RU2420586C2 - Method of producing l-amino acid of glutamate family with using escherichia bacterium - Google Patents
Method of producing l-amino acid of glutamate family with using escherichia bacterium Download PDFInfo
- Publication number
- RU2420586C2 RU2420586C2 RU2009102012/10A RU2009102012A RU2420586C2 RU 2420586 C2 RU2420586 C2 RU 2420586C2 RU 2009102012/10 A RU2009102012/10 A RU 2009102012/10A RU 2009102012 A RU2009102012 A RU 2009102012A RU 2420586 C2 RU2420586 C2 RU 2420586C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- gene
- bacterium
- amino acid
- producing
- strain
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Область техникиTechnical field
Настоящее изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способу получения L-аминокислоты, принадлежащей к семейству глутамата, с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, модифицированной таким образом, что активность глутаминсинтетазы в указанной бактерии увеличена.The present invention relates to the microbiological industry, in particular to a method for producing an L-amino acid belonging to the glutamate family, using a bacterium of the Enterobacteriaceae family, modified in such a way that the activity of glutamine synthetase in said bacterium is increased.
Описание предшествующего уровня техникиDescription of the Related Art
Традиционно L-аминокислоты в промышленном масштабе могут быть получены методом ферментации с использованием штаммов микроорганизмов, полученных из природных источников, или их мутантов. Обычно микроорганизмы модифицируют для увеличения продукции L-аминокислот.Traditionally, L-amino acids on an industrial scale can be obtained by fermentation using strains of microorganisms obtained from natural sources, or their mutants. Typically, microorganisms are modified to increase the production of L-amino acids.
Описано множество методов увеличения продукции L-аминокислот, включая трансформацию микроорганизмов рекомбинантной ДНК (см., например, патент США 4278765). Другие методы увеличения продукции включают повышение активности ферментов, вовлеченных в биосинтез аминокислот, и/или уменьшение чувствительности целевого фермента к ингибированию по типу обратной связи продуцируемой L-аминокислотой (см., например, международную заявку WO 95/16042 или патенты США 4346170; 5661012 и 6040160).Many methods have been described to increase the production of L-amino acids, including transformation of recombinant DNA microorganisms (see, for example, US Pat. No. 4,278,765). Other methods of increasing production include increasing the activity of enzymes involved in the biosynthesis of amino acids, and / or reducing the sensitivity of the target enzyme to feedback inhibition produced by the L-amino acid (see, for example, international application WO 95/16042 or US patent 4346170; 5661012 and 6040160).
Превращение глутамата в глутамин с участием глутаминсинтетазы (GS-glutamine synthetase) приводит к образованию донора азота для первой стадии биосинтеза многих аминокислот, пуринов, пиримидинов и аминосахаров. Исследовано превращение β-глутамата в β-глутамин архебактериальной и бактериальной глутаминсинтетазами. GS Methanohalophilus portucalensis (часитично очищенная) способна катализировать амидирование этого субстрата со скоростью, в 7 раз более низкой, чем скорость, полученная для α-глутамата. Рекомбинантная GS из архебактерий Methanococcus jannaschii и Archaeoglobus fulgidus была значительно более избирательна к α-глутамату, чем к β-глутамату в качестве субстрата. Все архебактериальные ферменты были намного менее селективны, чем две бактериальных GS (из Escherichia coli и Bacillus subtilis), специфическая активность которых по отношению к β-глутамату была значительно меньше, чем по отношению к α-изомеру (Robinson P. et al., Applied and Environmental Microbiology; 67(10), 4458-63(2001)).The conversion of glutamate to glutamine with the participation of glutamine synthetase (GS-glutamine synthetase) leads to the formation of a nitrogen donor for the first stage of the biosynthesis of many amino acids, purines, pyrimidines and amino sugars. The conversion of β-glutamate to β-glutamine by archaebacterial and bacterial glutamine synthetases was studied. GS Methanohalophilus portucalensis (partially purified) is capable of catalyzing the amidation of this substrate at a rate 7 times lower than the rate obtained for α-glutamate. Recombinant GS from archaebacteria Methanococcus jannaschii and Archaeoglobus fulgidus was significantly more selective for α-glutamate than for β-glutamate as a substrate. All archaebacterial enzymes were much less selective than two bacterial GS (from Escherichia coli and Bacillus subtilis), whose specific activity with respect to β-glutamate was significantly less than with respect to the α-isomer (Robinson P. et al., Applied and Environmental Microbiology; 67 (10), 4458-63 (2001)).
Кинетику изменения интенсивности флуоресценции белка, связанной с реакциями неаденилированной глутаминсинтетазы Е.coli [L-глутамат: аммонийлигаза (АДФ-образующая), ЕС 6.3.1.2] с ее субстратами, изучали с использованием метода быстрой реакции. Было установлено, что синтез глутамина осуществляется поэтапно. В процессе катализа наблюдали два флуориметрически различимых промежуточных продукта (Rhee S.G. and Chock Р.В., Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 73(2):476-80(1976)).The kinetics of changes in the fluorescence intensity of a protein associated with the reactions of non-adenylated E. coli glutamine synthetase [L-glutamate: ammonium ligase (ADP-forming), EC 6.3.1.2] with its substrates was studied using the rapid reaction method. It was found that the synthesis of glutamine is carried out in stages. Two fluorimetrically distinguishable intermediates were observed during catalysis (Rhee S.G. and Chock R.V., Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 73 (2): 476-80 (1976)).
Разработаны два метода, позволяющие провести очень быструю очистку глутаминсинтетазы из разнообразных бактерий. Первый метод, основанный на дифференциальном осаждении, зависит от связи GS с ДНК в клеточных экстрактах. Второй метод, основанный на методе С.Gross et al. (J. Bacteriol. 128:382-389, 1976) для очистки РНК-полимеразы путем ПЭГ(полиэтиленгликоль) осаждения, позволил получить большой выход GS как из малого, так и большого количества клеток. ПЭГ-методику использовали для очистки GS из Klebsiella aerogenes, K. pneumoniae, Е.coli, Salmonella typhimurium, Rhizobium sp. штамм 32H1, R. meliloti, Azotobacter vinelandii, Pseudomonas putida, Caulobacter crescentus и Rhodopseudomonas capsulate (Streicher S.L. and Tyler В., J. Bacteriol.; 142(1):69-78(1980)).Two methods have been developed to allow very fast purification of glutamine synthetase from a variety of bacteria. The first method, based on differential precipitation, depends on the binding of GS to DNA in cell extracts. The second method, based on the method of C. Gross et al. (J. Bacteriol. 128: 382-389, 1976) for purification of RNA polymerase by PEG (polyethylene glycol) deposition, allowed to obtain a large yield of GS from both a small and a large number of cells. The PEG technique was used to purify GS from Klebsiella aerogenes, K. pneumoniae, E. coli, Salmonella typhimurium, Rhizobium sp. strain 32H1, R. meliloti, Azotobacter vinelandii, Pseudomonas putida, Caulobacter crescentus and Rhodopseudomonas capsulate (Streicher S. L. and Tyler B., J. Bacteriol; 142 (1): 69-78 (1980)).
Продемонстрировано, что неаденилированная Mn-форма глутаминсинтетазы из Е.coli катализирует ранее не известный АМФ-зависимый (обратимый) синтез пирофосфата и L-глутамата из ортофосфата и L-глутамина (Whitley E.J. Jr. and Ginsburg A., J Biol Chem.; 255(22):10663-70(1980)).It has been demonstrated that the non-adenylated Mn-form of glutamine synthetase from E. coli catalyzes a previously unknown AMP-dependent (reversible) synthesis of pyrophosphate and L-glutamate from orthophosphate and L-glutamine (Whitley EJ Jr. and Ginsburg A., J Biol Chem .; 255 (22): 10663-70 (1980)).
Глутаминсинтетазу E.coli инактивировали с использованием неферментной окислительной системы со смешанными функциями, состоящей из аскорбата, O2 и Fe(III). Частичная инактивация GS этой системой приводит к образованию гибридных молекул GS (додекамеров), состоящих из активных и неактивных субъединиц. Взаимодействия субъединиц в таких гибридных молекулах слабее, чем в нативном ферменте. Взаимодействия гетерологичных субъединиц в таких гибридных молекулах не влияют на сродство активных субъединиц к глутамату (Nakamura K., Stadtman E.R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 81(7):2011-5(1984)).Glutamine synthetase of E. coli was inactivated using a mixed-function non-enzymatic oxidizing system consisting of ascorbate, O 2 and Fe (III). Partial inactivation of GS by this system leads to the formation of hybrid GS molecules (dodecamers), consisting of active and inactive subunits. The interactions of subunits in such hybrid molecules are weaker than in the native enzyme. Interactions of heterologous subunits in such hybrid molecules do not affect the affinity of active subunits for glutamate (Nakamura K., Stadtman ER, Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 81 (7): 2011-5 (1984)).
Регуляция глутаминсинтетазы в Е.coli путем обратимых циклов является прототипом сигнальной трансдукции каскадом ферментов. Известно, что такие каскады ферментов демонстрируют ультрачувствительный ответ на первичные стимулы и действуют как системы сигнальной интеграции. Продемонстрировано, что аденилирование GS глутамином в качестве сигнала не чувствительно к общим концентрациям GS, уридилилтрансферазы/ уридилилпереносящего фермента, регуляторного белка PII и аденилилтрансферазы/ аденилил-переносящего фермента. Такой сильный ответ аденилирования GS также наблюдали при изменениях в параметрах системы. Многочисленные анализы показали, что сильный сверхчувствительный ответ бициклического каскада связан с аллостерическими взаимодействиями глутамина и 2-кетоглутарата, бифункциональностью конвертерных ферментов и закрытостью бициклической каскадной структуры. По результатам количественного определения уровня системы GS бициклического каскада было сделано заключение о том, что такой сильный ответ может помогать клетке в адаптации к различным условиям с обеспечением углеродом и азотом (Mutalik V.K. et al., J. Biol. Chem.; 278(29):26327-32(2003)).Regulation of glutamine synthetase in E. coli by reversible cycles is a prototype of signal transduction by a cascade of enzymes. It is known that such enzyme cascades exhibit an ultra-sensitive response to primary stimuli and act as signal integration systems. Adenylation of GS with glutamine as a signal has been demonstrated to be insensitive to total concentrations of GS, uridyl transferase / uridyl transfer enzyme, regulatory PII protein and adenylyl transferase / adenylyl transfer enzyme. Such a strong GS adenylation response was also observed with changes in system parameters. Numerous analyzes have shown that the strong hypersensitive response of the bicyclic cascade is associated with allosteric interactions of glutamine and 2-ketoglutarate, the bifunctionality of the converter enzymes, and the closedness of the bicyclic cascade structure. Based on the results of quantitative determination of the level of the GS system of the bicyclic cascade, it was concluded that such a strong response can help the cell to adapt to various conditions with carbon and nitrogen (Mutalik VK et al., J. Biol. Chem .; 278 (29) : 26327-32 (2003)).
