RU2379691C1 - Method of multianalytic immune assay with using microparticles - Google Patents
Method of multianalytic immune assay with using microparticles Download PDFInfo
- Publication number
- RU2379691C1 RU2379691C1 RU2008127246/15A RU2008127246A RU2379691C1 RU 2379691 C1 RU2379691 C1 RU 2379691C1 RU 2008127246/15 A RU2008127246/15 A RU 2008127246/15A RU 2008127246 A RU2008127246 A RU 2008127246A RU 2379691 C1 RU2379691 C1 RU 2379691C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- microparticles
- fluorescence
- fluorochromes
- analytes
- biospecific
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к многоаналитному анализу на основе иммунохимических, генетических и других видов реакций биоспецифического связывания аналита с лигандами для биологических, медицинских и других целей.The invention relates to a multi-analytic analysis based on immunochemical, genetic and other types of reactions of biospecific binding of the analyte to ligands for biological, medical and other purposes.
К методам мультиплексного (многоаналитного) обнаружения, идентификации и количественной оценки биологических веществ (клеток, вирионов, нуклеиновых кислот, белков, антигенных молекулярных комплексов, низкомолекулярных биологически активных соединений), находящихся в низкой концентрации в пробах сложного состава, предъявляется ряд требований: методы должны быть быстрыми, давать однозначные результаты, быть работоспособными в условиях использования различных сложных по составу матриксов, иметь необходимый уровень чувствительности и специфичности, быть пригодными для определения очень низких концентраций биологических аналитов, результаты анализа должны считываться быстро. Требованием к мультиплексности диагностических тестов с использованием нуклеотидов, химических соединений и протеомных синтетических конструкций (рекомбинантных белков, пептидов и т.п.) является возможность параллельной регистрации десятков и сотен актов взаимодействия различных аналитов в анализируемой пробе.The methods of multiplex (multi-analytic) detection, identification and quantification of biological substances (cells, virions, nucleic acids, proteins, antigenic molecular complexes, low molecular weight biologically active compounds) that are low in samples of complex composition have a number of requirements: the methods must be fast, give unambiguous results, be efficient in the conditions of using various matrices with complex composition, have the necessary level of sensitivity and specificity, to be suitable for determining very low concentrations of biological analytes, the results of the analysis should be read quickly. The requirement for multiplex diagnostic tests using nucleotides, chemical compounds, and proteomic synthetic constructs (recombinant proteins, peptides, etc.) is the possibility of parallel registration of tens and hundreds of interactions of various analytes in the analyzed sample.
Известен способ и композиции для одновременного детектирования множества аналитов в исследуемом образце (заявка РСТ №01/073443, класс МКИ G01N 33/58). Изобретение может быть использовано для быстрого, точного и автоматического детектирования патогенов, а также для диагностики и прогноза заболеваний. Искомые аналиты (антигены) в образце детектируют и дифференцируют, используя множество флуоресцентных латексных частиц, связанных с различными связывающими молекулами, специфичными к искомым аналитам (антигенам). При определении множества аналитов каждая частица одной категории имеет свою, отличную от других флуоресцентную ("адресную") метку, а каждый антиген (аналит) выявляется одной и той же флуоресцентной меткой, связанной с реагентами для их выявления. Измерение флуоресценции частиц осуществляют путем определения отношения флуоресценции одного или более красителей. В качестве флуоресцентных меток для микрочастиц используют флуоресцеин, фикоэритрин, родамин и т.п., а для мечения антигенов используют вторичные флуоресцентные красители (метки), отличающиеся как по спектральной области возбуждения, так и по спектральной области эмиссии от флуоресцентных красителей, используемых для мечения категорий частиц. Для детектирования антигенов (аналитов) и оценки их количества регистрируют флуоресценцию вторичной метки, которая связана с биоспецифическими реагентами для выявления аналита, используя методы проточной цитометрии.A known method and composition for the simultaneous detection of many analytes in the test sample (PCT application No. 01/073443, class MKI G01N 33/58). The invention can be used for fast, accurate and automatic detection of pathogens, as well as for the diagnosis and prognosis of diseases. The desired analytes (antigens) in the sample are detected and differentiated using a variety of fluorescent latex particles bound to various binding molecules specific for the desired analytes (antigens). When determining the set of analytes, each particle in one category has its own distinct fluorescent ("address") label, and each antigen (analyte) is detected by the same fluorescent label associated with the reagents for their identification. Particle fluorescence measurement is carried out by determining the fluorescence ratio of one or more dyes. Fluorescein, phycoerythrin, rhodamine, etc. are used as fluorescent labels for microparticles, and secondary fluorescent dyes (labels) are used for labeling antigens, which differ both in the spectral region of excitation and in the spectral region of emission from the fluorescent dyes used for labeling categories of particles. To detect antigens (analytes) and estimate their amount, fluorescence of the secondary label is recorded, which is associated with biospecific reagents for detecting the analyte using flow cytometry methods.
Недостатком способа является низкое быстродействие, обусловленное использованием методов проточной цитометрии для детектирования сигналов, а также ограниченная чувствительность, так как не связавшиеся с микрочастицами реагенты создают фоновую люминесценцию.The disadvantage of this method is the low speed due to the use of flow cytometry methods for detecting signals, as well as limited sensitivity, since reagents not bound to microparticles create background luminescence.
Известен способ одновременного анализа и детектирования множества аналитов путем использования микрочастиц (заявка РСТ №01/44812, класс МПК G01N 33/53). В изобретении предложен способ приготовления и использования реагента, содержащего несколько видов микрочастиц с набором флуорохромов для детектирования множества аналитов. Один вид частиц отличается от другого спектром эмиссии, т.е. каждый вид частиц содержит различные метки для идентификации аналитов и различные аффинные лиганды, иммобилизованные на микрочастицах. Образец с микрочастицами инкубируют при условиях и времени, необходимых и достаточных для образования биоспецифического комплекса. После инкубации анализируют образовавшиеся комплексы под микроскопом с целью выявления категорий микрочастиц (вида аналита) и концентрации искомых аналитов по флуоресценции меток, при этом каждую микрочастицу анализируют последовательно.A known method for the simultaneous analysis and detection of many analytes by using microparticles (PCT application No. 01/44812, IPC class G01N 33/53). The invention provides a method for the preparation and use of a reagent containing several types of microparticles with a set of fluorochromes for the detection of many analytes. One type of particle differs from another in the emission spectrum, i.e. each type of particle contains different labels for identification of analytes and various affinity ligands immobilized on microparticles. A sample with microparticles is incubated under conditions and time necessary and sufficient for the formation of a biospecific complex. After incubation, the resulting complexes are analyzed under a microscope in order to identify the categories of microparticles (type of analyte) and the concentration of the desired analytes by fluorescence labels, with each microparticle being analyzed sequentially.
Недостатками способа являются ограниченная чувствительность из-за необходимости использования операции разведения образца и длительность проведения идентификации аналита под микроскопом.The disadvantages of the method are the limited sensitivity due to the need to use the operation of dilution of the sample and the duration of identification of the analyte under a microscope.
Известен биоспецифический многоаналитный способ исследования биологических образцов (патент США №5891738. класс НКИ 436/501). Способ основан на использовании различных категорий микрочастиц, покрытых различными первыми специфичными к аналиту реагентами и содержащих один или несколько флуоресцентных индикаторов в одной или нескольких концентрациях. В суспензию микрочастиц добавляют исследуемый образец с искомыми аналитами и вторые биоспецифические (проявляющие) реагенты, меченные вторичной фотолюминесцентной меткой, инициируют биоспецифическую реакцию, категорию микрочастиц, т.е. вид аналитов, определяют по интенсивности флуоресценции индикаторных меток, связанных с частицами, а концентрацию аналитов определяют по интенсивности флуоресценции вторичных фотолюминесцентных меток. В качестве индикаторных веществ используют тетрапиррольные (порфирин, хлорин, фталоцианин и др.) и цианиновые вещества, а в качестве фотолюминесцентной метки - фикоэритрин. При детектировании исследуют каждую частицу отдельно на микрофлуориметре, основанном на двухфотонном методе возбуждения люминесценции и конфокальной схеме возбуждения и регистрации люминесценции.Known biospecific multi-analytic method for the study of biological samples (US patent No. 5891738. Class NCI 436/501). The method is based on the use of various categories of microparticles coated with various first analyte-specific reagents and containing one or more fluorescent indicators in one or more concentrations. A test sample with the desired analytes is added to the microparticle suspension and the second biospecific (developing) reagents labeled with a secondary photoluminescent label initiate a biospecific reaction, a category of microparticles, i.e. the type of analytes is determined by the fluorescence intensity of the indicator labels associated with the particles, and the analyte concentration is determined by the fluorescence intensity of the secondary photoluminescent labels. Tetopyrrole (porphyrin, chlorin, phthalocyanine, etc.) and cyanine substances are used as indicator substances, and phycoerythrin as a photoluminescent label. During detection, each particle is examined separately on a microfluorimeter based on a two-photon method of luminescence excitation and a confocal scheme of excitation and registration of luminescence.
