RU2197732C1

RU2197732C1 - Method for detecting and identifying microorganism cells and viruses

Info

Publication number: RU2197732C1
Application number: RU2001114392A
Authority: RU
Inventors: Н.С. Осин; А.С. Соколов
Original assignee: Государственный научно-исследовательский институт биологического приборостроения
Priority date: 2001-05-30
Filing date: 2001-05-30
Publication date: 2003-01-27

Abstract

FIELD: medicine. SUBSTANCE: method involves first treating reaction reservoir bottom with specific antibodies and then with antibodies bound to Pt complexes of copro- and uroporphyrin as luminescent label. Luminescent label binding to analyte sought for is carried out in setting specific analyte binding reaction with components under analysis. The not bound analysis components are washed out. Reaction reservoir is dried and micro areas are scanned on the reservoir bottom using laser radiation beam of variable crosssection area. The laser radiation beam of variable cross-section area is taken to be equivalent to single micro area under scanning which area is selected 10⁴...3•10⁴ times as large as the area analyte sought for. EFFECT: high accuracy of early stage diagnosis; controlled bacteria and contaminants availability in various materials. 4 tbl

Description

Изобретение относится к иммунодиагностике, в частности к способам индикации искомого аналита в биологическом образце с использованием флуоресцентных и люминесцентных систем регистрации сигналов. The invention relates to immunodiagnostics, in particular to methods for indicating the desired analyte in a biological sample using fluorescent and luminescent signal recording systems.

В настоящее время требуются быстрые способы детектирования идентификации микробных аналитов, например, микроорганизмов, вирусов, риккетсий, грибов и их фрагментов не только в медицинской диагностике, но также в пищевой промышленности, сельском хозяйстве, биопроцессах и при очистке воды. Существуют различные способы для решения этой задачи: выращивание клеток на культуральных средах, использование микроскопии (наличие вирионов в пробе может быть обнаружено только с использованием электронной микроскопии), проточной цитометрии, различные иммунологические методы анализа, использование полимеразных цепных реакций с нуклеиновыми кислотами. Однако нет способов, которые позволяли бы проводить обнаружение и идентификацию низких концентраций микробных аналитов в пробе за короткое время, с высокой чувствительностью и специфичностью при средней сложности и невысокой стоимости анализа. Currently, fast methods are needed for detecting the identification of microbial analytes, for example, microorganisms, viruses, rickettsia, fungi and their fragments, not only in medical diagnostics, but also in the food industry, agriculture, bioprocesses and water treatment. There are various ways to solve this problem: growing cells on culture media, using microscopy (the presence of virions in a sample can only be detected using electron microscopy), flow cytometry, various immunological methods of analysis, and the use of polymerase chain reactions with nucleic acids. However, there are no methods that would allow the detection and identification of low concentrations of microbial analytes in a sample in a short time, with high sensitivity and specificity with moderate complexity and low cost of analysis.

Известен способ обнаружения и идентификации микроорганизмов в биологических жидкостях (патент США 5366858, класс НКИ 435-5). Способ основан на проведении реакции специфического связывания искомого микроорганизма с компонентами анализа, облучении исследуемого образца возбуждающим источником света, измерении оптической реакции частиц в образце на облучение и сравнении статистических данных измеренных значений со статистическими данными контрольного образца без искомого микроорганизма, о наличии которого судят по превышению измеренных сигналов над контрольными. Измерение сигналов осуществляют методом проточной цитометрии, при этом на выходе измерительного устройства получают интегральный сигнал от совокупности клеток. A known method for the detection and identification of microorganisms in biological fluids (US patent 5366858, class NCI 435-5). The method is based on carrying out a specific binding reaction of the desired microorganism with the analysis components, irradiating the test sample with an exciting light source, measuring the optical reaction of the particles in the sample to irradiation and comparing the statistical data of the measured values with the statistical data of the control sample without the desired microorganism, the presence of which is judged by the excess of the measured signals over the control. Signals are measured by flow cytometry, and an integral signal from a set of cells is obtained at the output of the measuring device.

Известен способ исследования с высоким пространственным и временным расширением малых областей исследуемого образца, находящегося на предметном стекле микроскопа (патент США 4920386, класс НКИ 356-417). При осуществлении способа исследуемый образец освещают источником излучения и измеряют либо отраженный от образца свет, либо проходящий через него свет, либо свет эмиссии. Высокая чувствительность измерений достигается за счет телевизионной камеры. Для получения сигнала используют гематопорфирин, внедренный в клетки, максимум длины волны возбуждения которого 400 нм, а максимум длины волны эмиссии 600 нм. A known research method with high spatial and temporal expansion of small areas of the test sample located on a microscope slide (US patent 4920386, class NCI 356-417). When implementing the method, the test sample is illuminated with a radiation source and either the light reflected from the sample, or the light passing through it, or the emission light is measured. High measurement sensitivity is achieved through a television camera. To obtain a signal, hematoporphyrin is introduced into cells with a maximum excitation wavelength of 400 nm and a maximum emission wavelength of 600 nm.

Способ не может быть использован для идентификации вирусов, т.е. объектов размером менее 0,2-0,3 мкм. Кроме того, способ не позволяет обнаруживать единичные клетки в 1 мл пробы, т.к., например, на подложку площадью 5х5 мм² (площадь, эквивалентная площади дна лунки планшета) наносится проба объемом всего 3-20 мкл, для надежного обнаружения единичных клеток необходимо, чтобы в поле зрения 100х100 мкм было бы не менее 1 клетки, для этого необходимо внесение пробы с концентрацией 10⁴ м.т./мл.The method cannot be used to identify viruses, i.e. objects less than 0.2-0.3 microns in size. In addition, the method does not allow the detection of single cells in 1 ml of a sample, because, for example, a sample of only 3-20 μl is applied to a substrate with an area of 5x5 mm ² (the area equivalent to the bottom area of a well of a plate), for reliable detection of single cells it is necessary that in the field of view 100x100 μm there would be at least 1 cell, for this it is necessary to introduce a sample with a concentration of 10 ⁴ mt / ml.

