RU2353650C1

RU2353650C1 - Line of cells of immature carp (cyprinus carpio) ico ovaries for virological research

Info

Publication number: RU2353650C1
Application number: RU2007132282/13A
Authority: RU
Inventors: Игорь Степанович Щелкунов (RU); Игорь Степанович Щелкунов; Татьяна Ивановна Щелкунова (RU); Татьяна Ивановна Щелкунова
Original assignee: ГНУ ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии
Priority date: 2007-08-28
Filing date: 2007-08-28
Publication date: 2009-04-27

Abstract

FIELD: chemistry, biochemistry.

SUBSTANCE: invention relates to field of biotechnology. Obtained is line of cells of immature carp Cyprinus carpio ovaries, which can be used as test-culture for isolation, accumulation, titration and study of viruses.

EFFECT: invention can be used in virological research.

Description

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению перевиваемых линий клеток рыб, пригодных для выделения и изучения вирусов рыб разных таксономических групп, разводимых в условиях аквакультуры.The invention relates to biotechnology, in particular to the production of transplantable fish cell lines suitable for isolation and study of fish viruses of different taxonomic groups bred under aquaculture conditions.

Вирусные болезни - один из главных факторов, тормозящих развитие мировой аквакультуры. На сегодня известны около 400 вирусов рыб, и число их продолжает расти. В настоящее время весьма актуальна задача получения постоянных (перевиваемых) линий клеток, чувствительных к широкому кругу вирусов рыб. Карп (Cyprinus carpio) является одним из наиболее распространенных объектов разведения в аквакультуре.Viral diseases are one of the main factors inhibiting the development of world aquaculture. Today, about 400 fish viruses are known, and their number continues to grow. Currently, the urgent task of obtaining permanent (transplantable) cell lines that are sensitive to a wide range of fish viruses. Carp (Cyprinus carpio) is one of the most common breeding sites in aquaculture.

Известны 24 постоянных линии клеток, полученных из разных органов и тканей карпа, и только одна из них (GON) была получена из гонадной ткани [1]. Однако чувствительность ее к вирусам рыб не была определена, что не позволяет использовать ее в работах по выделению и изучению вирусов, вызывающих опасные заболевания рыб.There are 24 known constant cell lines obtained from different organs and tissues of carp, and only one of them (GON) was obtained from gonadal tissue [1]. However, its sensitivity to fish viruses has not been determined, which does not allow its use in studies on the isolation and study of viruses that cause dangerous fish diseases.

Целью изобретения является получение постоянной клеточной линии карпа, пригодной для проведения вирусологических исследований карпа и чувствительной к другим вирусам рыб.The aim of the invention is to obtain a constant cell line of carp suitable for virological studies of carp and sensitive to other fish viruses.

Поставленная цель достигается получением постоянной линии клеток ICO яичников неполовозрелого карпа (Cyprinus carpio), используемой в вирусологических исследованиях и чувствительной к 6 вирусам разных видов рыб.This goal is achieved by obtaining a constant line of ICO cells of the ovaries of immature carp (Cyprinus carpio), used in virological studies and sensitive to 6 viruses of different fish species.

Постоянная клеточная линия ICO получена путем многократного пассирования первично-трипсинизированной культуры клеток яичников 3-х неполовозрелых (2-ая стадия зрелости по шкале Киселевича) четырехгодовиков карпа (Cyprinus carpio).The constant ICO cell line was obtained by repeatedly passaging the primary trypsinized culture of ovarian cells of 3 immature (2nd stage of maturity on the Kiselevich scale) four-year-old carp (Cyprinus carpio).

Постоянная клеточная линия ICO депонирована в Специализированной коллекции перевиваемых соматических культур клеток сельскохозяйственных и промысловых животных Российской коллекции культур клеток при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии (СХЖ РАСХН) под №66.The constant ICO cell line has been deposited in the Specialized Collection of Transplantable Somatic Cell Cultures of Agricultural and Commercial Animals of the Russian Cell Culture Collection at the All-Russian Scientific Research Institute of Experimental Veterinary Medicine under the number 66.

Постоянная клеточная линия ICO характеризуется следующими признаками.The constant ICO cell line is characterized by the following features.

Кулътуральные свойства. Жизненный цикл клеточной линии ICO, при котором сохраняются ее основные биологические показатели, составляет 690 пассажей. При посевной дозе 200-250×10³ клеток/см² монослой формируется через сутки культивирования при 25°С и сохраняется без смены среды в течение 10-14 дней, если через 2-3 суток после его образования инкубацию продолжить при 15°С. Коэффициент пересева 1:4-1:5.Cultural properties. The life cycle of the ICO cell line, in which its basic biological parameters are preserved, is 690 passages. At a seeding dose of 200-250 × 10 ³ cells / cm ^{2 the} monolayer is formed after 24 hours of cultivation at 25 ° C and remains without changing the medium for 10-14 days, if 2-3 days after its formation, the incubation is continued at 15 ° C. Reseeding coefficient 1: 4-1: 5.

