RU2416096C2 - Определение респондеров на химиотерапию - Google Patents

Определение респондеров на химиотерапию Download PDF

Info

Publication number
RU2416096C2
RU2416096C2 RU2007145514/15A RU2007145514A RU2416096C2 RU 2416096 C2 RU2416096 C2 RU 2416096C2 RU 2007145514/15 A RU2007145514/15 A RU 2007145514/15A RU 2007145514 A RU2007145514 A RU 2007145514A RU 2416096 C2 RU2416096 C2 RU 2416096C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
protein
phosphorylated
mapk
biological sample
mapk protein
Prior art date
Application number
RU2007145514/15A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2007145514A (ru
Inventor
Астрид ХЕЛЛЕР (DE)
Астрид ХЕЛЛЕР
Верена ЛУТЦ (DE)
Верена ЛУТЦ
Йоахим МЁКС (DE)
Йоахим МЁКС
Кэрол УАРД (FR)
Кэрол УАРД
Original Assignee
Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг filed Critical Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг
Publication of RU2007145514A publication Critical patent/RU2007145514A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2416096C2 publication Critical patent/RU2416096C2/ru

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57423—Specifically defined cancers of lung
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • G01N2333/91205—Phosphotransferases in general
    • G01N2333/9121—Phosphotransferases in general with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. general tyrosine, serine or threonine kinases
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к медицине и касается способа определения чувствительности биологического образца, включающего клетки рака легкого человека, к комбинации ингибитора рецептора фактора роста эпидермиса и химиотерапевтического агента, путем определения в биологическом образце сверхэкспрессии фосфорилированного белка АКТ и фосфорилированного белка МАПК. Изобретение обеспечивает расширение арсенала способов определения чувствительности к терапии ингибиторами EGFR. 3 н. и 7 з.п. ф-лы, 11 ил., 3 табл.