После цикла замораживания-оттаивания с последующей обработкой клеток Е.coli неионным детергентом, Lubrol WX, клетки становятся проницаемыми для небольших молекул, но не для цитозольных белков. Суспензии ставших проницаемыми после такой обработки клеток могут быть непосредственно проанализированы стандартными методами как по внутриклеточным уровням глутаминсинтетазы, так и по состоянию аденилирования. Было продемонстрировано, что клетки, обработанные Lubrol, можно использовать для исследования регуляции аденилирования глутаминсинтетазы in situ (Mura U., Stadtman E.R., J. Biol. Chem.; 256(24):13014-21(1981)).After a freeze-thaw cycle followed by treatment of E. coli cells with a nonionic detergent, Lubrol WX, the cells become permeable to small molecules, but not to cytosolic proteins. Suspensions that become permeable after this treatment of cells can be directly analyzed by standard methods, both by intracellular levels of glutamine synthetase and by adenylation. It has been demonstrated that Lubrol-treated cells can be used to study in situ regulation of glutamine synthetase adenylation (Mura U., Stadtman E.R., J. Biol. Chem .; 256 (24): 13014-21 (1981)).
Внутриклеточная протеолитическая деградация глутаминсинтетазы в E.coli имеет место на двух различных стадиях. На первой стадии окислительная система со смешанными функциями модифицирует глутаминсинтетазу. Модифицированный фермент, каталитически неактивный, становится чувствительным к протеолизу. На второй стадии протеаза, специфичная к модифицированному ферменту, катализирует реальную протеолитическую деградацию (Levine R.L., J. Biol. Chem.; 258(19):11823-7(1983)).Intracellular proteolytic degradation of glutamine synthetase in E. coli takes place at two different stages. In the first stage, an oxidizing system with mixed functions modifies glutamine synthetase. A modified enzyme, catalytically inactive, becomes susceptible to proteolysis. In the second stage, a protease specific for the modified enzyme catalyzes real proteolytic degradation (Levine R.L., J. Biol. Chem .; 258 (19): 11823-7 (1983)).
Раскрыт способ получения L-глутамина путем культивирования коринеформной бактерии, способной к продукции L-глутамина и модифицированной таким образом, что внутриклеточная активность глутаминсинтетазы в модифицированной бактерии увеличена, предпочтительно далее модифицированной таким образом, что внутриклеточная активность глутаматдегидрогеназы в модифицированной бактерии увеличена, в питательной среде для синтеза и накапливания L-глутамина в культуральной жидкости и выделения L-глутамина (ЕР 1229121 А2).A method is disclosed for producing L-glutamine by culturing a coryneform bacterium capable of producing L-glutamine and modified in such a way that the intracellular activity of glutamine synthetase in the modified bacterium is increased, preferably further modified so that the intracellular activity of glutamate dehydrogenase in the modified bacterium is increased in a nutrient medium for synthesis and accumulation of L-glutamine in the culture fluid and the allocation of L-glutamine (EP 1229121 A2).
В настоящее время нет сообщений, описывающих использование увеличения активности глутаминсинтетазы для увеличения продукции L-аминокислоты, принадлежащей к семейству глутамата.There are currently no reports describing the use of an increase in glutamine synthetase activity to increase the production of the L-amino acid belonging to the glutamate family.
Описание изобретенияDescription of the invention
Цели настоящего изобретения включают повышение продуктивности штаммов-продуцентов L-аминокислоты, принадлежащей к семейству глутамата, и предоставление способа получения L-аминокислоты, принадлежащей к семейству глутамата, с использованием этих штаммов.The objectives of the present invention include increasing the productivity of strains producing L-amino acids belonging to the glutamate family, and providing a method for producing L-amino acids belonging to the glutamate family using these strains.
Вышеуказанные цели были достигнуты благодаря обнаружению того факта, что увеличение активности глутаминсинтетазы может вести к увеличению продукции L-аминокислот, принадлежащих к семейству глутамата, таких как L-глутамин, L-пролин, L-аргинин, орнитин и цитруллин.The above objectives were achieved by discovering that an increase in glutamine synthetase activity can lead to an increase in the production of L-amino acids belonging to the glutamate family, such as L-glutamine, L-proline, L-arginine, ornithine and citrulline.
Настоящее изобретение предоставляет бактерию семейства Enterobacteriaceae, обладающую способностью к повышенной продукции аминокислот, принадлежащих к семейству глутамата, таких как L-глутамин, L-пролин, L-аргинин, орнитин и цитруллин.The present invention provides a bacterium of the Enterobacteriaceae family with the ability to increase production of amino acids belonging to the glutamate family, such as L-glutamine, L-proline, L-arginine, ornithine and citrulline.
Целью настоящего изобретения является предоставление принадлежащей к семейству Enterobacteriaceae бактерии-продуцента L-аминокислоты, принадлежащей к семейству глутамата, модифицированной таким образом, что активность глутаминсинтетазы в указанной бактерии увеличена.The aim of the present invention is the provision of belonging to the Enterobacteriaceae family of bacteria producing L-amino acids belonging to the glutamate family, modified so that the activity of glutamine synthetase in the bacteria is increased.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, в которой указанная активность увеличена за счет усиления экспрессии гена glnA.It is also an object of the present invention to provide a bacterium as described above in which said activity is enhanced by enhancing the expression of the glnA gene.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, в которой экспрессия указанного гена glnA усилена за счет увеличения числа копий гена или модификации последовательности, контролирующей экспрессию гена, в результате которой экспрессия гена усиливается.It is also an object of the present invention to provide a bacterium as described above in which expression of said glnA gene is enhanced by increasing the number of copies of a gene or modifying a sequence that controls gene expression, as a result of which gene expression is enhanced.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия принадлежит к роду Escherichia.It is also an object of the present invention to provide the bacteria described above, wherein said bacterium belongs to the genus Escherichia.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия принадлежит к роду Pantoea.It is also an object of the present invention to provide the bacteria described above, wherein said bacterium belongs to the genus Pantoea.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная L-аминокислота, принадлежащая к семейству глутамата, выбрана из группы, состоящей из L-глутамина, L-пролина, L-аргинина, орнитина и цитруллина.It is also an object of the present invention to provide the bacteria described above, wherein said L-amino acid belonging to the glutamate family is selected from the group consisting of L-glutamine, L-proline, L-arginine, ornithine and citrulline.
Также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения L-аминокислоты, принадлежащей к семейству глутамата, L-треонина или L-валина, включающего:Another objective of the present invention is the provision of a method for producing L-amino acids belonging to the family of glutamate, L-threonine or L-valine, including:
- выращивание описанной выше бактерии в питательной среде,- growing the above bacteria in a nutrient medium,
- выделение указанной L-аминокислоты из культуральной жидкости.- the allocation of the specified L-amino acids from the culture fluid.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, при этом указанная L-аминокислота, принадлежащая к семейству глутамата, выбрана из группы, состоящей из L-глутамина, L-пролина, L-аргинина, орнитина и цитруллина.It is also an object of the present invention to provide the method described above, wherein said L-amino acid belonging to the glutamate family is selected from the group consisting of L-glutamine, L-proline, L-arginine, ornithine and citrulline.
Настоящее изобретение подробно описано ниже.The present invention is described in detail below.
Наилучший способ осуществления настоящего изобретенияBEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
1. Бактерия согласно настоящему изобретению.1. The bacterium according to the present invention.
Бактерия, согласно настоящему изобретению, - это принадлежащая к семейству Enterobacteriaceae бактерия-продуцент L-аминокислоты, принадлежащей к семейству глутамата, модифицированная таким образом, что активность глутаминсинтетазы в указанной бактерии увеличена.A bacterium according to the present invention is a bacterium-producer of the L-amino acid belonging to the glutamate family, belonging to the Enterobacteriaceae family, modified in such a way that the activity of glutamine synthetase in said bacterium is increased.
Согласно настоящему изобретению «бактерия-продуцент L-аминокислоты» означает бактерию, обладающую способностью к продукции и выделению L-аминокислоты в питательную среду, когда бактерия согласно настоящему изобретению выращивается в указанной питательной среде.According to the present invention, “L-amino acid producing bacterium” means a bacterium capable of producing and secreting an L-amino acid into a culture medium when the bacterium of the present invention is grown in said culture medium.
Используемый здесь термин «бактерия-продуцент L-аминокислоты» также означает бактерию, которая способна к продукции и вызывает накопление L-аминокислоты, принадлежащей к семейству глутамата, в ферментационной среде в количествах, больших по сравнению с природным или родительским штаммом Е.coli, таким как штамм Е.coli K-12, и предпочтительно означает, что указанный микроорганизм способен накапливать в среде целевую L-аминокислоту в количестве не менее, чем 0.5 г/л, более предпочтительно - не менее чем 1.0 г/л.As used herein, the term “L-amino acid producing bacterium” also means a bacterium that is capable of producing and causes the accumulation of an L-amino acid belonging to the glutamate family in a fermentation medium in quantities greater than the natural or parent E. coli strain, such as E. coli K-12 strain, and preferably means that said microorganism is capable of accumulating in the medium the target L-amino acid in an amount of not less than 0.5 g / l, more preferably not less than 1.0 g / l.