Известен способ измерения пространственного распределения флуоресценции на субстрате (патент США 5424841, класс НКИ 356-417). Способ предназначен для автоматического исследования ДНК-последовательностей при иммуноанализе малых количеств исследуемого образца (порядка фемтомоль). Сущность способа заключается в том, что сканирующий пучок излучения направляют на конкретные площадки субстрата, содержащего множество флуорофорных маркеров, связанных с аналитом. Излучение возбужденного образца собирают волоконно-оптическим коллектором со всего пути сканирования одновременно и направляют на фотодетектор. Для уменьшения влияния фоновой люминесценции, возникающей в субстрате, используют фильтры, установленные на входе и выходе волоконно-оптического коллектора. A known method of measuring the spatial distribution of fluorescence on a substrate (US patent 5424841, class NKI 356-417). The method is intended for the automatic study of DNA sequences during immunoassay of small amounts of the test sample (femto mole). The essence of the method lies in the fact that the scanning beam of radiation is directed to specific sites of the substrate containing many fluorophore markers associated with the analyte. The radiation of the excited sample is collected by a fiber optic collector from the entire scanning path at the same time and sent to a photodetector. To reduce the effect of background luminescence arising in the substrate, filters are used that are installed at the input and output of the fiber-optic collector.

Способ не может быть использован для идентификации клеток микроорганизмов и вирионов, т.к. фотодетектор измерят интегральное излучение флуоресценции площадок с уровнем фоновой флуоресценции, многократно превышающий уровень флуоресценции единичных клеток микроорганизмов. The method cannot be used to identify cells of microorganisms and virions, because a photodetector will measure the integrated fluorescence emission of sites with a background fluorescence level that is many times higher than the fluorescence level of single microorganism cells.

Известен способ многопараметрового биоспецифического анализа биологических жидкостей (патент РСТ 94/01774, класс МКИ G 01 N 33/543). Способ предназначен для определения нескольких аналитов в пробе исследуемого образца, связанного с твердофазным носителем. В качестве вещества-метки для детектирования аналитов в пробе используют Pt- и Pd-комплексы копропорфирина. Это позволяет значительно уменьшить флуоресценцию фона при измерении сигналов с временным разрешением. A known method of multi-parameter biospecific analysis of biological fluids (patent PCT 94/01774, class MKI G 01 N 33/543). The method is intended for determination of several analytes in a sample of a test sample bound to a solid-phase carrier. Pt and Pd complexes of coproporphyrin are used as label substances for detecting analytes in a sample. This can significantly reduce background fluorescence when measuring signals with time resolution.

Однако при анализе жидких образцов металлопорфирины могут быть использованы в качестве меток только в случае, если они защищены детергентом, например, тритон Х-100 и сульфатом натрия от тушения водой и кислородом, что усложняет способ. However, in the analysis of liquid samples, metalloporphyrins can be used as labels only if they are protected with a detergent, for example, X-100 triton and sodium sulfate from quenching with water and oxygen, which complicates the method.

Известен способ иммуноанализа, использующий одноступенчатый сухой реагент "все-в-одном" (патент РСТ 97/38311, класс МКИ G 01 N 33/543). Сущность способа заключается в том, что специфические компоненты анализа иммобилизуют на твердой фазе реакционного сосуда, например в лунке микротитровальной платы. Добавляют меченые специфические компоненты анализа, отмывают несвязавшиеся с твердой фазой компоненты, высушивают микротитровальную плату и хранят до использования. При проведении анализа в лунки с сухим реагентом добавляют образец (общую кровь, плазму, сыворотку), содержащий маркер (определяемый аналит), проводят реакцию специфического связывания маркера с компонентами анализа, отмывают несвязавшиеся компоненты анализа и детектируют сигнал флуоресценции метки на DELFIA plate флуориметре модель 1234 (Wallac OY, F1). Детектирование осуществляют с поверхности дна лунки после операции отмывки. В качестве флуоресцентных меток используют хелаты лантанидов, европия, тербия, самария, обладающих высокой интенсивностью длительной люминесценции и сохраняющих достаточно высокую специфичность и активность конъюгатов, что позволяет использовать для анализа малые объемы образцов. Способ может быть использован для проведения конкурентного и неконкурентного анализа с моно- и поликлональными антителами. A known method of immunoassay using a single-stage dry reagent "all-in-one" (patent PCT 97/38311, class MKI G 01 N 33/543). The essence of the method lies in the fact that specific components of the analysis are immobilized on the solid phase of the reaction vessel, for example, in the well of a microtiter plate. Labeled specific analysis components are added, the components that are not bound to the solid phase are washed off, the microtiter plate is dried and stored until use. During the analysis, a sample (total blood, plasma, serum) containing a marker (analyte to be determined) is added to the wells with a dry reagent, a specific binding of the marker to the components of the analysis is carried out, unbound components of the analysis are washed off and the fluorescence signal of the label is detected on a DELFIA plate model 1234 fluorimeter (Wallac OY, F1). Detection is carried out from the bottom surface of the well after the washing operation. Chelates of lanthanides, europium, terbium, and samarium are used as fluorescent labels, which have a high intensity of long-term luminescence and preserve a sufficiently high specificity and activity of conjugates, which makes it possible to use small volumes of samples for analysis. The method can be used to conduct competitive and non-competitive analysis with mono - and polyclonal antibodies.