Description

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способу определения чувствительности биологического образца, включающего клетки рака легкого человека, к комбинации ингибитора рецептора фактора роста эпидермиса и химиотерапевтического агента, путем определения в биологическом образце сверхэкспрессии фосфорилированного белка АКТ и/или фосфорилированного белка МАПК. Настоящее изобретение также относится к способам выявления потенциального агента или выбора композиции для ингибирования прогрессирования рака легкого у пациента, в которых применяют фосфорилированный белок Akt и/или фосфорилированный белок МАПК.
Предпосылки создания изобретения
В развитие злокачественных новообразований у человека обычно вовлекается EGFR, кодируемый геном erbB1. В частности, повышенная экспрессия EGFR наблюдается при раке молочной железы, мочевого пузыря, легких, головы, шеи и желудка, а также при глиобластомах. Рецептор фактора роста эпидермиса (epidermal growth factor receptor - EGFR), гликопротеин молекулярной массой 170 кДа, состоит из N-концевого внеклеточного домена, гидрофобного трансмембранного домена и С-концевого внутриклеточного участка, содержащего домен киназы. EGFR лиганд-индуцированная димеризация активирует внутриклеточный домен RTK (Src-гомологический домен 1, SH1), что приводит к аутофосфорилированию шести специфических тирозиновых остатков EGFR в некаталитическом хвосте цитоплазматического домена.
Клеточные эффекты активации EGFR в раковой клетке индуцируют повышенную пролиферацию, активацию клеточной подвижности, адгезию, инвазию, ангиогенез и повышенное выживание клеток путем ингибирования апоптоза. Активированный EGFR индуцирует пролиферацию опухолевых клеток вследствие стимуляции каскада митоген-активированой протеинкиназы (МАПК). При связывании лиганда с EGFR фактор обмена гуаниновых нуклеотидов SOS привлекается к плазматической мембране посредством адаптерного белка Grb2, который стимулирует замещение ГТФ на ГДФ на малом G-белке Ras, активируя впоследствии каскад МАПК, состоящий из Raf, MEK и ERK. Активированные ERK (рМАПК, pERK1/2) в свою очередь фосфорилируют и активируют факторы транскрипции, например, ELK-1 или с-Мус, стимулирующие клеточный рост.
Многообразные метаболические пути факторов роста способствуют развитию и выживанию клеток немелкоклеточного рака легкого (НМКРЛ) путем активации множественных киназ. EGFR также повышает выживание раковых клеток путем передачи сигнала через фосфатидилинозит-3-киназный (PI3K)/Akt путь и STAT путь. Akt также стимулируется другими факторами роста, включая инсулиновый фактор роста 1, основной фактор роста фибробластов, и интерлейкины 3 и 6. Все три изоформы Akt 1-3 полностью фосфорилированы (рАКТ) сходным образом по остаткам Т308 в активационном домене и S473 в СООН-концевом домене.
Эрлотиниб (продукт Tarceva®) является сильным ингибитором тирозинкиназы (TKI) рецептора фактора роста эпидермиса (HER1/EGFR), который увеличивает выживаемость у пациентов с немелкоклеточным раком легкого (НМКРЛ), у которых предшествующая химиотерапия не дала результатов, при использовании данного препарата в качестве единственного лекарственного средства (WO 01/34574). Эффективность продукта Tarceva® исследована в различных испытаниях. Его химическое название N-(3-этинилфенил)-6,7-бис(2-метоксиэтокси)хиназолин-4-амин.
В испытании TALENT проведена III фаза плацебо-контролируемого исследования у пациентов с НМКРЛ первой линии терапии, которые получали гемцитабин и цисплатин (эта сопутствующая химиорадиотерапия была нетрадиционным для США лечением) в комбинации с эрлотинибом (продуктом Tarceva®) в дозе 150 мг/сутки или с плацебо. Основным конечным результатом считалась продолжительность выживания, вторичными конечными результатами были время до прогрессирования, степень ответа, продолжительность ответа, фармакокинетические и фармакодинамические показатели и качество жизни. Также оценивались уровни экспрессии HER1/EGFR и HER2. Был проведен стандартный анализ безопасности. Общий результат испытания TALENT оказался отрицательным. На основании первичных и вторичных результатов не было доказано преимущества эрлотиниба (продукта Tarceva®) в сочетании с химиотерапией (гемцитабин и цисплатин) по сравнению с лечением только гемцитабином и цисплатином (U.Gatzemeier и др., Proc Am Soc Clin Oncol, 23, 2004. с.617 (Реферат 7010)). Идентичные результаты наблюдались в исследовании TRIBUTE (США) с эрлотинибом в сочетании с карбоплатином и паклитакселом (R.S.Herbst и др., J Clin Oncol, 22, 2004, реферат 7011). В III фазе рандомизированного плацебо-контролируемого исследования единственного агента эрлотиниба в качестве второй или третьей линии терапии немелкоклеточного рака легкого (НМКРЛ) (BR.21; NCIC/OSIP) обнаружено статистически достоверное увеличение выживаемости при лечении эрлотинибом (6,7 месяцев) по сравнению с плацебо (4,7 месяцев).
Различные исследования посвящены изучению биомаркеров при немелкоклеточном раке легкого и их отношению к определенным лекарственным препаратам, ингибирующим EGFR. Han и др., Int J Cancer, 113, 2005. cc.109-115, исследовали 65 пациентов, получавших монотерапию гефитинибом (Iressa™, EGFR TKI). Они анализировали молекулы, ниже EGFR по метаболическому пути, в качестве маркеров прогнозирования ответа на гефитиниб при резистентном к химиотерапии немелкоклеточном раке легкого. F.Cappuzzo и др., JNCI, 96, 2004, cc.1133-1141, исследовали 106 пациентов, получавших монотерапию гефитинибом (Iressa™; EGFR TKI). Они изучали фосфорилирование Akt и эффективность гефитиниба у пациентов с продвинутой формой немелкоклеточного рака легкого и обнаружили, что лечебное действие гефитиниба было выше у пациентов с P-Akt-положительными опухолями, чем у пациентов с P-Akt-отрицательными опухолями. S.Vicent и др., Br J Cancer, 90, 2004, cc.1047-1052, исследовали 111 пациентов с НМКРЛ. Они обнаружили, что при немелкоклеточном раке легкого pERK активирован и связан с прогрессирующими опухолями. S.W.Han и др., J Clin Oncol, 23, 2005, cc.2493-2501, исследовали 90 пациентов, получавших монотерапию гефитинибом (EGFR TKI). Они провели анализ прогнозируемого и прогностического влияния мутации рецептора фактора роста эпидермиса у пациентов с немелкоклеточным раком легкого, находившихся на лечении гефитинибом. Т.Mukohara и др., Lung Cancer, 41, 2003, cc.123-130, исследовали 60 пациентов, по 20 пациентов на стадию, которые подвергались либо неоадьювантной химиотерапии, либо облучению. Экспрессия EGFR коррелировала с экспрессией pERK и pAkt. Сами авторы указывают, что объем выборки был слишком низким. D.Raben и др., Int J Radiation Oncology Biol. Phys, 59, 2004, cc.27-38, исследовали нацеленную терапию при немелкоклеточном раке легкого. М.Ono и др., Mol Cancer Ther, 3, 2004, cc.465-472, провели оценку 9 клеточных линий НМКРЛ при обработке гефитинибом. F.R.Hirsch и др., Curr Opin Oncol, 17, 2005, cc.118-122, рассматривали состояние фосфорилирования Akt и МАПК в качестве потенциального маркера устойчивости к гематинибу. Meert и др., Clinical Cancer Research, 9, 2003, 2316-2326, исследовали клеточные линии НМКРЛ в плане активности ингибиторов EGFR. Ни уровень экспрессии EGFR, ни уровень экспрессии Her2 не коррелировали с чувствительностью к ингибиторам EGFR. J.Brognard и др., Cell Death and Differentiation, 9, 2002, cc.893-904, провели анализ 19 клеточных линий НМКРЛ, из которых 17 показали фосфорилирование Erk1/2 и конститутивную активность. О.David и др., Clinical Cancer Research, 10, 2004, cc.6865-6871, показали, что сверхэкспрессия pAkt является независимым прогностическим фактором при НМКРЛ. S.Kakiuchi и др., Human Molecular Genetics, 13, 2004, cc.3029-3043, исследовали кДНК-микрочипы генома у 33 пациентов с НМКРЛ. Все пациенты получали гефитиниб в качестве монотерапии. Не было обнаружено доказательств корреляции между уровнем экспрессии Akt/pAkt, состоянием гена EGFR или окрашиванием pEGFR и ответом на гефитиниб. R.H.Kim и др., Cancer Cell, 7, 2005, cc.263-273, обнаружили, что экспрессия онкогена DJ-1 соответствует уровню pAkt. B.R.Balsara и др., Carcinogenesis, 25, 2004, cc.2053-2059, исследовали 110 пациентов с НМКРЛ с экспрессией ТМА pAkt. Не было существенных различий по выживаемости у негативных и позитивных по pAkt пациентов. Y.Hirami и др., Cancer Letters, 214, 2004, cc.157-164, исследовали связь рецептора фактора роста эпидермиса, pAkt и индуцируемого гипоксией фактора-1-альфа при немелкоклеточном раке легкого. S.H.Lee и др., APMIS 110, 2002, cc.587-592, провели анализ 43 метастазов в лимфоузлах у пациентов с НМКРЛ. Активация Akt при НМКРЛ играет большую роль в развитии опухоли, чем в ее прогрессировании. J.A.Engelman и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102, 2004, cc.3788-3793, провели анализ erbB-3 опосредованной активности фосфоинозитид-3-киназы в чувствительных к гефитинибу линиях клеток немелкоклеточного рака легкого. О.David, J Cell Mol Med, 5, 2001, cc.430-433, рассмотрели роль Akt и PTEN в качестве новых диагностических маркеров при раке легкого. A.Mantha и др., Clin. Cancer Res., 11, 2095, cc.2398-2407, исследовали использование в качестве мишени мевалонатного пути, ингибирующего функцию рецептора фактора роста эпидермиса.
Исследовали прогностические маркеры, связанные с EGFR-позитивным раком, в WO 2004/046386. Маркеры генной экспрессии для ответа на лекарственные препараты, являющиеся ингибиторами EGFR, описаны в US 2004/0157255. Биомаркеры и способы определения чувствительности к модуляторам рецептора фактора роста эпидермиса описаны в WO 2004/063709. В WO 01/00245 описывают гуманизированные антитела к ErbB2 и способы лечения рака с применением антител к ErbB2, например, гуманизированных антител к erbB2.
Краткое описание изобретения
По-прежнему существует потребность в способах определения чувствительности к терапии ингибиторами EGFR, в частности при комбинированной терапии ингибитором EGFR с химиотерапевтическим агентом.
Поэтому в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривается способ определения чувствительности биологического образца, включающего клетки рака легкого человека, к комбинации ингибитора рецептора фактора роста эпидермиса и химиотерапевтического агента, включающий способ определения сверхэкспрессии фосфорилированного белка АКТ и/или фосфорилированного белка МАПК в биологическом образце, при этом сверхэкспрессия фосфорилированного белка АКТ и/или фосфорилированного белка МАПК указывает на то, что биологический образец, включающий клетки рака легкого человека, является чувствительным к комбинации ингибитора рецептора фактора роста эпидермиса и химиотерапевтического агента.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения антитело, которое связывается с фосфорилированным белком АКТ, или антитело, которое связывается с фосфорилированным белком МАПК, применяют для определения чувствительности биологического образца, включающего клетки рака легкого человека, к комбинации ингибитора рецептора фактора роста эпидермиса и химиотерапевтического агента.
Еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения, предусматривается способ выбора композиции для ингибирования прогрессирования рака легкого у человека, включающий,
а) раздельную экспозицию аликвот биологического образца, включающего клетки рака легкого, которые чувствительны к комбинации ингибитора рецептора фактора роста эпидермиса и химиотерапевтического агента, в присутствии множества тестируемых композиций,
б) сравнение уровня экспрессии фосфорилированного белка Akt и/или фосфорилированного белка МАПК в аликвотах биологического образца, подвергавшихся контакту с тестируемыми композициями, и уровня экспрессии фосфорилированного белка Akt и/или фосфорилированного белка МАПК в аликвоте биологического образца, не подвергавшейся контакту с тестируемыми композициями,
в) выбор одной из тестируемых композиций, которая изменяет уровень экспрессии фосфорилированного белка Akt и/или фосфорилированного белка МАПК в аликвоте, содержащей эту тестируемую композицию, по сравнению с аликвотой, не контактировавшей с тестируемой композицией, в котором, по меньшей мере, 10% различие между уровнем экспрессии фосфорилированного белка Akt и/или фосфорилированного белка МАПК в аликвоте биологического образца, подвергавшейся контакту с тестируемой композицией, и уровнем экспрессии фосфорилированного белка Akt и/или фосфорилированного белка МАПК в аликвоте биологического образца, не подвергавшейся контакту с тестируемой композицией, является основанием для выбора тестируемой композиции.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения предусматривается способ выявления потенциального агента, включающий:
а) контактирование аликвоты биологического образца, содержащего клетки рака легкого, которые чувствительны к ингибитору EGFR и химиотерапевтическому агенту, с потенциальным агентом,
б) определение уровня экспрессии фосфорилированного белка Akt и/или фосфорилированного белка МАПК в аликвоте биологического образца, подвергавшейся контакту с потенциальным агентом, и определение уровня экспрессии фосфорилированного белка Akt и/или фосфорилированного белка МАПК в аликвоте биологического образца, не подвергавшейся контакту с потенциальным агентом,
в) отслеживание действия потенциального агента путем сравнения уровня экспрессии фосфорилированного белка Akt и/или фосфорилированного белка МАПК в аликвоте биологического образца, подвергавшейся контакту с потенциальным агентом, и уровня экспрессии фосфорилированного белка Akt и/или фосфорилированного белка МАПК в аликвоте биологического образца, не подвергавшейся контакту с потенциальным агентом,
г) выявление указанного агента по указанному наблюдаемому действию, при котором, по меньшей мере, 10% различие между уровнем экспрессии фосфорилированного белка Akt и/или фосфорилированного белка МАПК в аликвоте биологического образца, подвергавшейся контакту с потенциальным агентом, и уровнем экспрессии фосфорилированного белка Akt и/или фосфорилированного белка МАПК в аликвоте биологического образца, не подвергавшейся контакту с потенциальным агентом, указывает на действие потенциального агента.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения, предусматриваются потенциальный агент, устанавливаемый согласно способу настоящему изобретения, и фармацевтический препарат, включающий агент, соответствующий настоящему изобретению.
Кроме того, в другом варианте осуществления настоящего изобретения, агент согласно настоящему изобретению применяется для получения композиции для ингибирования прогрессирования рака легкого.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения предусматривается способ получения лекарственного препарата, включающий стадии способа настоящего изобретения и
(i) синтез потенциального агента, установленного на стадии (в), или его аналога, или производного в количестве, достаточном для обеспечения субъекта указанным лекарственным препаратом в терапевтически эффективном количестве, и/или
(ii) соединение потенциального агента, установленного на стадии (в), или его аналога, или производного с фармацевтически приемлемым носителем.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения белок Akt, белок МАПК, фосфорилированный белок Akt, фосфорилированный белок МАПК, антитело, селективно связывающееся с фосфорилированным белком Akt или фосфорилированным белком МАПК, применяют для выявления потенциального агента или для выбора композиции для ингибирования прогрессирования рака легкого у пациента.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения предусматривается набор, включающий антитело против фосфорилированного белка МАПК и/или фосфорилированного белка Akt.
Понятие «биологический образец» обычно обозначает какой-либо биологический образец, полученный от индивидуума, из тканевой жидкости, клеточной линии, культуры ткани или другого источника. Тканевыми жидкостями являются, например, лимфа, сыворотка, моча, сперма, синовиальная жидкость и спинномозговая жидкость. В соответствии с настоящим изобретением биологический образец включает клетки рака легкого и раковые клетки, не относящиеся к клеткам легкого (другие клетки). Способы получения биоптатов тканей и тканевых жидкостей млекопитающих хорошо известны в данной области.