Термин «L-аминокислота, принадлежащая к семейству глутамата» включает в себя L-глутамин, L-пролин, L-аргинин, орнитин и цитруллин.The term “L-amino acid belonging to the glutamate family” includes L-glutamine, L-proline, L-arginine, ornithine and citrulline.
Семейство Enterobacteriaceae включает в себя бактерии, принадлежащие к родам Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Morganella, Yersinia и т.д. Более конкретно, могут быть использованы бактерии, классифицируемые как принадлежащие к семейству Enterobacteriaceae в соответствии с таксономией, используемой в базе данных NCBI (National Center for Biotechnology Information) (http://\vww.ncbi.nlm.nih.gov/htbinpost/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=l&srchmode=l&unlock). Предпочтительна бактерия, принадлежащая к роду Escherichia или Pantoea.The Enterobacteriaceae family includes bacteria belonging to the genera Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Morganella, Yersinia, etc. More specifically, bacteria classified as belonging to the Enterobacteriaceae family according to the taxonomy used in the NCBI database (National Center for Biotechnology Information) (http: // \ vww.ncbi.nlm.nih.gov/htbinpost/Taxonomy can be used. / wgetorg? mode = Tree & id = 1236 & lvl = 3 & keep = l & srchmode = l & unlock). A bacterium belonging to the genus Escherichia or Pantoea is preferred.
Термин "бактерия, принадлежащая к роду Escherichia" означает, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, использованного в настоящем изобретении, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (Е.coli).The term "bacterium belonging to the genus Escherichia" means that the bacterium belongs to the genus Escherichia in accordance with the classification known to the person skilled in the field of microbiology. As an example of a microorganism belonging to the genus Escherichia used in the present invention, the bacterium Escherichia coli (E. coli) may be mentioned.
Круг бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, не ограничен каким-либо образом, однако, например, бактерии, описанные в книге Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Таблица 1), могут быть включены в число бактерий согласно настоящему изобретению.The range of bacteria belonging to the genus Escherichia that can be used in the present invention is not limited in any way, however, for example, the bacteria described in Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Table 1) can be included among the bacteria of the present invention.
Термин «бактерия, принадлежащая к роду Pantoea» означает, что бактерия относится к роду Pantoea в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. Недавно несколько видов Enterobacter agglomerans были классифицированы как Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii или подобные им, на основе анализа нуклеотидной последовательности 16S рРНК и т.д. (Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173 (1993)).The term "bacterium belonging to the genus Pantoea" means that the bacterium belongs to the genus Pantoea in accordance with the classification known to the specialist in the field of microbiology. Recently, several Enterobacter agglomerans species have been classified as Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii or the like based on analysis of the 16S rRNA nucleotide sequence, etc. (Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173 (1993)).
Термин "бактерия модифицирована таким образом, что активность глутаминсинтетазы в указанной бактерии увеличена" означает, что бактерия модифицирована таким образом, что активность глутаминсинтетазы в модифицированной бактерии выше, чем в немодифицированной. Термин "усиление экспрессии гена glnA" означает, что экспрессия гена выше, чем в немодифицированном штамме, например в штамме дикого типа. Примеры таких модификаций включают увеличение числа копий экспрессируемого гена в клетке, увеличение уровня экспрессии гена и т.д.The term "bacterium is modified so that the activity of glutamine synthetase in the specified bacterium is increased" means that the bacterium is modified so that the activity of glutamine synthetase in the modified bacterium is higher than in the unmodified one. The term "enhancing glnA gene expression" means that gene expression is higher than in an unmodified strain, for example, a wild-type strain. Examples of such modifications include an increase in the number of copies of an expressed gene in a cell, an increase in the level of gene expression, etc.
Количество копий экспрессируемого гена определяют, например, путем рестрикции хромосомной ДНК с последующим блоттингом по Саузерну с использованием зонда, сконструированного на основе последовательности гена, флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), и т.п. Уровень экспрессии гена можно определить различными известными методами, включая блоттинг по Нозерну, количественную ОТ-ПЦР, и т.п. Количество кодируемого геном белка может быть определено с использованием известных методов, включая электрофорез в SDS-ПААГ с последующим иммуноблоттингом (Вестерн-блоттинг) и т.п..The number of copies of the expressed gene is determined, for example, by restriction of the chromosomal DNA followed by Southern blotting using a probe constructed based on the gene sequence, in situ fluorescence hybridization (FISH), and the like. The level of gene expression can be determined by various known methods, including Northern blotting, quantitative RT-PCR, etc. The amount of protein encoded by the gene can be determined using known methods, including SDS-PAGE electrophoresis followed by immunoblotting (Western blotting), etc.
Ген glnA (синонимы: ECK3863, b3870) кодирует глутаминсинтетазу (синоним В3870). Ген glnA (нуклеотиды, комплементарные нуклеотидам с 4054648 по 4056057 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi: 16131710) расположен между геном glnL и геном typA на хромосоме штамма Е.coli K-12. Нуклеотидная последовательность гена glnA и аминокислотная последовательность GlnA, кодируемого геном glnA, приведены в Перечне последовательностей под номерами 1 (SEQ ID NO:1) и 2 (SEQ ID NO:2) соответственно.The glnA gene (synonyms: ECK3863, b3870) encodes glutamine synthetase (synonym for B3870). The glnA gene (nucleotides complementary to nucleotides 4054648 to 4056057 in sequence with accession number NC_000913.2 in the GenBank database; gi: 16131710) is located between the glnL gene and the typA gene on the chromosome of E. coli K-12 strain. The nucleotide sequence of the glnA gene and the amino acid sequence of GlnA encoded by the glnA gene are shown in the Sequence Listing Numbers 1 (SEQ ID NO: 1) and 2 (SEQ ID NO: 2), respectively.
Поскольку у представителей различных родов или штаммов семейства Enterobacteriaceae возможны некоторые вариации в нуклеотидных последовательностях, понятие гена glnA не ограничивается геном, последовательность которого приведена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:1, но также может включать и гены, гомологичные SEQ ID NO:1, кодирующие вариант белка GlnA.Since representatives of different genera or strains of the Enterobacteriaceae family may experience some variations in the nucleotide sequences, the concept of the glnA gene is not limited to the gene shown in the Sequence Listing under SEQ ID NO: 1, but may also include genes homologous to SEQ ID NO: 1 encoding a variant of the GlnA protein.
Термин "вариант белка", используемый в настоящем изобретении, означает белок с изменениями в последовательности, будь то делеции, вставки, добавления или замены аминокислот. Число изменений в варианте белка зависит от положения или типа аминокислотного остатка в третичной структуре белка. Оно может быть от 1 до 30, предпочтительно от 1 до 15, более предпочтительно - от 1 до 5 в SEQ ID NO:2. Данные изменения в вариантах могут иметь место в областях, не критичных для функции белка. Данные изменения возможны потому, что некоторые аминокислоты имеют высокую гомологию друг другу, поэтому такие изменения не влияют на третичную структуру или активность. Следовательно, вариант белка, кодируемого геном glnA, может иметь гомологию не менее 80%, предпочтительно не менее 90%, и наиболее предпочтительно - не менее 95%, по отношению к полной аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO.2, при условии сохранения активности глутаминсинтетазы.The term "protein variant", as used in the present invention, means a protein with changes in sequence, be it deletion, insertion, addition or replacement of amino acids. The number of changes in a protein variant depends on the position or type of amino acid residue in the tertiary structure of the protein. It can be from 1 to 30, preferably from 1 to 15, more preferably from 1 to 5 in SEQ ID NO: 2. These variations in variants may occur in areas not critical to protein function. These changes are possible because some amino acids have a high homology to each other, therefore, such changes do not affect the tertiary structure or activity. Therefore, a variant of the protein encoded by the glnA gene may have a homology of at least 80%, preferably at least 90%, and most preferably at least 95%, with respect to the complete amino acid sequence shown in SEQ ID NO.2, provided that glutamine synthetase activity.
Гомология между двумя аминокислотыми последовательностями может быть определена с использованием известных методов, например, компьютерной программы BLAST 2.0, которая считает три параметра: число аминокислот, идентичность и сходство.Homology between two amino acid sequences can be determined using known methods, for example, the BLAST 2.0 computer program, which counts three parameters: amino acid number, identity, and similarity.
Кроме того, ген ydbK может быть вариантом, который гибридизуется в жестких условиях с нуклеотидной последовательностью, приведенной в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:1, или с зондом, который может быть синтезирован на основе указанной нуклеотидной последовательности, при условии, что до инактивации он кодирует функциональный белок YdbK. «Жесткие условия» включают такие условия, при которых специфические гибриды, например гибриды с гомологией не менее 60%, предпочтительно - не менее 70%, более предпочтительно - не менее 80%, еще более предпочтительно - не менее 90%, и наиболее предпочтительно - не менее 95%, образуются, а неспецифические гибриды, например гибриды с меньшей гомологией, чем указано выше, не образуются. Практическим примером жестких условий является однократная или многократная отмывка, предпочтительно двух- или трехкратная, при концентрации солей 1×SSC, 0.1% SDS, предпочтительно 0.1×SSC, 0.1% SDS, при 60°C. Продолжительность отмывки зависит от типа используемой для блоттинга мембраны и, как правило, такова, как рекомендовано производителем. Например, рекомендуемая продолжительность отмывки для нейлоновой мембраны Hybond™ N+ (Amersham) при строгих условиях - 15 минут. Предпочтительна двух- трехкратная отмывка. Длина зонда может быть выбрана в зависимости от условий гибридизации, в данном конкретном случае она может быть около 100-1000 п.н.In addition, the ydbK gene can be a variant that hybridizes under stringent conditions with the nucleotide sequence shown in the Sequence Listing under the number SEQ ID NO: 1, or with a probe that can be synthesized based on the specified nucleotide sequence, provided that before inactivation it encodes a functional protein YdbK. "Stringent conditions" include those conditions under which specific hybrids, for example hybrids with a homology of at least 60%, preferably at least 70%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, and most preferably at least 95% are formed, and non-specific hybrids, for example hybrids with less homology than indicated above, are not formed. A practical example of harsh conditions is a single or multiple washing, preferably two or three times, at a salt concentration of 1 × SSC, 0.1% SDS, preferably 0.1 × SSC, 0.1% SDS, at 60 ° C. The duration of washing depends on the type of membrane used for blotting and, as a rule, is as recommended by the manufacturer. For example, the recommended washing time for Hybond ™ N + nylon membrane (Amersham) under stringent conditions is 15 minutes. Two to three times washing is preferred. The length of the probe can be selected depending on the hybridization conditions, in this particular case it can be about 100-1000 bp.