Недостатками способа являются ограниченная производительность из-за необходимости анализировать последовательно сигналы от каждой микрочастицы и ограниченная чувствительность из-за фоновой люминесценции.The disadvantages of the method are limited performance due to the need to analyze sequentially the signals from each microparticle and limited sensitivity due to background luminescence.
Известно использование микрочастиц с множеством флуоресцентных меток для детектирования множества аналитов (заявка РСТ №01/13120, класс МПК G01N 33/58). Способ может быть использован для исследования биологических жидкостей а также образцов, взятых из окружающей среды, воды или воздуха, промышленных источников, сточных вод и т. Способ основан на использовании микрочастиц строго фиксированного размера, имеющих на своей поверхности одну или более популяций флуоресцентно меченых наночастиц. При этом на микрочастицы наносят либо несколько видов наночастиц, равное количеству детектируемых аналитов, либо различные концентрации одних и тех же наночастиц. Изменяя количество и соотношение различных популяций наночастиц, устанавливают и различают большое число дискретных популяций частиц-носителей с одинаковым спектром эмиссии и соответственно выявляют большое число искомых аналитов. Анализ осуществляют в проточном цитометре, скорость обработки сигналов равна 2000 частиц в секунду.It is known to use microparticles with many fluorescent labels for detecting many analytes (PCT application No. 01/13120, IPC class G01N 33/58). The method can be used to study biological fluids, as well as samples taken from the environment, water or air, industrial sources, wastewater, etc. The method is based on the use of microparticles of a strictly fixed size having one or more populations of fluorescently labeled nanoparticles on its surface. In this case, either several types of nanoparticles equal to the number of detected analytes or different concentrations of the same nanoparticles are applied to the microparticles. By changing the number and ratio of different populations of nanoparticles, a large number of discrete populations of carrier particles with the same emission spectrum are established and distinguished, and accordingly, a large number of the desired analytes are detected. The analysis is carried out in a flow cytometer, the signal processing speed is 2000 particles per second.
Недостатками способа являются ограниченная мультиплексность системы из-за невозможности спектрально различать большое число частиц, отличающихся соотношением двух флуорохромов в частице, и низкое быстродействие, обусловленное использованием методов проточной цитометрии для анализа.The disadvantages of the method are the limited multiplex of the system due to the inability to spectrally distinguish between a large number of particles differing in the ratio of two fluorochromes in a particle and low speed due to the use of flow cytometry methods for analysis.
Известен способ проведения иммуноанализа с использованием двух частиц (патент США №6096563, класс НКИ 436/523), Способ может быть использован для анализа биологических образцов, а также для определения различных загрязнителей окружающей среды. Детектирование осуществляется невооруженным глазом или колориметром, рефрактометром. Сущность способа заключается в том, что на поверхность пористой мембраны наносят реакционную смесь, содержащую первые связывающие молекулы, специфичные к аналиту, исследуемый образец и частицы, покрытые вторыми связывающими молекулами, также специфичными к аналиту, но не способными пройти через поры мембраны. Затем на мембрану наносят детектирующие частицы, которые могут пройти через поры мембраны, эти частицы покрыты связывающим веществом, которое связывает детектирующие частицы с первыми связывающими молекулами, например вторыми антителами. В присутствии аналита в образце на поверхности мембраны образуется биоспецифический комплекс, который удерживается на поверхности мембраны и детектируется с помощью колориметра. Покрытые и детектирующие частицы могут отличаться цветом и размером и выполнены из разных материалов. В качестве покрытых и детектирующих частиц коммерчески выгодно использовать латексы.A known method of conducting immunoassay using two particles (US patent No. 6096563, class NKI 436/523), The method can be used to analyze biological samples, as well as to determine various environmental pollutants. Detection is carried out with the naked eye or colorimeter, refractometer. The essence of the method lies in the fact that a reaction mixture containing the first binding molecules specific for the analyte, the test sample and particles coated with the second binding molecules that are also specific for the analyte, but are not able to pass through the pores of the membrane are applied to the surface of the porous membrane. Then, detecting particles that can pass through the pores of the membrane are applied to the membrane, these particles are coated with a binder that binds the detecting particles to the first binding molecules, for example, second antibodies. In the presence of an analyte in the sample, a biospecific complex is formed on the membrane surface, which is retained on the membrane surface and is detected using a colorimeter. Coated and detecting particles can vary in color and size and are made of different materials. As coated and detecting particles, it is commercially advantageous to use latexes.
Недостатком способа является ограниченная мультиплексность анализа и то, что регистрация сигнала от детектирующих молекул осуществляется колориметрически, что существенно ограничивает чувствительность анализа.The disadvantage of this method is the limited multiplex analysis and the fact that the registration of the signal from the detecting molecules is carried out colorimetrically, which significantly limits the sensitivity of the analysis.
Наиболее близким является многопараметровый способ исследований с использованием различных категорий микрочастиц (ЕР №0617286, класс МПК G01N 33/533). Способ предназначен для определения множества аналитов в одном образце, в котором для маркирования (мечения) категорий микрочастиц, соответствующих различным аналитам, и для определения концентрации выявленных аналитов используют метки (флурохромы), имеющие долгоживущую флуоресценцию. В качестве флуорохромов используют редкоземельные металлы, например Eu, Sm, Tb, Dy. Способ заключается в том, что различные категории одинаковых по размеру и свойствам микрочастиц, меченных флуоресцентными молекулами (метками) и покрытых биоспецифическими (биоафинными) реагентами для связывания аналитов, смешивают с исследуемым образцом и биоспецифическим проявляющим (детектирующим) реагентом, также меченным флуоресцентной меткой, проводят биоспецифическую реакцию, возбуждают флуоресценцию всех флуорохромов и измеряют эмиссию флуоресценции для идентификации категорий микрочастиц и для определения концентрации искомых аналитов. Анализ проводят, используя регистрацию флуоресцентных сигналов в режиме временного разрешения. Микрочастицы и детектирующий реагент метят флуорохромами, испускающими долгоживущую флуоресценцию на различных длинах волн. Использование различных сочетаний концентраций флуорохромов для мечения микрочастиц позволяет выявлять большое количество аналитов в широком диапазоне концентраций.The closest is a multi-parameter method of research using various categories of microparticles (EP No. 0617286, IPC class G01N 33/533). The method is intended for determining a plurality of analytes in one sample, in which for labeling (labeling) categories of microparticles corresponding to various analytes, and for determining the concentration of detected analytes, labels (fluorochromes) having long-lived fluorescence are used. Rare earth metals, for example Eu, Sm, Tb, Dy, are used as fluorochromes. The method consists in the fact that various categories of microparticles of the same size and properties labeled with fluorescent molecules (tags) and coated with biospecific (bioaffine) reagents for binding analytes are mixed with the test sample and a biospecific developing (detecting) reagent also labeled with a fluorescent label is carried out biospecific reaction, excite the fluorescence of all fluorochromes and measure the emission of fluorescence to identify categories of microparticles and to determine the concentration and komyh analytes. The analysis is carried out using the registration of fluorescent signals in the time resolution mode. The microparticles and the detection reagent are labeled with fluorochromes emitting long-lived fluorescence at various wavelengths. The use of various combinations of fluorochrome concentrations for labeling microparticles allows the detection of a large number of analytes in a wide range of concentrations.
Недостатком способа является взаимовлияние сигналов от флуорохромов, используемых для указания «адреса» (категорий) частиц и флуорохромов, используемых для детектирования аналитов в пробе, что не позволяет выявлять аналиты в широком диапазоне изменения концентраций аналитов. Кроме того, недостатком способа является необходимость использования одинаковых по размеру и свойствам микрочастиц, что усложняет и удорожает технологию их производства, а методы измерения сигналов, используемые в способе, не позволяют проводить одновременную регистрацию флуоресценции микрочастиц, что сказывается на быстродействии способа.The disadvantage of this method is the mutual influence of signals from fluorochromes used to indicate the "address" (categories) of particles and fluorochromes used to detect analytes in a sample, which does not allow detecting analytes in a wide range of analyte concentrations. In addition, the disadvantage of this method is the need to use microparticles of the same size and properties, which complicates and increases the cost of their production technology, and the signal measurement methods used in the method do not allow simultaneous registration of microparticle fluorescence, which affects the speed of the method.
Задачей является создание быстрого способа обнаружения и количественного детектирования большого количества искомых аналитов в широком динамическом диапазоне анализируемых концентраций при проведении иммунохимических и клинических анализов, скрининге биологически активных соединений, генетических исследованиях и т.п.The objective is to create a quick method for the detection and quantitative detection of a large number of analytes in a wide dynamic range of the analyzed concentrations during immunochemical and clinical analyzes, screening of biologically active compounds, genetic studies, etc.
Техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения, является снижение взаимовлияния флуорохромов, обеспечивающих мультиплексность анализа, и флуорохромов, используемых для выявления аналита, при параллельном измерении сигналов от массива частиц, что приводит к увеличению динамического диапазона измеряемых концентраций выявляемых аналитов.The technical result achieved by using the invention is to reduce the interaction of fluorochromes providing multiplex analysis and fluorochromes used to identify the analyte in parallel measurement of signals from an array of particles, which leads to an increase in the dynamic range of the measured concentrations of detected analytes.
Технический результат достигается предлагаемым изобретением.The technical result is achieved by the invention.
Сущность изобретения достигается тем, что в способе многоаналитного анализа с использованием микрочастиц, включающем смешивание различных категорий микрочастиц, покрытых биоспецифическими реагентами для связывания различных искомых аналитов и меченных одним или несколькими флуорохромами в различных концентрациях, испускающими долгоживущую флуоресценцию, добавление к смеси микрочастиц исследуемого образца и биоспецифического проявляющего реагента, меченного детектирующим флуорохромом, проведение реакции для образования биоспецифических комплексов, возбуждение флуорохромов и измерение в режиме временного разрешения количества долгоживущей эмиссии флуоресценции для идентификации категорий микрочастиц и количества эмиссии флуоресценции для измерения количества искомых аналитов, образовавшиеся биоспецифические комплексы осаждают на твердофазный носитель, эмиссию флуоресценции всех флуорохромов возбуждают источниками излучения в двух спектральных диапазонах, для мечения биоспецифического проявляющего реагента используют детектирующий флуорохром с короткоживущей флуоресценцией, область возбуждения флуоресценции которого находится вне областей возбуждения флуоресценции флуорохромов с долгоживущей флуоресценцией, при этом соотношение концентраций флуорохромов с долгоживущей флуоресценцией в микрочастицах для определения одного вида аналитов постоянно, а для определения разных видов аналитов соотношение концентраций различается по крайней мере в два раза.The essence of the invention is achieved in that in a multi-analytic method using microparticles, comprising mixing various categories of microparticles coated with biospecific reagents for binding various desired analytes and labeled with one or more fluorochromes at various concentrations emitting long-lived fluorescence, adding a microparticle of the test sample and microparticles a developing reagent labeled with a detecting fluorochrome, carrying out a reaction to form a biosp of specific complexes, excitation of fluorochromes and measurement in the time resolution mode of the amount of long-lived fluorescence emission to identify the categories of microparticles and the amount of fluorescence emission to measure the number of analytes sought, the biospecific complexes formed are deposited on a solid-phase carrier, the emission of fluorescence from all fluorescopes in two spectral ranges is Labeling a biospecific developing reagent using a detecting fluorochrome with otkozhivuschey fluorescence, fluorescence excitation region which is located outside the regions of fluorescence excitation of fluorochromes with long-lived fluorescence, wherein the ratio of fluorochrome concentrations with long-lived fluorescence of the microparticles to determine one type of analyte continuously, and to determine the different kinds of analytes concentration ratio varies at least two times.
Сущность изобретения достигается также тем, что в качестве детектирующих флуорохромов используют фикоэритрин, Су5, NIRD750 NHS, NIRD782 NHS и другие флуорохромы, испускающие короткоживущую флуоресценцию.The invention is also achieved in that phycoerythrin, Cy5, NIRD750 NHS, NIRD782 NHS and other fluorochromes emitting short-lived fluorescence are used as detecting fluorochromes.
Сущность изобретения достигается также и тем, что для мечения категорий микрочастиц используют длительно флуоресцирующие комплексы ионов Eu, Sm, Tb, Dy и других редкоземельных элементов.The invention is also achieved by the fact that for labeling categories of microparticles using long-term fluorescent complexes of ions of Eu, Sm, Tb, Dy and other rare earth elements.
Сущность изобретения достигается также тем, что для мечения категорий микрочастиц используют длительно флуоресцирующие металлокомплексы копропорфирина, уропорфирина, протопорфирина, тетрафенилпорфирина и других порфиринов и их производных с центральными атомами платины, палладия, меди, цинка, алюминия и других металлов, обладающих замедленной флуоресценцией или фосфоресценцией при комнатной температуре.The invention is also achieved by the fact that for the labeling of categories of microparticles, long-term fluorescent metal complexes of coproporphyrin, uroporphyrin, protoporphyrin, tetraphenylporphyrin and other porphyrins and their derivatives with central atoms of platinum, palladium, copper, zinc, aluminum and other metals with slow fluorescence or phosphorus are used room temperature.
Сущность изобретения достигается также и тем, что для биоспецифического связывания аналитов в качестве проявляющих реагентов используют полимерные наночастицы диаметром 40-150 нм, содержащие флуорохромы с коротким временем затухания флуоресценции и связанные с молекулами, обладающими высоким аффинитетом по отношению к искомым аналитам.The invention is also achieved by the fact that for biospecific binding of analytes, polymer nanoparticles with a diameter of 40-150 nm containing fluorochromes with a short fluorescence decay time and associated with molecules with high affinity for the desired analytes are used as developing reagents.
Сущность изобретения достигается также и тем, что в качестве различных категорий микрочастиц используют латексные частицы диаметром 0,5-5 микрон.The invention is also achieved by the fact that as various categories of microparticles, latex particles with a diameter of 0.5-5 microns are used.
Авторам не известен способ, обладающий заявляемой совокупностью признаков, следовательно, предлагаемое техническое решение соответствует критерию "новизна"The authors are not aware of a method having the claimed combination of features, therefore, the proposed technical solution meets the criterion of "novelty"
Известны способы проведения многоаналитного анализа с использованием множества категорий окрашенных микрочастиц. В патентах США №5891738, класс НКИ 436/50 и №5028545, класс НКИ 435/501 и в заявке РСТ 01/13120, класс МКИ G01N 33/58 описаны способы, в которых для идентификации категорий микрочастиц и соответственно, аналитов используют флуоресцентные вещества (флуорохромы) с коротким временем затухания флуоресценции, а для детектирования концентрации аналита используют флуоресцентные вещества с длительным временем затухания флуоресценции, в частности хелаты лантанидов редкоземельных элементов (европия, тербия и др.), либо наоборот. В известных способах многоаналитного детектирования используют либо количество видов частиц, равное количеству детектируемых аналитов, либо различные концентрации одних и тех же частиц. Осуществление указанных выше способов требует либо сложных оптических устройств (спектрофлуориметры с двухфотонным возбуждением и измерением эмиссии флуоресценции, с использованием конфокальных оптических систем, микроскопы с CCD-камерами) либо дорогостоящих методов проточной цитометрии со сложной системой динамической фокусировки потока, с несколькими источниками излучения и несколькими детекторами сигналов. Мультиплексность указанных способов ограничена из-за перекрытия спектров эмиссии флуорохромов, используемых для маркирования категорий микрочастиц. По сравнению с известными техническими решениями в предлагаемом способе указанный выше технический результат может быть получен за счет предлагаемой совокупности признаков. Способ не требует использования микрочастиц строго определенного размера, так как категория каждой частицы определяется только соотношением флуорохромов, а не их абсолютным количеством, это позволяет создавать набор микрочастиц с соотношением концентраций в пределах четырех порядков - от 100:1 до 1:100. Предлагаемая совокупность признаков позволяет увеличить мультиплексность и быстродействие анализа, упрощает и удешевляет способ. Следовательно, заявляемое техническое решение соответствует критерию "уровень техники".Known methods for conducting multi-analytic analysis using many categories of colored microparticles. In US patent No. 5891738, class NKI 436/50 and No. 5028545, class NKI 435/501 and in the application PCT 01/13120, class MKI G01N 33/58 describes methods in which to identify categories of microparticles and, accordingly, analytes use fluorescent substances (fluorochromes) with a short decay time of fluorescence, and fluorescence substances with a long decay time of fluorescence, in particular rare-earth lanthanide chelates (europium, terbium, etc.), or vice versa, are used to detect analyte concentration. Known methods of multi-analytic detection use either the number of species of particles equal to the number of detected analytes, or different concentrations of the same particles. The implementation of the above methods requires either complex optical devices (two-photon excitation spectrofluorimeters and fluorescence emission measurements using confocal optical systems, microscopes with CCD cameras) or expensive flow cytometry methods with a complex dynamic flow focusing system, with several radiation sources and several detectors signals. The multiplexity of these methods is limited due to overlapping emission spectra of fluorochromes used for marking categories of microparticles. Compared with the known technical solutions in the proposed method, the above technical result can be obtained due to the proposed combination of features. The method does not require the use of microparticles of a strictly defined size, since the category of each particle is determined only by the ratio of fluorochromes, and not their absolute number, this allows you to create a set of microparticles with a concentration ratio in the range of four orders - from 100: 1 to 1: 100. The proposed set of features allows you to increase the multiplexness and speed of analysis, simplifies and reduces the cost of the method. Therefore, the claimed technical solution meets the criterion of "prior art".