Способ не позволяет проводить обнаружение и идентификацию единичных клеток микроорганизмов и вирусов, т.к. со дна лунок снимается интегральный сигнал. Кроме того, съем сигнала со дна лунок после отмывки при измерении очень малых сигналов люминесценции вносит в измеряемые сигналы значительный сигнал фоновой люминесценции твердой фазы, что ухудшает отношение сигнал/фон и затрудняет проведение индикации и идентификации микроорганизмов и вирусов. The method does not allow the detection and identification of single cells of microorganisms and viruses, because an integral signal is taken from the bottom of the wells. In addition, the removal of the signal from the bottom of the wells after washing when measuring very small luminescence signals introduces a significant signal of the background luminescence of the solid phase into the measured signals, which worsens the signal / background ratio and makes it difficult to indicate and identify microorganisms and viruses.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ измерения люминесценции образцов (ЕР 0841557, класс МКИ G 01 N 21/64). Способ предназначен для исследования тканей злокачественных опухолей и специфических хромосом последовательностей ДНК. Сущность способа заключается в том, что в лунки подготовленной для анализа микротитровальной платы вносят исследуемый образец, элементы образца метят люминесцентным веществом, и затем образец освещают лазерным лучом. При этом каждую лунку сканируют узким пучком лазерного излучения, площадь поперечного сечения которого изменяется процессором в зависимости от размера лунки (планшет с 6 или 384 лунками) и от количества сканируемых микроплощадок в лунке. Для выявления определенных областей (микроплощадок) в структуре клеток в тканях злокачественных опухолей и в специфических хромосомах ДНК-последовательностей используют несколько люминесцентных красителей. Излучение эмиссии каждой индивидуальной микроплощадки в лунке измеряют через некоторый интервал времени после окончания действия светового импульса. The closest in technical essence and the achieved result is a method of measuring luminescence of samples (EP 0841557, class MKI G 01 N 21/64). The method is intended for the study of tissues of malignant tumors and specific chromosomes of DNA sequences. The essence of the method lies in the fact that the test sample is introduced into the wells of a microtiter plate prepared for analysis, the elements of the sample are labeled with a luminescent substance, and then the sample is illuminated with a laser beam. At the same time, each well is scanned with a narrow beam of laser radiation, the cross-sectional area of which varies by the processor depending on the size of the well (plate with 6 or 384 holes) and on the number of scanned microplates in the well. Several luminescent dyes are used to identify specific areas (microplaces) in the structure of cells in the tissues of malignant tumors and in specific chromosomes of DNA sequences. The emission radiation of each individual microplate in the well is measured at a certain time interval after the end of the action of the light pulse.

Способ предназначен для исследования достаточно больших объектов (10-50 мкм) при большой концентрации аналита в образце с использованием визуального распознавания образов на мониторе и не может быть использован для обнаружения и идентификации единичных клеток микроорганизмов и вирионов в пробах, содержащих небольшое количество клеток, в присутствии мешающих примесей. The method is designed to study sufficiently large objects (10-50 μm) at a high analyte concentration in the sample using visual pattern recognition on a monitor and cannot be used to detect and identify single cells of microorganisms and virions in samples containing a small number of cells in the presence of interfering impurities.

Задачей является создание способа обнаружения и идентификации единичных клеток микроорганизмов и вирионов в образце в присутствии гетерологичных биообъектов. The objective is to create a method for the detection and identification of single cells of microorganisms and virions in a sample in the presence of heterologous biological objects.

Техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения, является повышение отношения сигнал/фон, что позволяет повысить надежность обнаружения и идентификации единичных клеток микроорганизмов и вирионов при низких концентрациях их в образце, что позволяет диагностировать различные заболевания на ранней стадии и контролировать наличие бактерий и вирусной контаминации различных материалов в очень низких концентрациях (1-100 частиц аналита в образце). The technical result achieved by using the invention is to increase the signal / background ratio, which improves the reliability of detection and identification of single cells of microorganisms and virions at low concentrations in the sample, which allows you to diagnose various diseases at an early stage and control the presence of bacteria and viral contamination of various materials in very low concentrations (1-100 analyte particles in the sample).

Технический результат достигается предлагаемым изобретением. The technical result is achieved by the invention.

Сущность изобретения заключается в том, что в способе обнаружения аналита в образце, включающем связывание люминесцентной метки с искомым аналитом, находящимся на дне реакционного сосуда, сканирование микроплощадок на дне этого сосуда пучком лазерного излучения с переменной площадью поперечного сечения и детектирование с временным разрешением интенсивности эмиссии люминесцентной метки, обрабатывают дно реакционного сосуда вначале специфическими к искомому аналиту антителами, а затем антителами, связанными с люминесцентной меткой, в качестве которой используют Pt-комплексы копро- или уропорфирина, причем связывание люминесцентной метки с искомым аналитом осуществляют в процессе проведения реакции специфического связывания аналита с компонентами анализа, отмывают несвязавшиеся компоненты анализа и высушивают дно реакционного сосуда, при этом площадь поперечного сечения сканирующего лазерного пучка света принимают эквивалентной площади отдельной сканируемой микроплощадки, площадь которой выбирают в 10⁴...3•10⁴ раз больше площади искомого аналита.The essence of the invention lies in the fact that in a method for detecting an analyte in a sample, comprising binding a luminescent label to the desired analyte located at the bottom of the reaction vessel, scanning the micro areas at the bottom of this vessel with a laser beam with a variable cross-sectional area and detecting with a time resolution the emission intensity of the luminescent tags, treat the bottom of the reaction vessel with antibodies specific for the desired analyte, and then antibodies associated with the luminescent label, Pt complexes of copro- or uroporphyrin are used, moreover, the binding of the luminescent label with the desired analyte is carried out during the process of specific binding of the analyte to the components of the analysis, the unbound components of the analysis are washed and the bottom of the reaction vessel is dried, while the cross-sectional area of the scanning laser light beam take the equivalent area of a single scanned microplate, the area of which is selected 10 ⁴ ... 3 • 10 ⁴ times the area of the analyte sought.

Авторам не известны технические решения, имеющие совокупность признаков, аналогичную заявляемой. Следовательно, предлагаемое решение отвечает критерию новизны. The authors are not aware of technical solutions having a combination of features similar to those claimed. Therefore, the proposed solution meets the criterion of novelty.