Далее раскрывается способ увеличения активности глутаминсинтетазы.The following discloses a method for increasing glutamine synthetase activity.
При использовании гена Escherichia coli ген, кодирующий глутаминсинтетазу, можно получить методом ПЦР (полимеразная цепная реакция; White, T.J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)) с использованием праймеров, сконструированных на основании нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1. Ген, кодирующий глутаматдегидрогеназу из других организмов также можно получить методом ПЦР из библиотек хромосомной или геномной ДНК с использованием в качестве праймеров олигонуклеотидов, сконструированных на основании известных последовательностей гена бактерии или гена бактерии другого рода, или методом гибридизации с использованием в качестве зонда олигонуклеотида, сконструированного на основании последовательности. Хромосомная ДНК может быть получена из бактерии, служащей в качестве донора ДНК, методом Saito and Miura (см. Н. Saito and K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963), Experiment Manual for Biotechnology, edited by The Society for Biotechnology, Japan, p.97-98, Baifukan Co, Ltd., 1992) и т.п..Using the Escherichia coli gene, the gene encoding glutamine synthetase can be obtained by PCR (polymerase chain reaction; White, TJ et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)) using primers designed based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 . A gene encoding glutamate dehydrogenase from other organisms can also be obtained by PCR from libraries of chromosomal or genomic DNA using oligonucleotides as primers constructed on the basis of known sequences of a bacterial gene or a bacterium gene of a different kind, or by hybridization using an oligonucleotide designed as a probe based sequence. Chromosomal DNA can be obtained from a bacterium that serves as a DNA donor by the method of Saito and Miura (see N. Saito and K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963), Experiment Manual for Biotechnology, edited by The Society for Biotechnology, Japan, p. 97-98, Baifukan Co, Ltd., 1992) and the like.
Затем конструируют рекомбинантную ДНК путем лигирования гена, амплифицированного с использованием ПЦР, с векторной ДНК, способной функционировать в бактерии-хозяине. Примеры векторов, способных функционировать в бактерии-хозяине, включают векторы, автономно реплицирующиеся в бактерии-хозяине. Примеры вектора, автономно реплицирующегося в Escherichia coli, включают pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, pHSG398, pACYC184, (pHSG и pACYC доступны в Takara Bio Inc.), RSF1010 (Gene vol. 75(2), p.271-288, 1989), pBR322, pMW219, pMW119 (pMW доступен в Nippon Gene Co, Ltd.), pSTV28, and pSTV29 (Takara Bio Inc.). Также может быть использована фаговая векторная ДНК.Recombinant DNA is then constructed by ligation of a gene amplified by PCR with a vector DNA capable of functioning in a host bacterium. Examples of vectors capable of functioning in a host bacterium include vectors autonomously replicating in a host bacterium. Examples of a vector autonomously replicating in Escherichia coli include pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, pHSG398, pACYC184, (pHSG and pACYC are available from Takara Bio Inc.), RSF1010 (Gene vol. 75 (2), p.271-288, 1989), pBR322, pMW219, pMW119 (pMW is available from Nippon Gene Co, Ltd.), pSTV28, and pSTV29 (Takara Bio Inc.). Phage vector DNA can also be used.
Для лигирования гена в вышеупомянутый вектор обрабатывают вектор рестриктазой, соответствующей сайту узнавания в концевой области фрагмента ДНК, содержащего ген. Лигирование обычно проводят с использованием лигазы, такой как Т4-ДНК-лигаза. Методы приготовления плазмидной ДНК, рестрикции и лигирования ДНК, трансформации, выбора нуклеотидов в качестве праймера и т.п. могут быть обычными методами, известными специалисту в этой области. Эти методы описаны, например, в Sambrook, J, Fritsch, E.F, and Maniatis, T, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) и т.п.To ligate the gene into the aforementioned vector, the vector is treated with a restriction enzyme corresponding to the recognition site in the terminal region of the DNA fragment containing the gene. Ligation is usually carried out using a ligase, such as T 4 -DNA ligase. Methods for preparing plasmid DNA, DNA restriction and ligation, transformation, selection of nucleotides as a primer, etc. may be conventional methods known to a person skilled in the art. These methods are described, for example, in Sambrook, J, Fritsch, EF, and Maniatis, T, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) and the like.
Приготовленную таким образом рекомбинантную ДНК вводят в бактерию в соответствии с традиционным методом трансформации. Примеры метода включают электропорацию (Gliesche, C.G, Can. J. Microbiol., 43, 2, 197-201 (1997)). Возможно также увеличить проникающую способность ДНК путем обработки реципиентных клеток хлоридом кальция, как это описано для Escherichia coli K-12 (Mandel, М. and Higa, A, J. Mol. Biol, 53, 159 (1970), и ввести ДНК в компетентную клетку, приготовленную из клетки в стадии пролиферации, как это описано для Bacillus subtilis (Duncan, С.Н, Wilson, G.A and Young, F.E, Gene, 1, 153 (1977)).Thus prepared recombinant DNA is introduced into the bacterium in accordance with the traditional method of transformation. Examples of the method include electroporation (Gliesche, C. G, Can. J. Microbiol., 43, 2, 197-201 (1997)). It is also possible to increase DNA penetration by treating the recipient cells with calcium chloride as described for Escherichia coli K-12 (Mandel, M. and Higa, A, J. Mol. Biol, 53, 159 (1970), and introducing the DNA into a competent a cell prepared from a cell in a proliferation step as described for Bacillus subtilis (Duncan, C. H, Wilson, GA and Young, FE, Gene, 1, 153 (1977)).
Увеличение числа копий гена также может быть достигнуто путем введения множества копий гена, кодирующего глутаминсинтетазу, в хромосомную ДНК бактерии. Для введения множества копий гена в бактериальную хромосому выполняется гомологичная рекомбинация с использованием в качестве целевых последовательностей, присутствующих в хромосоме во множестве копий. Такими последовательностями с множеством копий в хромосомной ДНК могут быть повторяющиеся ДНК или инвертированные повторы на концах транспонируемых элементов. С другой стороны, как раскрыто в заявке JP 2-109985 А, множество копий гена можно ввести в хромосомную ДНК путем вставки гена в транспозон и его перенос, с тем чтобы множество копий гена были интегрированы в хромосомную ДНК. Интеграцию этих генов в хромосому можно подтвердить методом гибридизации по Саузерну с использованием в качестве зонда части гена.An increase in the number of copies of a gene can also be achieved by introducing multiple copies of a gene encoding glutamine synthetase into the bacterial chromosomal DNA. To introduce multiple copies of the gene into the bacterial chromosome, homologous recombination is performed using the target sequences present on the chromosome in multiple copies. Such sequences with multiple copies in the chromosomal DNA can be repeated DNA or inverted repeats at the ends of the transposed elements. On the other hand, as disclosed in JP 2-109985 A, multiple copies of a gene can be introduced into chromosomal DNA by inserting the gene into a transposon and transferring it so that multiple copies of the gene are integrated into the chromosomal DNA. The integration of these genes into the chromosome can be confirmed by Southern hybridization using a portion of the gene as a probe.
Кроме того, экспрессию гена можно усилить, как описано в международной заявке WO 00/18935, путем замены регулирующей экспрессию последовательности, такой как промотор, гена на хромосомной ДНК или гена на плазмиде более сильным промотором, амплификации регулятора, усиливающего экспрессию, или делеции, или ослабления регулятора, ослабляющего экспрессию гена. Примеры известных сильных промоторов включают lac промотор, trp промотор, trc промотор, tac промотор, PR или PL промоторы фага λ и tet промотор.In addition, gene expression can be enhanced, as described in international application WO 00/18935, by replacing the expression control sequence, such as the promoter, of the gene on the chromosomal DNA or the gene on the plasmid with a stronger promoter, amplification of the expression enhancing regulator, or deletion, or weakening the regulator, weakening gene expression. Examples of known strong promoters include the lac promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter, P R or P L phage λ promoters and tet promoter.
С другой стороны, действие промотора может быть усилено, например, введением в промотор нуклеотидной замены. Примеры метода увеличения силы промотора и примеры сильных промоторов описаны Goldstein et al. (Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128) or the like. Кроме того, известно, что несколько нуклеотидов в области между сайтом связывания рибосомы (ribosome binding site - RBS) и стартовым кодоном, особенно в последовательности непосредственно перед стартовым кодоном, существенно влияет на эффективность трансляции. Следовательно, можно модифицировать эту последовательность.On the other hand, the action of the promoter can be enhanced, for example, by introducing a nucleotide substitution into the promoter. Examples of a method for increasing promoter strength and examples of strong promoters are described by Goldstein et al. (Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128) or the like. In addition, it is known that several nucleotides in the region between the ribosome binding site (RBS) and the start codon, especially in the sequence immediately before the start codon, significantly affect translation efficiency. Therefore, you can modify this sequence.
Кроме того, для увеличения активности глутаминсинтетазы можно ввести в ген мутацию, приводящую к увеличению ферментативной активности. Примеры такой мутации включают мутацию в последовательности промотора с целью увеличения уровня транскрипции гена, кодирующего глутаминсинтетазу, и мутацию в кодирующей области этого гена с целью увеличения специфической активности глутаминсинтетазы.In addition, to increase the activity of glutamine synthetase, a mutation can be introduced into the gene, leading to an increase in enzymatic activity. Examples of such a mutation include a mutation in the promoter sequence to increase the transcription level of a gene encoding glutamine synthetase, and a mutation in the coding region of this gene to increase the specific activity of glutamine synthetase.
