, as well as any other methods known in the art. See Harlow et al. (See above).
Подходящий способ для выделения антител, эффективных для использования в рамках настоящего изобретения, включает (а) назначение животному эффективного количества белка, пептида или его мимотопа с целью получения антител, (b) выделение указанных антител, (с) определение последовательности антител и конструирование гуманизированных антител.A suitable method for isolating antibodies effective for use in the framework of the present invention includes (a) administering to the animal an effective amount of a protein, peptide or mimotope thereof to produce antibodies, (b) isolating said antibodies, (c) determining the sequence of antibodies and constructing humanized antibodies .
Ранее авторы настоящего изобретения получили моноклональное мышиное антитело, обладающее способностью эффективно связывать антиген F1 из Yersinia pestis (Y. pestis), и определили последовательность Fab указанного антитела. Такое антитело содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO:5 в качестве вариабельного участка тяжелой цепи (VH) антитела, последовательность аминокислот SEQ ID NO:6 в качестве вариабельного участка легкой цепи (VL) антитела и консервативные участки обеих цепей, необходимые для функционирования антитела. Полученное моноклональное мышиное антитело продемонстрировало высокую специфичность и эффективность связывания антигена F1 из Y. pestis.Previously, the authors of the present invention obtained a monoclonal mouse antibody having the ability to efficiently bind the F1 antigen from Yersinia pestis (Y. pestis), and determined the Fab sequence of the indicated antibodies. Such an antibody contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 as the variable region of the heavy chain (VH) of the antibody, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 as the variable region of the light chain (VL) of the antibody, and the conserved regions of both chains necessary for the functioning of the antibody. The resulting monoclonal mouse antibody showed high specificity and binding efficiency of F1 antigen from Y. pestis.
Затем авторы настоящего изобретения сконструировали каркасные участки с использованием аминокислот, которые наиболее часто встречаются в человеческих гомологах указанного мышиного антитела против антигена F1 из Y. pestis. С использованием базы данных недегенеративных последовательностей белков PubMed и программного обеспечения BlastP было найдено 100 наиболее близких человеческих гомологов для каждого каркасного участка каждой цепи антитела. На основе наиболее часто встречающихся аминокислот были составлены последовательности консенсусных каркасных участков. Окончательные последовательности гуманизированных вариабельных доменов антитела против антигена F1 из Y. pestis были составлены из последовательностей консенсусных каркасных участков и последовательностей мышиных CDR (Фиг.1 и 2). Термин "CDR" или "участок, определяющий комплементарность" относится к тем частям тяжелой и легкой цепи антитела, которые расположены в непосредственной близости друг от друга в трехмерном пространстве и формируют связывающую поверхность антитела.The authors of the present invention then constructed the skeleton regions using amino acids that are most commonly found in human homologues of said mouse anti-F1 antigen from Y. pestis. Using the PubMed database of non-degenerate protein sequences and BlastP software, the 100 closest human homologs were found for each skeleton of each antibody chain. Based on the most common amino acids, sequences of consensus framework sections were compiled. The final humanized variable domain sequences of the anti-F1 antigen from Y. pestis were composed of consensus framework regions and murine CDR sequences (FIGS. 1 and 2). The term "CDR" or "complementarity determining region" refers to those parts of the heavy and light chains of an antibody that are located in close proximity to each other in three-dimensional space and form the binding surface of the antibody.
Так было выполнено настоящее изобретение.Thus, the present invention has been completed.
В частности, антителом согласно настоящему изобретению является гуманизированное антитело, обладающее способностью к связыванию антигена F1 из Yersinia pestis (Y. pestis).In particular, the antibody of the present invention is a humanized antibody having the ability to bind F1 antigen from Yersinia pestis (Y. pestis).
Таким антителом является антитело, содержащее последовательность аминокислот SEQ ID NO:1 в качестве вариабельного участка тяжелой цепи (VH) указанного антитела, последовательность аминокислот SEQ ID NO:2 в качестве вариабельного участка легкой цепи (VL) указанного антитела и консервативные участки обеих цепей, необходимых для функционирования указанного антитела. Такое новое гуманизированное антитело селективно связывается с антигеном F1 из Yersinia pestis. Консервативные участки тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина IgG, IgM, IgA, IgD или IgE могут быть использованы в качестве консервативных участков для тяжелой цепи антитела согласно настоящему изобретению. Консервативные участки легкой цепи человеческого иммуноглобулина каппа или лямбда могут быть использованы в качестве консервативных участков для легкой цепи антитела согласно настоящему изобретению.Such an antibody is an antibody comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 as the variable region of the heavy chain (VH) of the indicated antibody, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 as the variable region of the light chain (VL) of the indicated antibody and the conserved regions of both chains required for the functioning of the specified antibodies. Such a new humanized antibody selectively binds to the F1 antigen from Yersinia pestis. Conservative sections of the heavy chain of the human immunoglobulin IgG, IgM, IgA, IgD or IgE can be used as conservative sites for the heavy chain of the antibodies of the present invention. Conservative regions of the light chain of the human immunoglobulin kappa or lambda can be used as conservative regions for the light chain of an antibody of the present invention.