Клеточную линию ICO культивируют в монослойных культурах в среде Игла MEM с двойным набором аминокислот и витаминов (2МЕМ) с 10% сыворотки эмбрионов коров. Для диспергирования клеточного монослоя при пересевах используют смесь 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора версена в соотношении 5:7 при комнатной температуре. Урожай клеток с флакона площадью 20 см² составляет 12-15 млн. клеток.The ICO cell line is cultured in monolayer cultures in Eagle MEM with a double set of amino acids and vitamins (2MEM) with 10% serum of cow embryos. A mixture of a 0.25% trypsin solution and a 0.02% versene solution in a 5: 7 ratio at room temperature is used to disperse the cell monolayer during transfers. The harvest of cells from a vial with an area of 20 cm ² is 12-15 million cells.

Для криоконсервирования при температуре -196°С применяют смесь, состоящую из 70% среды 2МЕМ, 20% сыворотки эмбрионов коров и 10% диметилсульфоксида, при концентрации клеток 5-6×10⁶ в мл. Жизнеспособность клеток по тесту витального окрашивания трипановым синим после хранения в жидком азоте составляет 75-80%. Клетки восстанавливают исходные ростовые и морфологические свойства в течение 2-х пассажей.For cryopreservation at a temperature of -196 ° C, a mixture is used consisting of 70% 2MEM medium, 20% serum of cow embryos and 10% dimethyl sulfoxide, at a cell concentration of 5-6 × 10 ⁶ in ml. Cell viability according to the test of vital staining with trypan blue after storage in liquid nitrogen is 75-80%. Cells restore their original growth and morphological properties within 2 passages.

Морфологические признаки. Клетки ICO эпителиоподобные, мелкие, преимущественно однородные, их форма близка к кубической, ядра крупные округлые, число ядрышек от 1 до 3, чаще 1.Morphological signs. ICO cells are epithelial-like, small, mostly homogeneous, their shape is close to cubic, the nuclei are large, round, the number of nucleoli is from 1 to 3, more often 1.

Кариологическая характеристика. (2n=100). Интервал варьирования хромосом от 95 до 104. Модальное число 100 хромосом. Величина модального класса 56%.Karyological characteristic. (2n = 100). The range of variation of chromosomes is from 95 to 104. The modal number is 100 chromosomes. The value of the modal class is 56%.

Видовая идентичность подтверждена кариологическими и олекулярно-генетическими методами.Species identity is confirmed by karyological and molecular genetic methods.

Контроль клеточной линии ICO на посторонние контаминанты. При исследовании клеточной линии ICO на стерильность (наличие бактерий, грибов, микоплазм) получены отрицательные результаты.Control ICO cell lines for contaminants. When examining the ICO cell line for sterility (the presence of bacteria, fungi, mycoplasmas), negative results were obtained.

Клеточная линия ICO может быть использована для выделения, накопления, титрования и изучения следующих вирусов рыб: весенней виремии карпа (SVCV), вирусной геморрагической септицемии (VHSV), инфекционного некроза гемопоэтической ткани (IHNV), рабдовируса европейского угря (Rhabdovirus anguilla), рабдовируса мальков щуки (PFRV) и иридовируса карпа (CCIV).The ICO cell line can be used to isolate, accumulate, titrate and study the following fish viruses: spring carp viremia (SVCV), viral hemorrhagic septicemia (VHSV), hematopoietic tissue infectious necrosis (IHNV), European eel rhabdovirus (Rhabdovirus anguilla), and juvenile rhabdovirus pike (PFRV) and carp iridovirus (CCIV).

Клеточная линия ICO может быть также использована для детектирования анти-SVCV-антител в сыворотках переболевших рыб.The ICO cell line can also be used to detect anti-SVCV antibodies in the sera of ill fish.

Список литературыBibliography

Chen S.N., Kou G.H. Establishment, characterization and application of 14 cell lines, derived from warm-water fish. In: "Invertebrate and Fish Tissue Culture". (Eds. by E. Kurstak and Y. Kuroda), Japan Scientific Press - Springer - Verlag. 1987, P. 218-227.Chen S.N., Kou G.H. Establishment, characterization and application of 14 cell lines, derived from warm-water fish. In: "Invertebrate and Fish Tissue Culture". (Eds. By E. Kurstak and Y. Kuroda), Japan Scientific Press - Springer - Verlag. 1987, P. 218-227.

Claims

The Cyprinus carpio immature carp ovary ICO cell line, intended for virological research, deposited in the Specialized Collection of Transplantable Somatic Cell Cultures of Agricultural and Commercial Animals of the Russian Cell Culture Collection at the All-Russian Scientific Research Institute of Experimental Veterinary Medicine (CXC RASHN) under No. 66.