Поскольку L-глутамин является предшественником в биосинтезе цитруллина, L-аргинина, орнитина и L-пролина, увеличение активности глутаминсинтетазы приводит к увеличеню продукции всех указанных аминокислот.Since L-glutamine is a precursor in the biosynthesis of citrulline, L-arginine, ornithine, and L-proline, an increase in the activity of glutamine synthetase leads to an increase in the production of all these amino acids.
Активность глутаминсинтетазы можно определить, например, как описано Robinson P. et al. (Applied and Environmental Microbiology; 67(10), 4458-63(2001), Bender et al., J. Bacterid.; 129(2), 1001-9(1977)).Glutamine synthetase activity can be determined, for example, as described by Robinson P. et al. (Applied and Environmental Microbiology; 67 (10), 4458-63 (2001), Bender et al., J. Bacterid; 129 (2), 1001-9 (1977)).
Бактерия-продуцент L-аминокислотыL-amino acid producing bacterium
В качестве бактерии согласно настоящему изобретению, модифицированной таким образом, что экспрессия гена glnA усилена (с целью увеличения активности глутаминсинтетазы), может быть использована бактерия, способная к продукции L-аминокислоты, принадлежащей к семейству глутамата.As a bacterium according to the present invention, modified so that the expression of the glnA gene is enhanced (in order to increase the activity of glutamine synthetase), a bacterium capable of producing an L-amino acid belonging to the glutamate family can be used.
Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем усиления экспрессии гена glnA в бактерии, уже обладающей способностью к продукции L-аминокислоты, принадлежащей к семейству глутамата. С другой стороны, бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем придания бактерии, в которой экспрессия гена glnA уже усилена, способности к продукции L-аминокислоты, принадлежащей к семейству глутамата.The bacterium of the present invention can be obtained by enhancing the expression of the glnA gene in a bacterium already capable of producing an L-amino acid belonging to the glutamate family. Alternatively, the bacterium of the present invention can be obtained by imparting to a bacterium in which expression of the glnA gene is already enhanced, the ability to produce an L-amino acid belonging to the glutamate family.
Бактерия-продуцент L-пролинаL-proline producing bacterium
Примеры бактерий-продуцентов L-пролина, используемых в качестве родительского штамма согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli 702ilvA (ВКПМ В-8012), дефицитного по гену ilvA и способного к продукции L-пролина (Европейский патент ЕР 1172433). Бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, вовлеченных в биосинтез L-пролина. Предпочтительно примеры таких генов для бактерий-продуцентов L-пролина, включают ген ргоВ, кодирующий глутаматкиназу с десенсибилизированной регуляцией L-пролином по типу обратной связи (патент Германии 3127361). Кроме того, бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, кодирующих белки, экскретирующие L-аминокислоту из бактериальной клетки. Примерами таких генов являются гены b2682 и b2683 (ygaZH гены) (Европейская патентная заявка ЕР 1239041А2).Examples of L-proline producing bacteria used as the parent strain of the present invention include, but are not limited to, strains belonging to the genus Escherichia, such as E. coli strain 702ilvA (VKPM B-8012) deficient in the ilvA gene and capable of producing L-proline (European patent EP 1172433). The bacterium of the present invention can be improved by enhancing the expression of one or more genes involved in the biosynthesis of L-proline. Preferably, examples of such genes for bacterium-producing L-proline include the rgoB gene encoding glutamate kinase with desensitized feedback regulation of L-proline (German patent 3127361). In addition, the bacterium of the present invention can be improved by enhancing the expression of one or more genes encoding proteins that secrete the L-amino acid from a bacterial cell. Examples of such genes are the b2682 and b2683 genes (ygaZH genes) (European Patent Application EP 1239041A2).
Примеры бактерий, принадлежащих к роду Escherichia и обладающих способностью к продукции L-пролина, включают следующие штаммы Е.coli: NRRL В-12403 и NRRL В-12404 (патент Великобритании GB 2075056), ВКПМ В-8012 (патентная заявка РФ 2000124295), плазмидные мутанты, описанные в патенте Германии DE 3127361, плазмидные мутанты, описанные у Bloom F.R. et al. (The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34), и подобные им.Examples of bacteria belonging to the genus Escherichia and having the ability to produce L-proline include the following E. coli strains: NRRL B-12403 and NRRL B-12404 (UK patent GB 2075056), VKPM B-8012 (RF patent application 2000124295), plasmid mutants described in German patent DE 3127361, plasmid mutants described in Bloom FR et al. (The 15 th Miami winter symposium, 1983, p. 34), and the like.
Бактерия-продуцент L-аргининаL-arginine producing bacterium
Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-аргинина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli 237 (ВКПМ В-7925) (патентная заявка США 2002/058315 А1) и его производные, содержащие мутантную N-ацетилглутаматсинтазу (патентная заявка РФ 2001112869), штамм Е.coli 382 (ВКПМ В-7926) (Европейская патентная заявка ЕР1170358А1), штамм-продуцент аргинина, в который введен ген argA, кодирующий N-ацетилглутаматсинтетазу (Европейская патентная заявка ЕР1170361А1), и подобные им.Examples of parental strains used to produce the L-arginine producing bacterium of the present invention include, but are not limited to, strains belonging to the genus Escherichia, such as E. coli strain 237 (VKPM B-7925) (US patent application 2002 / 058315 A1) and its derivatives containing mutant N-acetylglutamate synthase (RF patent application 2001112869), E. coli strain 382 (VKPM B-7926) (European patent application EP1170358A1), arginine producing strain into which the argA gene encoding N gene is introduced -acetylglutamate synthetase (European patent application EP1170361 A1), and the like.
Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-аргинина согласно настоящему изобретению, также включают в себя штаммы, в которых усилена экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-аргинина. Примеры ферментов биосинтеза L-аргинина, включают N-ацетилглутамилфосфатредуктазу (argC), орнитинацетилтрансферазу (argJ), N-ацетилглутаматкиназу (argB), ацетилорнитинтрансаминазу (argD), орнитинкарбамоилтрансферазу (argF), синтетазу аргининсукциниловой кислоты (argG), лиазу аргининсукциниловой кислоты (argH), и карбамоилфосфатсинтетазу (carAB).Examples of parental strains used to produce the L-arginine producing bacterium of the present invention also include strains in which the expression of one or more genes encoding L-arginine biosynthesis enzymes is enhanced. Examples of L-arginine biosynthesis enzymes include N-acetylglutamylphosphate reductase (argC), ornithine acetyl transferase (argJ), N-acetyl glutamate kinase (argB), acetylornithine transaminase (argD), ornithinecarbamoyl transferase argin (argF), argN and carbamoyl phosphate synthetase (carAB).
Бактерия-продуцент цитруллинаCitrulline Producing Bacteria
Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента цитруллина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются ими, штаммы, принадлежащие к роду Escherichia, такие как мутантные по N-ацетилглутаматсинтазе штаммы Е.coli 237/pMADS11, 237/pMADS12 и 237/pMADS13 (RU2215783, ЕР1170361B1, US6790647B2).Examples of parental strains used to produce the citrulline producer bacteria of the present invention include, but are not limited to, strains belonging to the genus Escherichia, such as N-acetylglutamate synthase mutant strains E. coli 237 / pMADS11, 237 / pMADS12 and 237 / pMADS13 (RU2215783, EP1170361B1, US6790647B2).
Также бактерию-продуцент цитруллина можно легко получить из любой бактерии-продуцента аргинина, например из штамма Е.coli 382 (ВКПМ В-7926), путем инактивации аргининсукцинатсинтазы, кодируемой геном argG.Also, the citrulline producing bacterium can be easily obtained from any arginine producing bacterium, for example, from E. coli 382 strain (VKPM B-7926), by inactivation of arginine succinate synthase encoded by the argG gene.
Фраза "инактивация аргининсукцинатсинтазы" означает, что бактерия модифицирована таким образом, что модифицированная бактерия содержит неактивную аргининсукцинатсинтазу или также она может означать, что бактерия не способна синтезировать аргининсукцинатсинтазу. Инактивация аргининсукцинатсинтазы может быть осуществлена путем инактивации гена argG.The phrase "inactivation of arginine succinate synthase" means that the bacterium is modified so that the modified bacterium contains inactive arginine succinate synthase, or it may also mean that the bacterium is not capable of synthesizing arginine succinate synthase. Inactivation of arginine succinate synthase can be accomplished by inactivation of the argG gene.
Фраза "инактивация гена argG" означает, что модифицированный ген кодирует полностью нефункциональный белок. Также возможно, что область модифицированной ДНК не способна к естественной экспрессии гена из-за делеции части гена или всего гена, сдвига рамки считывания гена, введения миссенс/нонсенс мутации(-ий) или модификации прилегающих к гену областей, включая последовательности, контролирующие экспрессию гена, такие как промотор, энхансер, аттенюатор, сайт связывания рибосомы и т.д..The phrase "inactivation of the argG gene" means that the modified gene encodes a fully non-functional protein. It is also possible that the region of the modified DNA is not capable of naturally expressing the gene due to deletion of part of the gene or the entire gene, shift of the reading frame of the gene, insertion of the missense / nonsense mutation (s), or modification of regions adjacent to the gene, including sequences that control gene expression such as promoter, enhancer, attenuator, ribosome binding site, etc.
Наличие или отсутствие гена argG на хромосоме бактерии может быть определено хорошо известными методами, включая ПЦР, блоттинг по Саузерну и т.п. Кроме того, уровень экспрессии гена можно оценить определением количества транскрибируемой с гена РНК с использованием различных известных методов, включая блоттинг по Нозерну, количественную ОТ-ПЦР и т.п. Количество белка, кодируемого геном argG, можно определить известными методами, включая электрофорез в SDS-ПААГ с последующим иммуноблоттингом (Вестерн-блоттинг) и т.д.The presence or absence of the argG gene on the bacterial chromosome can be determined by well-known methods, including PCR, Southern blotting, and the like. In addition, the level of gene expression can be estimated by determining the amount of RNA transcribed from the gene using various known methods, including Northern blotting, quantitative RT-PCR, etc. The amount of protein encoded by the argG gene can be determined by known methods, including SDS-PAGE electrophoresis followed by immunoblotting (Western blotting), etc.