Понятие «уровень экспрессии» обычно относится к количеству аминокислотного продукта или белка в образце, предпочтительно к количеству фосфорилированного аминокислотного продукта или фосфорилированного белка в образце согласно настоящему изобретению. Понятие «экспрессия» относится к процессу, посредством которого кодируемая геном информация преобразуется в структуры, присутствующие и функционирующие в клетке, и включает их фосфорилирование согласно настоящему изобретению. В контексте настоящего изобретения, «экспрессируемые гены» включают таковые, которые транскрибируются в иРНК и затем транслируются в белок и посттрансляционно модифицируются, например, фосфорилируются. Для полноты это понятие также включает экспрессируемые гены, которые транскрибируются в РНК, но не транслируются в белок (например, транспортную или рибосомную РНК). Понятия «сверхэкспрессия» и «недостаточная экспрессия» относятся к отклонению в сторону повышения или понижения относительно уровня экспрессии в образце, используемом в качестве контроля. Следовательно, понятие «сверхэкспрессия» также означает «повышенную экспрессию», а понятие «недостаточная экспрессия» означает «пониженную экспрессию».
Используемое в настоящем описании в общем смысле и в частности понятие «антитело» охватывает интактные моноклональные антитела, поликлональные антитела, поливалентные антитела (например, бивалентные), образованные, по меньшей мере, из двух интактных антител, а также фрагменты антител, при условии, что они проявляют желаемую биологическую активность.
Понятие «моноклональное антитело» в контексте настоящего изобретения относится к антителу, полученному из популяции в основном гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, являются одинаковыми, за исключением возможных естественных мутаций, которые могут присутствовать в небольших количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифическими, направленными против одного антигенного сайта. Кроме того, в противоположность препаратам поликлональных антител, которые включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты на антигене. В дополнение к их специфичности, моноклональные антитела обладают тем преимуществом, что их можно синтезировать незагрязненными другими антителами. Определение «моноклональное» обозначает характер антитела, полученного в основном из гомогенной популяции антител, и не ограничивается необходимостью получения антитела каким-либо определенным методом. Например, моноклональные антитела для применения по настоящему изобретению могут быть получены гибридомным методом, впервые описанным G.Kohler и др. в Nature, 256, 1975, с.495, или могут быть получены методами рекомбинантных ДНК (см., например, патент US 4816567). «Фрагменты антител» включают часть интактного антитела.
Антитело, которое «связывает» антиген, представляющий интерес в соответствии с настоящим изобретением, т.е. фосфорилированный белок МАПК или фосфорилированный белок рАКТ, является таковым, способным связываться с этим антигеном с достаточным сходством, исходя из условия, что антитело пригодно для определения наличия антигена. Антитело по настоящему изобретению является антителом, которое связывает фосфорилированный белок МАПК или фосфорилированный белок рАКТ, обычно оно предпочтительно связывает фосфорилированный белок МАПК или фосфорилированный белок рАКТ в противоположность нефосфорилированному белку МАПК или нефосфорилированному белку рАКТ, или не дает значительной перекрестной реакции с нефосфорилированным белком МАПК или нефосфорилированным белком рАКТ. В таких вариантах осуществления настоящего изобретения степень связывания антитела с нефосфорилированными белками составляет менее 10%, что было определено с помощью анализа разделения клеток по интенсивности флюоресценции (FACS) или радиоиммунопреципитации (РИП). Другими словами, оно специфически связывает фосфорилированный белок МАПК или фосфорилированный белок рАКТ, и не специфически связывает или не полностью связывает нефосфорилированный белок МАПК или нефосфорилированный белок рАКТ.
«Химиотерапевтический агент» представляет соединение, пригодное для лечения рака. Примеры химиотерапевтических агентов включают алкилирующие агенты, например, тиотеп и циклофосфамид (продукт CYTOXAN™), алкилсульфонаты, например, бусульфан, импросульфан и пипосульфан, азиридины, например, бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа, этиленимины и метиламеламины, включая алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилоломеламин, азотистые иприты, например, хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорфосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлоретамин, мехлоретаминоксид гидрохлорид, мелфалан, новембихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урацилиприт, нитрозомочевины, например, кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин, антибиотики, например, аклациномицины, актиномицин, антрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, калихеамицин, карабицин, карминомицин, карцинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин, эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, порфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин, антиметаболиты, например, метотрексат и 5-фторурацил (5-ФУ), аналоги фолиевой кислоты, например, деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат, аналоги пуринов, например, флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин, аналоги пиримидинов, например, анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин, 5-ФУ, андрогены, например, калустерон, дромостанолонпропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон, антиадреналины, например, аминоглютетимид, митотан, трилостан, усилители фолиевой кислоты, например, фролиниковая кислота, ацеглатон, альдофосфамидгликозид, аминолевулиновая кислота, амсакрин, бестрабуцил, бисантрен, эдатраксат, дефофамин, демеколцин, диазихинон, элформитин, ацетат эллиптиния, этоглуцид, нитрат галлия, гидроксимочевина, лентинан, лонидамин, митогуазон, митоксантрон, мопидамол, нитракрин, пентостатин, фенамет, пирарубицин, подофиллиновая кислота, 2-этилгидразид, прокарбазин, продукт PSK®, разоксан, сизофиран, спирогерманий, тенуазоновая кислота, триазихинон, 2,2,2''-трихлортриэтиламин, уретан, виндезин, дакарбазин, манномустин, митобронитол, митолактол, пипоброман, гацитозин, арабинозид («Ara-С»), циклофосфамид, тиотепа, таксаны, например, паклитаксел (продукт TAXOL®, фирма Bristol-Myers Squibb Oncology, Принстон, Нью-Джерси) и доцетаксел (продукт TAXOTERE®, фирма Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Франция), хлорамбуцил, гемцитабин, 6-тиогуанин, меркаптопурин, метотрексат, аналоги платины, например, цисплатин и карбоплатин, винбластин, платина, этопозид (VP-16), ифосфамид, митомицин С, митоксантрон, винкристин, винорелбин, навелбин, новантрон, тенипозид, дауномицин, аминоптерин, кселода, ибандронат, СРТ-11, ингибитор топоизомеразы RFS 2000, дифторметилорнитин (DMFO), ретиноевая кислота, эсперамицины, капецитабин, и фармацевтически приемлемые соли, кислоты и производные какого-либо из вышеуказанных соединений. Также в это определение включены антигормональные агенты, которые регулируют или ингибируют действие гормонов на опухоли, например, антиэстрогены, включая, например, тамоксифен, ралоксифен, ингибирующие ароматазу 4(5)-имидазолы, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон и торемифен (фарестон), и антиандрогены, например, флутамид, нилутамид, бикалутамид, леупролид и гозерелин, и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные какого-либо из вышеуказанных соединений. Сам «химиотерапевтический агент» может представлять комбинацию указанных выше химических соединений, пригодных для лечения рака, т.е. комбинация может представлять гемцитабин/цисплатин, а также, например, цисплатин/паклитаксел, цисплатин/доцетаксел, цисплатин/винорелбин, гемцитабин/карбоплатин или карбоплатин/доцетаксел.
Понятие «ингибитор EGFR» относится к терапевтическому агенту, который связывается с EGFR и, необязательно, ингибирует активацию EGFR. Примеры таких агентов включают антитела и мелкие молекулы, которые связываются с EGFR. Примеры антител, которые связываются с EGFR, включают моноклональные антитела MAb 579 (АТСС CRL НВ 8506), MAb 455 (АТСС CRL НВ8507), MAb 225 (АТСС CRL 8508), MAb 528 (АТСС CRL 8509) (см., US 4943533, Mendelsohn и др.) и их варианты, например, химерный 225 (С225 или цетуксимаб, продукт ERBUTIX®), и реконструированное человеческое антитело 225 (Н225) (см., WO 96/40210), антитела, которые связывают мутантный тип 11EGFR (US 5212290), гуманизированные и химерные антитела, которые связывают EGFR, что описано в US 5891996, человеческие антитела, которые связывают EGFR, например, ABX-EGF (см. WO 98/50433, фирма Abgenix). Антитело против EGFR может быть конъюгировано с цитотоксическим агентом, с образованием, таким образом, иммуноконъюгата (см., например, ЕР 0659439 А2, Merck Patent GmbH). Примеры малых молекул, которые связываются с EGFR, включают ZD1839 или гефитиниб (продукт IRESSA™, фирма Astra Zeneca), CP-358774 (продукт Tarceva®, фирма Genentech/OSI) и AG1478, AG1571 (продукт SU 5271, фирма Sugen). Особо предпочтительными в этой заявке являются ингибиторы тирозинкиназы EGFR, например, особенно ингибиторы тирозинкиназы EGFR с небольшими молекулами, например продукт Tarceva®. «Небольшая молекула» может быть, например, пептидом или пептидомиметиком с молекулярной массой менее примерно 10000 г на моль, предпочтительно менее примерно 5000 г на моль. Предпочтительно «небольшая молекула» является соединением, т.е. органическим или неорганическим соединением, с молекулярной массой менее примерно 5000 г на моль, предпочтительно менее примерно 1000 г на моль, более предпочтительно менее 500 г на моль, и солями, сложными эфирами и другими фармацевтически приемлемыми формами таких соединений. Поэтому в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения ингибитор EGFR является ингибитором тирозинкиназы EGFR, который является соединением с молекулярной массой менее, примерно, 5000 г на моль, предпочтительно менее примерно 1000 г на моль, и солями, сложными эфирами и другими фармацевтически приемлемыми формами такого соединения. Другими словами, ингибитор EGFR является соединением, которое ингибирует активность тирозинкиназы EGFR и которое имеет молекулярную массу менее примерно 5000 г на моль, предпочтительно менее примерно 1000 г на моль, более предпочтительно менее 500 г на моль, и солями, сложными эфирами и другими фармацевтически приемлемыми формами такого соединения.
«Гемцитабин» является химиотерапевтическим агентом 2',2'-дифтордезоксицитидином (dFdC), который является пиримидиновым аналогом дезоксицитидина, у которого дезоксирибозная часть в 2'-положении содержит два атома фтора (см. V.Heinemann и др., Cancer Res, 48, 1988, с.4024). Он имеется в продаже в качестве продукта Gemzar® от фирмы Eli Lilly and Company, Индианаполис, штат Индиана, США.
«Цисплатин» в контексте этой заявки является химиотерапевтическим агентом цис-диаминодихлорплатиной (см. US 5562925), который коммерчески доступен в качестве продукта Platinol® от фирмы Bristol-Myers Squibb Company, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк, США. «Цисплатин» является комплексом тяжелого металла, содержащим центральный атом платины, окруженный двумя атомами хлора и двумя молекулами аммиака в цис-положении.
Согласно настоящему изобретению выражение «биологический образец», содержащий клетки рака легкого человека, чувствителен к комбинации ингибитора рецептора фактора роста эпидермиса и химиотерапевтического агента» означает, что биологический образец, содержащий клетки рака легкого человека, чувствителен к лечению комбинацией ингибитора рецептора фактора роста эпидермиса и химиотерапевтического агента в противоположность лечению только одним ингибитором рецептора фактора роста эпидермиса. Понятие «чувствительный» также можно понимать в качестве «реагирующего на» или «показывающего реакцию на», особенно такую реакцию, которая оказывает лечебное воздействие на пациента с раком легкого. Таким образом, можно установить является ли пациент с раком легкого чувствительным к лечению комбинацией ингибитора рецептора фактора роста эпидермиса и химиотерапевтического агента в противоположность лечению только одним ингибитором рецептора фактора роста эпидермиса. Это означает, что такое лечение будет эффективно для пациента.
Белок "МАПК" является членом высоко консервативного цитозольного семейства серин/треониновых протеинкиназ, известных в качестве митоген-активируемых протеинкиназ (МАПК) или внеклеточных сигнал-регулируемых киназ (ERK). Это семейство белков включает несколько подгрупп. ERK активируются и фосфорилируются по тирозину или треонину в ответ на широкое разнообразие внеклеточных сигналов, включая осмотический стресс, тепловой шок, провоспалительные цитокины, гормоны и митогены. Понятие «белок МАПК» в контексте настоящего изобретения предпочтительно относится к членам семейства белков МАПК, включающего или предпочтительно состоящего из МАПК1 и МАПКЗ. Аминокислотные последовательности МАПК1 (ERK2) представляют (SEQ ID NO:1) и МАПК3 (ERK1) - (SEQ ID NO:2). Эти аминокислотные последовательности кодируются последовательностями иРНК, т.е. кДНК последовательностями SEQ ID NO:3 и 4 для МАПК1 и SEQ ID NO:5 для МАПК 3. Основными участками фосфорилирования в МАПК1 являются Thr-185 и Tyr185 и основными участками фосфорилирования в МАПК3 являются Thr202 и Tyr204. Эти участки фосфорилирования также распознаются антителом, применяемым в настоящем изобретении, т.е. предпочтительно поликлональной сывороткой к фосфорилированным формам МАПК1 и МАПК3.
Понятие «белок Akt» относится к белкам подсемейства Akt/PKB, регулируемым вторичным мессенджером серин/треониновых протеинкиназ, который представлен тремя членами, обозначаемыми Akt1/PKB-альфа, Akt2/РКВ-бета (S.P.Staal, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1987, cc.5034-5037) и Akt3/РКВ-гамма (K.Nakatani и др., Biochem. Biophys. Res. Comm., 257, 1999, cc.906-910; US 6881555), соответственно. Изоформы являются гомологичными и активируются путем фосфорилирования в ответ на сигнал фосфатидилинозит-3'-ОН-киназы (PI3K). Метаболический путь PI3K/Akt/PKB, по-видимому, важен для регулирования клеточного выживания/клеточной гибели (H.Dudek и др., Science, 275, 1997, cc.661-665), а также для онкогенеза. Понятие «белок Akt» в контексте настоящего изобретения предпочтительно относится к членам семейства белков Akt, включающего или предпочтительно состоящего из Akt1, Akt2 и Akt3. Фосфорилирование Akt1/PKB-альфа происходит по двум участкам Thr308 и Ser473 (R.Meier и др., J. Biol. Chem., 272, 1997, cc.30491-30497). Эквивалентные участки фосфорилирования находятся в Akt2/PKB-бета (Thr309 и Ser474) и Akt3/PKB-гамма (Thr305 и Ser472). Понятие «фосфорилированный белок Akt» относится к фосфорилированному белку «Akt», предпочтительно фосфорилированному на указанных выше участках. Понятие «белок МАПК» в контексте настоящего изобретения предпочтительно относится к членам семейства белков МАПК, включающего или предпочтительно состоящего из МАПК1 и МАПК3. Akt 1 также известен в качестве серин/треониновой протеинкиназы человека RAC-alpha (EC 2.7.1.37) (RAC-PK-альфа), протеинкиназы В (РКВ) (С-АКТ) и аминокислотная последовательность Akt 1 представляет последовательность SEQ ID NO:6. AKT2 также известен в качестве серин/треониновой протеинкиназы человека RAC-бета (ЕС 2.7.1.37) (RAC-PK-бета), протеинкиназы Akt-2 или протеинкиназы В, бета (РКВ бета), и аминокислотная последовательность Akt 2 представляет последовательность SEQ ID NO:7. AKT3 также известен в качестве серин/треониновой протеинкиназы человека RAC-гамма (ЕС 2.7.1.37) (RAC-PK-гамма), протеинкиназы Akt-3 или протеинкиназы В, гамма (РКВ гамма) (STK-2), и аминокислотная последовательность Akt 3 представляет последовательность SEQ ID NO:8.
Подробное описание изобретения
Традиционные методы молекулярной биологии и химии нуклеиновых кислот, которые находятся в пределах компетентности в данной области техники, описаны в литературе. См., например, J.Sambrooket и др. «Molecular Cloning: A Laboratory Manual», Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк, 1989, «Oligonucleotide Synthesis - A Practical Approach», под ред. M.J.Gait, IRL Press, 1984, «Nucleic Acid Hybridisation - A Practical Approach», под ред. B.D Hames и S.J.Higgins, IRL Press, 1985, и серии «Methods in Enzymology», Academic Press, Inc., все из которых включены в настоящее описание в качестве ссылок. Все указанные в настоящем описании патенты, заявки на патенты и публикации, которые приведены выше и ниже, включены в настоящее описание в качестве ссылок.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предусматривается способ определения чувствительности биологического образца, включающего клетки рака легкого человека, к комбинации ингибитора рецептора фактора роста эпидермиса и химиотерапевтического агента, включающий определение сверхэкспрессии фосфорилированного белка АКТ и/или фосфорилированного белка МАПК в биологическом образце, при этом сверхэкспрессия фосфорилированного белка АКТ и/или фосфорилированного белка МАПК указывает на то, что биологический образец, включающий клетки рака легкого человека, является чувствительным к комбинации ингибитора рецептора фактора роста эпидермиса и химиотерапевтического агента.