Также антигенсвязывающим фрагментом (Fab) согласно настоящему изобретению является изолированный Fab, который селективно связывается с антигеном F1 из Yersinia pestis и который включает в себя вариабельный участок тяжелой цепи (VH) с последовательностью аминокислот SEQ ID NO:1, соединенный с доменом CH1 иммуноглобулина человека, и вариабельный участок легкой цепи (VL) с последовательностью аминокислот SEQ ID NO:2, соединенный с доменом CL иммуноглобулина человека. Домен CH1 тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина IgG, IgM, IgA, IgD или IgE может быть использован в качестве домена CH1 тяжелой цепи Fab согласно настоящему изобретению. Домен CL легкой цепи человеческого иммуноглобулина каппа или лямбда может быть использован в качестве домена CL легкой цепи Fab согласно настоящему изобретению. Такой Fab согласно настоящему изобретению представлен, но не ограничивается Fab, содержащим последовательности аминокислот SEQ ID NO:7 (тяжелая цепь) и SEQ ID NO:8 (легкая цепь) (Фиг.3 и 4).Also, the antigen binding fragment (Fab) of the present invention is an isolated Fab that selectively binds to the F1 antigen from Yersinia pestis and which includes the variable region of the heavy chain (VH) with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, connected to the
В настоящем изобретении термин "антитело" использован для описания иммуноглобулинов или их фрагментов, мономеров или димеров легкой цепи или тяжелой цепи, одноцепочечных антител, таких как одноцепочечные антитела Fvs, в которых вариабельные домены тяжелой и легкой цепей соединены пептидным линкером, а также как природных, так и полученных методами рекомбинантных ДНК или другим образом, при условии, что антитело содержит по крайней мере один антигенсвязывающий участок. Остальная часть антитела не должна обязательно включать только последовательность, производную от иммуноглобулина. Например, может быть сконструирован ген, в котором последовательность ДНК, кодирующая часть цепи человеческого иммуноглобулина, соединена с последовательностью ДНК, кодирующей последовательность аминокислот полпептида эффектора или молекулы-репортера.In the present invention, the term "antibody" is used to describe immunoglobulins or fragments thereof, monomers or dimers of a light chain or heavy chain, single chain antibodies, such as single chain Fvs antibodies, in which the variable domains of the heavy and light chains are connected by a peptide linker, as well as natural, and obtained by recombinant DNA methods or in another way, provided that the antibody contains at least one antigen binding site. The rest of the antibody does not need to include only the sequence derived from immunoglobulin. For example, a gene can be constructed in which a DNA sequence encoding a portion of the chain of a human immunoglobulin is connected to a DNA sequence encoding the amino acid sequence of an effector polypeptide or reporter molecule.
Термин "гуманизированное антитело" используется для описания антитела, содержащего по крайней мере один, а предпочтительно два или три, участка CDR в одном или обоих вариабельных участках, полученных из антитела из первого вида животного, это понимается как то, что он может содержать определенный выбранный каркасный участок из аминокислот, соединенный с определенной гипервариабельной последовательностью аминокислот. Оставшиеся части антитела, полученные из иммуноглобулина Ig, получают из одного или нескольких различных антител. Вариабельные домены могут быть получены с использованием техники рекомбинантных ДНК или пептидным синтезом.The term “humanized antibody” is used to describe an antibody containing at least one, and preferably two or three, sections of a CDR in one or both of the variable regions derived from an antibody from a first animal species, this is understood to mean that it may contain a particular selected amino acid skeleton linked to a specific hypervariable amino acid sequence. The remaining parts of the antibody obtained from Ig immunoglobulin are obtained from one or more different antibodies. Variable domains can be obtained using recombinant DNA techniques or peptide synthesis.
Гуманизированные антитела или их связывающие белки согласно настоящему изобретению содержат последовательности аминокислот, включающие в себя все или части CDR, полученные главным образом из моноклонального антитела, обладающего специфичностью к антигену F1 из Yersinia pestis. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения таким моноклональным антителом является мышиное по происхождению антитело. Аминокислотные последовательности каркасных участков вариабельных доменов антитела или их части являются главным образом человеческими по происхождению в наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения и следовательно "гуманизированными антителами". Эта "гуманизация" считается полезной в снижении иммуногенности указанного антитела при терапевтическом назначении пациентам. Определенные выбранные остатки в каркасных участках остаются мышиными, а не человеческими. Считается, что это необходимо для достижения нужной трехмерной структуры молекулы, и таким образом для повышения связывающей специфичности и аффинности к антигену F1 из Yersinia pestis.The humanized antibodies or their binding proteins of the present invention comprise amino acid sequences including all or parts of the CDRs obtained primarily from a monoclonal antibody that is specific for the F1 antigen from Yersinia pestis. In a most preferred embodiment, the monoclonal antibody is a murine antibody of origin. The amino acid sequences of the framework regions of the variable domains of an antibody, or parts thereof, are mainly human in origin in the most preferred embodiment of the invention, and hence are “humanized antibodies”. This "humanization" is considered useful in reducing the immunogenicity of the indicated antibodies for therapeutic use in patients. Certain selected residues in the frame regions remain murine, not human. It is believed that this is necessary to achieve the desired three-dimensional structure of the molecule, and thus to increase the binding specificity and affinity for the F1 antigen from Yersinia pestis.
Любая часть гуманизированных антител (и следовательно, в широком смысле определения термина антитела), полученная в соответствии с настоящим описанием, не выходит за рамки настоящего изобретения, при условии, что специфичность связывания и аффинность к антигену F1 из Yersinia pestis сохраняется. Таким образом, связывающие белки, полученные из указанных антител, без сомнений в рамках настоящего изобретения, как и другие фрагменты, которые способствуют проявлению из способности, по крайней мере в степени необходимой для терапевтического использования, как описано ниже.Any part of humanized antibodies (and therefore, in the broad sense of the term antibodies) defined in accordance with the present description is not beyond the scope of the present invention, provided that the binding specificity and affinity for the F1 antigen from Yersinia pestis is preserved. Thus, the binding proteins obtained from these antibodies are without doubt within the framework of the present invention, as are other fragments that contribute to the manifestation of the ability, at least to the extent necessary for therapeutic use, as described below.