Изобретение может быть использовано для детектирования, идентификации и количественного определения аналитов, которые способны специфически связываться с лигандами, в частности биологических материалов, таких как биологически активные химические соединения, пептиды, белки, антигены, микроорганизмы и нуклеиновые кислоты. Способ может быть использован для прямых и конкурентных схем иммуноанализа. В частности, способ может быть использован для серодиагностики инфекционных заболеваний, детектирования низкой концентрации гормонов, микроорганизмов, их специфических генов, видов или серотипов в изолированной форме или в качестве контаминантов пищи, окружающей среды, образцов судебной экспертизы. Способ позволяет проводить высокопроизводительный анализ с использованием промышленно выпускаемых микропланшетов, стандартного оборудования для промывки и подготовки проб к анализу, на его основе могут быть созданы простые устройства, в том числе и переносные, на доступной элементной базе. Следовательно, заявляемое изобретение соответствует критерию "промышленная применимость".The invention can be used to detect, identify and quantify analytes that are capable of specifically binding to ligands, in particular biological materials, such as biologically active chemical compounds, peptides, proteins, antigens, microorganisms and nucleic acids. The method can be used for direct and competitive immunoassay regimens. In particular, the method can be used for serodiagnosis of infectious diseases, for detecting low concentrations of hormones, microorganisms, their specific genes, species or serotypes in isolated form or as contaminants of food, the environment, and forensic samples. The method allows for high-performance analysis using industrially produced microplates, standard equipment for washing and preparing samples for analysis, simple devices, including portable ones, based on an accessible element base can be created on its basis. Therefore, the claimed invention meets the criterion of "industrial applicability".
На фиг.1 показаны спектры возбуждения и эмиссии флуорохромов, используемых для указания категории (адреса) микрочастиц, т.е. для детектирования типа аналита: 1-хелатный комплекс Eu-флуорена, 2 - Pt-копропорфирин, 3 - Pd-копропорфирин.Figure 1 shows the excitation and emission spectra of fluorochromes used to indicate the category (address) of microparticles, i.e. for detecting the type of analyte: 1-chelate complex of Eu-fluorene, 2 - Pt-coproporphyrin, 3 - Pd-coproporphyrin.
На фиг.2 показана степень перекрытия спектров эмиссии Eu-флуорена, Pt-копропорфирина, Pd-копропорфирина и NIRD782 NHS в режиме временного разрешения сигнала, максимум возбуждения λ=380 нм, за 100% принят уровень сигнала флуорохрома, для которого данная длина волны является максимумом эмиссии: 4 - Eu-флуорен; 5 - Pt-копропорфирин; 6 - Pd-копропорфирин; 7 - NIRD782 NHS. при максимумах возбуждения Eu-флуорена - 615 нм, Pt-копропорфирина 645 нм, - Pd-копропорфирина 665 нм, NIRD782 NHS - 800 нм; режимы регистрации: длина волны 615 нм - длительность импульса возбуждения 600 микросекунд, время задержки строба 300 микросекунд, длительность строба 600 микросекунд; длина волны 645 нм - длительность импульса возбуждения - 40 микросекунд, время задержки строба - 40 микросекунд, длительность строба - 80 микросекунд; длина волны 665 нм - длительность импульса возбуждения 1000 микросекунд, время задержки строба 1000 микросекунд, длительность строба 1000 микросекунд; длина волны 800 нм - без режима временного разрешения.Figure 2 shows the degree of overlap of the emission spectra of Eu-fluorene, Pt-coproporphyrin, Pd-coproporphyrin and NIRD782 NHS in the time resolution mode of the signal, the excitation maximum is λ = 380 nm, the fluorochrome signal level for which this wavelength is maximum emission: 4 - Eu-fluorene; 5 - Pt-coproporphyrin; 6 - Pd-coproporphyrin; 7 - NIRD782 NHS. at maximum excitation Eu-fluorene - 615 nm, Pt-coproporphyrin 645 nm, Pd-coproporphyrin 665 nm, NIRD782 NHS - 800 nm; registration modes:
На фиг.3 показана схема проведения мультиплексного анализа с использованием универсального конъюгата с флуорохромом: 8 - инкубация пробы со смесью биотинилированных антител и удаление несвязавшихся реагентов фильтрацией; 9 - инкубация пробы с универсальным проявляющим реагентом (стрептавидин, маркированный Су-5 или NIRD782) и удаление несвязавшихся реагентов фильтрацией; 10 - регистрация сигнала флуоресценции от отдельных микрочастиц; 11 - мембрана; 12 - микрочастицы с Pt-копропорфирином и Еu-флуореном для связывания 1-го вида аналита; 13 - лиганды для выявления 1-го вида аналита; 14 - микрочастицы с Pd-копропорфирином и Pt-копропорфирином для связывания 2-го вида аналита; 15 - лиганды для выявления 2-го вида аналита; 16 - микрочастицы с Pd-копропорфирином и Еu-флуореном для связывания 3-го вида аналита; 17 - лиганды для выявления 3-го вида аналита; 18 - молекулы Pd-копропорфирина в микрочастице; 19 - молекулы Eu-флуорена в микрочастице; 20 - молекулы Pt-копропорфирина в микрочастице; 21 - молекулы 1-го аналита в пробе (антитела искомого аналита); 22 - молекулы 2-го аналита в пробе; 23 - молекулы 3-го аналита в пробе; 24 - молекулы универсального лиганда для выявления аналитов в пробе, маркированные биотином; 25 - универсальный проявляющий реагент - стрептавидин, маркированный NIRD782 NHS, 26 - примеси пробы.Figure 3 shows a diagram of a multiplex analysis using a universal conjugate with fluorochrome: 8 - incubation of the sample with a mixture of biotinylated antibodies and removal of unbound reagents by filtration; 9 - incubation of the sample with a universal developing reagent (streptavidin labeled Su-5 or NIRD782) and removing unbound reagents by filtration; 10 - registration of the fluorescence signal from individual microparticles; 11 - membrane; 12 - microparticles with Pt-coproporphyrin and Eu-fluorene for binding the 1st type of analyte; 13 - ligands for detecting the 1st type of analyte; 14 - microparticles with Pd-coproporphyrin and Pt-coproporphyrin for binding the 2nd type of analyte; 15 - ligands for detecting the 2nd type of analyte; 16 - microparticles with Pd-coproporphyrin and Eu-fluorene for binding the 3rd type of analyte; 17 - ligands for detecting the 3rd type of analyte; 18 - molecules of Pd-coproporphyrin in a microparticle; 19 - Eu-fluorene molecules in a microparticle; 20 - Pt-coproporphyrin molecules in the microparticle; 21 - molecules of the 1st analyte in the sample (antibodies of the desired analyte); 22 - molecules of the 2nd analyte in the sample; 23 - molecules of the 3rd analyte in the sample; 24 - universal ligand molecules for the detection of analytes in the sample, marked with biotin; 25 - universal developing reagent - streptavidin, marked NIRD782 NHS, 26 - sample impurities.
На фиг.4 показаны результаты определения антител к клещевому энцефалиту в 20 образцах сыворотки крови человека по сравнению с результатами иммуноферментного определения антител с помощью коммерческих тестов. По оси ординат указана оптическая плотность в иммуноферментных тестах, по оси абсцисс - интенсивность сигнала эмиссии флуоресценции детектирующего флуорохрома от анализируемых микрочастиц, обработанных антигеном для выявления антител к клещевому энцефалиту.Figure 4 shows the results of the determination of antibodies to tick-borne encephalitis in 20 samples of human serum compared with the results of enzyme-linked immunosorbent assay of antibodies using commercial tests. The ordinate indicates the optical density in the enzyme immunoassay; the abscissa indicates the intensity of the fluorescence emission signal of the detecting fluorochrome from the analyzed microparticles treated with antigen to detect antibodies to tick-borne encephalitis.
На фиг.5 показаны результаты определения антител к бореллиям в 20 образцах сыворотки крови человека по сравнению с результатами иммуноферментного определения с помощью коммерческих тестов. По оси ординат указана оптическая плотность в иммуноферментных тестах, по оси абсцисс - интенсивность сигнала эмиссии флуоресценции детектирующего флуорохрома от анализируемых микрочастиц, обработанных антигеном для выявления антител к возбудителю Лайм-бореллиоза.Figure 5 shows the results of the determination of antibodies to borellia in 20 samples of human serum compared with the results of enzyme-linked immunosorbent assay using commercial tests. The ordinate indicates the optical density in enzyme-linked immunosorbent assays, the abscissa indicates the intensity of the fluorescence emission signal of the detecting fluorochrome from the analyzed microparticles treated with antigen to detect antibodies to Lyme borreliosis pathogen.
На фиг.6 показаны результаты определения антител к возбудителю сифилиса в 20 образцах сыворотки крови человека по сравнению с результатами иммуноферментного определения с помощью коммерческих тестов. По оси ординат указана оптическая плотность в иммуноферментных тестах, по оси абсцисс-интенсивность сигнала эмиссии флуоресценции детектирующего флуорохрома от анализируемых микрочастиц, обработанных антигеном для выявления антител к возбудителю сифилиса.Figure 6 shows the results of the determination of antibodies to the causative agent of syphilis in 20 samples of human serum compared with the results of enzyme-linked immunosorbent assay using commercial tests. The ordinate indicates the optical density in the enzyme immunoassay, the abscissa indicates the intensity of the fluorescence emission signal of the detecting fluorochrome from the analyzed microparticles treated with an antigen to detect antibodies to the syphilis pathogen.