Экспрессия гена argG может быть ослаблена введением в ген на хромосоме такой мутации, что внуктриклеточная активность кодируемого геном белка уменьшена по сравнению с таковой в немодифицированном штамме. Такой мутацией гена может быть замена одного или более оснований для аминокислотной замены в кодируемом геном белке («миссенс»-мутация), введение стоп-кодона («нонсенс»-мутация), делеция одного или более оснований для сдвига рамки считывания, вставка гена устойчивости к антибиотику или делеция гена или его части (Qiu, Z. and Goodman, M.F., J. Biol. Chem., 272, 8611-8617 (1997); Kwon, D. H. et al., J. Antimicrob. Chemother., 46, 793-796 (2000)). Экспрессия гена argG также может быть ослаблена путем модификации экспрессии регуляторных последовательостей, таких как промотор, последовательность Shine-Dalgarno (SD) и т.д. (заявка РСТ WO 95/34672; Carrier, Т.А. and Keasling, J.D., Biotechnol. Prog. 15, 58-64 (1999)).The expression of the argG gene can be attenuated by introducing a mutation into the gene on the chromosome so that the intracellular activity of the protein encoded by the gene is reduced compared to that in the unmodified strain. Such a gene mutation may be the replacement of one or more bases for amino acid substitution in the encoded protein (the Missense mutation), the introduction of a stop codon (the "nonsense" mutation), the deletion of one or more bases for reading frame shift, insertion of the resistance gene an antibiotic or deletion of a gene or part thereof (Qiu, Z. and Goodman, MF, J. Biol. Chem., 272, 8611-8617 (1997); Kwon, DH et al., J. Antimicrob. Chemother., 46, 793-796 (2000)). The expression of the argG gene can also be attenuated by modifying the expression of regulatory sequences such as a promoter, Shine-Dalgarno (SD) sequence, etc. (PCT application WO 95/34672; Carrier, T.A. and Keasling, J.D., Biotechnol. Prog. 15, 58-64 (1999)).
Например, следующие методы могут применяться для введения мутаций путем генной рекомбинации. Конструируется мутантный ген, кодирующий мутантный белок со сниженной активностью, и бактерия для ее модификации трансформируется фрагментом ДНК, содержащим мутантный ген. Затем нативный ген на хромосоме замещается гомологичной рекомбинацией мутантным геном, отбирается полученный штамм. Такое замещение гена с использованием гомологичной рекомбинации может быть проведено методом с использованием линейной ДНК, известным как "Red-зависимая интеграция" или "интеграция посредством Red-системы" (Datsenko, K.A., Wanner, B.L., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 97, 12, 6640-6645(2000), заявка РСТ WO 2005/010175) или методом с использованием плазмиды, репликация которой чувствительна к температуре (патент США 6303383 или патентная заявка Японии JP 05-007491 А). Далее, введение сайт-специфической мутации путем замещения гена с использованием вышеупомянутой гомологичной рекомбинации может также быть осуществлено с использованием плазмиды с пониженной способностью к репликации в клетке хозяина.For example, the following methods can be used to introduce mutations by gene recombination. A mutant gene is constructed that encodes a mutant protein with reduced activity, and the bacterium for its modification is transformed with a DNA fragment containing the mutant gene. Then the native gene on the chromosome is replaced by homologous recombination with the mutant gene, and the resulting strain is selected. Such gene substitution using homologous recombination can be carried out using a linear DNA method known as “Red-dependent integration” or “Red-system integration” (Datsenko, KA, Wanner, BL, Proc.Natl.Acad.Sci.USA , 97, 12, 6640-6645 (2000), PCT application WO 2005/010175) or by a method using a plasmid whose replication is temperature sensitive (US Patent 6303383 or Japanese Patent Application JP 05-007491 A). Further, the introduction of a site-specific mutation by replacing a gene using the aforementioned homologous recombination can also be carried out using a plasmid with reduced replication ability in the host cell.
Экспрессия гена также может быть ослаблена вставкой транспозона или IS фактора в кодирующую область гена (патент США 5175107) или традиционными методами, такими как мутагенез с использованием УФ излучения или обработка нитрозогуанидином (N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин).Gene expression can also be attenuated by inserting a transposon or IS factor into the coding region of the gene (US Pat. No. 5,175,107) or by traditional methods such as mutagenesis using UV radiation or treatment with nitrosoguanidine (N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine).
Бактерия-продуцент орнитинаOrnithine-producing bacteria
Бактерия-продуцент орнитина может быть легко получена из любой бактерии-продуцента аргинина, например штамма Е.coli 382 (ВКПМ В-7926), путем инактивации орнитинкарбамоилтрансферазы, кодируемой генами argF и argI. Методы для инактивации орнитинкарбамоилтрансферазы описаны выше.The ornithine producing bacterium can be easily obtained from any arginine producing bacterium, for example, E. coli 382 strain (VKPM B-7926), by inactivating the ornithine carbamoyltransferase encoded by the argF and argI genes. Methods for inactivating ornithine carbamoyltransferase are described above.
2. Способ согласно настоящему изобретению.2. The method according to the present invention.
Способом согласно настоящему изобретению является способ получения L-аминокислоты, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления L-аминокислоты в питательной среде и выделения L-аминокислоты из культуральной жидкости.The method according to the present invention is a method for producing an L-amino acid, comprising the steps of growing a bacterium according to the present invention in a culture medium in order to produce and accumulate the L-amino acid in the culture medium and isolate the L-amino acid from the culture fluid.
Согласно настоящему изобретению выращивание, выделение и очистка L-аминокислоты из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых аминокислота продуцируется с использованием бактерии.According to the present invention, the cultivation, isolation and purification of an L-amino acid from a culture or similar liquid may be carried out in a manner similar to traditional fermentation methods in which the amino acid is produced using a bacterium.
Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, необходимых для роста микроорганизмов. В качестве источника углерода используют этанол. В качестве источника азота могут использоваться различные неорганические соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов, ферментолизат микроорганизмов. В качестве минеральных добавок могут использоваться фосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. В качестве витаминов могут использоваться тиамин, дрожжевой экстракт и т.п.The nutrient medium used for growing can be either synthetic or natural, provided that the medium contains sources of carbon, nitrogen, mineral additives and, if necessary, the appropriate amount of nutrient additives necessary for the growth of microorganisms. Ethanol is used as a carbon source. Various inorganic ammonium salts, such as ammonia and ammonium sulfate, other nitrogen compounds, such as amines, natural nitrogen sources, such as peptone, soybean hydrolyzate, microorganism fermentolizate, can be used as a nitrogen source. As mineral additives, potassium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, iron sulfate, manganese sulfate, calcium chloride and the like can be used. As vitamins, thiamine, yeast extract, and the like can be used.
Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях, таких как перемешивание культуральной жидкости на качалке, взбалтывание с аэрацией, при температуре в пределах от 20 до 40°C, предпочтительно в пределах от 30 до 38°C. рН среды поддерживают в пределах от 5 до 9, предпочтительно - от 6.5 до 7.2. рН среды может регулироваться аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферными растворами. Обычно выращивание в течение от 1 до 5 дней приводит к накоплению целевой L-аминокислоты в культуральной среде.The cultivation is preferably carried out under aerobic conditions, such as mixing the culture fluid on a rocking chair, shaking with aeration, at a temperature in the range from 20 to 40 ° C, preferably in the range from 30 to 38 ° C. The pH of the medium is maintained in the range of 5 to 9, preferably 6.5 to 7.2. The pH of the medium can be adjusted by ammonia, calcium carbonate, various acids, bases and buffer solutions. Typically, growing for 1 to 5 days leads to the accumulation of the target L-amino acid in the culture medium.
После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем L-аминокислота может быть выделена и очищена методами ионообменной хроматографии, концентрирования и/или кристаллизации.After growth, solid residues, such as cells, can be removed from the culture fluid by centrifugation or filtration through a membrane, and then the L-amino acid can be isolated and purified by ion exchange chromatography, concentration and / or crystallization.
Краткое описание чертежаBrief Description of the Drawing
На чертеже показано конструирование плазмиды pMglnA12.The drawing shows the construction of the plasmid pMglnA12.
ПримерыExamples
Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже со ссылкой на следующие не ограничивающие настоящее изобретение Примеры.The present invention will be described in more detail below with reference to the following non-limiting Examples.
Пример 1. Конструирование штамма с усиленной экспрессией гена glnA.Example 1. Construction of a strain with enhanced gene expression of glnA.
На первой стадии фрагмент ДНК, содержащий ген glnA, получили методом ПЦР с использованием праймеров P1 (SEQ ID NO:3) и Р2 (SEQ ID NO:4) и хромосомной ДНК Е.coli MG1655(ATCC 700926) в качестве матрицы. Полученный продукт ПЦР размером ≈1,6 т.п.н. очищали в агарозном геле и затем клонировали по сайтам XbaI и HindIII в плазмиде pMW119. Таким образом была получена плазмида pMglnA12 (см. чертеж). Для подтверждения экспрессии гена glnA в штамме, содержащем плазмиду pMglnA12, компетентные клетки штамма НВ101 (АТСС 33694) трансформировали плазмидой pMglnA12 и плазмидой pMW119 (в качестве контроля). Определяли активность глутаминсинтетазы в штаммах HB101/pMW119 и HB101/pMglnA12. Результаты представлены в Таблице 1. Как следует из Таблицы 1, активность глутаминсинтетазы в штамме HB101/pMglnA12 была значительно выше, чем в штамме HB101/pMW119.In the first step, a DNA fragment containing the glnA gene was obtained by PCR using primers P1 (SEQ ID NO: 3) and P2 (SEQ ID NO: 4) and E. coli chromosomal DNA MG1655 (ATCC 700926) as a template. The resulting PCR product of size ≈1.6 TPN purified on an agarose gel and then cloned at the XbaI and HindIII sites in plasmid pMW119. Thus, the plasmid pMglnA12 was obtained (see drawing). To confirm the expression of the glnA gene in a strain containing plasmid pMglnA12, competent cells of strain HB101 (ATCC 33694) were transformed with plasmid pMglnA12 and plasmid pMW119 (as a control). Glutamine synthetase activity was determined in strains HB101 / pMW119 and HB101 / pMglnA12. The results are presented in Table 1. As follows from Table 1, the activity of glutamine synthetase in strain HB101 / pMglnA12 was significantly higher than in strain HB101 / pMW119.