Предпочтительно в способе по настоящему изобретению сверхэкспрессию фосфорилированного белка АКТ и/или фосфорилированного белка МАПК в биологическом образце выявляют следующим путем:
а) определением в биологическом образце уровня экспрессии фосфорилированного белка АКТ и/или фосфорилированного белка МАПК,
б) определением уровня экспрессии фосфорилированного белка АКТ и/или фосфорилированного белка МАПК в биологическом образце, включающем клетки рака легкого человека, которые не чувствительны к комбинации ингибитора рецептора фактора роста эпидермиса и химиотерапевтического агента,
в) выявлением разницы уровней экспрессии фосфорилированного белка АКТ и/или фосфорилированного белка МАПК, установленных на стадиях а) и б), в соответствии с чем выявляют сверхэкспрессию фосфорилированного белка АКТ и/или фосфорилированного белка МАПК.
Предпочтительно разность уровней экспрессии фосфорилированного белка АКТ и/или фосфорилированного белка МАПК, установленных на стадиях а) и б), составляет по меньшей мере 10%. Более предпочтительно, разность уровней экспрессии фосфорилированного белка АКТ и/или фосфорилированного белка МАПК, установленных на стадиях а) и б), составляет по меньшей мере 25%. В другом варианте осуществления настоящего изобретения, разность уровней экспрессии фосфорилированного белка АКТ и/или фосфорилированного белка МАПК, установленных на стадиях а) и б), составляет по меньшей мере 50%, 75%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 300%, 400%, 500% или 1000%. Разница уровней экспрессии фосфорилированного белка АКТ и/или фосфорилированного белка МАПК, установленных на стадиях а) и б), может достигать 10000 или 50000%. Разница уровней экспрессии фосфорилированного белка АКТ и/или фосфорилированного белка МАПК, установленных на стадиях а) и б), составляет предпочтительно от 10% до 10,000%, более предпочтительно 25%-10000%, 50%-10000%, 100%-10000%, еще более предпочтительно 25%-5000%, 50%-5000%, 100%-5000%.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, биологический образец представлен первичной опухолью легкого или метастазом (местным или отдаленным), который может быть получен, например, путем биопсии легкого или путем биопсии других органов. Метастаз может быть представлен также отдаленным метастазом, например, в печень или лимфоузел. Следует отметить, что такой отдаленный метастаз также содержит клетки рака легкого, поскольку метастазы происходят от легкого.
В другом предпочтительном варианте настоящего изобретения рак представлен другим раком, отличным от рака легкого, например, раком поджелудочной железы. Однако пригодны также и другие раки в виде солидных опухолей, например, рак яичника, колоректальный рак, рак головы и шеи, почечно-клеточная карцинома, глиома и раки желудочно-кишечного тракта, особенно рак желудка.
В другом предпочтительном варианте настоящего изобретения ингибитор EGFR представлен ингибиторами тирозинкиназы EGFR, особенно ингибиторами тирозинкиназы EGFR с небольшими молекулами, например, препаратом Tarceva®. Следовательно, другими словами, в особо предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения ингибитором EGFR является эрлотиниб или N-(3-этинилфенил)-6,7-втор(2-метоксиэтокси)хиназолин-4-амин.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, химиотерапевтическим агентом является гемцитабин и/или цисплатин.
В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения сверхэкспрессию фосфорилированного белка Akt или фосфорилированного белка МАПК устанавливают с использованием реагента, который специфически связывается с фосфорилированным белком и предпочтительно не специфически связывается или совсем не связывается с нефосфорилированным белком. Предпочтительно антитело, производное антитела или фрагмент антитела специфически связывается с фосфорилированным белком АКТ или фосфорилированным белком МАПК и предпочтительно не специфически связывается или совсем не связывается с нефосфорилированным белком АКТ или нефосфорилированным белком МАПК.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения фосфорилированный белок АКТ фосфорилирован по аминокислоте в положении, соответствующем аминокислотному положению 473 белка Akt1, или белок МАПК фосфорилирован по аминокислотам в положениях, соответствующим аминокислотным положениям 202 и 204 белка МАПК1. Предпочтительно аминокислотная последовательность белка МАПК является аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1 или 2, а аминокислотная последовательность белка АКТ является аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:6, 7 или 8.
Существует много различных типов иммунологических анализов, которые можно использовать в способе настоящего изобретения, например, твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), иммунофлуоресцентный анализ (ИФлА), иммунохемилюминесцентный анализ (ИХЛА), радиоиммунный анализ (РИА) и иммуноблоттинг. Обзор различных пригодных методов иммуноанализа см. в кн.: «Bioanalytik», под ред. Lottspeich и Zorbas, 1998, изд.1, изд-во Spektrum Akademischer Verlag, Гейдельберг, Берлин, Германия. Поэтому в еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения уровень экспрессии определяют с использованием метода, выбранного из группы, состоящей из протеомики, проточной цитометриии, иммуноцитохимии, иммуногистохимии и твердофазного иммуноферментного анализа.
В предпочтительном варианте настоящего изобретения, сверхэкспрессию фосфорилированного белка АКТ и/или фосфорилированного белка МАПК определяют путем
а) иммуногистохимического окрашивания биологического образца,
б) присвоения оценки по бальной шкале в баллах 1, 2, 3 и 4 уровню экспрессии фосфорилированного белка АКТ и/или фосфорилированного белка МАПК на основе визуального контроля окрашивания клеток в биологическом образце, в соответствии с чем устанавливается наивысшая обнаруживаемая оценка уровня экспрессии,
в) определения процентного отношения клеток с наивысшей обнаруживаемой оценкой в иммуногистохимически окрашенном биологическом образце,
г) умножения присвоенной оценки с процентным отношением клеток с наивысшей обнаруживаемой оценкой в иммуногистохимически окрашенном биологическом образце на 100, и
д) определения сверхэкспрессии фосфорилированного белка АКТ и/или фосфорилированного белка МАПК в биологическом образце, когда результат умножения на стадии г) превышает 100.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривается способ определения чувствительности биологического образца, включающего клетки рака легкого человека, к комбинации ингибитора рецептора фактора роста эпидермиса и химиотерапевтического агента, включающий определение сверхэкспрессии фосфорилированного белка АКТ и/или фосфорилированного белка МАПК в образце, полученном от пациента, при этом сверхэкспрессия фосфорилированного белка АКТ и/или фосфорилированного белка МАПК указывает, что комбинация ингибитора фактора роста эпидермиса и химиотерапевтического агента оказывает лечебное воздействие на пациента. Все другие вышеописанные предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения в равной степени применимы к этому варианту его осуществления. Предпочтительно в способе по настоящему изобретению сверхэкспрессию фосфорилированного белка АКТ и/или фосфорилированного белка МАПК в образце, полученном от пациента, устанавливают путем
а) определения уровня экспрессии фосфорилированного белка АКТ и/или фосфорилированного белка МАПК в образце, полученном от пациента,
б) определения уровня экспрессии фосфорилированного белка АКТ и/или фосфорилированного белка МАПК в образце, полученном от пациента с раком легкого, на которого не оказывает лечебного воздействия комбинация ингибитора фактора роста эпидермиса и химиотерапевтического агента,
в) определения разницы уровней экспрессии фосфорилированного белка АКТ и/или фосфорилированного белка МАПК, установленных на стадиях а) и б), при этом устанавливая сверхэкспрессию фосфорилированного белка АКТ и/или фосфорилированного белка МАПК. Понятие «лечебное воздействие» означает, что пациент не имеет благоприятного результата лечения комбинацией ингибитора фактора роста эпидермиса и химиотерапевтического агента в противоположность лечению одним ингибитором фактора роста эпидермиса.
В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения для определения чувствительности биологического образца, включающего клетки рака легкого человека, к комбинации ингибитора фактора роста эпидермиса и химиотерапевтического агента, применяется антитело, которое связывается с фосфорилированным белком АКТ, или антитело, которое связывается с фосфорилированным белком МАПК.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения предусматривается способ выбора композиции для ингибирования прогрессирования рака легкого у пациента, включающий:
а) раздельную экспозицию аликвот полученного от пациента биологического образца, включающего клетки рака легкого, которые чувствительны к комбинации ингибитора EGFR и химиотерапевтического агента, в присутствии множества тестируемых композиций;
б) сравнение уровня экспрессии фосфорилированного белка Akt и/или фосфорилированного белка МАПК в аликвотах биологического образца, подвергавшихся контакту с тестируемыми композициями, и уровня экспрессии фосфорилированного белка Akt и/или фосфорилированного белка МАПК в аликвоте биологического образца, не контактировавшей с тестируемыми композициями,
в) выбор одной из тестируемых композиций, которая изменяет уровень экспрессии фосфорилированного белка Akt и/или фосфорилированного белка МАПК в аликвоте, содержащей эту тестируемую композицию, по сравнению с аликвотой, не контактировавшей с тестируемой композицией, где, по меньшей мере, 10% различие между уровнем экспрессии фосфорилированного белка Akt и/или фосфорилированного белка МАПК в аликвоте биологического образца, подвергавшейся контакту с тестируемой композицией, и уровнем экспрессии фосфорилированного белка Akt и/или фосфорилированного белка МАПК в аликвоте биологического образца, не подвергавшейся контакту с тестируемой композицией, является основанием для выбора тестируемой композиции.
Предпочтительно разница уровней экспрессии фосфорилированного белка АКТ и/или фосфорилированного белка МАПК на стадии в) составляет по меньшей мере 25%. Более предпочтительно разность уровней экспрессии фосфорилированного белка АКТ и/или фосфорилированного белка МАПК на стадии в) составляет по меньшей мере 50%. В другом варианте осуществления, разность уровней экспрессии фосфорилированного белка АКТ и/или фосфорилированного белка МАПК на стадии в) составляет по меньшей мере 75%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 300%, 400%, 500% или 1000%. Разность уровней экспрессии фосфорилированного белка АКТ и/или фосфорилированного белка МАПК, установленная на стадии в), может достигать 10000% или 50000%. Разница уровней экспрессии фосфорилированного белка АКТ и/или фосфорилированного белка МАПК, установленная на стадии в) составляет предпочтительно от 10% до 10000%, более предпочтительно 25%-10000%, 50%-10000%, 100%-10000%, еще предпочтительнее 25%-5000%, 50%-5000%, 100%-5000%.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения предусматривается способ выявления потенциального агента, при этом указанный способ включает:
а) контактирование аликвоты биологического образца, содержащего клетки рака легкого, которые чувствительны к ингибитору EGFR и химиотерапевтическому агенту, с потенциальным агентом,
б) определение уровня экспрессии фосфорилированного белка Akt и/или фосфорилированного белка МАПК в аликвоте биологического образца, подвергавшейся контакту с потенциальным агентом, и определение уровня экспрессии фосфорилированного белка Akt и/или фосфорилированного белка МАПК в аликвоте биологического образца, не подвергавшейся контакту с потенциальным агентом,
в) отслеживание действия потенциального агента путем сравнения уровня экспрессии фосфорилированного белка Akt и/или фосфорилированного белка МАПК в аликвоте биологического образца, подвергавшейся контакту с потенциальным агентом, и уровня экспрессии фосфорилированного белка Akt и/или фосфорилированного белка МАПК в аликвоте биологического образца, не подвергавшейся контакту с потенциальным агентом,
г) выявление указанного агента по указанному наблюдаемому действию, при котором по меньшей мере 10% различие между уровнем экспрессии фосфорилированного белка Akt и/или фосфорилированного белка МАПК в аликвоте биологического образца, подвергавшейся контакту с потенциальным агентом, и уровнем экспрессии фосфорилированного белка Akt и/или фосфорилированного белка МАПК в аликвоте биологического образца, не подвергавшейся контакту с потенциальным агентом, указывает на действие потенциального агента.
Предпочтительно разность уровней экспрессии фосфорилированного белка АКТ и/или фосфорилированного белка МАПК на стадии г) составляет по меньшей мере 25%. Более предпочтительно разность уровней экспрессии фосфорилированного белка АКТ и/или фосфорилированного белка МАПК на стадии г) составляет по меньшей мере 50%. В другом варианте осуществления, разность уровней экспрессии фосфорилированного белка АКТ и/или фосфорилированного белка МАПК на стадии г) составляет по меньшей мере 75%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 300%, 400%, 500% или 1000%. Разность уровней экспрессии фосфорилированного белка АКТ и/или фосфорилированного белка МАПК, установленная на стадии г) может достигать 10000% или 50000%. Разница уровней экспрессии фосфорилированного белка АКТ и/или фосфорилированного белка МАПК, установленная на стадии г) предпочтительно составляет от 10% до 10000%, более предпочтительно 25%-10000%, 50%-10000%, 100%-10000%, еще предпочтительнее 25%-5000%, 50%-5000%, 100%-5000%.
В предпочтительном варианте осуществления указанный потенциальный агент является потенциальным ингибирующим агентом или агентом, усиливающим потенциальный агент.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривается потенциальный агент, выявленный способом согласно настоящему изобретению.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения предусматривается фармацевтический препарат, включающий агент по настоящему изобретению.
Кроме того, в другом варианте осуществления агент по настоящему изобретению применяется для получения композиции для ингибирования прогрессирования рака легкого.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения, предусматривается способ получения лекарственного средства, включающий стадии способа настоящего изобретения, и
(i) синтез потенциального агента, установленного на стадии (в), или его аналога или производного в количестве, достаточном для обеспечения субъекта указанным лекарственным препаратом в терапевтически эффективном количестве, и/или
(ii) соединение потенциального агента для потенциального лекарственного средства, установленного на стадии (в), или его аналога или производного, с фармацевтически приемлемым носителем.
В еще одном варианте осуществления белок Akt, белок МАПК, фосфорилированный белок Akt, фосфорилированный белок МАПК, антитело, селективно связывающееся с фосфорилированным белком Akt или фосфорилированным белком МАПК, применяются для выявления потенциального агента или для выбора композиции для ингибирования прогрессирования рака легкого у пациента.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения рассматривается набор, включающий антитело против фосфорилированного белка МАПК и/или фосфорилированного белка Akt. Такие наборы, известные в данной области, дополнительно включают пластиковые изделия, которые можно использовать во время процесса амплификации, например, 96- и 384-луночные микропланшеты или пробирки для проведения реакции, изготовленные, например, фирмой Eppendorf, Гамбург, Германия, и все другие реактивы для выполнения методов по настоящему изобретению, предпочтительно иммуноанализа, например, твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), иммунофлуоресцентного анализа (ИФлА), иммунохемилюминесцентного анализа (ИХЛА), радиоиммунного анализа (РИА) и иммуноблоттинга. В качестве обзора различных методов иммуноанализа и реактивов, которые можно использовать, см. в кн.: «Bioanalytik», под ред. Lottspeich и Zorbas, 1998, изд.1, изд-во Spektrum Akademischer Verlag, Гейдельберг, Берлин, Германия.