На фиг.7 показаны результаты определения тиреотропного гормона в 25 образцах сывороток крови новорожденных по сравнению с результатами определения с помощью лантанидного иммунофлуоресцентного метода с использованием коммерческих тестов DELFIA. По оси ординат - интенсивность сигнала эмиссии флуоресценции ионов европия в системе DELFIA; по оси абсцисс - интенсивность сигнала эмиссии флуоресценции детектирующего флуорохрома от анализируемых микрочастиц, обработанных антителами к тиреотропному гормону.7 shows the results of determining thyroid stimulating hormone in 25 samples of blood serum of newborns compared with the results of determination using the lanthanide immunofluorescence method using commercial DELFIA tests. The ordinate axis is the intensity of the fluorescence emission signal of europium ions in the DELFIA system; along the abscissa axis is the intensity of the fluorescence emission signal of the detecting fluorochrome from the analyzed microparticles treated with antibodies to thyroid-stimulating hormone.
На фиг.8 показаны результаты определения тироксина в 25 образцах сывороток крови новорожденных по сравнению с результатами определения с помощью коммерческих тестов методом DELFIA. По оси ординат - интенсивность сигнала эмиссии флуоресценции ионов европия в системе DELFIA; по оси абсцисс - интенсивность сигнала эмиссии флуоресценции детектирующего флуорохрома от анализируемых микрочастиц, предназначенных для выявления тироксина.On Fig shows the results of the determination of thyroxine in 25 samples of blood serum of newborns compared with the results of determination using commercial tests by DELFIA. The ordinate axis is the intensity of the fluorescence emission signal of europium ions in the DELFIA system; along the abscissa axis is the intensity of the fluorescence emission signal of the detecting fluorochrome from the analyzed microparticles designed to detect thyroxin.
На фиг.9 показаны результаты определения 17 гидроксипрогестерона в 25 образцах сывороток крови новорожденных по сравнению с результатами определения с помощью коммерческих тестов методом DELFIA. По оси ординат - интенсивность сигнала эмиссии флуоресценции ионов европия в системе DELFIA; по оси абсцисс - интенсивность сигнала эмиссии флуоресценции детектирующего флуорохрома от анализируемых микрочастиц, предназначенных для выявления 17 гидроксипрогестерона.Figure 9 shows the results of the determination of 17 hydroxyprogesterone in 25 samples of blood serum of newborns compared with the results of determination using commercial tests by DELFIA. The ordinate axis is the intensity of the fluorescence emission signal of europium ions in the DELFIA system; along the abscissa axis is the intensity of the fluorescence emission signal of the detecting fluorochrome from the analyzed microparticles designed to detect 17 hydroxyprogesterone.
На фиг.10 показаны результаты определения иммунореактивного трипсина в 25 образцах пятен крови новорожденных по сравнению с результатами определения с помощью коммерческих тестов методом DELFIA. По оси ординат - интенсивность сигнала эмиссии флуоресценции ионов европия в системе DELFIA; по оси абсцисс - интенсивность сигнала эмиссии флуоресценции детектирующего флуорохрома от анализируемых микрочастиц, предназначенных для выявления иммунореактивного трипсина.Figure 10 shows the results of the determination of immunoreactive trypsin in 25 samples of blood stains of newborns compared with the results of determination using commercial tests by DELFIA. The ordinate axis is the intensity of the fluorescence emission signal of europium ions in the DELFIA system; along the abscissa axis is the intensity of the fluorescence emission signal of the detecting fluorochrome from the analyzed microparticles designed to detect immunoreactive trypsin.
Проведение анализа на примере выявления антител при серодиагностических исследованиях включает следующие стадии (см. фиг.3): 8 - инкубация пробы со смесью биотинилированных антител и удаление несвязавшихся реагентов фильтрацией; 9 - инкубация пробы с универсальным проявляющим реагентом (стрептавидин, маркированный Су-5 или NIRD782 NHS) и удаление несвязавшихся реагентов фильтрацией; 10 - регистрация сигнала флуоресценции от отдельных микрочастиц. Регистрацию осуществляют на мембране 11. Для связывания 1-го вида аналита используют микрочастицы 12 с соотношением концентраций двух длительно флуоресцирующих флуорохромов Pt-копропорфирин/Eu-флуорен - 1:1. В качестве лигандов для выявления 1-го вида аналита используется сахарозо-ацетоновый антиген вируса клещевого энцефалита 13. Для выявления второго аналита используют микрочастицы 14 с соотношением концентраций двух длительно флуоресцирующих флуорохромов Pd-копропорфирин/Pt-копропорфирин - 1:1. В качестве лигандов для выявления 2-го вида аналита используют пептид 15 С6. Для выявления третьего вида аналита используют микрочастицы 16 с соотношением концентраций двух длительно флуоресцирующих флуорохромов Pd-копропорфирин/Eu-флуорен - 1:1. В качестве лигандов 17 для связывания антител к возбудителю сифилиса используют смесь рекомбинантных белков. Соотношение молекул Pd-копропорфирина - 18, Eu-флуорена 19, Pt-копропорфирина 20 в микрочастице задается с учетом их молярного коэффициента экстинкции на длине волны возбуждения 380 нм и квантового выхода излучения (эмиссии). Для выявления молекул первого аналита 21, молекул второго аналита 22 и молекул третьего аналита 23 в пробе используют конъюгат биотинилированных антител кролика против иммуноглобулинов человека. Биотинилированные антитела 24 являются универсальным реагентом для выявления всех трех аналитов. Концентрацию каждого из выявляемых аналитов определяют с помощью универсального проявляющего реагента 25 стрептавидина, маркированного СУ-5 или NIRD782. Непрореагировавшие компоненты пробы и примеси 26 удаляют фильтрацией.The analysis on the example of antibody detection during serodiagnostic studies includes the following stages (see figure 3): 8 - incubation of the sample with a mixture of biotinylated antibodies and removal of unbound reagents by filtration; 9 - incubation of the sample with a universal developing reagent (streptavidin labeled Su-5 or NIRD782 NHS) and removing unbound reagents by filtration; 10 - registration of the fluorescence signal from individual microparticles. Registration is carried out on the
Для проведения иммуноанализа используют 96-ячеистые микротитровальные платы (Millipore, USA) с дном ячеек площадью 30-36 мм2, выполненным из фильтрующего полимерного мембранного материала (полипропилен, полиметилметакрилат) с диаметром пор меньше, чем диаметр микрочастиц - 0,2-0,4 микрона. Пробы сывороток в разведении 1:100 смешивают в равных объемах с суспензией микрочастиц и помещают в лунки микропланшета с мембранными фильтрами Unipor фирмы Biorad с диаметром пор 0,2 мкм. Инкубируют в течение 15 минут, фильтруют через пористое дно лунок микропланшета и вносят конъюгат специфических антител с флуоресцентной меткой Су-5 или NIRD782 в объеме 200 микролитров на лунку. Инкубируют в течение 10 минут, промывают осажденные микрочастицы буферным раствором, а затем высушивают под струей воздуха в течение 2-3 минут. Микропланшет с обработанными образцами проб помещают в сканирующий фосфоресцентный анализатор и измеряют сигналы люминесценции от микрочастиц, иммобилизованных на мембранном фильтре дна лунок. Распределение сигнала от каждой из микрочастиц регистрируют в спектральных и временных интервалах, оптимальных для регистрации эмиссии каждого из флуорохромов. Сканирование дна ячейки микропланшета осуществляют с разрешением микроплощадок 30×30 мкм в режиме временного разрешения люминесценции с выделением длительной флуоресценции (фосфоресценции) в диапазоне от 40 до 100 микросекунд при длине волны максимума эмиссии 645 нм для Pt-копропорфирина; с выделением длительной флуоресценции в диапазоне от 400 до 700 микросекунд при длине волны 615 нм для хелата Еu и 665 нм для Pd-копропорфирина. Суммируют сигналы флуоресценции Су-5 или NIRD782 от микрочастиц одного сорта и рассчитывают средний уровень сигнала в расчете на одну частицу. Как видно из фиг.1, область возбуждения длительно флуоресцирующих соединений (флуорохромов) ограничена максимальной длиной волны 600 нм, спектральная область эмиссии этих соединений расположена в диапазоне 540-750 нм, а спектры эмиссии флуоресценции перекрываются. В максимуме эмиссии каждого из флуорохромов присутствует флуоресценция других флуорохромов, вклад которых может достигать 1%. Для определения концентрации аналитов в предлагаемом способе использованы вещества с коротким временем затухания флуоресценции, спектральные области возбуждения и эмиссии которых находятся вне спектрального диапазона возбуждения и эмиссии длительно флуоресцирующих флуорохромов. При этом сигналы от флуорохромов с длительной флуоресценцией, используемых для идентификации категорий микрочастиц (вида аналита), измеряют в режиме временного разрешения с учетом постоянных времени затухания эмиссии. Одновременно с этими сигналами измеряют сигналы короткоживущей флуоресценции флуорохрома, используемого для выявления концентрации аналита, возбуждаемого при другой длине волны. Это исключает влияние эмиссии флуоресценции флуорохромов с длительным временем затухания флуоресценции на сигналы эмиссии флуоресценции флуорохромов с коротким временем затухания флуоресценции, повышает мультиплексность анализа и расширяет динамический диапазон