В настоящем изобретении фраза "антитело или Fab, обладающий способностью к связыванию с антигеном F1 из Yersinia pestis" означает молекулу, которая связывается с антигеном F1 и образует стабильный комплекс. Стабильным комплексом является комплекс, в котором связывание между партнерами происходит на период времени, достаточный для того, чтобы произвести детектирование указанного комплекса с использованием описанных здесь методов. Термин "селективно связывает антиген F1 из Yersinia pestis" означает способность указанной молекулы предпочтительно связываться с антигеном F1 в отличие от связывания с белками, не имеющими отношения к антигену F1, или связывания с небелковыми компонентами, присутствующими в образце. Антителом или Fab, которое предпочтительно связывается с антигеном F1, является антитело или Fab, которое связывается с антигеном F1, но не связывается в существенной степени с другими молекулами или компонентами, которые могут присутствовать в образце. Существенное связывание предполагает, например, связывание антитела, связывающегося с антигеном F1, с молекулой, не являющейся антигеном F1, с аффиностью или силой, достаточной для того, чтобы помешать способности антитела, связывающегося с антигеном F1, определить уровень антигена F1 из Y. pestis в образце. Примерами таких молекул и компонентов, которые могут присутствовать в образце, являются, но не ограничиваются ими, белки, не являющиеся антигеном F1, липиды и углеводы.In the present invention, the phrase "antibody or Fab capable of binding to the F1 antigen from Yersinia pestis" means a molecule that binds to the F1 antigen and forms a stable complex. A stable complex is a complex in which binding between partners occurs for a period of time sufficient to detect the specified complex using the methods described here. The term “selectively binds F1 antigen from Yersinia pestis” means the ability of said molecule to preferably bind to the F1 antigen, as opposed to binding to proteins unrelated to the F1 antigen or binding to non-protein components present in the sample. An antibody or Fab that preferably binds to the F1 antigen is an antibody or Fab that binds to the F1 antigen but does not bind substantially to other molecules or components that may be present in the sample. Significant binding involves, for example, the binding of an antibody that binds to the F1 antigen with a molecule that is not an F1 antigen, with an affinity or strength sufficient to interfere with the ability of the antibody that binds to the F1 antigen to determine the level of F1 antigen from Y. pestis in sample. Examples of such molecules and components that may be present in a sample are, but are not limited to, non-F1 antigen proteins, lipids and carbohydrates.
Способность антитела или Fab к связыванию с антигеном может быть определена специалистом в данной области с использованием методов, включающих, но не ограничивающихся методом ELISA и равновесным диализом. Методы определения аффинности и силы связывания хорошо известны специалисту в данной области техники, подробно описаны Janeway и др. (Immunobiology: The Immune System in Health and Disease (Garland Publishing Company, 1996)).The ability of an antibody or Fab to bind to an antigen can be determined by a person skilled in the art using methods including, but not limited to, ELISA and equilibrium dialysis. Methods for determining affinity and binding strength are well known to those skilled in the art, described in detail by Janeway et al. (Immunobiology: The Immune System in Health and Disease (Garland Publishing Company, 1996)).
Fab, пригодный для осуществления настоящего изобретения, - это Fab, обладающий способностью к связыванию антигена F1 из Y. pestis, когда концентрация антигена F1 составляет от около 10 нг/мл и около 10 пг/мл. В частности, пригодные в рамках настоящего изобретения антитела связывают антиген F1 из Y. pestis, когда концентрация антигена F1 составляет 10 нг/мл, около 1 нг/мл или менее, предпочтительно 100 пг/мл. Такие антитела и Fab описаны в сопутствующих Примерах.A Fab suitable for practicing the present invention is a Fab having the ability to bind F1 antigen from Y. pestis when the concentration of F1 antigen is between about 10 ng / ml and about 10 pg / ml. In particular, antibodies useful in the framework of the present invention bind F1 antigen from Y. pestis when the concentration of F1 antigen is 10 ng / ml, about 1 ng / ml or less, preferably 100 pg / ml. Such antibodies and Fab are described in the accompanying Examples.
Изолированным фрагментом ДНК, кодирующим антитело согласно настоящему изобретению, является экспрессирующийся фрагмент ДНК, содержащий промотор, сигнальную последовательность, последовательность нуклеотидов, кодирующую структурные части тяжелой и легкой цепей антитела, участок терминации транскрипции.An isolated DNA fragment encoding an antibody of the present invention is an expressed DNA fragment containing a promoter, a signal sequence, a nucleotide sequence encoding the structural parts of the antibody heavy and light chains, and a transcription termination site.
В частности, нуклеотидные последовательности, кодирующие структурные части тяжелой и легкой цепей антитела согласно настоящему изобретению, содержат фрагмент ДНК, кодирующий вариабельный участок тяжелой цепи (VH) (SEQ ID NO:3) и вариабельный участок легкой цепи (VL) (SEQ ID NO:4), связанный с фрагментом ДНК, кодирующим консервативные участки обеих цепей, необходимые для функционирования указанного антитела. Нуклеотидные последовательности, кодирующие Fab согласно настоящему изобретению, представлены, но не ограничиваются нуклеотидными последовательностями с 31 по 693 нуклеотид в SEQ ID NO:9 (тяжелая цепь) и с 31 по 669 нуклеотид в SEQ ID NO:10 (легкая цепь) (Фиг.3 и 4). Фрагмент ДНК, кодирующий Fab согласно настоящему изобретению, может быть получен любым методом, известным специалисту в данной области техники, включая ПЦР с использованием набора перекрывающихся праймеров, синтез по технологии Slonogene™ (Sloning Biotechnology GmbH), химическим способом и т.д.In particular, the nucleotide sequences encoding the structural parts of the heavy and light chains of an antibody of the present invention comprise a DNA fragment encoding a heavy chain variable region (VH) (SEQ ID NO: 3) and a light chain variable region (VL) (SEQ ID NO: 4) associated with a DNA fragment encoding the conserved regions of both chains necessary for the functioning of the specified antibodies. The nucleotide sequences encoding the Fab of the present invention are, but are not limited to, nucleotide sequences 31 to 693 nucleotides in SEQ ID NO: 9 (heavy chain) and 31 to 669 nucleotides in SEQ ID NO: 10 (light chain) (FIG. 3 and 4). The DNA fragment encoding the Fab according to the present invention can be obtained by any method known to a person skilled in the art, including PCR using a set of overlapping primers, synthesis using Slonogene ™ technology (Sloning Biotechnology GmbH), a chemical method, etc.