От прототипа предлагаемое изобретение отличается новыми признаками и новой их совокупностью. При низких концентрациях искомого аналита в пробе для его обнаружения большое значение имеет отношение величины полезного сигнала к величине фона (с/ф). При измерении сигнала люминесценции метки, связанной с аналитом, непосредственно после операции отмывки большое влияние на величину полезного сигнала оказывает фоновая составляющая флуоресценции остаточного количества реагентов и материала твердой фазы. Высушивание реакционного сосуда снижает влияние первой из этих составляющих. Кроме того, операция высушивания позволяет в качестве метки использовать Pt-комплексы копро- и/или уропорфирина, эмиссия фосфоресценции которых увеличивается при дегидратации. Кроме того, она находится в длинноволновой области спектра, это дает возможность в значительной степени ослабить влияние коротковолновой флуоресценции материала твердой фазы (реакционного сосуда), что позволяет увеличить полезный сигнал и улучшить отношение с/ф. Регулирование поперечного сечения сканирующего лазерного пучка излучения указанным образом позволяет сохранять оптимальное соотношение между площадью сканируемой микроплощадки и площадью поперечного сечения сканирующего пучка излучения, т.е. яркостью освещения искомого аналита, что позволяет получить оптимальное соотношение с/ф. Вся совокупность признаков позволяет получить такое соотношение с/ф, что становится возможным обнаружение, идентификация единичных клеток микроорганизмов и вирусов и их количественная оценка в искомом материале. Следовательно, предлагаемое изобретение отвечает критерию уровня техники. The invention differs from the prototype by new features and their new combination. At low concentrations of the desired analyte in the sample, the ratio of the useful signal to the background value (s / f) is of great importance for its detection. When measuring the luminescence signal of the label associated with the analyte, immediately after the washing operation, the background component of the fluorescence of the residual amount of reagents and solid phase material has a great influence on the value of the useful signal. Drying the reaction vessel reduces the effect of the first of these components. In addition, the drying operation allows the use of Pt-complexes of copro- and / or uroporphyrin, the phosphorescence emission of which increases upon dehydration, as a label. In addition, it is located in the long-wavelength region of the spectrum, this makes it possible to significantly weaken the influence of short-wavelength fluorescence of the solid phase material (reaction vessel), which makes it possible to increase the useful signal and improve the c / f ratio. The adjustment of the cross section of the scanning laser radiation beam in this way allows us to maintain the optimal ratio between the area of the scanned microplate and the cross-sectional area of the scanning radiation beam, i.e. brightness of the desired analyte, which allows you to get the optimal ratio s / f. The whole set of features allows you to get such a ratio with / f that it becomes possible to detect, identify single cells of microorganisms and viruses and their quantitative assessment in the desired material. Therefore, the present invention meets the criteria of the prior art.

Изобретение найдет широкое применение в медицинской диагностике, в биохимии, пищевой и других отраслях промышленности, в случаях, когда возникает необходимость быстрой и ранней диагностики заболеваний, загрязнения окружающей среды и т.п. Следовательно, предлагаемое изобретение отвечает критерию промышленной применимости. The invention will find wide application in medical diagnostics, in biochemistry, food and other industries, in cases where there is a need for quick and early diagnosis of diseases, environmental pollution, etc. Therefore, the present invention meets the criterion of industrial applicability.

Способ осуществляется следующим образом. The method is as follows.

В лунки микротитровальной платы (или на поверхность любого твердофазного носителя) вносят специфические к определяемому аналиту антитела в концентрации 2-10 мкг/мл и инкубируют в течение 2 ч при 37^oС или в течение 12-18 ч при 4^oС. Затем несвязавшиеся антитела удаляют промывкой, а дно и стенки лунок микротитровальной платы обрабатывают блокирующим раствором, например 1% раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА). В подготовленные лунки вносят анализируемую пробу в объеме 100-250 мкл, инкубируют в течение 2-4 ч при комнатной температуре, а несвязавшуюся часть пробы удаляют промывкой. После этого в лунки вносят конъюгат - специфические к искомому аналиту антитела, меченные Pt-комплексом уро- или копропорфирина, в концентрации 50-100 нг на лунку в объеме 200 мкл. При окрашивании антител используют соотношение "метка/белок" 3-10 молекул вещества-метки на одну молекулу белка. После инкубации искомого аналита с конъюгатом лунки промывают 3-6 раз буферным раствором (фосфатный буфер 0,1М или трис буфер 0,1М, рН 7-7,5), а затем двукратно дистиллированной водой и высушивают на воздухе. Обнаружение аналитов в пробе осуществляют сканированием дна лунки микротитровальной платы импульсным лазерным пучком излучения. При этом площадь поперечного сечения сканирующего пучка света принимают эквивалентной площади единичной сканируемой микроплощадки дна реакционного сосуда, которая изменяется в пределах от 10000 мкм² (для клеток микроорганизмов) до 500 мкм² (для клеток вирионов).Antibody-specific antibodies at a concentration of 2-10 μg / ml are added to the wells of the microtiter plate (or to the surface of any solid-phase carrier) and incubated for 2 hours at 37 ^° C or for 12-18 hours at 4 ^° C. Then unbound the antibodies are removed by washing, and the bottom and the walls of the wells of the microtiter plate are treated with a blocking solution, for example 1% solution of bovine serum albumin (BSA). An assayed sample is added to the prepared wells in a volume of 100-250 μl, incubated for 2-4 hours at room temperature, and the unbound part of the sample is removed by washing. After that, a conjugate is introduced into the wells — antibodies specific for the desired analyte labeled with the Pt complex of uro or coproporphyrin in a concentration of 50-100 ng per well in a volume of 200 μl. When staining antibodies using the ratio of "label / protein" 3-10 molecules of substance-tags per molecule of protein. After incubation of the desired analyte with the conjugate, the wells are washed 3-6 times with buffer solution (0.1 M phosphate buffer or 0.1 M Tris buffer, pH 7-7.5), and then twice with distilled water and dried in air. Detection of analytes in the sample is carried out by scanning the bottom of the hole microtiter plate pulsed laser beam of radiation. In this case, the cross-sectional area of the scanning light beam is taken to be the equivalent area of a single scanned microplate of the bottom of the reaction vessel, which varies from 10,000 μm ² (for microorganism cells) to 500 μm ² (for virion cells).