Следующие примеры, ссылки, перечни последовательностей и фигуры предназначены для лучшего понимания настоящего изобретения, объем которого изложен в прилагаемой формуле изобретения. Следует понимать, что в указанных методах могут допускаться модификации, без отступления от сущности изобретения.
Описание чертежей
Фиг.1. Кривые Каплана-Мейера для анализа времени до смерти (OS) среди всех пациентов случайным образом распределенных для лечения с использованием эрлотиниба/гемцитабина/цисплатина (А) или плацебо/гемцитабина/цисплатина (круги указывают время цензурированных наблюдений, если наблюдение заканчивалось до наступления события).
Фиг.2. Кривые Каплана-Мейера для анализа времени до смерти (OS) среди пациентов с биомаркерными данными, случайным образом распределенных для лечения с использованием эрлотиниба/гемцитабина/цисплатина (А) или плацебо/ гемцитабина/цисплатина (круги указывают время цензурированных наблюдений, когда наблюдение заканчивалось до наступления события).
Фиг.3. Кривые Каплана-Мейера для анализа времени до прогрессирования заболевания/смерти (PFS) среди всех пациентов, случайным образом распределенных для лечения с использованием эрлотиниба/гемцитабина/цисплатина (А) или плацебо/гемцитабина/цисплатина (круги указывают время цензурированных наблюдений, когда наблюдение заканчивалось до наступления события).
Фиг.4. Кривые Каплана-Мейера для анализа времени до прогрессирования заболевания/смерти (PFS) среди всех пациентов с биомаркерными данными, случайным образом распределенных для лечения с использованием эрлотиниба/гемцитабина/цисплатина (А) или плацебо/гемцитабина/цисплатина (круги указывают время цензурированных наблюдений, когда наблюдение заканчивалось до наступления события).
Фиг.5. Кривые Каплана-Мейера для анализа времени до смерти (OS) среди всех пациентов с биомаркерными данными, получавших лечение с применением плацебо/гемцитабина/цисплатина, при сравнении пациентов с рМАПК Н-счет≥100 (Н) с пациентами с рМАПК Н-счет<100 (круги указывают время цензурированных наблюдений, когда наблюдение заканчивалось перед наступлением события).
Фиг.6. Кривые Каплана-Мейера для анализа времени до смерти (OS) среди всех пациентов с биомаркерными данными с рМАПК Н-счет<100, при сравнении лечения с применением эрлотиниба/гемцитабина/цисплатина (А) с лечением с применением плацеба/гемцитабина/цисплатина (круги указывают время цензурированных наблюдений, когда наблюдение заканчивалось до наступления события).
Фиг.7. Кривые Каплана-Мейера для анализа времени до смерти (OS) среди всех пациентов с биомаркерными данными с рМАПК Н-счет<100 и рМАПК Н-счет≥100, при сравнении лечения с применением эрлотиниба/гемцитабина/цисплатина (LA, НА) с лечением с применением плацеба/гемцитабина/цисплатина (Н), соответственно, (круги указывают время цензурированных наблюдений, когда наблюдение заканчивалось до наступления события).
Фиг.8. Кривые Каплана-Мейера для анализа времени до прогрессирования заболевания/смерти (PFS) среди всех пациентов с биомаркерными данными с рМАПК Н-счет<100 и рМАПК Н-счет≥100, при сравнении лечения с применением эрлотиниба/гемцитабина/цисплатина (LA, НА) с лечением с применением плацеба/гемцитабина/цисплатина (H), соответственно, (круги указывают время цензурированных наблюдений, когда наблюдение заканчивалось до наступления события).
Фиг.9. Кривые Каплана-Мейера для анализа времени до смерти (OS) среди всех пациентов с биомаркерными данными, получавших лечение с применением плацеба/гемцитабина/цисплатина, при сравнении рАКТ1 Н-счет<300 (L) и рАКТ1 Н-счет≥300 (Н) (круги указывают время цензурированных наблюдений, когда наблюдение заканчивалось до наступления события).
Фиг.10. Кривые Каплана-Мейера для анализа времени до смерти (OS) среди всех пациентов с биомаркерными данными, получавших эрлотиниб/гемцитабин/цисплатин, при сравнении рАКТ1 Н-счет<300 (L) и рАКТ1 Н-счет≥300 (Н) (круги указывают время цензурированных наблюдений, когда наблюдение заканчивалось до наступления события).
Фиг.11. Кривые Каплана-Мейера для анализа времени до смерти (OS) среди всех пациентов с биомаркерными данными, рАКТ1 Н-счет<300 (L) и рАКТ1 Н-счет≥300 (Н), при сравнении лечения с применением эрлотиниба/гемцитабина/цисплатина (LA, НА) с лечением с применением плацеба/гемцитабина/цисплатина (Н), соответственно, (круги указывают время цензурированных наблюдений, когда наблюдение заканчивалось до наступления события).
Пример 1. Биомаркерный анализ на образцах опухолевой ткани
Целью анализов, основанных на использовании опухолевых биомаркеров, для клинического исследования, является идентификация таких маркеров или комбинаций маркеров, которые лучше всего прогнозируют положительный или отрицательный исход болезни при лечении с применением продукта Tarceva®. Поскольку клинические результаты настоящего исследования не позволяют сделать предположений по отбору групп пациентов, которые получают наибольшее действие от лечения с применением продукта Tarceva®, особое значение придается идентификации маркеров, по которым дифференцируют пациентов (подгруппы), которые имеют преимущества при лечении с применением комбинации с продуктом Tarceva® по сравнению с группой лечения монохимиотерапией в качестве контроля. Дополнительно проводят исследование по идентификации маркеров, на основании которых дифференцируют пациентов (подгруппы), на которых конкретная комбинация с продуктом Tarceva® оказывает отрицательное воздействие, по сравнению с группой лечения монохимиотерапией в качестве контроля.
Цель настоящего исследования заключается в анализе опухолеспецифического биомаркера, связанного с EGFR-сигнальным путем, например, EGFR, HER2, рАКТ и рМАПК.
Данные по биомаркерам коррелируют с клиническими данными (общий анализ и анализ специфического действия терапии).
Материалы и методы:
Клинические образцы:
Анализы биомаркеров проводят на выборочном множестве из 141 пациента, для которых получают фиксированные формалином заключенные в парафин (ФФЗП) блоки тканей, отобранные при первоначально поставленном диагнозе.
Антитела для ИГХ-исследования:
Антитело Белок-мишень Предварительная обработка препарата Разведение
Abcam ab8932 (фирма Abcam, Кембридж, Великобритания) рАКТ (антитело против фосфорилированного Ser 473 белка Akt) автоклавирование, 120°С/5 мин, цитратный буфер, рН9 1:450
Zymed 36-8800 (фирма Zytomed GmbH, Берлин, Германия, или фирма Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США) рМАПК (ERK1+2 Thr202/Tyr204) автоклавирование, 120°С/5 мин, цитратный буфер, рН6 1:150
Протокол ИГХ-исследования рМАПК:
1. Делают срезы толщиной примерно 3-4 мкм с парафиновых блоков с заключенной в них тканью.
2. Помещают срезы на предметные стекла и оставляют их на ночь для подсушивания.
3. Микроскопические препараты освобождают от парафина в ксилоле и затем проводят через серии растворов этанола при понижающейся концентрации:
- ксилол, в течение ночи
- ксилол, 2×10 мин
- абсолютный этанол, 2×10 мин
- 96% этанол, 2×5 мин
- 80% этанол, 1×5 мин
- 70% этанол, 2×5 мин
- ФСБР (фосфатно-солевой буферный раствор), 10 мин (буфер меняют один или два раза)
4. Возврат антигенов/предварительная обработка образца
Автоклавируют в течение 5 мин при 120°С в 1х цитратном буфере, рН 6 (фирма Biocyc GmbH, порядковый номер 400300692). Отмывают в трис-буферном растворе/фосфатно-солевом буферном растворе (ТБР/ФСБР) (1:10) в течение 5 мин
5. Блокирование пероксидазы
- Микроскопические препараты инкубируют в 3% H2O2 в течение 10 мин.
- Промывают 2×5 мин в ТБР/ФСБР.
6. Инкубация антител
- Помещают микроскопические препараты в нормальную сыворотку (1,5%) разведенную в трис-буфере или другом блокирующем растворе.
- Наносят на микроскопические препараты разбавленное 1:150 первичное антитело (продукт Zymed Rabbit anti phospho-ERK1+2 номер в каталоге 36-8800) и инкубируют их во влажной камере при 30°С в течение 2 ч.
- Промывают 2×5 мин в ТБР/ФСБР.
- Наносят на микроскопические препараты полимер для визуализации HRP (фирма Dako) и инкубируют во влажной камере при 30°С в течение 30 мин.
- Промывают 2×5 мин в ТБР/ФСБР.
7. Выявление
- Промывают микроскопические препараты в 0,05 моль трис-буфере, pH 7,6, в течение 20 мин.
- Покрывают микроскопические препараты в течение 5 мин хромогеном ДАБ (препарат Liquid DAB Dako номер в каталоге K3467) и инкубируют в течение 5-10 мин.
- Промывают микроскопические препараты деминерализованной водой в течение 5 мин для остановки цветной реакции.
- Проводят контрастное окрашивание гематоксилином (препарат Harris Hamatoxylin HTX 31000, фирма Medite GmbH)
- Ополаскивают водой
- Дифференцируют в HCl-этаноле
- «Подсинивают» в течение 5 мин в воде
- Проводят через серии повышающихся концентраций этанола
- Наносят на препарат ксилол
- Покрывают покровным стеклом
Протокол ИГХ исследования рАКТ:
Протокол аналогичен таковому для рМАПК, за исключением
Сравните с п.4.: Образец предварительно обрабатывают в цитратном буфере, pH 9 (фирма Dako номер по каталогу S2367)
Сравните с п.6.: Первичное антитело (abcam АКТ фосфо S473), разведенное 1:450 (сравните с п.6.)
Отчет по данным ИГХ:
Все результаты иммуноокрашивания оценивает один патолог. Интенсивность ядерного окрашивания (рАКТ, рМАПК) оценивают путем визуального осмотра по 4-х бальной шкале (0, 1, 2, 3). В дополнение к интенсивности ядерного окрашивания регистрируют процентное отношение положительных клеток и причину неудачного анализа (т.е. отсутствие опухолевых клеток в участке ткани или отсутствие участка ткани на ТМА микроскопическом препарате).
Предварительный статистический анализ:
Статистический анализ данных по биомаркерам направлен на исследование возможности прогнозировать клиническую эффективность и/или токсичность, в отношении каждого маркера в отдельности и/или в отношении подходящих комбинаций.
Согласно опыту многие биомаркеры показывают асимметричное статистическое распределение от пациента к пациенту и в рамках одного пациента. Часто также имеется некоторый биохимический фон этой асимметрии, в котором процесс варьирования имеет мультипликативную структуру. Асимметричные распределения связаны с проблемами, когда нужно применять линейные статистические подходы (например, регрессию). При использовании ковариатов в статистических моделях асимметрия также может затмевать результаты. Поэтому необходимо проведение приемлемых преобразований для трансформирования этих измерений в распределения с примерно гауссовой кривой. В области биомаркеров обычно выбирают преобразование формы log(x+c). Эти преобразования не изменяют порядок значений, из условия, чтобы непараметрические анализы, основанные на рангах и крайних значениях, оставались без изменений при преобразовании. Такие преобразования также являются необходимым условием, когда следует применять линейные многофакторные методы, например, дискриминантный анализ и принципиальный компонентный анализ.
Описательно исследуют основные статистические характеристики и взаимозависимости различных маркеров. Для достоверности и обоснованности проводят методологические анализы, сравнивающие различные методы измерения, например, для ИГХ. Лечебное воздействие в отношении продукта Tarceva® определяют по времени выживания (или времени до смерти, TTD), PFS-времени (времени до прогрессирования заболевания TTP/D), объективному ответу, наилучшему ответу (CR/PR/SD/PD) в качестве клинических конечных точек.
Полученные в результате этих анализов p-значения не должны интерпретироваться с позиций подтверждения, они должны рассматриваться в качестве специфического описательного средства для того, чтобы направить исследование в сторону эффективного исследуемого критерия прогнозирования. Оценку маркеров проводят на одномерном уровне в отношении их возможности (например, выявление крайних значений) для предсказания клинических конечных точек. Для изучения комбинаций маркеров применяют дополнительные многомерные методы (например, линейный дискриминантный анализ, множественная логистическая регрессия, кластерный анализ, CART методология). Проводят исследование корреляций биомаркеров и ответов с клиническими ковариатами. Испытываемые группировки, выводимые на основании биомаркеров, соответствуют времени событийных переменных (кривые Каплана-Мейера, модель пропорционального риска Кокса, логарифмический ранговый тест).
Результаты:
Анализ выборочного множества ТМА в сравнении с общей исследуемой популяцией.
Подгруппу пациентов с пробами для биомаркерного анализа сравнивают с общей исследуемой популяцией по базисным характеристикам пациентов и клиническим исходящим параметрам. Выводы показаны в таблице ниже.
  Основная клиническая популяция Подгруппа пациентов с биомаркерными данными ИГХ/FISH-анализа
  Плацебо (N=582) Tarceva® (N=580) Плацебо (N=70) Tarceva® (N=71)
Возраст (годы) 59,1 59,9 57,5 59,1
Мужчины (%) 75,3 78,6 80,0 74,6
IV стадия заболевания (%) 67,2 64,8 74,3 80,3
Аденокарцинома (%) 37,6 37,9 41,4 46,5
Число метастатических участков 3,7 3,7 3,4 4,0
Число пораженных органов 2,5 2,5 2,1 2,4
Суммарный максимальный диаметр 92,8 95,4 80,1 93,5
Средняя отягощенность симптомами 26,5 26,7 24,3 25,3
Респондеры (%) 38,3 (N=418) 42 4 (N=396) 42,3 (N=52) 43,5 (N=46)
Коэффициент риска TTD 1,035 1,217
Коэффициент риска ТТР 0,980 1,262
Полученные данные:
Подгруппа пациентов с биомаркерными данными нерепрезентативна для исследуемой популяции ВО16411. Существуют различия в отношении степеней риска по TTD и ТТР между основной группой и биомаркерной подгруппой. Пациенты, подвергшиеся лечению продуктом Tarceva®, биомаркерной подгруппы имеют худший прогноз по сравнению с основной клинической группой. Некоторые основные коварианты указывают, что биомаркерная подгруппа, и внутри этой подгруппы особенно пациенты, которых лечили препаратом Tarceva®, является группой с наибольшим числом патологических случаев по сравнению с основной исследуемой группой. Также необходимо принимать во внимание диаграммы КМ (Фиг.1-4).
Результаты ИГХ анализа рМАПК
Данные ИГХ анализа рМАПК показывают достаточный разброс, чтобы являться пригодными для дальнейшего статистического анализа.
Для выявления корреляции между экспрессией рМАПК и клиническим результатом, устанавливают крайние значения при дескриптивном статистическом анализе: Franklin Н-счет определяют по суммарной интенсивности окрашивания и процентному отношению окрашенных опухолевых клеток (pMAПK_hsco=(pMAПK_Nuclear_Staining+1)* pMAПK_Nuclear_Pos_Cells, диапазон: 0-400). «Положительным» считают окрашивание рМАПК при Н-счете=/>100, в других случаях окрашивание считают «отрицательным».
Диаграммы Каплана-Мейера показаны на фиг.5-8.
Figure 00000001
Полученные данные:
Для пациентов, получавших лечение с применением химиотерапии/плацебо «положительная» экспрессия рМАПК связана с худшим прогнозом (TTD: HR 4,882, р=0,0001), а «отрицательная» экспрессия рМАПК, по-видимому, связана с продлением выживаемости.
Тенденция: На «рМАПК-положительных» пациентов может оказывать лечебное воздействие комбинация химиотерапии/продукта Tarceva® (HR 0,500, р:0,0516) (----)
Результаты ИГХ анализа рАКТ
Данные ИГХ анализа рАКТ показывают достаточный разброс, чтобы являться пригодными для дальнейшего статистического анализа.
Для выявления корреляции между экспрессией рАКТ и клиническим результатом устанавливают крайние значения при дескриптивном статистическом анализе: Franklin Н-счет определяют по суммарной интенсивности окрашивания и процентному отношению окрашенных опухолевых клеток: (pAKT_hsco=(pAKT_Nuclear_Staining+1)* pAKT_Nuclear_Pos_Cells; диапазон: 0-400). «Положительным» считают окрашивание рАКТ при Н-счете=/>300, в других случаях окрашивание считают «отрицательным».
Диаграммы Каплана-Мейера показаны на фиг.9-11.
Figure 00000002
Полученные данные:
Для пациентов, получавших лечение с использованием химиотерапии/плацебо, «положительная» экспрессия pAKt связана с худшим прогнозом (TTD: HR 2,258, р=0,0573), а «отрицательная» экспрессия рАКТ, по-видимому, связана с продлением выживаемости.
Для пациентов, подвергшихся лечению комбинацией химиотерапии/Tarceva®, подобного различия не обнаружено.