Также, нуклеотидные последовательности, кодирующие Fab согласно настоящему изобретению, содержат фрагмент ДНК, кодирующий вариабельный участок тяжелой цепи (VH) (SEQ ID NO:3) и вариабельный участок легкой цепи (VL) (SEQ ID NO:4).Also, the nucleotide sequences encoding the Fab of the present invention comprise a DNA fragment encoding a heavy chain variable region (VH) (SEQ ID NO: 3) and a light chain variable region (VL) (SEQ ID NO: 4).
Ввиду вырожденности трансляционного кода могут быть различия в последовательности ДНК. Фрагменты ДНК согласно настоящему изобретению не ограничены фрагментами, показанными в SEQ ID NO:3 или 4 при условии, что они кодируют участки цепей антитела с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO:1 или 2.Due to the degeneracy of the translation code, there may be differences in the DNA sequence. The DNA fragments of the present invention are not limited to the fragments shown in SEQ ID NO: 3 or 4, provided that they encode antibody chain sections with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2.
Клетками дрожжей согласно настоящему изобретению являются клетки дрожжей, трансформированные фрагментом ДНК, описанным выше, и обладающие способностью к продукции Fab против антигена F1 из Y. pestis.The yeast cells of the present invention are yeast cells transformed with the DNA fragment described above and having the ability to produce Fab against the F1 antigen from Y. pestis.
Фраза «клетки дрожжей, трансформированные фрагментом ДНК» означает, что желаемый фрагмент ДНК был введен в клетку дрожжей с использованием методов, известных специалисту в данной области техники. Трансформация клетки дрожжей фрагментом ДНК приводит к увеличению экспрессии фрагмента ДНК, кодирующего антитело согласно настоящему изобретению. Присутствие сигнальной последовательности α-фактора приводит к секреции произведенного антитела в культуральную жидкость. Методы трансформации клеток дрожжей включают в себя все известные методы, например модифицированная версия процедуры, описанной для S. cerevisiae (Gietz and Schiestl, 1996).The phrase “yeast cells transformed with a DNA fragment” means that the desired DNA fragment has been introduced into the yeast cell using methods known to one skilled in the art. Transformation of a yeast cell with a DNA fragment leads to an increase in the expression of the DNA fragment encoding the antibody of the present invention. The presence of an α-factor signal sequence results in secretion of the produced antibody into the culture fluid. Methods for transforming yeast cells include all known methods, for example, a modified version of the procedure described for S. cerevisiae (Gietz and Schiestl, 1996).
Способом согласно настоящему изобретению является способ получения Fab против антигена F1 из Y. pestis, включающий выращивание дрожжей в питательной среде и выделение полученного Fab из культуральной жидкости.The method according to the present invention is a method for producing a Fab against F1 antigen from Y. pestis, comprising growing yeast in a nutrient medium and isolating the obtained Fab from the culture fluid.
Примером клетки дрожжей, пригодных для продукции Fab согласно настоящему изобретению, являются, но не ограничивается ими, клетки дрожжей Pichia pastoris. Фраза "дрожжи Pichia pastoris" означает, что указанные дрожжи классифицируют как Pichia pastoris (Р. pastoris) в соответствии с классификацией, известной специалисту в данной области микробиологии. Примерами дрожжей Р. pastoris, применимых в рамках настоящего изобретения, являются, но не ограничиваются ими, дрожжи Р. pastoris GS115 (Invitrogen).An example of yeast cells suitable for producing Fab according to the present invention are, but are not limited to, Pichia pastoris yeast cells. The phrase "Pichia pastoris yeast" means that said yeast is classified as Pichia pastoris (P. pastoris) in accordance with a classification known to one skilled in the art of microbiology. Examples of P. pastoris yeast useful in the framework of the present invention include, but are not limited to, P. pastoris GS115 yeast (Invitrogen).
В настоящем изобретении выращивание, накопление и очистка Fab из культуральной жидкости и других жидкостей может быть осуществлена методом, сходным с традиционными методами ферментации, когда некий белок производится с использованием микроорганизма.In the present invention, the cultivation, accumulation and purification of Fab from the culture fluid and other fluids can be carried out by a method similar to traditional fermentation methods, when a certain protein is produced using a microorganism.
Питательная среда для выращивания может быть как синтетической, так и натуральной при условии, что указанная среда содержит источник углерода, источник азота, минералы и, если это необходимо, подходящее количество питательных веществ, в которых нуждаются дрожжи для их роста. К источникам углерода относятся углеводы, такие как глюкоза и сахароза, и различные органические кислоты. В зависимости от способа ассимиляции у указанного микроорганизма может быть использован спирт, включая метанол, этанол, глицерин. В качестве источника азота могут быть использованы различные соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, источники природного азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов, расщепленные ферментированные микроорганизмы. В качестве источника минералов могут быть использованы монофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. В качестве витаминов могут быть использованы тиамин, дрожжевой экстракт и подобные им соединения.The growth medium can be either synthetic or natural, provided that the medium contains a carbon source, a nitrogen source, minerals and, if necessary, a suitable amount of the nutrients that yeast needs to grow. Carbon sources include carbohydrates such as glucose and sucrose, and various organic acids. Depending on the method of assimilation, the indicated microorganism can use alcohol, including methanol, ethanol, glycerin. Various ammonium salts, such as ammonia and ammonium sulfate, other nitrogen compounds, such as amines, natural nitrogen sources, such as peptone, soybean hydrolyzate, and digested fermented microorganisms, can be used as a nitrogen source. As a source of minerals, potassium monophosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, iron sulfate, manganese sulfate, calcium chloride and the like can be used. As vitamins, thiamine, yeast extract and the like can be used.