измеряемых концентраций искомых аналитов за счет возможности измерения низких концентраций. Сигналы эмиссии всех флуорохромов от всего массива микрочастиц, находящихся на твердой фазе, измеряют одновременно на сканирующем фосфоресцентном анализаторе. В качестве флуорохромов с коротким временем затухания флуоресценции могут быть использованы фикоэритрин, Су5, NIRD782 NHS (N-Hydroxysuccinamide) и другие флуорохромы, максимум возбуждения и эмиссии которых находится вне диапазона возбуждения эмиссии длительно флуоресцирующих соединений, используемых для создания категорий микрочастиц. Например, NIRD782 NHS имеет длинноволновый максимум возбуждения в области 780 нм и максимум излучения на длине волны 800 нм, что исключает возможность возбуждения флуорохромов с длительной флуоресценцией, используемых для указания категории микрочастиц.For immunoassay, 96-cell microtiter plates (Millipore, USA) with a cell bottom of 30-36 mm 2 made of filtering polymer membrane material (polypropylene, polymethylmethacrylate) with a pore diameter of less than 0.2-0 microparticles are used. 4 microns. Serum samples at a dilution of 1: 100 are mixed in equal volumes with a suspension of microparticles and placed in the wells of a microplate with Biorad Unipor membrane filters with a pore diameter of 0.2 μm. Incubated for 15 minutes, filtered through the porous bottom of the wells of the microplate and add a conjugate of specific antibodies with a fluorescent label Su-5 or NIRD782 in the amount of 200 microliters per well. Incubated for 10 minutes, washed the precipitated microparticles with a buffer solution, and then dried under a stream of air for 2-3 minutes. The microplate with the processed sample samples is placed in a scanning phosphorescent analyzer and the luminescence signals from the microparticles immobilized on the membrane filter of the bottom of the wells are measured. The distribution of the signal from each of the microparticles is recorded in spectral and time intervals optimal for recording the emission of each of the fluorochromes. Scanning the bottom of a microplate cell is carried out with a resolution of 30 × 30 μm microplates in the mode of temporary resolution of luminescence with the release of long-term fluorescence (phosphorescence) in the range from 40 to 100 microseconds at a wavelength of maximum emission of 645 nm for Pt-coproporphyrin; with the release of long-term fluorescence in the range from 400 to 700 microseconds at a wavelength of 615 nm for Eu chelate and 665 nm for Pd-coproporphyrin. The fluorescence signals of Su-5 or NIRD782 from microparticles of the same sort are summarized and the average signal level per one particle is calculated. As can be seen from figure 1, the excitation region of long-fluorescent compounds (fluorochromes) is limited to a maximum wavelength of 600 nm, the spectral emission region of these compounds is in the range of 540-750 nm, and the emission spectra of fluorescence overlap. At the maximum emission of each of the fluorochromes, there is fluorescence of other fluorochromes, the contribution of which can reach 1%. To determine the analyte concentration in the proposed method, substances with a short fluorescence decay time were used, the spectral regions of excitation and emission of which are outside the spectral range of excitation and emission of long-fluorescent fluorochromes. In this case, signals from long-term fluorescence fluorochromes used to identify categories of microparticles (type of analyte) are measured in the time resolution mode taking into account the emission decay time constants. Simultaneously with these signals, signals of short-lived fluorescence fluorochrome are used to detect the concentration of analyte excited at a different wavelength. This eliminates the influence of fluorochrome fluorescence emission with a long fluorescence decay time on fluorochrome fluorescence emission signals with a short fluorescence decay time, increases the multiplexness of the analysis and widens the dynamic range of the measured concentrations of the desired analytes due to the possibility of measuring low concentrations. The emission signals of all fluorochromes from the entire array of microparticles located on the solid phase are measured simultaneously on a scanning phosphorescent analyzer. Phycoerythrin, Cy5, NIRD782 NHS (N-Hydroxysuccinamide), and other fluorochromes, the maximum of excitation and emission of which is outside the excitation range of the emission of long-fluorescent compounds used to create categories of microparticles, can be used as fluorochromes with a short fluorescence decay time. For example, the NIRD782 NHS has a long-wavelength excitation maximum at 780 nm and a radiation maximum at 800 nm, which excludes the possibility of excitation of long-term fluorescence fluorochromes used to indicate the category of microparticles.
Из фиг.2 (поз.4, 5, 6, 7) видно, что эмиссия флуорохромов, используемых для выявления концентрации аналитов, не влияет на эмиссию флуорохромов, используемых для адресных частиц, и наоборот. В качестве проявляющего реагента могут быть использованы полимерные наночастицы диаметром 40-150 нм, включающие флуорохромы с коротким временем затухания флуоресценции и связанные с молекулами, обладающими высоким аффинитетом по отношению к искомым аналитам.From figure 2 (pos.4, 5, 6, 7) it can be seen that the emission of fluorochromes used to detect the concentration of analytes does not affect the emission of fluorochromes used for targeted particles, and vice versa. As a developing reagent, polymer nanoparticles with a diameter of 40-150 nm can be used, including fluorochromes with a short fluorescence decay time and associated with molecules with high affinity for the desired analytes.
Пример 1. Выявление в пробах сывороток крови человека антител к возбудителям клещевого энцефалита, болезни Лайма, сифилиса с помощью универсального проявляющего реагентаExample 1. Detection of antibodies to human tick-borne encephalitis, Lyme disease, syphilis pathogens in human serum samples using a universal developing reagent
При проведении анализа в качестве фосфоресцентной метки использовали Pt-копропорфирин и Pd-копропорфирин, в качестве длительно флуоресцирующих меток использовали хелатные комплексы ионов европия. Для анализа используют меламинформальдегидные микрочастицы ЗАО «Иммуноскрин» (ТУ 2634-015-49941990-03) диаметром от 0,5 до 5 микрон в концентрации 3·103 на пробу (0,1-0,3 мл), содержащие "адресные" длительно флуоресцирующие флуорохромы, используемые для кодирования категорий микрочастиц, спектральные характеристики возбуждения и эмиссии которых представлены на фиг.1. Заранее готовят набор микрочастиц, каждая из которых включает два из трех следующих флуорофоров: флуорофор 1 - хелат с ионом европия-флуорена, флуорофор 2 - платина-копропорфирин и флуорофор 3 - палладий-копропорфирин. Для выявления антител к трем вышеперечисленным аналитам используют три вида микрочастиц, отличающихся соотношением входящих в них длительно флуоресцирующих флуорофоров. Первые микрочастицы диаметром от 0,9 до 1,3 микрона с соотношением показателей светимости (произведения квантового выхода на молярный коэффициент экстинкции на длине волны 380 нм) εφEu/εφp1KP=1; вторые микрочастицы диаметром от 1,6 до 2,1 микрона с соотношением показателей светимости εφPdKP/εφPtKP=1; третьи микрочастицы диаметром от 4,3 до 5 микрон с соотношением показателей светимости εφPdKP/εφEu=1. При проведении анализа использованы образцы от доноров с низким содержанием специфических антител, а также по 3 образца с высоким содержанием специфических антител к антигенам клещевого энцефалита, антигенам к возбудителю болезни Лайма и антигенам к возбудителю сифилиса.In the analysis, Pt-coproporphyrin and Pd-coproporphyrin were used as a phosphorescent label, and chelate complexes of europium ions were used as long-term fluorescent labels. For analysis, melamine-formaldehyde microparticles of ZAO Immunoskrin (TU 2634-015-49941990-03) with a diameter of 0.5 to 5 microns at a concentration of 3 · 10 3 per sample (0.1-0.3 ml) containing "targeted" are used long-term fluorescent fluorochromes used to encode categories of microparticles, the spectral characteristics of the excitation and emission of which are presented in figure 1. A set of microparticles is prepared in advance, each of which includes two of the following three fluorophores: fluorophore 1 - chelate with europium fluorene ion, fluorophore 2 - platinum-coproporphyrin and fluorophore 3 - palladium-coproporphyrin. To identify antibodies to the three analytes listed above, three types of microparticles are used, which differ in the ratio of the long-term fluorescent fluorophores included in them. The first microparticles with a diameter of 0.9 to 1.3 microns with a ratio of luminosity (the product of the quantum yield to the molar extinction coefficient at a wavelength of 380 nm) εφ Eu / εφ p1KP = 1; second microparticles with a diameter of 1.6 to 2.1 microns with a ratio of luminosity indices εφ PdKP / εφ PtKP = 1; third microparticles with a diameter of 4.3 to 5 microns with a ratio of luminosity indices εφ PdKP / εφ Eu = 1. The analysis used samples from donors with a low content of specific antibodies, as well as 3 samples with a high content of specific antibodies to tick-borne encephalitis antigens, antigens to the Lyme disease causative agent and antigens to the syphilis causative agent.