Claims (10)

1. Способ определения чувствительности биологического образца, включающего клетки рака легкого человека, к комбинации ингибитора рецептора эпидермального фактора роста эрлотиниба - (N-(3-этинилфенил-6,7-бис(2-метоксиэтилокси)хиназолин-4-амин) и химиотерапевтического агента, включающий определение сверхэкспрессии фосфорилированного белка протеинкиназы АКТ и фосфорилированного белка МАПК (митоген-активированой протеинкиназы) или фосфорилированного белка МАПК в биологическом образце, причем фосфорилированный белок протеинкиназы АКТ (SEQ ID NO:6, 7 или 8) фосфорилирован по аминокислоте в положении, соответствующем аминокислотному положению 473 белка Akt1 и белок МАПК (SEQ ID NO:1 или 2) фосфорилирован по аминокислотам в положениях, соответствующих аминокислотным положениям 202 и 204 белка МАПК1, при котором сверхэкспрессию фосфорилированного белка АКТ и фосфорилированного белка МАПК или фосфорилированного белка МАПК в биологическом образце устанавливают путем
а) определения уровня экспрессии фосфорилированного белка АКТ и фосфорилированного белка МАПК или фосфорилированного белка МАПК в биологическом образце,
б) определения уровня экспрессии фосфорилированного белка АКТ и фосфорилированного белка МАПК или фосфорилированного белка МАПК в биологическом образце, включающем клетки рака легкого человека, которые не чувствительны к комбинации ингибитора эпидермального фактора роста эрлотиниба и химиотерапевтического агента,
в) определения разности уровней экспрессии фосфорилированного белка АКТ и фосфорилированного белка МАПК или фосфорилированного белка МАПК, установленных на стадиях а) и б), таким образом, устанавливают сверхэкспрессию фосфорилированного белка АКТ и фосфорилированного белка МАПК или фосфорилированного белка МАПК, причем сверхэкспрессия фосфорилированного белка АКТ и фосфорилированного белка МАПК или фосфорилированного белка МАПК указывает на то, что биологический образец, включающий клетки рака легкого человека, является чувствительным к комбинации ингибитора рецептора эпидермального фактора роста эрлотиниба и химиотерапевтического агента.
2. Способ по п.1, согласно которому разница уровней экспрессии фосфорилированного белка АКТ и фосфорилированного белка МАПК или фосфорилированного белка МАПК, установленных на стадиях а) и б), составляет по меньшей мере 10%.
3. Способ по п.2, согласно которому разница уровней экспрессии фосфорилированного белка АКТ и фосфорилированного белка МАПК или фосфорилированного белка МАПК, установленных на стадиях а) и б), составляет, по меньшей мере, 25%.
4. Способ по п.1, в котором биологический образец является первичной опухолью легкого или метастазом.
5. Способ по п.1, в котором химиотерапевтический агент является гемцитабином или цисплатином.
6. Способ по п.1, в котором сверхэкспрессию фосфорилированного белка Akt или фосфорилированного белка МАПК устанавливают, используя реагент, который специфически связывается с указанным фосфорилированным белком Akt или фосфорилированным белком МАПК.
7. Способ по п.6, в котором реагент, который специфически связывается с фосфорилированным белком АКТ или фосфорилированным белком МАПК, является антителом, производным антитела или фрагментом антитела.
8. Способ по п.1, в котором сверхэкспрессию фосфорилированного белка АКТ и фосфорилированного белка МАПК или фосфорилированного белка МАПК в биологическом образце определяют путем
а) иммуногистохимического окрашивания биологического образца,
б) присвоения оценки по шкале баллов 1, 2, 3 и 4 уровню экспрессии фосфорилированного белка АКТ и фосфорилированного белка МАПК или фосфорилированного белка МАПК на основе визуального контроля окрашивания клеток в биологическом образце,
в) определения процентного отношения клеток с наивысшей выявляемой оценкой в иммуногистохимически окрашенном биологическом образце,
г) умножения присвоенной оценки с процентным отношением клеток с наивысшей выявляемой оценкой в иммуногистохимически окрашенном биологическом образце на 100, и
д) определения сверхэкспрессии фосфорилированного белка АКТ и фосфорилированного белка МАПК или фосфорилированного белка МАПК в биологическом образце, если результат умножения на стадии г) превышает 100.
9. Применение фосфорилированного белка Akt и фосфорилированного белка МАПК, фосфорилированного белка МАПК или антитела, селективно связывающегося с фосфорилированным белком Akt или фосфорилированным белком МАПК, для осуществления способов по пп.1-8, причем фосфорилированный белок протеинкиназы АКТ (SEQ ID NO:6, 7 или 8) фосфорилирован по аминокислоте в положении, соответствующем аминокислотному положению 473 белка Akt1 и белок МАПК (SEQ ID NO:1 или 2) фосфорилирован по аминокислотам в положениях, соответствующих аминокислотным положениям 202 и 204 белка МАПК1.
10. Набор, включающий антитела, селективно связывающегося с фосфорилированным белком Akt или фосфорилированным белком МАПК, для применения в способах по пп.1-8.
RU2007145514/15A 2005-05-11 2006-05-10 Определение респондеров на химиотерапию RU2416096C2 (ru)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP05010244 2005-05-11
EP05010244.1 2005-05-11
EP05011070.9 2005-05-23
EP05011070 2005-05-23