Пример 2. Продукция L-аргинина штаммом Е.coli 382/pMRlnA12Example 2. The production of L-arginine strain E. coli 382 / pMRlnA12
Для анализа влияния увеличения активности глутаминсинтетазы на продукцию L-аргинина штамм-продуцент L-аргинина Е.coli 382 трансформировали плазмидой pMglnA12 с целью получения штамма 382/pMglnA12. Штамм 382 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 117545 Москва, 1-ый Дорожный проезд, 1) 10 апреля 2000 года с инвентарным номером ВКПМ В-7926, затем 18 мая 2001 г. было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора.To analyze the effect of an increase in glutamine synthetase activity on L-arginine production, the E. coli 382 L-arginine producing strain was transformed with plasmid pMglnA12 to obtain strain 382 / pMglnA12. Strain 382 was deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Russia, 117545 Moscow, 1st Dorozhniy proezd, 1) on April 10, 2000 with accession number VKPM B-7926, then on May 18, 2001, this strain was internationally deposited according to terms of the Budapest Treaty.
Оба штамма, 382 и 382/pMglnA12, выращивали с перемешиванием при 37°C в течение 18 часов в 3 мл питательного бульона, по 0.3 мл полученных культур вносили в 2 мл ферментационной среды в пробирки размером 20×200 мм, и культуры выращивали при 32°C в течение 48 часов на роторной качалке.Both strains, 382 and 382 / pMglnA12, were grown with stirring at 37 ° C for 18 hours in 3 ml of nutrient broth, 0.3 ml of the resulting cultures were introduced into 2 ml of fermentation medium in 20 × 200 mm tubes, and cultures were grown at 32 ° C for 48 hours on a rotary shaker.
После выращивания количество накопленного в среде L-аргинина определяли с помощью бумажной хроматографии, при этом использовали следующий состав подвижной фазы: бутанол:уксусная кислота:вода=4:1:1 (v/v). Раствор нингидрина (2%) в ацетоне использовали для визуализации. Пятно, содержащее L-аргинин, вырезали; L-аргинин элюировали 0.5% водным раствором CdCl2, после чего количество L-аргинина определяли спектрофотометрическим методом при длине волны 540 нм. Результаты десяти независимых пробирочных ферментации представлены в Таблице 2. Как следует из Таблицы 2, 382/pMglnA12 накапливал большее количество L-аргинина, чем 382.After growing, the amount of L-arginine accumulated in the medium was determined using paper chromatography, and the following composition of the mobile phase was used: butanol: acetic acid: water = 4: 1: 1 (v / v). A solution of ninhydrin (2%) in acetone was used for visualization. A spot containing L-arginine was excised; L-arginine was eluted with a 0.5% aqueous solution of CdCl 2 , after which the amount of L-arginine was determined spectrophotometrically at a wavelength of 540 nm. The results of ten independent in vitro fermentations are shown in Table 2. As follows from Table 2, 382 / pMglnA12 accumulated more L-arginine than 382.
Состав использованной ферментационной среды, г/л:The composition of the used fermentation medium, g / l:
Глюкозу и сульфат магния стерилизовали раздельно. СаСО3 стерилизовали сухим жаром при 180°C в течение 2 часов. рН доводили до 7.0.Glucose and magnesium sulfate were sterilized separately. CaCO 3 was dry heat sterilized at 180 ° C for 2 hours. The pH was adjusted to 7.0.
Пример 3. Продукция L-пролина штаммом Е.coli 702ilvA/pMglnA12.Example 3. Production of L-Proline by E. coli strain 702ilvA / pMglnA12.
Для оценки влияния увеличения активности глутаминсинтетазы на продукцию L-пролина штамм-продуцент L-пролина Е.coli 702ilvA может быть трансформирован плазмидой pMglnA12 с получением штамма 702ilvA/pMglnA12. Штамм 702ilvA депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 117545, Москва, 1ый Дорожный проезд, 1) с инвентарным номером ВКПМ В-8012, затем 18 мая 2001 г. было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора.To assess the effect of an increase in glutamine synthetase activity on L-proline production, the E. coli 702ilvA L-proline producing strain can be transformed with plasmid pMglnA12 to obtain strain 702ilvA / pMglnA12. Strain 702ilvA was deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Russia, 117545, Moscow, 1st Road passage, 1) with accession number VKPM B-8012, then on May 18, 2001, this strain was internationally deposited in accordance with the conditions of the Budapest Treaty.
Оба штамма, Е.coli, 702ilvA и 702ilvA/pMglnA12, могут быть выращены в течение 18-24 часов при температуре 37°C на чашках с L-агаром. Далее, одна петля клеток может быть перенесена в пробирки, содержащие 2 мл ферментационной среды. Ферментационная среда содержит глюкозу - 60 г/л, сульфат аммония - 25 г/л, KH2PO4 - 2 г/л, MgSO4 - 1 г/л, тиамин - 0.1 мг/мл, L-изолейцин - 70 мкг/мл и мел - 25 г/л, значение рН доводят до 7.2. Глюкозу и мел стерилизуют отдельно. Выращивание может производиться при 30°C в течение 3 дней с перемешиванием. После выращивания количество полученного L-пролина может быть определено с помощью бумажной хроматографии (состав подвижной фазы: бутанол-уксусная кислота-вода=4:1:1) с последующим окрашиванием нингидрином (1% раствор в ацетоне) и дальнейшим элюированием полученных соединений в 50% этаноле с 0.5% CdCl2.Both strains, E. coli, 702ilvA and 702ilvA / pMglnA12, can be grown for 18-24 hours at 37 ° C on plates with L-agar. Further, one loop of cells can be transferred to tubes containing 2 ml of fermentation medium. The fermentation medium contains glucose - 60 g / l, ammonium sulfate - 25 g / l, KH 2 PO 4 - 2 g / l, MgSO 4 - 1 g / l, thiamine - 0.1 mg / ml, L-isoleucine - 70 μg / ml and chalk - 25 g / l, the pH is adjusted to 7.2. Glucose and chalk are sterilized separately. Cultivation can be carried out at 30 ° C for 3 days with stirring. After growing, the amount of L-proline obtained can be determined by paper chromatography (mobile phase composition: butanol-acetic acid-water = 4: 1: 1), followed by staining with ninhydrin (1% solution in acetone) and further eluting the resulting compounds with 50 % ethanol with 0.5% CdCl 2 .
Пример 4. Продукция цитруллина штаммом Е.coli 382ΔargG/pMglnA12Example 4. The production of citrulline strain E. coli 382ΔargG / pMglnA12
Для оценки влияния увеличения активности глутаминсинтетазы на продукцию цитруллина штамм-продуцент цитруллина Е.coli 382ΔargG может быть трансформирован плазмидой pMglnA12 с целью получения штамма 382ΔargG/pMglnA12. Штамм 382ΔargG может быть получен в результате делеции гена argG на хромосоме штамма 382 (ВКПМ В-7926) с использованием метода, предложенного Datsenko, K.A. and Wanner, B.L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645), называемого "Red-зависимая интеграция". В соответствии с этой процедурой могут быть сконструированы ПЦР-праймеры, гомологичные как области, прилегающей к гену argG, так и гену, отвечающему за устойчивость к антибиотику. В качестве матрицы в ПЦР может быть использована плазмидa pMWl 18-attL-Cm-attR (WO 05/010175).To assess the effect of an increase in glutamine synthetase activity on citrulline production, the E. coli 382ΔargG citrulline producing strain can be transformed with plasmid pMglnA12 to obtain strain 382ΔargG / pMglnA12. The 382ΔargG strain can be obtained by deletion of the argG gene on the chromosome of strain 382 (VKPM B-7926) using the method proposed by Datsenko, K.A. and Wanner, B.L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97 (12), 6640-6645), called "Red-dependent Integration". In accordance with this procedure, PCR primers homologous to both the region adjacent to the argG gene and the gene responsible for antibiotic resistance can be designed. As a template in PCR, the plasmid pMWl 18-attL-Cm-attR (WO 05/010175) can be used.
Оба штамма Е.coli, 382ΔargG и 382ΔargG/pMglnA12, могут быть выращены с перемешиванием при 37°C в течение 18 часов в 3 мл питательной среды, и 0.3 мл полученных культур могут быть перенесены в 2 мл ферментационной среды в пробирках 20×200-мм и могут быть культивированы при 32°C в течение 48 часов на роторной качалке.Both strains of E. coli, 382ΔargG and 382ΔargG / pMglnA12, can be grown with stirring at 37 ° C for 18 hours in 3 ml of culture medium, and 0.3 ml of the resulting cultures can be transferred to 2 ml of fermentation medium in 20 × 200- tubes mm and can be cultured at 32 ° C for 48 hours on a rotary shaker.
После выращивания количество полученного цитруллина может быть определено с помощью бумажной хроматографии с использованием подвижной фазы следующего состава: бутанол-уксусная кислота-вода - 4:1:1. Последующее окрашивание может быть выполнено нингидрином (2% раствор в ацетоне). Содержащее цитруллин пятно может быть вырезано, цитруллин может быть элюирован с использованием 0.5% водного раствора CdCl2, и количество цитруллина может быть определено спектрофотометрически при длине волны 540 нм.After growing, the amount of citrulline obtained can be determined using paper chromatography using the mobile phase of the following composition: butanol-acetic acid-water - 4: 1: 1. Subsequent staining can be performed with ninhydrin (2% solution in acetone). A stain containing citrulline can be excised, citrulline can be eluted using a 0.5% aqueous solution of CdCl 2 , and the amount of citrulline can be determined spectrophotometrically at a wavelength of 540 nm.