Интенсивность сигнала люминесценции примесей и материала твердой фазы, регистрируемая со дна реакционного сосуда, пропорциональна площади, освещаемой возбуждающим источником излучения, и интенсивности возбуждающего светового потока. В то же время полезный сигнал от фиксированного на носителе количества клеток микроорганизмов (или вирусов) не зависит от освещаемой площади и пропорционально возрастает только при увеличении интенсивности возбуждающего светового потока, т.к. площадь, занимаемая выявляемыми биоагентами, остается постоянной. Т.о., для повышения отношения полезного сигнала к уровню фоновой люминесценции необходимо существенно уменьшить площадь освещаемой микроплощадки и, соответственно, пропорционально увеличить интенсивность возбуждающего светового потока, т.е. уменьшить площадь поперечного сечения светового пучка при одном и том же источнике излучения. Однако чрезмерное уменьшение размеров сканируемой микроплощадки приводит к значительному увеличению времени анализа образца. Ограничение максимального размера микроплощадки обусловлено уровнем сигнала фоновой люминесценции твердофазного носителя (дна реакционного сосуда), с которой биоспецифически связан микробный аналит. Поэтому оптимальным размером микроплощадки будет такой ее размер, при котором уровень сигнала фоновой люминесценции микроплощадки достоверно ниже уровня сигнала люминесценции единичного микробного аналита. Как правило, для достоверного обнаружения микробного аналита достаточно, чтобы уровень сигнала от микробного аналита был выше среднего уровня фоновой люминесценции твердофазного носителя в 3 раза. The intensity of the luminescence signal of impurities and solid phase material recorded from the bottom of the reaction vessel is proportional to the area illuminated by the exciting radiation source and the intensity of the exciting light flux. At the same time, the useful signal from the number of microorganism cells (or viruses) fixed on the carrier does not depend on the illuminated area and increases proportionally only with an increase in the intensity of the exciting light flux, because the area occupied by identified bioagents remains constant. Thus, to increase the ratio of the useful signal to the level of background luminescence, it is necessary to significantly reduce the area of the illuminated microplate and, accordingly, proportionally increase the intensity of the exciting light flux, i.e. reduce the cross-sectional area of the light beam with the same radiation source. However, an excessive reduction in the size of the scanned microplate leads to a significant increase in the time of analysis of the sample. The limitation of the maximum microplate size is due to the level of the background luminescence signal of the solid-phase carrier (bottom of the reaction vessel), to which the microbial analyte is biospecifically associated. Therefore, the optimal size of the microplate will be its size at which the signal level of the background luminescence of the microplate is significantly lower than the level of the luminescence signal of a single microbial analyte. As a rule, for reliable detection of a microbial analyte, it is sufficient that the signal level from the microbial analyte be 3 times higher than the average background luminescence of the solid-phase carrier.

При использовании Pt-копро- или уропорфирина при детектировании микробных аналитов на твердой фазе полистирола в режиме временного разрешения люминесценции (время задержки между импульсом возбуждения и регистрацией строба 100 мкс, частота следования импульсов возбуждения 5000 имп./с, λ_возб- 532 нм, λ_эм- 645 нм, мощность падающего лазерного светового потока сохраняется постоянной - 20 мВт) сопоставимый уровень фоновой люминесценции твердой фазы наблюдается при превышении площади микроплощадки над площадью микробного аналита на ней в 10⁴...3•10⁴ раз.When using Pt-copro or uroporphyrin in the detection of microbial analytes on the solid phase of polystyrene in the mode of temporary resolution of luminescence (the delay time between the excitation pulse and the detection of the strobe is 100 μs, the pulse repetition rate is 5000 cps, λ _exc is 532 nm, λ _em - 645 nm, the power of the incident laser light flux is kept constant - 20 mW) comparable to the level of background luminescence of the solid phase is observed at excess mikroploschadki area over the area of microbial analyte thereon 10 3 ⁴ ... • April ¹⁰ al.

Площадь поперечного сечения лазерного пучка света выбирают эквивалентной площади освещаемой микроплощадки, т.к. с уменьшением или увеличением площади сканируемой микроплощадки должно оставаться оптимальным отношение с/ф, т.е. увеличиваться или уменьшаться мощность падающего на микроплощадку светового потока. При этом количество темновых и фоновых импульсов люминесценции, детектируемых с освещаемой микроплощадки (при измерении в режиме счета фотонов) в заданном временном и спектральном интервале должно быть в три и более раз ниже, чем полезный сигнал от единичных клеток микроорганизмов и вирионов, меченных длительно люминесцирующей меткой. The cross-sectional area of the laser light beam is chosen to be equivalent to the area of the illuminated microplate, because with a decrease or increase in the area of the scanned microplate, the c / f ratio should remain optimal, i.e. increase or decrease the power of the light flux incident on the microplate. The number of dark and background luminescence pulses detected from the illuminated microplate (when measured in the photon counting mode) in a given time and spectral interval should be three or more times lower than the useful signal from single cells of microorganisms and virions labeled with a long luminescent label .

Уменьшение размеров освещаемой микроплощадки и, соответственно, увеличение интенсивности сканирующего пучка света может осуществляться до определенного предела. Допустимый уровень интенсивности возбуждающего светового потока ограничен люминесцентными характеристиками вещества метки и не должен превышать 10-15% от уровня, при котором все молекулы вещества-метки переводятся в возбужденное состояние. При превышении этого уровня будет искажена концентрационная зависимость сигнала люминесценции от содержания метки в пробе. Reducing the size of the illuminated microplate and, accordingly, increasing the intensity of the scanning light beam can be carried out to a certain limit. The permissible level of intensity of the exciting light flux is limited by the luminescent characteristics of the label substance and should not exceed 10-15% of the level at which all molecules of the label substance are brought into an excited state. If this level is exceeded, the concentration dependence of the luminescence signal on the label content in the sample will be distorted.