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2007145514A RU2007145514A (ru) 2009-06-20
RU2416096C2 true RU2416096C2 (ru) 2011-04-10

Family

ID=36733489

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2007145514/15A RU2416096C2 (ru) 2005-05-11 2006-05-10 Определение респондеров на химиотерапию

Country Status (14)

Country Link
US (2) US7655414B2 (ru)
EP (1) EP1889066A1 (ru)
JP (2) JP4847518B2 (ru)
KR (1) KR100962162B1 (ru)
CN (1) CN102854315A (ru)
AR (1) AR053272A1 (ru)
AU (1) AU2006245962B8 (ru)
BR (1) BRPI0609096A2 (ru)
CA (1) CA2605151A1 (ru)
IL (1) IL185631A (ru)
MX (1) MX2007013973A (ru)
NO (1) NO20074389L (ru)
RU (1) RU2416096C2 (ru)
WO (1) WO2006119980A1 (ru)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2557976C2 (ru) * 2013-05-07 2015-07-27 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) Способ определения чувствительности клеток рака легкого к цисплатину на основании уровней экспрессии маркерных генов и набор для его осуществления
RU2702908C2 (ru) * 2012-11-01 2019-10-14 Инфинити Фармасьютикалз, Инк. Лечение злокачественных опухолей с использованием модуляторов изоформ pi3-киназы
RU2738167C1 (ru) * 2020-06-08 2020-12-09 федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр онкологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ определения эффективности химиотерапии препаратами платины при раке яичников III-IV стадии
RU2745730C2 (ru) * 2016-05-09 2021-03-31 Инсерм (Энститю Насьональ Де Ля Сантэ Э Де Ля Решерш Медикаль) Способы классификации пациентов с солидным раком