Возможный состав ферментационной среды, г/л:Possible composition of the fermentation medium, g / l:
Глюкозу и сульфат магния стерилизуют отдельно. СаСО3 стерилизуют сухим жаром при 180°C в течение 2 часов. Значение рН доводят до 7.0.Glucose and magnesium sulfate are sterilized separately. CaCO 3 is sterilized by dry heat at 180 ° C for 2 hours. The pH is adjusted to 7.0.
Пример 5. Продукция орнитина штаммом Е.coli 382ΔargFΔargI/pMglnA12Example 5. Production of ornithine by E. coli strain 382ΔargFΔargI / pMglnA12
Для оценки влияния увеличения активности глутаминсинтетазы на продукцию орнитина штамм-продуцент орнитина Е.coli 382ΔargFΔargI может быть трансформирован плазмидой pMglnA12 с целью получения штамма 382ΔargFΔargI/pMglnA12. Штамм 382ΔargFΔargI может быть получен в результате последовательных делеций генов argF и argI на хромосоме штамма 382 (ВКПМ В-7926) с использованием метода, предложенного Datsenko, K.А. and Wanner, B.L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645), называемого "Red-зависимая интеграция". В соответствии с этой процедурой могут быть сконструированы две пары ПЦР-праймеров, гомологичных как областям, прилегающим к генам argF и argI, так и гену, отвечающему за устойчивость к антибиотику. В качестве матрицы в ПЦР может быть использована плазмида pMW118-attL-Cm-attR (WO 05/010175).To assess the effect of an increase in glutamine synthetase activity on ornithine production, E. coli 382ΔargFΔargI ornithine producer strain can be transformed with plasmid pMglnA12 to obtain strain 382ΔargFΔargI / pMglnA12. Strain 382ΔargFΔargI can be obtained by successive deletions of the argF and argI genes on the chromosome of strain 382 (VKPM B-7926) using the method proposed by Datsenko, K.A. and Wanner, B.L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97 (12), 6640-6645), called "Red-dependent Integration". In accordance with this procedure, two pairs of PCR primers can be constructed that are homologous to both the regions adjacent to the argF and argI genes and the gene responsible for antibiotic resistance. Plasmid pMW118-attL-Cm-attR (WO 05/010175) can be used as a template in PCR.
Оба штамма Е.coli, 382ΔargFΔargI и 382ΔargFΔargI/pMglnA12, могут быть выращены с перемешиванием при 37°C в течение 18 часов в 3 мл питательной среды, и 0.3 мл полученных культур могут быть перенесены в 2 мл ферментационной среды в пробирках 20×200-мм и могут быть культивированы при 32°C в течение 48 часов на роторной качалке.Both strains of E. coli, 382ΔargFΔargI and 382ΔargFΔargI / pMglnA12, can be grown with stirring at 37 ° C for 18 hours in 3 ml of culture medium, and 0.3 ml of the resulting cultures can be transferred to 2 ml of fermentation medium in 20 × 200- tubes mm and can be cultured at 32 ° C for 48 hours on a rotary shaker.
После выращивания количество полученного орнитина может быть определено с помощью бумажной хроматографии с использованием подвижной фазы следующего состава: бутанол-уксусная кислота-вода=4:1:1. Последующее окрашивание может быть выполнено нингидрином (2% раствор в ацетоне). Содержащее цитруллин пятно может быть вырезано, цитруллин может быть элюирован с использованием 0.5% водного раствора CdCl2, и количество цитруллина может быть определено спектрофотометрически при длине волны 540 нм.After growing, the amount of ornithine obtained can be determined by paper chromatography using a mobile phase of the following composition: butanol-acetic acid-water = 4: 1: 1. Subsequent staining can be performed with ninhydrin (2% solution in acetone). A stain containing citrulline can be excised, citrulline can be eluted using a 0.5% aqueous solution of CdCl 2 , and the amount of citrulline can be determined spectrophotometrically at a wavelength of 540 nm.
Возможный состав ферментационной среды, г/л:Possible composition of the fermentation medium, g / l:
Глюкозу и сульфат магния стерилизуют отдельно. СаСО3 стерилизуют сухим жаром при 180°C в течение 2 часов. Значение рН доводят до 7.0.Glucose and magnesium sulfate are sterilized separately. CaCO 3 is sterilized by dry heat at 180 ° C for 2 hours. The pH is adjusted to 7.0.
Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на Наилучший способ осуществления изобретения, для специалиста в указанной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены, и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения.Although the invention has been described in detail with reference to the Best Mode for Carrying Out the Invention, it will be apparent to those skilled in the art that various changes can be made and equivalent replacements made, and such changes and replacements are not outside the scope of the present invention.
Каждому из упомянутых выше документов соответствует ссылка, и все цитируемые документы являются частью описания настоящего изобретения.Each of the above documents has a link, and all cited documents are part of the description of the present invention.
Claims (4)
- выращивание бактерии по п.1 в питательной среде и
- выделение указанной L-аминокислоты из культуральной жидкости. 4. A method of obtaining an L-amino acid belonging to the glutamate family and selected from the group consisting of L-glutamine, L-proline, L-arginine, L-ornithine and L-citrulline, including:
- growing bacteria according to claim 1 in a nutrient medium and
- the allocation of the specified L-amino acids from the culture fluid.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009102012/10A RU2420586C2 (en) | 2009-01-23 | 2009-01-23 | Method of producing l-amino acid of glutamate family with using escherichia bacterium |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009102012/10A RU2420586C2 (en) | 2009-01-23 | 2009-01-23 | Method of producing l-amino acid of glutamate family with using escherichia bacterium |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2009102012A RU2009102012A (en) | 2010-07-27 |
| RU2420586C2 true RU2420586C2 (en) | 2011-06-10 |
Family
ID=42697855
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2009102012/10A RU2420586C2 (en) | 2009-01-23 | 2009-01-23 | Method of producing l-amino acid of glutamate family with using escherichia bacterium |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2420586C2 (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2496867C2 (en) * | 2011-04-25 | 2013-10-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | Method to produce l-amino acid of glutamate family using coryneformic bacterium |
-
2009
- 2009-01-23 RU RU2009102012/10A patent/RU2420586C2/en active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2009102012A (en) | 2010-07-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2244007C2 (en) | Method for preparing l-threonine, strain escherichia coli as producer of threonine (variants) | |
| RU2230114C2 (en) | Mutant glutamine synthetase, dna fragment, strain of escherichia coli as p roducer of l-glutamine and method for preparing l-amino acids | |
| RU2275424C2 (en) | Method for preparing l-threonine by using bacterium belonging to genus escherichia | |
| US9051591B2 (en) | Bacterium of enterobacteriaceae family producing L-aspartic acid or L-aspartic acid-derived metabolites and a method for producing L-aspartic acid or L-aspartic acid-derived metabolites | |
| EP2186881B1 (en) | A method for producing an L-amino acid using bacterium of the Enterobacteriaceae family with attenuated expression of a gene coding for small RNA | |
| JP5429170B2 (en) | Bacteria producing a product of a reaction catalyzed by a protein having 2-oxoglutarate-dependent enzyme activity, and a method for producing the product | |
| US20070202571A1 (en) | Method for microbial production of amino acids of the spartate and/or glutamate family and agents which can be used in said method | |
| EP2486123B1 (en) | A METHOD FOR PRODUCING AN L-CYSTEINE, L-CYSTINE, A DERIVATIVE OR PRECURSOR THEREOF OR A MIXTURE THEREOF USING A BACTERIUM OF Enterobacteriaceae FAMILY | |
| CN103396976A (en) | Microorganism capable of producing L-glutamic acid-type amino acid, and method for production of amino acid | |
| EP1856269B1 (en) | A METHOD FOR PRODUCING A NON-AROMATIC L-AMINO ACID USING A BACTERIUM OF THE ENTEROBACTERIACEAE FAMILY HAVING EXPRESSION OF THE csrA GENE ATTENUATED | |
| EP2089528B1 (en) | A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the genus escherichia with attenuated expression of any of the cynt, cyns, cynx or cynr genes or a combination thereof | |
| US8647838B2 (en) | Method for producing L-arginine using a bacterium of enterobacteriaceae family, having attenuated expression of a gene encoding an L-arginine transporter | |
| CN102286562B (en) | Method for producing l-amino acids using bacteria of the enterobacteriaceae family | |
| CN108463555A (en) | The method for producing benzaldehyde | |
| EP2185683B1 (en) | Method for producing l-threonine using bacterium of enterobacteriaceae family, having attenuated expression of the yahn gene | |
| EP2674499B1 (en) | Method for producing target substance by fermentation process | |
| RU2471870C2 (en) | METHOD FOR PRODUCING L-ARGININE AND L-CITRULLINE WITH USE OF BACTERIA OF ENTEROBACTERIACEAE FAMILY WITH ATTENUATED pepA GENE EXPRESSION | |
| JP6690529B2 (en) | γ-Glutamylvaline synthase and method for producing γ-glutamyl valylglycine | |
| JP5907076B2 (en) | Method for producing L-amino acids using bacteria of the family Enterobacteriaceae having a weakened expression of a gene encoding lysine / arginine / ornithine transporter | |
| WO2014027702A1 (en) | Method for producing l-arginine using bacterium of the family enterobacteriaceae having n-acetylornithine deacetylase with downregulated activity | |
| US6919190B2 (en) | Regulation of carbon assimilation | |
| RU2420586C2 (en) | Method of producing l-amino acid of glutamate family with using escherichia bacterium | |
| CN101107355A (en) | A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family having a pathway of glycogen biosynthesis disrupted | |
| KR101117513B1 (en) | L-Threonine producing bacterium belonging to the genus Escherichia and method for producing L-threonine | |
| RU2515095C1 (en) | Bacteria of escherichia kind - producer of l-threonine and method of microbiological synthesis of l-threonine with its usage |