Для микроорганизмов возбудителя туляремии среднее число молекул метки составляет 3. . .6•10⁵. Это число определяется количеством эпитопов к моно- или поликлональным антителам и "нагрузкой" метки на молекулу антитела (обычно 4-8 молекул). Для вакцинного вируса натуральной оспы число молекул метки составляет 2...4•10⁴. Разница в числе молекул метки связана с тем, что количество эпитопов на поверхности вируса ниже, чем на поверхности возбудителя туляремии, почти в 10 раз. С учетом этого и для сохранения отношения с/ф, достаточного для обнаружения и идентификации биоагентов, размер единичной освещаемой сканирующим пучком света микроплощадки должен изменяться при детектировании биоагента прямо пропорционально количеству молекул метки. При этом в соответствии с изменением размера единичной микроплощадки, эквивалентно ей, изменяется и площадь сечения сканирующего лазерного пучка. В табл. 1 представлены экспериментальные данные, подтверждающие выбор оптимального размера сканируемой микроплощадки.For microorganisms of the causative agent of tularemia, the average number of label molecules is 3.. .6 • 10 ⁵ . This number is determined by the number of epitopes to mono- or polyclonal antibodies and the “load” of the label on the antibody molecule (usually 4-8 molecules). For smallpox vaccine virus, the number of label molecules is 2 ... 4 • 10 ⁴ . The difference in the number of label molecules is due to the fact that the number of epitopes on the surface of the virus is lower than on the surface of the causative agent of tularemia by almost 10 times. With this in mind, and in order to maintain a c / f ratio sufficient for the detection and identification of bioagents, the size of a single microplate illuminated by a scanning beam of light should change upon detection of the bioagent in direct proportion to the number of label molecules. Moreover, in accordance with the change in the size of a single microplate, equivalent to it, the cross-sectional area of the scanning laser beam also changes. In the table. 1 presents experimental data confirming the choice of the optimal size of the scanned microplate.

Сканирование дна реакционного сосуда осуществляют путем последовательного облучения микроплощадок лазерным пучком света. Время сканирования одной микроплощадки 30-50 мс, что позволяет реакционный сосуд с площадью дна 25•10⁶ мкм² просканировать за 4-6 мин.Scanning the bottom of the reaction vessel is carried out by sequentially irradiating the microplates with a laser beam of light. The scanning time of one microplate is 30-50 ms, which allows a reaction vessel with a bottom area of 25 • 10 ⁶ μm ^{2 to} scan for 4-6 minutes.

Индикацию биоагентов можно осуществлять следующим образом. Измеряют количество фотоимпульсов люминесценции от единичных микроплощадок и количество фотоимпульсов от всех микроплощадок. Вычисляют среднее значение количества фотоимпульсов от одной микроплощадки и определяют отношение количества измеренных фотоимпульсов от единичной микроплощадки к среднему значению количества фотоимпульсов от одной микроплощадки. При достоверном превышении первого сигнала над вторым судят о наличии в пробе микроорганизмов и вирионов. Если это отношение равно 3, констатируют наличие в пробе вирусов, а если 10 - микроорганизмов. Ниже приведены примеры обнаружения единичных клеток микроорганизмов и вирионов. Indication of bioagents can be carried out as follows. Measure the number of luminescence photopulses from single microplates and the number of photopulses from all microplates. The average value of the number of photo pulses from one microplate is calculated and the ratio of the number of measured photo pulses from a single microplate to the average number of photo pulses from a single microplate is determined. With a significant excess of the first signal over the second, the presence of microorganisms and virions in the sample is judged. If this ratio is 3, the presence of viruses in the sample is ascertained, and if 10 - microorganisms. The following are examples of the detection of single cells of microorganisms and virions.

Пример. 1. Выявление клеток возбудителя туляремии. Example. 1. Detection of tularemia pathogen cells.

Дно лунок микропланшета обрабатывают специфическими антителами к возбудителю туляремии. С этой целью в лунки вносят по 0,05 мл моноклональных мышиных антител, специфичных к липополисахариду Fr.tularensis, в концентрации 1 мкг/мл в виде карбонатно-бикарбонатного (КББ) 0,15 мМ буферного раствора, рН 7,7. Инкубируют раствор в течение 1 ч при 37^oС и затем удаляют раствор и трехкратно промывают лунку изотоничным раствором КББ.The bottom of the microplate wells is treated with specific antibodies to the tularemia pathogen. For this purpose, 0.05 ml of monoclonal mouse antibodies specific for Fr.tularensis lipopolysaccharide are added to the wells at a concentration of 1 μg / ml in the form of a carbonate-bicarbonate (CBB) 0.15 mM buffer solution, pH 7.7. Incubate the solution for 1 h at 37 ^{° C.} and then remove the solution and wash the well three times with isotonic KBB solution.