Выращивание предпочтительно осуществляют в аэробных условиях, таких как культивирование с перемешиванием, взбалтывание с аэрацией, при температуре от 20 до 40°С, предпочтительно от 28 до 30°С. рН среды обычно поддерживают в диапазоне от 2 до 9, предпочтительно в диапазоне от 6 до 7.5. рН среды может быть скорректирован с помощью аммиака, карбоната кальция, различных оснований и буферов. Обычно выращивание в течение от 1 до 7 дней приводит к накоплению Fab в культуральной жидкости.The cultivation is preferably carried out under aerobic conditions, such as cultivation with stirring, shaking with aeration, at a temperature of from 20 to 40 ° C, preferably from 28 to 30 ° C. The pH of the medium is usually maintained in the range from 2 to 9, preferably in the range from 6 to 7.5. The pH of the medium can be adjusted using ammonia, calcium carbonate, various bases and buffers. Typically, growing for 1 to 7 days leads to the accumulation of Fab in the culture fluid.
После выращивания твердые компоненты, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрации с использованием мембраны, а затем антитела или Fab могут быть выделены и очищены методом осаждения с солями, с использованием сульфата натрия или сульфата аммония, аффинной хроматографии, ионообменной хроматографии и т.п.After growth, solid components, such as cells, can be removed from the culture fluid by centrifugation or filtration using a membrane, and then the antibodies or Fab can be isolated and purified by salt precipitation using sodium sulfate or ammonium sulfate, affinity chromatography, ion exchange chromatography, etc.
Для терапии, применяемой к людям, необходимо использовать человеческие изотипы для того, чтобы минимизировать антиглобулинный ответ а в течение этой терапии. Последовательности ДНК человеческих константных доменов, предпочтительно в сочетании с каркасными участками вариабельных доменов могут быть получены в соответствии с хорошо известными методиками. Примером такой методики является методика CAMPATH 1H, доступная у компании Burroughs Wellcome Ltd.For therapy applied to humans, it is necessary to use human isotypes in order to minimize the antiglobulin response a during this therapy. The DNA sequences of human constant domains, preferably in combination with the frame regions of the variable domains can be obtained in accordance with well-known methods. An example of such a technique is the CAMPATH 1H technique available from Burroughs Wellcome Ltd.
Антитело, обладающее способностью к связыванию антигена F1 из Y. pestis, использованное в настоящем изобретении, может содержаться в составе медицинской рецептуры. Например, антитело может быть объединено с буфером, в котором указанное антитело растворено, и/или с неким носителем. Буферы и носители, пригодные для этого, известны специалистам в данной области техники. Примерами таких буферов являются буферы, в которых указанное антитело может функционировать, селективно связывая антиген F1, такие как, но не ограничивающиеся солевым фосфатным буфером, водой, салином, фосфатным буфером, буфером HEPES (солевой буфер N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновой кислоты), буфером TES (солевым буфером Трис-ЭДТА), буфером Трис и буфером ТАЕ (Трис-ацетат-ЭДТА). Примерами носителей являются, но не ограничены полимерными матрицами, токсоидами, сывороточными альбуминами, такие как бычий сывороточный альбумин. Носители могут быть комбинированы с антителами и конъюгированными (то есть, присоединенными) антителами так, что они несущественно влияют на способность антитела к селективному связыванию антигена F1.An antibody having the ability to bind F1 antigen from Y. pestis used in the present invention may be contained in a medical formulation. For example, an antibody may be combined with a buffer in which the antibody is dissolved and / or with a carrier. Buffers and carriers suitable for this are known to those skilled in the art. Examples of such buffers are buffers in which the antibody can function by selectively binding to F1 antigen, such as but not limited to saline phosphate buffer, water, saline, phosphate buffer, HEPES buffer (N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2 salt buffer -ethanesulfonic acid), TES buffer (Tris-EDTA saline buffer), Tris buffer and TAE buffer (Tris-acetate-EDTA). Examples of carriers are, but are not limited to, polymeric matrices, toxoids, serum albumin, such as bovine serum albumin. Carriers can be combined with antibodies and conjugated (i.e., coupled) antibodies so that they do not significantly affect the ability of the antibody to selectively bind F1 antigen.
Методы получения плазмидной ДНК, расщепления и лигирования ДНК, трансформации, подбора олигонуклеотидов в качестве праймеров и подобные методы могут быть стандартными методами, хорошо известными специалисту в данной области техники. Эти методы описаны, например в Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т., ("Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).Methods for obtaining plasmid DNA, DNA cleavage and ligation, transformation, selection of oligonucleotides as primers and similar methods can be standard methods well known to those skilled in the art. These methods are described, for example, in Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., ("Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).
Последующие примеры приведены для целей объяснения и не ограничивают каким-либо образом рамки настоящего изобретения.The following examples are provided for purposes of explanation and do not in any way limit the scope of the present invention.
Пример 1. Конструирование генов, кодирующих фрагмент Fab гуманизированного антитела против антигена F1 из Y. pestisExample 1. Construction of genes encoding a Fab fragment of a humanized antibody against F1 antigen from Y. pestis
С использованием базы данных последовательностей не дегенеративных белков PubMed с применением программного обеспечения BlastP было найдено 100 наиболее близких человеческих гомологов для каждого каркасного участка каждой цепи антитела. Консенсусные участки были составлены на основе наиболее часто встречающихся аминокислот. Окончательная последовательность гуманизированных вариабельных доменов антитела против антигена F1 из Y. pestis была составлена из консенсусных последовательностей каркасных участков и последовательностей мышиных CDR (Фиг.1 и 2, SEQ OD NO:1 и 2).Using the database of non-degenerative protein sequences PubMed using the BlastP software, the 100 closest human homologs were found for each skeleton of each antibody chain. Consensus plots were compiled based on the most common amino acids. The final sequence of the humanized variable domains of the anti-F1 antigen from Y. pestis was composed of consensus sequences of framework regions and murine CDR sequences (FIGS. 1 and 2, SEQ OD NO: 1 and 2).