Микрочастицы обрабатывают специфическими антигенами (рекомбинантными белками) для специфического связывания иммуноглобулинов из образцов сывороток крови. Антигены иммобилизуют на поверхности микрочастиц по стандартным методикам путем адсорбции или ковалентного связывания через карбоксильные группы полимера, несвязавшиеся (свободные) антигены удаляют стандартными процедурами, например путем осаждения микрочастиц центрифугированием или методом гельфильтрации. При этом первую категорию микрочастиц обрабатывают антигенами для выявления антител к вирусу клещевого энцефалита, вторую категорию - антигенами для выявления антител к бореллиям - возбудителю болезни Лайма, третью категорию - антигенами к возбудителю сифилиса. Для выявления специфических антител при серодиагностических исследованиях микрочастицы первой категории для выявления первого аналита - антител к вирусу клещевого энцефалита - обрабатывают сахарозо-ацетоновым антигеном вируса клещевого энцефалита, микрочастицы второй категории для выявления второго аналита - антител к бореллиям - обрабатывают пептидом С6, микрочастицы третьей категории для выявления третьего аналита - антител к сифилису - обрабатывают смесью рекомбинантных белков. Подготовленные микрочастицы в виде смеси с концентрацией 5000 микрочастиц каждого сорта в расчете на 1 мл суспензии используют для анализа клинических образцов. Антивидовые антитела (антитела против иммуноглоублинов человека) маркированы флуорохромом NIRD782, длина волны возбуждения 780 нм, длина волны эмиссии 800 нм.The microparticles are treated with specific antigens (recombinant proteins) for specific binding of immunoglobulins from blood serum samples. Antigens are immobilized on the surface of microparticles according to standard methods by adsorption or covalent binding through the carboxyl groups of the polymer, unbound (free) antigens are removed by standard procedures, for example, by precipitation of microparticles by centrifugation or gel filtration. In this case, the first category of microparticles is treated with antigens to detect antibodies to tick-borne encephalitis virus, the second category is treated with antigens to detect antibodies to borrelia, the causative agent of Lyme disease, and the third category is treated with antigens to the causative agent of syphilis. To identify specific antibodies during serodiagnostic studies, microparticles of the first category for detecting the first analyte - antibodies to tick-borne encephalitis virus - are treated with sucrose-acetone antigen of tick-borne encephalitis virus, microparticles of the second category to detect the second analyte - antibodies to borrelia - are treated with peptide C6, microparticles of the third category for detection of the third analyte - antibodies to syphilis - is treated with a mixture of recombinant proteins. Prepared microparticles in the form of a mixture with a concentration of 5000 microparticles of each variety per 1 ml of suspension are used for the analysis of clinical samples. Anti-species antibodies (antibodies against human immunoglobulins) are marked with NIRD782 fluorochrome,
Из данных фиг.4, 5, 6 следует, что образцы сывороток, содержащие высокие титры (концентрации) антител к указанным возбудителям, имеют многократно более высокий сигнал флуоресценции детектирующих флуорохромов, а результаты мультиплексного анализа предлагаемым способом хорошо коррелируют с результатами иммуноферментного определения с помощью коммерческих тестов, при этом выявление антител предлагаемым способом осуществляется в 1000-кратном диапазоне изменения флуоресцентных сигналов, т.е. концентрации аналитов.From the data of Figures 4, 5, 6, it follows that serum samples containing high titers (concentrations) of antibodies to these pathogens have a much higher fluorescence signal for detecting fluorochromes, and the multiplex analysis of the proposed method correlates well with the results of enzyme-linked immunosorbent assay using commercial tests, while the detection of antibodies by the proposed method is carried out in a 1000-fold range of changes in fluorescent signals, i.e. analyte concentration.
Пример 2. Выявление в пробах сывороток крови человека антител к возбудителям клещевого энцефалита, болезни Лайма и сифилисаExample 2. Detection in samples of human blood sera of antibodies to pathogens of tick-borne encephalitis, Lyme disease and syphilis
Способ анализа осуществляется аналогично тому, как описано в примере 1. При осуществлении способа используют смесь микрочастиц такого же размера, как и в примере 1, но с другим соотношением флуорохромов: для выявления антител клещевого энцефалита используют микрочастицы с соотношением εφEu/εφptKPp=1:100, для выявления антител бореллий используют микрочастицы с соотношением εφPdKP/εφPtKP=1:100, для выявления антител возбудителя сифилиса используют микрочастицы с соотношением εφPdKP/εφEu=1:50. В качестве проявляющего биоспецифического реагента используют антивидовые кроличьи антитела против иммуноглобулинов человека, связаны с наночастицами диаметром от 40 до 150 нм, включающие Су-5, длина волны возбуждения 710 нм, длина волны эмиссии 740 нм. Полученные результаты аналогичны результатам, показанным на фиг.4, 5, 6; изменение соотношения флуорохромов в 100 раз не привело к искажению результатов анализа, при этом детектируемый сигнал от образцов увеличивается пропорционально увеличению содержания флуорохрома СУ-5. Это свидетельствует о возможности создания большого числа комбинаций из нескольких флуорохромов в широком динамическом диапазоне концентраций и повышении надежности регистрации низких концентраций аналитов.The analysis method is carried out similarly to that described in example 1. When carrying out the method, a mixture of microparticles of the same size as in example 1, but with a different ratio of fluorochromes, is used: to detect tick-borne encephalitis antibodies, microparticles with a ratio of εφ Eu / εφ ptKP p = 1: 100, microparticles with a ratio of εφ PdKP / εφ PtKP = 1: 100 are used to detect antibodies of borellium, microparticles with a ratio of εφ PdKP / εφ Eu = 1: 50 are used to detect antibodies of the syphilis pathogen. As a biospecific reagent, anti-species rabbit antibodies against human immunoglobulins are used, bound to nanoparticles with a diameter of 40 to 150 nm, including Su-5, an excitation wavelength of 710 nm, an emission wavelength of 740 nm. The results obtained are similar to those shown in FIGS. 4, 5, 6; a 100-fold change in the ratio of fluorochromes did not lead to a distortion of the analysis results, while the detected signal from the samples increases in proportion to the increase in the content of the SU-5 fluorochrome. This indicates the possibility of creating a large number of combinations of several fluorochromes in a wide dynamic range of concentrations and increasing the reliability of recording low concentrations of analytes.
Пример 3. Количественное определение содержания маркеров врожденного гипотиреоза - тиротропина и тироксина, адреногенитальной гиперплазии - 17 гидроксипрогестерона и муковисцидоза - иммунореактивного трипсина в образцах из сухих пятен кровиExample 3. Quantitative determination of the content of markers of congenital hypothyroidism - thyrotropin and thyroxine, adrenogenital hyperplasia - 17 hydroxyprogesterone and cystic fibrosis - immunoreactive trypsin in samples from dry blood spots
Для проведения анализа использовали специально подобранную группу из 25 образцов крови новорожденных, в том числе включающую по 4 образца с содержанием указанных маркеров в несколько раз выше нормальных значений для группы здоровых новорожденных. Образцы получены путем экстракции материала из сухих пятен крови, нанесенных на фильтровальную бумагу. Для выявления аналитов микрочастицы, приготовленные в соответствии с примером 1, обрабатывают специфическими реагентами. Для определения тиротропина микрочастицы обрабатывают коммерческими моноклональными антителами. Для определения тироксина микрочастицы обрабатывают БСА, конъюгированным с тироксином. Для определения 17 гидроксипрогестерона микрочастицы обрабатывают БСА, конъюгированным с 17 гидроксипрогестероном. Для определения иммунореактивного трипсина микрочастицы обрабатывают моноклональными антителами, специфичными к иммунореактивному трипсину. Пробы сывороток смешивают в равных объемах с суспензией микрочастиц, вносят конъюгаты антител к тиреотропному гормону, тироксину, 17 гидроксипрогестерону и иммунореактивному трипсину и смесь помещают в лунки микропланшета с мембранными фильтрами Unipor фирмы Biorad с диаметром пор 0,2 мкм. Инкубируют в течение 25 минут, фильтруют через пористое дно лунок микропланшета и вносят смесь биотинилированных конъюгатов специфических антител с флуоресцентной меткой NIRD782 в объеме 200 микролитров на лунку. Инкубируют в течение 10 минут, промывают осажденные микрочастицы буферным раствором, а затем высушивают под струей воздуха. Микропланшет с обработанными таким образом микрочастицами анализируют на сканирующем фосфоресцентном анализаторе. Для количественной оценки содержания аналитов в пробе предварительно строят калибровочные графики. Для этого используют образцы сывороток с заведомо заданными концентрациями реагентов.For analysis, a specially selected group of 25 blood samples of newborns was used, including 4 samples each containing these markers several times higher than normal values for a group of healthy newborns. Samples were obtained by extracting material from dry blood stains deposited on filter paper. To identify analytes, microparticles prepared in accordance with example 1 are treated with specific reagents. To determine thyrotropin, the microparticles are treated with commercial monoclonal antibodies. To determine thyroxin, microparticles are treated with BSA conjugated with thyroxin. To determine 17 hydroxyprogesterone, the microparticles are treated with BSA conjugated to 17 hydroxyprogesterone. To determine the immunoreactive trypsin, the microparticles are treated with monoclonal antibodies specific for immunoreactive trypsin. Serum samples are mixed in equal volumes with a suspension of microparticles, conjugates of antibodies to thyroid stimulating hormone, thyroxin, 17 hydroxyprogesterone and immunoreactive trypsin are added and the mixture is placed in the wells of a microplate with 0.2 μm Unipor membrane filters from Biorad. Incubated for 25 minutes, filtered through the porous bottom of the wells of the microplate and a mixture of biotinylated conjugates of specific antibodies with a fluorescent label NIRD782 in the amount of 200 microliters per well. Incubated for 10 minutes, washed the precipitated microparticles with a buffer solution, and then dried under a stream of air. The microplate with the microparticles thus treated is analyzed on a scanning phosphorescent analyzer. To quantify the content of analytes in the sample, calibration plots are preliminarily constructed. To do this, use serum samples with known concentrations of reagents.