Затем в лунки микропланшета, обработанные специфическими антителами к возбудителю туляремии, вносят по 0,2 мл пробы, содержащей клетки искомого микроорганизма в концентрации от 20 до 600 клеток в мл, и конъюгат специфических антител к Fr. tularensis в концентрации 0,1 мкг/мл, меченых Pt-копропорфирином, в молярном соотношении метка-белок 4:1. В качестве контрольных проб используют суспензию E.coli М-17 в концентрации 10⁴...10⁶ м.т. в мл и осповакцину, содержащую живой вирус, от 10⁶ до 10⁸ вирионов. Контрольные пробы также обрабатывают конъюгатом специфических антител к возбудителю туляремии. С этой целью используют часть лунок, обработанных специфическими к возбудителю туляремии антителами. Количество микроорганизмов в пробе рассчитывают по стандарту мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича. Количество вирионов - титрованием на культуре клеток.Then, 0.2 ml of a sample containing cells of the desired microorganism at a concentration of from 20 to 600 cells per ml and a conjugate of specific antibodies to Fr. are added to the wells of a microplate treated with specific antibodies to the tularemia causative agent. tularensis at a concentration of 0.1 μg / ml labeled with Pt-coproporphyrin in a 4: 1 label-protein molar ratio. As control samples, a suspension of E. coli M-17 at a concentration of 10 ⁴ ... 10 ⁶ mt is used. in ml and smallpox vaccine containing live virus, from 10 ⁶ to 10 ⁸ virions. Control samples are also treated with a conjugate of specific antibodies to the causative agent of tularemia. For this purpose, part of the wells treated with antibodies specific to the causative agent of tularemia is used. The number of microorganisms in the sample is calculated according to the standard turbidity GISK them. L.A. Tarasevich. The number of virions is titrated on cell culture.

После внесения проб и инкубации их в течение 4 ч лунки 3-кратно промывают дистиллированной водой и высушивают на воздухе. После этого осуществляют регистрацию сигнала в соответствии с описанной выше процедурой. Данные эксперимента приведены в табл.2. Гетерологичные микроорганизмы не адсорбируются на твердой фазе полистирола, и в контрольных пробах не регистрируются микроплощадки с уровнем сигнала, в 3 и более раз превышающим средний уровень. After making the samples and incubating them for 4 hours, the wells are washed 3 times with distilled water and dried in air. After that, the signal is recorded in accordance with the procedure described above. The experimental data are given in table.2. Heterologous microorganisms are not adsorbed on the solid phase of polystyrene, and microsites with a signal level 3 or more times higher than the average level are not recorded in control samples.

Результаты опыта показывают, что искомые биоагенты специфически связывают метку в существенно более высоких концентрациях, чем гетерологичные клетки и вирусы, и могут быть выявлены предлагаемым способом в низких концентрациях. При этом для обнаружения клеток возбудителя туляремии достаточно иметь максимальный размер площадки около 100х100 мкм. При снижении размера площадки в 9 раз эффективность обнаружения практически не изменяется, но время анализа увеличивается в 9 раз. Таким образом, площадь зондирующего луча должна устанавливаться с учетом фоновой фосфоресценции и уровня сигнала фосфоресценции искомого биоагента. Этот уровень зависит от качества используемых меченых антител и числа эпитопов, связывающих меченые антитела на поверхности клетки. Максимальная площадь зондирующего луча должна быть такой, чтобы сигнал фосфоресценции единичной клетки достоверно превышал сигнал фоновой фосфоресценции. В представленном примере для клеток возбудителя туляремии эффективной является площадка 100х100 мкм. The results of the experiment show that the desired bioagents specifically bind the label at significantly higher concentrations than heterologous cells and viruses, and can be detected by the proposed method in low concentrations. Moreover, to detect tularemia pathogen cells, it is sufficient to have a maximum area size of about 100x100 microns. With a decrease in the size of the site by 9 times, the detection efficiency remains practically unchanged, but the analysis time increases by 9 times. Thus, the area of the probe beam should be established taking into account background phosphorescence and the level of the phosphorescence signal of the desired bioagent. This level depends on the quality of the labeled antibodies used and the number of epitopes that bind the labeled antibodies on the cell surface. The maximum area of the probe beam should be such that the signal of phosphorescence of a single cell significantly exceeds the signal of background phosphorescence. In the presented example, an area of 100x100 μm is effective for the cells of the causative agent of tularemia.

Пример. 2. Выявление вируса осповакцины. Example. 2. Identification of vaccinia virus.

Дно лунок микропланшета обрабатывают специфическими антителами к вирусу осповакцины. С этой целью в лунки вносят по 0,05 мл поликлональных кроличьих антител, специфичных к вирусу осповакцины, в концентрации 1 мкг/мл в виде карбонатно-бикарбонатного (КББ) 0,15 мМ буферного раствора, рН 7,7. Инкубируют раствор в течение 1 ч при 37^oС и затем удаляют раствор и трехкратно промывают лунку изотоничным раствором КББ.The bottom of the microplate wells is treated with specific antibodies for vaccinia virus. For this purpose, 0.05 ml of polyclonal rabbit antibodies specific for the vaccinia virus are added to the wells at a concentration of 1 μg / ml in the form of a carbonate-bicarbonate (CBB) 0.15 mM buffer solution, pH 7.7. Incubate the solution for 1 h at 37 ^{° C.} and then remove the solution and wash the well three times with isotonic KBB solution.

Затем в лунки микропланшета, обработанные специфическими антителами к вирусу осповакцины, вносят по 0,2 мл пробы, содержащей вирус осповакцины в концентрации от 200 до 5000 вирионов, и конъюгат специфических антител к вирусу осповакцины в концентрации 0,1 мкг/мл, меченых Pt-копропорфирином, в молярном соотношении метка-белок 6:1. В качестве контрольных проб используют суспензию E.coli М-17 в концентрации 10⁴...10⁶ м.т. в мл и возбудитель туляремии. Контрольные пробы также обрабатывают конъюгатом специфических антител к вирусу осповакцины. С этой целью используют часть лунок, обработанных специфическими к вирусу антителами. После внесения проб и инкубации их в течение 4 ч лунки 3-кратно промывают дистиллированной водой. После этого осуществляют регистрацию сигнала в соответствии с описанной выше процедурой. Данные эксперимента приведены в табл.3.Then, 0.2 ml of a sample containing vaccinia virus at a concentration of 200 to 5000 virions and a conjugate of specific antibodies to vaccinia virus at a concentration of 0.1 μg / ml labeled with Pt- are added to the wells of a microplate treated with specific antibodies to the vaccinia virus. coproporphyrin, in a label-protein molar ratio of 6: 1. As control samples, a suspension of E. coli M-17 at a concentration of 10 ⁴ ... 10 ⁶ mt is used. in ml and the causative agent of tularemia. Control samples are also treated with a conjugate of specific antibodies for the vaccinia virus. For this purpose, part of the wells treated with virus-specific antibodies is used. After making the samples and incubating them for 4 hours, the wells are washed 3 times with distilled water. After that, the signal is recorded in accordance with the procedure described above. The experimental data are given in table.3.