Пример 2. Конструирование экспрессионной системы для получения фрагмента Fab гуманизированного антитела против антигена F1 из Y. pestis и получение указанного фрагмента Fab с использованием дрожжей.Example 2. Construction of an expression system to obtain a Fab fragment of a humanized antibody against F1 antigen from Y. pestis and obtaining the specified Fab fragment using yeast.
Фрагмент ДНК (SEQ ID NO:9), содержащий ген, кодирующий фрагмент VH Fab против антигена F1 из Y. pestis, соединенный с доменом CH1 иммуноглобулина человека IgG1, содержащий сайты рестрикции XhoI и XbaI на концах, необходимые для клонирования в экспрессионный вектор, был составлен с помощью набора перекрывающихся синтетических праймеров и клонирован в вектор pPICZalpha A (Invitrogen).DNA fragment (SEQ ID NO: 9) containing the gene encoding the V H Fab fragment against the F1 antigen of Y. pestis, connected to the
Фрагмент ДНК (SEQ ID NO:10), содержащий ген, кодирующий фрагмент VL Fab против антигена F1 из Y. pestis, соединенный с доменом CL иммуноглобулина человека каппа, содержащий сайты рестрикции XhoI и XbaI на концах, необходимые для клонирования в экспрессионный вектор, был составлен с помощью набора перекрывающихся синтетических праймеров и клонирован в вектор pPICZalpha A ΔMssI.DNA fragment (SEQ ID NO: 10) containing the gene encoding the V L Fab fragment against the F1 antigen from Y. pestis, connected to the C L domain of the human kappa immunoglobulin, containing the XhoI and XbaI restriction sites at the ends necessary for cloning into the expression vector , was compiled using a set of overlapping synthetic primers and cloned into the vector pPICZalpha A ΔMssI.
Вектор pPICZalpha A ΔMssI получали из вектора pPICZalpha A (Invitrogen) путем замены сайта рестрикции MssI (PmeI) на сайт рестрикции KspAI. Для этой цели в ходе ПЦР использовали 4 праймера (SEQ ID NO:11-14), плазмиду pPICZalpha А использовали в качестве матрицы. Полученный фрагмент ПЦР расщепляли с использованием рестриктаз SacI и Mph1103I и лигировали в вектор pPICZalpha А, предварительно обработанный теми же рестриктазами. Таким образом были получены плазмиды pPICZalpha-F1-humanized-H и pPICZalphaΔMssI-F1-humanized-L.The pPICZalpha A ΔMssI vector was obtained from the pPICZalpha A vector (Invitrogen) by replacing the MssI restriction site (PmeI) with the KspAI restriction site. For this purpose, 4 primers were used during PCR (SEQ ID NO: 11-14), plasmid pPICZalpha A was used as template. The resulting PCR fragment was digested using restriction enzymes SacI and Mph1103I and ligated into the vector pPICZalpha A pretreated with the same restriction enzymes. Thus, the plasmids pPICZalpha-F1-humanized-H and pPICZalphaΔMssI-F1-humanized-L were obtained.
Сборку обоих генов, кодирующих цепи фрагмента Fab, на одной плазмиде осуществляли лигированием фрагмента BglII-BamHI из вектора, содержащего легкую цепь, в сайт рестрикции BamHI вектора, содержащего тяжелую цепь.Both genes encoding the chains of the Fab fragment were assembled on one plasmid by ligating the BglII-BamHI fragment from a light chain vector to the BamHI restriction site of a heavy chain vector.
Так была сконструирована экспрессионная плазмида pPICZαA-F1-humanized-H-L, содержащая последовательность, кодирующую обе цепи фрагмента Fab гуманизированного антитела против антигена F1 из Y. pestis, каждый из которых был непосредственно соединен в одной рамке считывания с сигнальной последовательностью α-фактора из Saccharomyces cerevisiae под контролем промотора АОХ1.Thus, the expression plasmid pPICZαA-F1-humanized-HL was constructed, containing the sequence encoding both chains of the Fab fragment of the humanized anti-F1 antigen from Y. pestis, each of which was directly connected in the same reading frame to the α-factor signal sequence from Saccharomyces cerevisiae under the control of the promoter AOX1.
Пример 3. Получение трансформантов дрожжей и анализ продукции фрагмента FabExample 3. Obtaining yeast transformants and analysis of the production of the Fab fragment
Экспрессионную плазмиду pPICZαA-F1-humanized-H-L, линеаризованную с помощью рестриктазы PmeI, вводили в клетки GS115 в соответствии с протоколом производителя INVITROGEN с помощью методики, использующей LiCl. Трансформанты отбирали на питательной среде YPDS (Invitrogen), содержащей глюкозу и Zeocin (100 мкг/мл). Интеграция линеаризованной плазмиды в хромосому подтверждали методом ПЦР с использованием ген-специфичных праймеров (SEQ ID NO:15 и 16 для тяжелой цепи и SEQ ID NO:17 и 18 для легкой цепи) и геномной ДНК трансформантов в качестве матрицы.The expression plasmid pPICZαA-F1-humanized-H-L, linearized with the restriction enzyme PmeI, was introduced into GS115 cells according to the manufacturer's protocol INVITROGEN using a technique using LiCl. Transformants were selected on YPDS growth medium (Invitrogen) containing glucose and Zeocin (100 μg / ml). Integration of the linearized plasmid into the chromosome was confirmed by PCR using gene-specific primers (SEQ ID NO: 15 and 16 for the heavy chain and SEQ ID NO: 17 and 18 for the light chain) and genomic DNA transformants as the template.