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR053272A1 (es) * 2005-05-11 2007-04-25 Hoffmann La Roche Determinacion de responsivos a la quimioterapia
WO2008019375A2 (en) * 2006-08-07 2008-02-14 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Proteomic patterns of cancer prognostic and predictive signatures
BRPI0717416A2 (pt) 2006-09-21 2013-11-12 Prometheus Lab Inc Método para realizar um imunoensaio complexo de alta produtividade, e, arranjo
JP4795203B2 (ja) * 2006-11-13 2011-10-19 シスメックス株式会社 アンスラサイクリン系抗癌剤の感受性判定方法及びそのシステム
ES2529790T3 (es) 2007-04-13 2015-02-25 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Métodos de tratamiento de cáncer resistente a agentes terapéuticos de ERBB
AU2008276251B2 (en) * 2007-07-13 2014-04-24 Nestec S.A. Drug selection for lung cancer therapy using antibody-based arrays
AU2008286407A1 (en) * 2007-08-14 2009-02-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Predictive markers for EGFR inhibitor treatment
ES2437122T3 (es) * 2007-08-14 2014-01-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Marcador predictivo en el tratamiento inhibidor del EGFR
EP2188390A1 (en) * 2007-08-14 2010-05-26 F. Hoffmann-Roche AG Predictive markers for egfr inhibitors treatment
WO2009052159A2 (en) 2007-10-15 2009-04-23 Precision Therapeutics, Inc. Methods for selecting active agents for cancer treatment
WO2009089521A2 (en) * 2008-01-10 2009-07-16 Nuvera Biosciences, Inc. Predictors for evaluating response to cancer therapy
NZ600339A (en) 2008-02-25 2013-12-20 Nestec Sa Drug selection for breast cancer therapy using antibody-based arrays
WO2009126543A1 (en) * 2008-04-08 2009-10-15 Nuclea Biomarkers, Llc Biomarker panel for prediction of recurrent colorectal cancer
EP2281027A4 (en) * 2008-05-14 2011-07-27 Precision Therapeutics Inc METHOD FOR PREDICTING THE REACTION OF A PATIENT TO EGFR HEMMER
US20100311084A1 (en) * 2008-05-14 2010-12-09 Precision Therapeutics, Inc. Methods for predicting a patient's response to egfr inhibitors
EP2304439A4 (en) * 2008-05-29 2012-07-04 Nuclea Biotechnologies Llc ANTI-phospho-AKT ANTIBODY
EP2667194A3 (en) * 2009-01-14 2014-06-04 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Ratio based biomarkers and methods of use thereof
US8546091B2 (en) * 2009-05-22 2013-10-01 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services AKT phosphorylation at Ser473 as an indicator for taxane-based chemotherapy
JP5795311B2 (ja) 2009-07-15 2015-10-14 ネステク ソシエテ アノニム 抗体ベースのアレイを使用する胃癌療法のための薬物選択
US9719995B2 (en) 2011-02-03 2017-08-01 Pierian Holdings, Inc. Drug selection for colorectal cancer therapy using receptor tyrosine kinase profiling
WO2013033623A1 (en) 2011-09-02 2013-03-07 Nestec S.A. Profiling of signal pathway proteins to determine therapeutic efficacy
CN104271583B (zh) * 2012-01-24 2017-10-24 米伦纽姆医药公司 治疗鼻咽癌的方法
EP2810066B1 (en) * 2012-01-24 2019-07-31 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods of treatment of cancer
JP5383836B2 (ja) 2012-02-03 2014-01-08 ファナック株式会社 検索ウィンドウを自動的に調整する機能を備えた画像処理装置
KR102456088B1 (ko) 2014-04-04 2022-10-19 델 마 파마슈티컬스 폐의 비소세포 암종 및 난소암을 치료하기 위한 디안하이드로갈락티톨 및 이의 유사체 또는 유도체
WO2017095632A1 (en) 2015-11-30 2017-06-08 Mayo Foundation For Medical Education And Research Heatr1 as a marker for chemoresistance

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5562925A (en) 1970-04-20 1996-10-08 Research Corporation Tech. Inc. Anti-tumor method
CU22545A1 (es) 1994-11-18 1999-03-31 Centro Inmunologia Molecular Obtención de un anticuerpo quimérico y humanizado contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico para uso diagnóstico y terapéutico
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4943533A (en) 1984-03-01 1990-07-24 The Regents Of The University Of California Hybrid cell lines that produce monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
CA2066428C (en) 1989-09-08 2000-11-28 Bert Vogelstein Structural alterations of the egf receptor gene in human gliomas
DE69428764T2 (de) 1993-12-24 2002-06-20 Merck Patent Gmbh Immunokonjugate
CA2222231A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Imclone Systems Incorporated Antibody and antibody fragments for inhibiting the growth of tumors
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
US6881555B2 (en) 1999-03-19 2005-04-19 Aventis Pharmaceuticals Inc. AKT nucleic acids, polypeptides, and uses thereof
EP2112167A3 (en) * 1999-06-25 2010-12-22 Genentech, Inc. Humanized ANTI-ERBB2 antibodies and treatment with ANTI-ERBB2 antibodies
UA74803C2 (ru) 1999-11-11 2006-02-15 Осі Фармасьютікалз, Інк. Стойкий полиморф гидрохлорида n-(3-этинилфенил)-6,7-бис(2-метоксиэтокси)-4-хиназолинамина, способ его получения (варианты) и фармацевтическое применение
TWI310684B (en) 2000-03-27 2009-06-11 Bristol Myers Squibb Co Synergistic pharmaceutical kits for treating cancer
DK2189162T3 (da) 2000-11-09 2014-02-03 Oncolytics Biotech Inc Fremgangsmåder til behandling af cellulære proliferative forstyrrelser
ATE394115T1 (de) * 2001-02-27 2008-05-15 Brni Neurosciences Inst Diagnose der alzheimer-krankheit auf basis von mitogenaktivierter proteinkinase-phosphorylierung
CA2439404A1 (en) * 2001-03-07 2002-09-12 Bio-Rad Laboratories Inc. Assay system for simultaneous detection and measurement of multiple modified cellular proteins
JP2003189866A (ja) * 2001-12-26 2003-07-08 Sankyo Co Ltd 骨吸収抑制剤探索法
CA2506066A1 (en) 2002-11-15 2004-06-03 Genomic Health, Inc. Gene expression profiling of egfr positive cancer
JP2007520995A (ja) 2003-01-08 2007-08-02 ブリストル−マイヤーズ　スクイブ　カンパニー 上皮増殖因子受容体モデュレーターに対する感受性を決定するためのバイオマーカーおよび方法
JP2004229547A (ja) * 2003-01-29 2004-08-19 Nobuhiko Nomura アシル化ホモセリンラクトン阻害物質をスクリーニングする方法
US7537906B2 (en) * 2003-01-29 2009-05-26 Nobuhiko Nomura Apoptosis inducer and method of screening for a substance inhibiting acylated homoserine lactone
EP1590487A2 (en) * 2003-02-06 2005-11-02 Genomic Health, Inc. Gene expression markers for response to egfr inhibitor drugs
JP2004257783A (ja) * 2003-02-25 2004-09-16 Jgs:Kk 金属錯化合物抗癌剤に対する癌細胞の耐性の検査方法及び該耐性を低減させるための薬剤
AR053272A1 (es) * 2005-05-11 2007-04-25 Hoffmann La Roche Determinacion de responsivos a la quimioterapia

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Federico Cappuzzo et al., "Akt Phosphorylation and Gefitinib Efficacy in Patients With Advanced Non-Small-Cell Lung Cancer" Journal of the National Cancer Institute, Vol.96, No. 15, August 4, 2004, 1133-1141. Fiona H. Blackball et al., "Expression and Prognostic Significance of Kit, Protein Kinase B, and Mitogen-activated Protein Kinase in Patients with Small Cell Lung Cancer" Vol.9. 2241-2247, June 2003. Fuster LM. et al., "Select clinical trials of erlotinib (OSI-774) in non-small-cell lung cancer with emphasis on phase III outcomes." Clin Lung Cancer. 2004 Dec; 6 Suppl 1:S24-9. *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2702908C2 (ru) * 2012-11-01 2019-10-14 Инфинити Фармасьютикалз, Инк. Лечение злокачественных опухолей с использованием модуляторов изоформ pi3-киназы
RU2557976C2 (ru) * 2013-05-07 2015-07-27 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) Способ определения чувствительности клеток рака легкого к цисплатину на основании уровней экспрессии маркерных генов и набор для его осуществления
RU2745730C2 (ru) * 2016-05-09 2021-03-31 Инсерм (Энститю Насьональ Де Ля Сантэ Э Де Ля Решерш Медикаль) Способы классификации пациентов с солидным раком
RU2738167C1 (ru) * 2020-06-08 2020-12-09 федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр онкологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ определения эффективности химиотерапии препаратами платины при раке яичников III-IV стадии

Also Published As

Publication number Publication date
KR100962162B1 (ko) 2010-06-10
US20070054330A1 (en) 2007-03-08
AU2006245962B2 (en) 2011-11-03
CA2605151A1 (en) 2006-11-16
JP2008538817A (ja) 2008-11-06
JP2012021997A (ja) 2012-02-02
US20100196931A1 (en) 2010-08-05
US7655414B2 (en) 2010-02-02
RU2007145514A (ru) 2009-06-20
NO20074389L (no) 2007-12-06
EP1889066A1 (en) 2008-02-20
CN102854315A (zh) 2013-01-02
IL185631A0 (en) 2008-01-06
BRPI0609096A2 (pt) 2010-02-17
AU2006245962A1 (en) 2006-11-16
AU2006245962B8 (en) 2011-12-08
AR053272A1 (es) 2007-04-25
KR20070116641A (ko) 2007-12-10
WO2006119980A1 (en) 2006-11-16
MX2007013973A (es) 2008-01-11
JP4847518B2 (ja) 2011-12-28
IL185631A (en) 2011-12-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2416096C2 (ru) Определение респондеров на химиотерапию
JP6664323B2 (ja) 神経膠芽腫を治療するための診断方法及び組成物
US20040106141A1 (en) Methods and materials for examining pathways associated with glioblastoma progression
JP5479332B2 (ja) 癌の診断方法および治療方法
CA2509543C (en) Method for predicting the response to her2-directed therapy
JP2011502513A (ja) 癌患者における診断用途のための方法および組成物
Fujita et al. High EGFR mRNA expression is a prognostic factor for reduced survival in pancreatic cancer after gemcitabine-based adjuvant chemotherapy
WO2020046966A1 (en) Treatment of adenocarcinomas with mapk pathway inhibitors
Fasig et al. Immunohistochemical analysis of receptor tyrosine kinase signal transduction activity in chordoma
US20170363629A1 (en) Biomarkers and targets for cancer immunotherapy
WO2014018683A2 (en) A novel method to detect resistance to chemotherapy in patients with lung cancer
WO2019057913A1 (en) METHOD AND KITS FOR THE PROGNOSIS OF SQUAMOUS CARCINOMA PULMONARY (SCC)
CN101166979A (zh) 化学治疗应答者的确定
Singhai et al. Cancer biomarker HER-2/neu in breast cancer in Indian women
CN103620412B (zh) 作为对表皮生长因子受体治疗剂治疗的响应的预测物的cxcr1
Patil et al. Cancer biomarker her-2/neu in breast cancer in indian women

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20140511