Из представленного примера видно, что для обнаружения вируса осповакцины необходимо уменьшение размера площадки сканирования до 30х30 мкм. В этом случае счетная концентрация вирионов соответствует заданной. Уменьшение размера площадки сканирования обусловлено тем, что количество эпитопов на поверхности вируса существенно ниже, чем на поверхности возбудителя туляремии. From the presented example it is seen that in order to detect the vaccinia virus, it is necessary to reduce the size of the scanning site to 30x30 microns. In this case, the calculated concentration of virions corresponds to the given one. The decrease in the size of the scanning site is due to the fact that the number of epitopes on the surface of the virus is significantly lower than on the surface of the tularemia pathogen.

Приемник излучения люминесценции меток при работе в режиме счета фотонов должен обеспечивать получение не менее одного фотоимпульса в секунду от одной молекулы метки. Регистрацию сигналов люминесценции метки осуществляют в режиме временного разрешения сигналов люминесценции. При использовании Pt-комплексов уро- и копропорфирина исследуемую пробу образца возбуждают излучением лазера на длине волны 532 нм, а фосфоресценцию метки детектируют на длине волны 645 нм. При этом время задержки между актом возбуждения и приемом излучения фосфоресценции выбирается равным 30-40 мс, а время регистрации строба - 100 мкс. Это позволяет уменьшить влияние фоновой флуоресценции материала твердофазного носителя (дна реакционного сосуда) на более коротких длинах волн, что улучшает отношение сигнал/фон и позволяет повысить чувствительность измерений. The receiver of the luminescence of labels when operating in the photon counting mode should provide at least one photopulse per second from one label molecule. The registration of the luminescence signals of the label is carried out in the time resolution mode of the luminescence signals. When using the Ut and coproporphyrin Pt complexes, the test sample is excited by laser radiation at a wavelength of 532 nm, and the phosphorescence of the label is detected at a wavelength of 645 nm. In this case, the delay time between the act of excitation and the reception of phosphorescence radiation is chosen equal to 30-40 ms, and the time of registration of the strobe is 100 μs. This makes it possible to reduce the effect of background fluorescence of the solid-phase support material (the bottom of the reaction vessel) at shorter wavelengths, which improves the signal / background ratio and makes it possible to increase the sensitivity of measurements.

Регистрация сигналов фосфоресценции с высушенной поверхности дна лунки существенно увеличивает постоянную времени затухания (с τ =15-20 мкс до τ =60-80 мкс) и квантовый выход метки, что также улучшает отношение с/ф, а вся совокупность признаков позволяет увеличить чувствительность и надежность обнаружения и идентификации биоагентов в пробе. Registration of phosphorescence signals from the dried surface of the bottom of the well significantly increases the decay time constant (from τ = 15-20 μs to τ = 60-80 μs) and the quantum yield of the label, which also improves the c / f ratio, and the whole set of features allows to increase the sensitivity and reliability of detection and identification of bioagents in the sample.

Операция высушивания твердой фазы с адсорбированными метками и коньюгатом обеспечивает увеличение уровня полезного сигнала примерно в 40 раз по сравнению с сигналами, измеренными на поверхности твердой фазы без ее высушивания. Это достигается за счет снятия тушащего эффекта воды, кислорода, а также за счет увеличения жесткости молекулярного окружения (подвижности) при дегидратации при сохранении уровня сигнала фоновой длительной люминесценции твердой фазы. В качестве коньюгата используют Pt-комплексы копро- или уропорфирина с моноклональными антителами, адсорбированными на твердой фазе реакционного сосуда. Молекулярное соотношение метка/белок - 4:1. Образец материала для исследования получен путем внесения в лунки раствора конъюгата 300 нг/мл и адсорбции на твердой фазе 300 нг/мл. The operation of drying the solid phase with adsorbed labels and conjugate provides an increase in the level of the useful signal by about 40 times compared with the signals measured on the surface of the solid phase without drying it. This is achieved by removing the quenching effect of water and oxygen, as well as by increasing the rigidity of the molecular environment (mobility) during dehydration while maintaining the signal level of the background long-term luminescence of the solid phase. As the conjugate, Pt complexes of copro- or uroporphyrin with monoclonal antibodies adsorbed on the solid phase of the reaction vessel are used. The molecular label / protein ratio is 4: 1. A sample of material for the study was obtained by adding 300 ng / ml conjugate solution to the wells and adsorption on a solid phase of 300 ng / ml.

Способ найдет широкое применение в различных отраслях техники для обнаружения и идентификации микроорганизмов и вирионов при низкой их концентрации в пробе. The method will find wide application in various fields of technology for the detection and identification of microorganisms and virions at low concentrations in the sample.

Claims

A method for detecting and identifying cells of microorganisms and viruses, including binding a luminescent label to a desired analyte located at the bottom of a reaction vessel, scanning micro areas at the bottom of this vessel with a laser beam with a variable cross-sectional area and temporarily resolving the emission intensity of the luminescent label, characterized in that they treat the bottom of the reaction vessel first with antibodies specific for the desired analyte, and then with antibodies associated with the luminescent a copolymer, which uses copro- or uroporphyrin Pt complexes, the binding of the luminescent label to the desired analyte is carried out during the process of specific binding of the analyte to the analysis components, the unbound analysis components are washed and the reaction vessel is dried, while the cross-sectional area of the scanning laser beam the light take the equivalent area of a single scanned micro-site, the area of which is chosen in 10 ⁴ . . . 3 • 10 ⁴ times the area of the analyte sought.