Отобранные трансформанты переносили на питательную среду BMMY (Invitrogen), содержащую метанол, для индукции экспрессии генов, кодирующих фрагмент Fab против антигена F1 из Y. pestis. Клоны штамма GS115/pPICZαA-F1-humanized-H-L выращивали в пробирках (V=4 мл) в течение 45 часов при 30°С и рН 6.0 (конечная оптическая плотность - OD 40). Измерение количества фрагментов Fab в культуральной жидкости осуществляли методом ELISA. В соответствии с результатами анализа был выбран штамм, продуцирующий до 5 мг/л фрагмента Fab гуманизированного антитела против антигена F1 из Y. pestis.Selected transformants were transferred to BMMY medium (Invitrogen) containing methanol to induce the expression of genes encoding the Fab fragment against the F1 antigen from Y. pestis. Clones of strain GS115 / pPICZαA-F1-humanized-H-L were grown in test tubes (V = 4 ml) for 45 hours at 30 ° C and pH 6.0 (final optical density - OD 40). The number of Fab fragments in the culture fluid was measured by ELISA. In accordance with the results of the analysis, a strain was selected that produced up to 5 mg / L of the Fab fragment of the humanized anti-F1 antigen from Y. pestis.
Анализ ELISA для фрагмента Fab в культуральной жидкости:ELISA for Fab fragment in culture fluid:
- Сорбция антитела 2А11, разбавленного 1/1000 в 20 мМ Na2HPO4 (рН 7.2), 100 мкл на лунку, 2 часа при комнатной температуре. Антитела 2А11 связываются константные домены фрагмента Fab человеческого IgG1.- Sorption of antibody 2A11, diluted 1/1000 in 20 mm Na 2 HPO 4 (pH 7.2), 100 μl per well, 2 hours at room temperature. Antibodies 2A11 bind to the constant domains of the Fab fragment of human IgG1.
- Промывка лунок три раза буфером PBSt (0.1% Tween).- Rinse the wells three times with PBSt buffer (0.1% Tween).
- Блокировка 0.5% БСА в PBSt (200 мкл на лунку) в течение 30 минут.- Block 0.5% BSA in PBSt (200 μl per well) for 30 minutes.
- Добавление образцов питательной среды (СМ), 100 мкл на лунку (20 мкл CM + 80 мкл человеческого IgG1, 25 нг/мл в 0.05% БСА), 2 часа при комнатной температуре. Образцы фрагмента Fab человеческого IgG1, 20 нг/мл в 0.05% БСА, использовали в качестве стандарта.- Adding samples of the nutrient medium (CM), 100 μl per well (20 μl CM + 80 μl human IgG1, 25 ng / ml in 0.05% BSA), 2 hours at room temperature. Samples of the Fab fragment of human IgG1, 20 ng / ml in 0.05% BSA, were used as standard.
- Промывка лунок три раза буфером PBSt (0.1% Tween).- Rinse the wells three times with PBSt buffer (0.1% Tween).
- Добавление меченных пероксидазой хрена анти-Fc антител, разбавленных 1/7000 в 0.05% БСА в PBS, 100 мкл на лунку, и инкубирование 90 минут при комнатной температуре.- Addition of horseradish peroxidase-labeled anti-Fc antibodies diluted 1/7000 in 0.05% BSA in PBS, 100 μl per well, and incubated for 90 minutes at room temperature.
- Промывка лунок шесть раз буфером PBSt (0.1% Tween).- Rinse the wells six times with PBSt buffer (0.1% Tween).
- Добавление о-фенилендиамина 100 мкл (4 мг/10 мл) с H2O2 в буфере рН 5.0.- Addition of o-
- Остановка реакции добавлением 100 мкл 10% H2SO4.- Stop the reaction by adding 100 μl of 10% H 2 SO 4 .
Пример 4. Характеристика аффинности фрагмента Fab гуманизированного антитела против антигена F1 из Y. pestis, произведенного дрожжами.Example 4. Characterization of the affinity of the Fab fragment of a humanized antibody against the F1 antigen from Y. pestis produced by yeast.
Определение констант диссоциации рекомбинантных и природных фрагментов FabDetermination of the dissociation constants of recombinant and natural Fab fragments
Константы диссоциации (Kd) определяли в ходе двухступенчатого метода ELISA, как описано в Примере 3. Было установлено, что Kd для гуманизированного фрагмента Fab против антигена F1 из Y. pestis составляет 8×10-8 М.Dissociation constants (Kd) were determined using the two-step ELISA as described in Example 3. The Kd for the humanized Fab fragment against Y. pestis F1 antigen was found to be 8 × 10 -8 M.
Хотя настоящее изобретение было подробно описано со ссылкой на предпочтительные варианты его осуществления, для специалиста в данной области техники ясно, что могут быть сделаны различные замены и применены эквиваленты, которые не выходят за рамки настоящего изобретения. Все процитированные здесь документы являются частью настоящей заявки, включенные путем ссылки.Although the present invention has been described in detail with reference to preferred embodiments thereof, it will be apparent to one skilled in the art that various substitutions can be made and equivalents applied that are not outside the scope of the present invention. All documents cited here are part of this application, incorporated by reference.