На фиг.7 представлены результаты определения тиреотропного гормона в 25 образцах сывороток крови новорожденных по сравнению с результатами определения с помощью коммерческих тестов методом DELFIA. На фиг.8 представлены результаты определения тироксина в 25 образцах сывороток крови по сравнению с результатами определения с помощью коммерческих тестов методом DELFIA. На фиг.9 представлены результаты определения 17 гидроксипрогестерона в 25 образцах пятен крови новорожденных по сравнению с результатами определения с помощью коммерческих тестов методом DELFIA. На фиг.10 представлены результаты тестирования образцов крови новорожденных для определения трипсина по сравнению с результатами определения с помощью коммерческих тестов методом.7 shows the results of the determination of thyroid-stimulating hormone in 25 samples of blood serum of newborns compared with the results of determination using commercial tests by DELFIA method. On Fig presents the results of the determination of thyroxine in 25 samples of blood serum compared with the results of determination using commercial tests by DELFIA. Figure 9 presents the results of the determination of 17 hydroxyprogesterone in 25 samples of blood stains of newborns compared with the results of determination using commercial tests by DELFIA. Figure 10 presents the results of testing blood samples of newborns to determine trypsin compared with the results of determination using commercial tests by the method.
Из данных фиг.7, 8, 9 и 10 следует, что результаты мультиплексного анализа предлагаемым способом с использованием микрочастиц при соотношении флуорохромов, изменяющемся в широком диапазоне концентраций, хорошо коррелируют с результатами иммунолюминесцентного лантанидного иммуноанализа с помощью коммерческих тестов.From the data of Figures 7, 8, 9 and 10 it follows that the results of the multiplex analysis of the proposed method using microparticles with a fluorochrome ratio varying over a wide concentration range correlate well with the results of immunoluminescent lanthanide immunoassay using commercial tests.
Claims (6)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008127246/15A RU2379691C1 (en) | 2008-07-07 | 2008-07-07 | Method of multianalytic immune assay with using microparticles |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008127246/15A RU2379691C1 (en) | 2008-07-07 | 2008-07-07 | Method of multianalytic immune assay with using microparticles |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2379691C1 true RU2379691C1 (en) | 2010-01-20 |
Family
ID=42120935
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2008127246/15A RU2379691C1 (en) | 2008-07-07 | 2008-07-07 | Method of multianalytic immune assay with using microparticles |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2379691C1 (en) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2480772C1 (en) * | 2012-05-17 | 2013-04-27 | Закрытое акционерное общество "ИММУНОСКРИН" (ЗАО "ИММУНОСКРИН") | Method for simultaneous detection of thyrotropin and total thyroxin in dry blood stains |
| RU2541164C2 (en) * | 2013-04-05 | 2015-02-10 | Закрытое акционерное общество "ИММУНОСКРИН" (ЗАО "ИММУНОСКРИН") | Method for simultaneous detection of several markers of congenital diseases in dry blood stains |
| CN107037025A (en) * | 2017-06-24 | 2017-08-11 | 杭州微瑞科技有限公司 | The high quick fluorescent chromatographic device of group of the lanthanides and detection method |
| RU2636620C1 (en) * | 2016-10-25 | 2017-11-24 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Тюменский научный центр Сибирского отделения РАН" (ТюмНЦ СО РАН) | Method of optical evaluation of microbial cell concentration in suspension |
| CN111665237A (en) * | 2019-03-08 | 2020-09-15 | 上海索昕生物科技有限公司 | Homogeneous phase chemiluminescence detection method and application thereof |
| CN113454455A (en) * | 2018-12-28 | 2021-09-28 | 雅培制药有限公司 | Direct detection of single molecules on microparticles |
-
2008
- 2008-07-07 RU RU2008127246/15A patent/RU2379691C1/en active
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2480772C1 (en) * | 2012-05-17 | 2013-04-27 | Закрытое акционерное общество "ИММУНОСКРИН" (ЗАО "ИММУНОСКРИН") | Method for simultaneous detection of thyrotropin and total thyroxin in dry blood stains |
| RU2541164C2 (en) * | 2013-04-05 | 2015-02-10 | Закрытое акционерное общество "ИММУНОСКРИН" (ЗАО "ИММУНОСКРИН") | Method for simultaneous detection of several markers of congenital diseases in dry blood stains |
| RU2636620C1 (en) * | 2016-10-25 | 2017-11-24 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Тюменский научный центр Сибирского отделения РАН" (ТюмНЦ СО РАН) | Method of optical evaluation of microbial cell concentration in suspension |
| CN107037025A (en) * | 2017-06-24 | 2017-08-11 | 杭州微瑞科技有限公司 | The high quick fluorescent chromatographic device of group of the lanthanides and detection method |
| CN113454455A (en) * | 2018-12-28 | 2021-09-28 | 雅培制药有限公司 | Direct detection of single molecules on microparticles |
| CN113454455B (en) * | 2018-12-28 | 2024-04-30 | 雅培制药有限公司 | Direct detection of single molecules on microparticles |
| CN111665237A (en) * | 2019-03-08 | 2020-09-15 | 上海索昕生物科技有限公司 | Homogeneous phase chemiluminescence detection method and application thereof |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100804202B1 (en) | Chromatographic assay system | |
| US7704730B2 (en) | Multiplexed assay methods | |
| JPH0754324B2 (en) | Test agent for measuring antigen and / or antibody in liquid sample | |
| US9274056B2 (en) | Use of non-chelated fluorochromes in rapid test systems | |
| RU2379691C1 (en) | Method of multianalytic immune assay with using microparticles | |
| US20140170674A1 (en) | Membraine-Based Assay Devices Utilizing Time-Resolved Up-Converting Luminescence | |
| JP4274944B2 (en) | Particle-based ligand assay with extended dynamic range | |
| JP2008538609A (en) | Multiplex microparticle system | |
| KR20030040208A (en) | Improvements to the fluorescent polymer-QTL approach to biosensing | |
| US20170074874A1 (en) | Synthetic Thread Based Lateral Flow Immunoassay | |
| CN103837675A (en) | Homogeneous luminescence immunoassay method for quantitatively analyzing multiple components simultaneously and kit used for method | |
| JP2007519933A (en) | Systems, methods, and reagents for detection of biological and chemical materials using dynamic surface generation and imaging | |
| JP2005510706A5 (en) | ||
| WO2002052245A2 (en) | Rapid particle detection | |
| WO2021087006A1 (en) | Analyte detection and quantification by discrete enumeration of particle complexes | |
| CA1229301A (en) | Substrate for fluoroimmunoassay of biological fluids | |
| US7361515B2 (en) | Method and test kit for detecting analytes in a sample | |
| EP1239284A1 (en) | Non-separation assay method and system using opaque particles | |
| RU2339953C1 (en) | Method of multyanalite immunoassay with use of microparticles | |
| KR102347135B1 (en) | Device and methods for detecting norovirus using time-resolved fluorescence | |
| WO2013013214A1 (en) | Method for detecting microorganisms | |
| RU2197732C1 (en) | Method for detecting and identifying microorganism cells and viruses | |
| RU2710262C1 (en) | Biological analysis method | |
| CN212459331U (en) | Time-resolved flow type fluorescence detection and analysis device | |
| CN113758886B (en) | Multi-target object simultaneous detection method based on concentration change of latex microspheres |