Claims (8)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009124226/10A RU2420587C2 (en) | 2009-06-25 | 2009-06-25 | HUMANISED ANTIBODIES AND Fab BOUND WITH ANTIGEN F1 OF Yersinia pestis, AND METHOD FOR PRODUCING THEREOF WITH USING YEAST |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009124226/10A RU2420587C2 (en) | 2009-06-25 | 2009-06-25 | HUMANISED ANTIBODIES AND Fab BOUND WITH ANTIGEN F1 OF Yersinia pestis, AND METHOD FOR PRODUCING THEREOF WITH USING YEAST |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2009124226A RU2009124226A (en) | 2010-12-27 |
| RU2420587C2 true RU2420587C2 (en) | 2011-06-10 |
Family
ID=44055464
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2009124226/10A RU2420587C2 (en) | 2009-06-25 | 2009-06-25 | HUMANISED ANTIBODIES AND Fab BOUND WITH ANTIGEN F1 OF Yersinia pestis, AND METHOD FOR PRODUCING THEREOF WITH USING YEAST |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2420587C2 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2460788C1 (en) * | 2011-07-28 | 2012-09-10 | Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ПМБ) | Hybrid cell strain of mus musculus 13f8 animals - producer of monoclonal antibodies specific to capsular f1 antigen yersinia pestis |
| RU2478704C1 (en) * | 2011-12-20 | 2013-04-10 | Российская Федерация, от имени которой выступает Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | STRAIN OF HYBRID ANIMAL CELLS Mus musculus 2B8 - PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES SPECIFIC TO Yersinia pestis V ANTIGEN |
| WO2017079115A1 (en) * | 2015-11-03 | 2017-05-11 | Janssen Biotech, Inc. | Antibodies specifically binding tim-3 and their uses |
-
2009
- 2009-06-25 RU RU2009124226/10A patent/RU2420587C2/en active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| РЫБАЛЬСКИЙ Н.Г., СЕРОВА М.А., ИГНАТЬЕВА Г.А., СТАРЧЕУС А.П. Моноклональные антитела и гибридомы. - М.: ВАСХНИЛ, 1989. * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2460788C1 (en) * | 2011-07-28 | 2012-09-10 | Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ПМБ) | Hybrid cell strain of mus musculus 13f8 animals - producer of monoclonal antibodies specific to capsular f1 antigen yersinia pestis |
| RU2478704C1 (en) * | 2011-12-20 | 2013-04-10 | Российская Федерация, от имени которой выступает Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | STRAIN OF HYBRID ANIMAL CELLS Mus musculus 2B8 - PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES SPECIFIC TO Yersinia pestis V ANTIGEN |
| WO2017079115A1 (en) * | 2015-11-03 | 2017-05-11 | Janssen Biotech, Inc. | Antibodies specifically binding tim-3 and their uses |
| WO2017079116A3 (en) * | 2015-11-03 | 2017-07-20 | Janssen Biotech, Inc. | Antibodies specifically binding pd-1 and tim-3 and their uses |
| US10894830B2 (en) | 2015-11-03 | 2021-01-19 | Janssen Biotech, Inc. | Antibodies specifically binding PD-1, TIM-3 or PD-1 and TIM-3 and their uses |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2009124226A (en) | 2010-12-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109535254B (en) | Anti-human BDCA-2 antibody, method for producing same, polynucleotide, expression vector, host cell and pharmaceutical composition | |
| US10577418B2 (en) | Monoclonal anti-GPC-1 antibodies and uses thereof | |
| RU2420587C2 (en) | HUMANISED ANTIBODIES AND Fab BOUND WITH ANTIGEN F1 OF Yersinia pestis, AND METHOD FOR PRODUCING THEREOF WITH USING YEAST | |
| CN105368904A (en) | Preparation method and application of immunoglobulin G fragment | |
| CN103254312B (en) | Mouse monoclonal antibody and its preparation method and application thereof | |
| CN114594272A (en) | Products and methods for detecting beta-amyloid | |
| RU2420588C2 (en) | MURINE MONOCLONAL ANTIBODIES BOUND WITH ANTIGEN F1 OF Yersinia pestis, METHOD FOR PRODUCING THEREOF WITH USING YEAST, METHOD AND KIT FOR Yersinia pestis DETECTION | |
| CN116425870A (en) | Novel coronavirus N protein resistant monoclonal antibody 31A8, and product and application thereof | |
| CN114213541B (en) | Monoclonal antibody of totipotent nuclease and preparation method thereof | |
| CN114127110B (en) | anti-CGRP antibodies and uses thereof | |
| CN103214571B (en) | Murine monoclonal antibody and preparation method and application thereof | |
| CN114249828B (en) | Monoclonal antibody of DNase I and preparation method thereof | |
| CN114316053B (en) | VCE monoclonal antibody and preparation method thereof | |
| CN113004413A (en) | Monoclonal antibody of porcine IgG3, epitope peptide specifically recognized by monoclonal antibody and application of epitope peptide | |
| CN115825415B (en) | Blocker and in vitro immunodiagnostic product and use | |
| CN114249829B (en) | Monoclonal antibody of RNase inhibitor and preparation method thereof | |
| CN117417455B (en) | Antigen binding protein capable of specifically binding 25-hydroxy vitamin D3 | |
| RU2539752C2 (en) | HUMANISED ANTIBODY AND ANTIGENBINDING FRAGMENT (Fab), WHICH BINDS WITH HUMAN INTERFERON-γ, DNA FRAGMENTS CODING CLAIMED ANTIBODY AND ANTIGEN-BINDING FRAGMENT, CELL, TRANSFORMED BY DNA FRAGMENT, AND METHOD OF OBTAINING CLAIMED ANTIBODY AND ANTIGEN-BINDING FRAGMENT | |
| CN114262378B (en) | OMT monoclonal antibody and preparation method thereof | |
| WO2024067151A1 (en) | Anti-respiratory syncytial virus antibody and related use thereof | |
| CN113621059B (en) | Beta-form 2 Microglobulin detection kit and clinical application thereof | |
| RU2729391C2 (en) | Monoclonal antibody capable of neutralizing biological activity of human interferon beta 1a | |
| RU2440412C2 (en) | HUMANISED ANTIGEN-BINDING FRAGMENTS (Fab) AGAINST RABIES VIRUS, ISOLATED DNA FRAGMENT, CODING Fab AGAINST RABIES VIRUS, YEAST CELL, TRANSFORMED BY DNA FRAGMENT, AND METHOD OF OBTAINING Fab AGAINST RABIES VIRUS WITH APPLICATION OF YEASTS | |
| CN112279913B (en) | Anti-human IL-6 monoclonal antibody and application | |
| RU2623157C1 (en) | Antigen binding section (fab), including humanized fab, against botulinical neurotoxin c (versions), method to obtain fab using yeast, method and set for botulinical neurotoxin c detection |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner |